專利名稱：：禽流感疫苗的制作方法禽流感疫苗相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求以下申請(qǐng)的權(quán)益2006年10月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第601850,761號(hào)、2006年11月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第601860,301號(hào)、2007年3月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第601920,874號(hào)和2007年4月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第601921,669號(hào)，全部文獻(xiàn)因而〉開(kāi)地通過(guò)引用的方式完整并入。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及免疫原性組合物和用作抗禽流感病毒疫苗的方法。相關(guān)技術(shù)的描述流感病毒從動(dòng)物適應(yīng)于人的能力由幾種病毒基因產(chǎn)物決定(見(jiàn)Parrish,C.R.等2005微生物學(xué)年評(píng)《AnnuRevMicvobiol》中綜述)。它們當(dāng)中，病毒血凝素(HA)尤其令人感興趣；它結(jié)合至呼吸道中影響傳播的特定唾液酸(SA)受體(Parrish,C.R.等2005微生物學(xué)年評(píng)《AnnuRevMicvobiol》59:553;Bean,W丄等1992病毒學(xué)雜志(JVirol)66:1129;Vine、A.等1998病毒學(xué)雜志(JVirol)72:7626)。與此同時(shí)，它影響作為免疫保護(hù)主要決定因素的中和抗體的敏感性(Subbarao，K.等200620免疫學(xué)《Immunity》24:5;B.R.Murphy和R.G.Webster,費(fèi)氏病毒學(xué)《FieldsVirology》.D.M.Knipe等編輯(Lippincott，Philadelphia,第3版，1996)，第1403頁(yè))。發(fā)明簡(jiǎn)述提供了因突變而適應(yīng)于人的H5血凝素(HA)多肽和相關(guān)多核苷酸、方法、組合物和疫苗，其中所述的突變改變H1血清型的受體特異性。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及分離或重組的血凝素(HA)多肽，所述多肽選自由以下項(xiàng)所組成的組中(a)具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:82的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽；(d)由多核苷酸序列編碼的多肽，其中所述的多核苷酸序列在高度嚴(yán)格性條件下與編碼(a)、(b)或(c)的多核芬S交序列的基本上全長(zhǎng)雜交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含與所述(a)、(b)或(c)中連續(xù)的至少約350個(gè)氨基酸、與至少約400個(gè)氨基酸、與至少約450個(gè)氨基酸或與至少約500個(gè)氨基酸基本上相同的氨基酸序列；和(f)H5HA多肽；其中所述多肽包含S137除S之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸即是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y或V,優(yōu)選地是A，并任選包含T192除T之外的氨基酸的又一個(gè)突變，其中所述氨基酸即是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V,優(yōu)選地是I。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及分離或重組的血凝素(HA)多肽，所述多肽選自由以下項(xiàng)所組成的組中(a)具有SEQIDNO:2的氨基S臾序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:82的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽；(d)由多核香酸序列編碼的多肽，其中所述的多核苦Si^列在高度嚴(yán)格性條件下與編碼(a)、(b)或(c)的多核苦酸序列的基本上全長(zhǎng)雜交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含與所述(a)、(b)或(c)中連續(xù)的至少約350個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約400個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約450個(gè)氨基酸或連續(xù)的至少約500個(gè)氨基S緣本上相同的氨基酸序列；和(f)H5HA多肽；其中所述多肽包含K/R除K或R之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸即是A、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y或V,優(yōu)選地是S、A、T或N，并包含由以下項(xiàng)所組成的組中的至少一種突變S136除S之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸即是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y，或V，優(yōu)選地是T;E190除E之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V，優(yōu)選是D、N,或G;L194除L之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V、優(yōu)選是I或F;R216除R之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸是A、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y,或V、優(yōu)選是E;S221除S之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y，或V、優(yōu)選是P;K222除K之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y，或V、優(yōu)選是W;G225除G之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V、優(yōu)選是D或N;Q226除Q之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y,或V、優(yōu)選是R或L;S227氨基酸除S之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y，或V、優(yōu)選是A、H、P、E，或N;以及G228除G之外的氨基酸的突變，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y,或V、優(yōu)選是S。本發(fā)明的其它實(shí)施方式涉及包含與前述血凝素多肽具有至少95%序列同一性的序列的多肽、其免疫原性片段、其組合物、其免疫原性組合物、修飾其裂解位點(diǎn)、修飾替代跨膜結(jié)構(gòu)域的前述血凝素多肽的外部三聚區(qū)的羧基末端、編碼前述血凝素多肽的多核苷酸序列、載體、產(chǎn)生方法、使用方法、對(duì)其特異的抗體和抗體9B11、IODIO、9E8及11H12。圖1.曱型流感病毒粒子的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2.流感病毒A血凝素蛋白的圖示。圖3.曱型流感病毒(A/泰國(guó)/l(KAN-l)/2004(H5N1))血凝素(HA);GenBank登錄號(hào)AY555150;野i型；多肽序列是SEQIDNO:2;并且多核苷酸序列是SEQIDNO:1。圖4.血凝素突變的結(jié)構(gòu)和遺傳基礎(chǔ)。A)顯示可選性病毒血凝素的RBD。B)130主環(huán)和220主環(huán)和190螺旋內(nèi)氨基酸序列的比較。圖5.HANA假型慢病毒載體的功能性活性野生型和突變H5血凝素的等效表達(dá)、具有a2,3和a2,6SA特異新凝集素的293A細(xì)胞的反應(yīng)性、除神經(jīng)氨酸酶之外還含有野生型或突變HA的假型病毒介導(dǎo)進(jìn)入的能力。(A)使用流式細(xì)胞術(shù)，在轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中顯示野生型或所述突變流感病毒H5MHA的表達(dá)(Paulson,J.C.和Roger、G.N.1987酶學(xué)方法《MethodsEnzymol》138:162);免疫前對(duì)照(灰色)或抗H5(黑色)。(B)293A細(xì)胞如所示與生物素化標(biāo)記MAA或SNA—起孵育，由流式細(xì)胞術(shù)分析。(C)在如實(shí)施例1中所述制備除NA之外以所示HA野生型(WT)或突變型變體假型化的慢病毒載體后，利用螢光素酶測(cè)定法測(cè)量，分析了由H5(KAN-1)及其衍生物介導(dǎo)的進(jìn)入的效率。對(duì)應(yīng)于所述突變體的表達(dá)水平是對(duì)照，4.78x10、WT,3.16xlO8;Q226L,G228、3.79xlO8;E190D,1.55x107;K193、3.78xlO8;G225D,2.97xl08;E190D,K193、4.51x108;E190D，G225D,8.3x168;K193S,G225D,4.03x108;E190D,K193S，G225D，3.05x108。圖6.與隨同NA—起共表達(dá)的野生型KAN-201H5相比，三重突變體H5的變異特異性。在隨同NA共表達(dá)后純化的(A)野生型或(B)三重突變體HA的聚糖微陣列分析通過(guò)先前技術(shù)(Steven、J.等2006自然-微生物學(xué)綜述《NatRevMicrobiol》4:857)的改良(實(shí)施例1)進(jìn)行，由CoreH,功能基因組協(xié)會(huì)，Emory大學(xué)實(shí)施。具有相關(guān)系的聚糖通過(guò)編號(hào)進(jìn)行分組選擇糖蛋白(1-6),主要是2，3-唾液酸糖香(7-44),2,6-唾液酸糖苷(45-60),2,8配體(61-67)或其它(68-84)，如前所示(表8)。圖7.突變H5N1假病毒的變異中和敏感性。(A)對(duì)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中隨NA共表達(dá)的HA的結(jié)合由流式細(xì)胞術(shù)以所示mAb(黑色)或同種型對(duì)照IgG(灰色)測(cè)定。(B)中和敏感性用所示mAb評(píng)價(jià)。(C)顯示了所示野生型和突變HA對(duì)這些mAb(400ng/ml)的中和敏感性。(D)展示了野生型以及S137A、T1921突變體對(duì)mAb9E8和11H12的中和敏感性。圖8.H5(Kan畫(huà)l)(E190D/K193S/G225D)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:8)、DNA序列(SEQIDNO:26)。圖9.H5(Kan-l)(mut.A)(E190D/K193S/G225D)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:9)、DNA序列(SEQIDNO:27)。圖10.H5(Kan-l)(mut.A)(短)/Foldon(折疊子)(E190D/K193S/G225D)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:10)、DNA序列(SEQIDNO:28)。圖11.H5印度尼西亞(E190D/K193S/G225D)。蛋白質(zhì)序刮(SEQIDNO:11)、DNA序列(SEQIDNO:29)。圖12.H5印度尼西亞(mutA)(E190D/K193S/G225D)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:12)、DNA序列(SEQIDNO:30)。圖13.H5(印度尼西亞)(mut.A)(短)/Foldon(E190D/K193S/G225D)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:13)、DNA序列(SEQIDNO:31)。圖14.VRC9151(SEQIDNO:14)。圖15.VRC9152(SEQIDNO:15)。圖16.VRC9153(SEQIDNO:16)。圖17.H5(Kan-l)(S137A)。蛋白質(zhì)序歹'J(SEQIDNO:17)、DNA序列(SEQIDNO:32)。圖18.H5(Kan曙l)(mut.A)(S137A)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:18)、DNA序列(SEQIDNO:33)。圖19.H5(Kan-l)(mut.A)(短)/Foldon(S137A)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:19)、DNA序列(SEQIDNO:34)。圖20.H5(Kan-l)(T1921)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:20)、DNA序列(SEQIDNO:35)。圖21.H5(Kan-l)(mut.A)(T192I)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:21)、DNA序列(SEQIDNO:36)。圖22.H5(Kan-l)(mut.A)01)/Foldon(T192I)。蛋白質(zhì)序歹寸(SEQIDNO:22)、DNA序列(SEQIDNO:37)。圖23.H5(Kan-l)(S137A/T192I)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:23)、DNA序列(SEQIDNO:38)。圖24.H5(Kan-l)(mut.A)(S137A/T192I)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:24)、DNA序列(SEQIDNO:39)。圖25.H5(Kan-l)(mut,A)(短)IFoldon(S137A/T192I)。蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:25)、DNA序列(SEQIDNO:40)。圖26.曱型流感病毒(A/印度尼西亞/5/05(H5Nl))血凝素(HA);GenBank登錄號(hào)ISDN125873;野生型；多肽序列是SEQIDNO:82;并且多核苷酸序列是SEQIDNO:81。圖27.曱型流感病毒(A/Anhui/1/2005(H5N1))血凝素(HA);GenBank登錄號(hào)ABD28180;野生型；多肽序列是SEQIDNO:84;并且多核苷#列是SEQIDNO:83。以下生物材料已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約條款在所示日期保藏于弗吉尼亞州馬納薩斯的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC):<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>生物材料10D10的保藏D10小鼠B細(xì)胞雜交瘤在2006年10月10日作為ATCC登錄號(hào)PTA-7916保藏于美國(guó)弗吉尼亞州20110-2209,馬納薩斯，Blvd大學(xué),10801,美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。所述保藏物根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約(布達(dá)佩斯條約)的條款產(chǎn)生。這確保維持此保藏物有活力的培養(yǎng)物自保藏日期起持續(xù)30年。ATCC將根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款使該保藏物可獲得并且該保藏物遵循申請(qǐng)人與ATCC之間的合同，其中所述的合同確保在相關(guān)的美國(guó)專利發(fā)布時(shí)或在任何美國(guó)申請(qǐng)或外國(guó)申請(qǐng)對(duì)公眾公開(kāi)時(shí)，無(wú)論誰(shuí)在先，公眾可永久且不受限制地獲得該保藏物的培養(yǎng)物的子代，并且確保由美國(guó)專利商標(biāo)局委員根據(jù)35USC§122和根據(jù)其的行政規(guī)章(Commissioner'srulespursuantthereto)(包括375CFR§1.14)決定對(duì)其授權(quán)的個(gè)人可獲得所述利法授予的權(quán)力相抵觸地許可實(shí)施本發(fā)明。生物材料9B11的保藏9B11小鼠B細(xì)胞雜交瘤在2007年4月2日作為ATCC登錄號(hào)PTA-8306保藏于美國(guó)弗吉尼亞州20110-2209,馬納薩斯，Blvd大學(xué)，10801,美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。所述保藏物根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約(布達(dá)佩斯條約)的條款產(chǎn)生。這確保維持此保藏物有活力的培養(yǎng)物自保藏日期起持續(xù)30年。ATCC將根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款使該保藏物可獲得并且該保藏物遵循申請(qǐng)人與ATCC之間的合同，其中所述的合同確保在相關(guān)的美國(guó)專利發(fā)布時(shí)或在任何美國(guó)申請(qǐng)或外國(guó)申請(qǐng)對(duì)公眾^Hf時(shí)，無(wú)論誰(shuí)在先，公眾可永久且不受限制地獲得該保藏物的培養(yǎng)物的子代，并且確保由美國(guó)專利商標(biāo)局委員根據(jù)35USC§122和根據(jù)其的行政規(guī)章(包括375CFR§1.14)決定對(duì)其授權(quán)的個(gè)人可獲得所述子代。所保藏的生物材^h的可獲得性不得解釋為與任何政府權(quán)利機(jī)關(guān)根據(jù)其專利法授予的權(quán)力相抵觸地許可實(shí)施本發(fā)明。含有CDR和FR區(qū)的9E8抗體序列I.人源化序列蛋白質(zhì)序列人源化9E8重鏈V區(qū)FR1:VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG(SEQIDNO:41)FR2:WVRQAPGQGLEWMGW(SEQIDNO:42)FR3:TMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR(SEQIDNO:43)FR4:WGQGTMVTVSS(SEQIDNO:44)CDR1:YIFSEYIIN(SEQIDNO:45)CDR2:FYPGSGSVKYNEKFNDKA(SEQIDNO:46)CDR3:HERDGYYVY(SEQIDNO:47)人源化9E8K鏈V區(qū)FR1:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS(SEQIDNO:48)FR2:MHWYQQKPGQAPRLLIY(SEQIDNO:49)FR3:NLETGIPARFSGSGSGTDFTLTIDPLEAEDVATYYC(SEQIDNO:50)FR4:FGQGTKVEIK(SEQIDNO:51)CDRl:ESVDSFGNSF(SEQIDNO:52)CDR2:LAS(SEQIDNO:53)CDR3:QQNNEDPYT(SEQIDNO:54)人源化9E8重鏈(SEQIDNO:55)mdwtwrilflvaaatgahsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgyifseyiinwvrqa卿glewmgwfypgsgsvkynekfndkatmtadtsistaymelsrlrsddtavyycarherdgyyvywgqgtmvtvssastlcgpsv^lapsskstsggtaaigclvkdyQ>epvtvswnsgaHsgvhtfpavlqssg1yslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsMkvdkkvepkscdkthtcppcpapelggpsvf!fppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhq(lwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqi)i-q)qvytlpi)srdeltknqvsItclvI、'gfypsHave、vesngqpennykttpp、'kls(lgsfflyskltv他snvqqgm'ftcs、TiiheaHmiiytql"'Msi)gk人源化9E8輕鏈(SEQIDNO:56)me，qllfHllwipclrtgeivltqspatlskpgeraUscrasesvds%isfiiihwyqq.kpgqaprlUylasnletgiparfsgsgsgtdftltidp〗eaedvatyycqqnnedpytfgqgtkvdkrtva汰psvfifppsdeqHcsgtasvvdlimfypreakvqw]cvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsst!tlskadyekhkvyacevth(jglsspvtksfhrgecDNA序列人源化9E8重鏈(SEQIDNO:57)atggattggacatggagaatcctgt〖cctggtggctgctgctocag伊gctcatagccaggtgcagctggigcagagcggagctgaagtgaagaagcctggagctegcgtgaaggtgtcctgtaaggcctccggatacatcttcagcgagtacatcatcaactgggtgagacaggctcctggacagggactggaatggatgggatggttctoccctggaagcggaagcgtgaagtacaacgagaagttcaacgacaaggctacaatgacagctgacacaagcatctocacagcttacatggaactgtccagactgagaagcgatgatacagctgtgtactactgtgccagacacgaaagagacggatactacgtgtactggggacagggaacaatggtgaccgtgtcctccgcctcc線ceaagggcccatcggtettccccctggcaGCCtectccaag3gcacctot卿ggcac3gcggccctgggctgcctggtca鄉(xiāng)actacttccccg抑cc敏gaeggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccgg卿cctacagtcctcaggactctactcccte3gcagcgtggtgacc狗ccctceagcagcttgggcaccc3g3cctacatctgcaacgtgaatc3caagcccagc3acacc的ggtggacaagaaagttgagcccaaatettgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcUccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccct'gaggtcaagtteaactggtacgtggacggcgtggaggtgca〖aatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacglaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctocaacaaagccctcccagcccccatcgag3aaaccatctccsia3gcca3agggcagccccgaga3ccac鄉(xiāng)tgtacaccctgcccccatcccgggatgagc〖gaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgcfcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgca伊，gcctctcccfgtctccgggt嫌言ga人源化9E8輕鏈(SEQIDNO:58)AtggaagcccctgctcagctcctgUtctgcl,gctgctgtggctgcctgatacaacaggagaaatcgtgctgacacagagccctgccacact鵬cclgagccctggagaaagagccacactgagctgcaga忌cctcc,agcgtggattccttcggaaacagcttcatgcactggtaccagcag餘gcctggacaggcceccagactgctgatctacctggcctecaacctggaaacaggaatccc〖gccagattttccgg抑gcggMgcgg幼cag池tcacactgac組cgaccctctggaagctgaagatgtggctacMactectgtcagcaga織acgaagatccttacacatttggacagggaacaaaggtggagatcaagagaacagtggccgccccttccgtgttcatcttccctccttecgacgaacagctgaaaagcggaacagccagcgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaagtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcgga朋oigccaggaaagcgtgacagagcaggattccaaggattcaicatecagcctgagcagcacadgacactgtc'omggccgactacgaga3gcaccmggt.gtacgcctgcgaagtgacacaccagggactgtcctcccctgtgaII.小鼠序列蛋白質(zhì)序列小鼠抗H5(Kan-l)單克隆抗體，9E8VH(SEQIDNO:59):mgwswiflfllsvtagvhskvqqqsgaelvkpgasvklsckasgyifs巧iinwvkqksgcjg化wiawfypgsgsvkynekfndkatlsadtssrrtvymdirvtsedsavyjfcarherdgyyvywgqgttltvss小鼠抗H5(Kan-l)單克隆抗體，9E8VL(SEQJDNO:60):sgsgsrtdftltidpveaddvatyycqqnnedpytfgggtkleikDNA序列小鼠抗H5(Kan-l)單克隆抗體，9E8VH(SEQIDNO:61):atgggatggagctggatctttctcttcctcctgtcagtaactgcaggtgtccactccaaggtccagctgcaacagtctggagctgagct:ggtgaaaeccggggcttcagl'gaagctgtcctgcaaggcttctggctacatcttcagtgaatatattataaattgggtpaagcagaaatctggacagggtcttgagtggattgcgtggttttaecctggaagtggtagtgtaaagtacaatgagaaattcaacgacaaggccacattgagtgcggacacgtcctccaacacagtctatatggagcttattagagtgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagacacga3鄉(xiāng)gMggttactecgtetoctggggccii郷cacc3ctctcEic3gtctcctca小鼠抗H5(Kan-l)單克隆抗體，9E8VL(SEQIDNO:62):atggagacagacacactcctgctatgggtgetgctgclctgggttccaggt襲ccacaggtaacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctaggacagagggccaccatatcctgcagaaccagtgaaagtgttgatagttttggcaatagttttetgcactggtaccagcagaaaecaggacagccacccaaactcctcatctotctfgcatecaficctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagt卿tct鄉(xiāng)acagacttcaccctcaccattgatcctgtgg鄉(xiāng)ctgatgatgttgcaacctattactgtcagcaaaataatgaagatccgtacacgttcg賊鵬紹gace鄉(xiāng)etg:g細(xì)taaaa含有CDR和FR區(qū)的11H12抗體序列蛋白質(zhì)序列鼠類11H12重鏈V區(qū)FRl:VQLQQSGAVLMKPGASVKISCKATG(SEQIDNO:63)FR2:WVKQRPGHGLEWIG(SEQIDNO:64)FR3:AFTADTSSNTANIQLTSLTSEDSAVYYCAR(SEQIDNO:65)FR4:WGAGTTVTVSS(SEQIDNO:66)CDR1:YTFSSYWIE(SEQIDNO:67)CDR2:EILPGSGSINYNEIFKDKA(SEQIDNO:68)CDR3:GGYGYDPLYWSFDV(SEQIDNO:69)鼠類11H12K《連V區(qū)FRl:DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRAS(SEQIDNO:70)FR2:IHWYQQRTNGSPRLLIQ(SEQIDNO:71)FR3:ESISGIPSRFSGSGSGTNFTLTINSVESEDIADYYC(SEQIDNO:72)FR4:FGGGTKLEIK(SEQIDNO:73),CDR1:QSIGTN(SEQIDNO:74)CDR2:SAS(SEQIDNO:75)CDR3:QLTNTWPMT(SEQIDNO:76)11H12重鏈(SEQIDNO:77):mgwswiflfUsvtagvhsqvqlqqsgavlmkpgasvkisckatgytfssywiewkqi'pghglewigeUpgsgsiiiyneifkfJkaaftadtssntaiiiqltsltsedsavyycarggygydplywsfdvwgagttvtvssalcttppsvypIapgsaaqtnsOTVtlgdvfc-epvtvtwiisgsksgvhtfpavlqsdiytlsssvtvpsstwpsetvtettvfihpasstkvdkfcivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltithpkvlcvw出skddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfhstfrsvsdpimhqdwbgkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkcqmakdkvsltanitdffpe(litvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyiVysklnvqksnweagntfksv!heglhnhhtekslshspgk11H12輕鏈(SEQIDNO:78):mesqsqvfvfllftvipasrgcMUtqspailsvsi3gervsfecrasqsigtoiliwycicir1iigspriliqsasesisgipsrfsgsgsgtn組tiiw敏edia柳c:qltatMpR詢ggtkleikradaaptvg;ifppaseqlts靜,flimfypldirw1wlddg鵬rqngvlnswtdqds]ccIstysinsst:lt!tkdeyCTlinsytceathktstspivksfmTiecDNA序列11H12重鏈(SEQIDNO:79):atgggatggagcl名galctttctcttcclcctgtcagtaactgctggtgtccactcccaggttcagctgcagCMtctggagdgtactgatgaagcctggggcctcagtgaagatttcctgcaaggctactggctacacattcagtagctac;tggatagaglgggtgaagcagaggcctggacatggccHgaglgga"ggagagat很acctggaagl.ggtagtattaattacaatgagatcttcaaggacaaggccgeattcactgc3g站織tcctcc職gcc咖3ta,ctc8ccagcctg職tctg鄉(xiāng)3ctctgccgtc敏flctgtgc船ggggaggctatggUacgacccactctactggfcctregatgtccagccaaaacgacacecccatctgtetet(xactggcecclggatcl'gctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgaectggaadct經(jīng)gttccctgtecagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaat〖gtgcccagggattgtggttgt肌gccttgcat欲gtacagtcccagaagtetcatctgtctteatettecccccaaagccxaaggatgtgctcaca"tactdgactcefaaggto3cgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttc鄉(xiāng)t敏ttgtag8tg卿gg鄉(xiāng)tgcac織gctcagacgcaaccccgggagg紹cagttc油c鄉(xiāng)adttccgcteagtcagtgaacttoceatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggteaacagtgcagctttccctgcccccatcg3ga鄉(xiāng)ccatctecaaaaccggc曰gaccgaa卿tecacaggtgtacaccattccacctecc卿g3gcag購(gòu)gcc8鄉(xiāng)ataaagtcagtdgaectgeatgataacagacttettcectgaagacattectgtggagtggcagtggaat紹gcagccagcggagaactacaagaaeactcageccatcatggacacagatggctcttocttcgtetacagcaagctcaatgtgcag腿gagcaadgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggaaatga11H12輕鏈(SEQIDNO:80):atggagtcacagtctcaggtctugtatmtgcmtctggattccagcctccagaggtgacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtuctcctgca鵬ccagtcagagcattggcacaaacatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctcatacagtctgcttctgagtctatuctgggatcccgtccaggtttagtggcagtggatcagggacaaattttactctaaccatcaacaglgtggagtctgaagatattgcagattattactgtcaacttactaatacctggccaatgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctc.agtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcetgaacagttggactgateaggac汰gcaaagaeagcacctecagcatgageagcacceteacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctalacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttgatga表l曱型病毒HA序列和質(zhì)粒構(gòu)建<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>具體實(shí)施例方式流感病毒進(jìn)入由其刺突蛋白-血凝素(HA)的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)介導(dǎo)。禽病毒對(duì)人的適應(yīng)性與HA針對(duì)a2，6-連接而非a2，3-連接唾液酸(SA)受體的特異性有關(guān)。本文中，我們定義了曱型流感病毒亞型H5N1(禽)HA中的如此突變，其通過(guò)減少a2,3-或增加a2，6-SA識(shí)別作用而改變所述HA對(duì)SA的特異性。使用RBD突變體來(lái)開(kāi)發(fā)疫苗和中和新變體的單克隆抗體。基于結(jié)構(gòu)對(duì)HA特異性的修飾可以指導(dǎo)開(kāi)發(fā)可在人適應(yīng)性H5N1抹出現(xiàn)之前進(jìn)行評(píng)價(jià)的優(yōu)選疫苗和治療性單克隆抗體。定義除非另外定義，本文中所用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所述領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。參見(jiàn)例如，SingletonP和SainsburyD.，微生物學(xué)與分子生物學(xué)詞典第三版(DictionarvofMicrobiology和MolecularBiology.3rded.),J.Wiley&Son、奇切斯特(Chichester)，紐約(NewYork)，2001和費(fèi)氏病毒學(xué)第四版(TieldsVirology.4thEd.)編者KnipeD.M.和HowleyP.M.,LippincottWilliams&Wilkin、費(fèi)城(Philadelphia),PA，2001。過(guò)渡態(tài)術(shù)語(yǔ)"包含"是與"包括"、"含有"或"特征在于"同義的，是包含性或開(kāi)放的，并且不排除額外的、未提及的要素或方法步驟。過(guò)渡態(tài)短語(yǔ)"由......組成"排除了未在權(quán)利要求中詳述的任意要素、步驟或組分，但是不排除與本發(fā)明不相關(guān)的額外組分或步驟，如通常與本發(fā)明相關(guān)的雜質(zhì)。過(guò)渡態(tài)短語(yǔ)"基本上由……組成"將權(quán)利要求的范圍限于指定的材料或步驟和這樣的材料或步驟，其實(shí)際上不影響所要求專利的發(fā)明的基本和新穎性特征。如本說(shuō)明書(shū)及所附權(quán)利要求書(shū)中所用，單數(shù)形式"一個(gè)(a)"、"一種(an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)指稱，除非上下文清楚地聲明。因此，例如對(duì)"一種病毒"的指稱包括多種病毒；對(duì)一種"宿主細(xì)胞"的指稱包括宿主細(xì)胞的混合物等。術(shù)語(yǔ)"核酸"、"多核苦酸"、"多核苷酸序列"和"核S交序列"，才艮據(jù)上下文，指單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物、其嵌合物或類似物，或代表此類對(duì)象的字符串。如本文中所用，該術(shù)語(yǔ)任選地包括天然存在性核苷酸的類似物的聚合物，所述的聚合物具有天然核苷酸的本質(zhì)特性，從而它們以類似于天然存在性核苦酸的方式與單鏈核酸雜交(例如聚酰胺核酸)。除非另外說(shuō)明，本發(fā)明的具體核S吏序列除清楚說(shuō)明的序列之外任選地包括互補(bǔ)序列。從任意的所述多核苷酸序列，可以確定給定的核酸或互補(bǔ)性多核苷S吏序列(例如互^M亥酉臾)。術(shù)語(yǔ)"核酸"或"多核苷酸"也包括單體單元的任意實(shí)體串列，所述的串列可以對(duì)應(yīng)于一串核苦酸，包括核苷酸聚合物(例如常見(jiàn)的DNA或RNA聚合物)、PNA、修飾的寡核普酸(例如包含對(duì)于溶液中的生物RNA或DNA是不常見(jiàn)的堿基的寡核苦酸，如2'-0-曱基化寡核苷酸)等。核酸例如可以是單t連或雙鏈的。"亞序列，，是全長(zhǎng)的任意部分，脂質(zhì)并且包括整個(gè)序列。通常，亞序列包含小于全長(zhǎng)的序列。在兩種核酸或多肽(例如編碼HA分子的DNA或HA分子的氨基酸序列)的上下文中，短語(yǔ)"基本上相同"指兩個(gè)或更多個(gè)序列或亞序列，在為最大對(duì)應(yīng)性進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)，如使用序列比較算法或通過(guò)目視檢查測(cè)量，所述序列具有至少約90%、優(yōu)選91%、最優(yōu)選92°/。、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、599.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更大的核香酸殘基同一性或氨基酸殘基同一性。術(shù)語(yǔ)"變體"就多肽而言，指相對(duì)于參考序列氨因一個(gè)或多個(gè)氨基酸而改變的氨基酸序列。所述變體可以具有"保守性，，變化，其中置換的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)屬性，例如用異亮氨酸替換亮氨酸。或者，變體可以"非保守性"變化，例如用色氨酸替換甘氨酸。類似的細(xì)微變異也可以包括氨基酸缺失或；插入或這兩種情況。使用i本領(lǐng)域眾所周知的計(jì)算機(jī)程序例如軟件DNASTAR,可以找到?jīng)Q定哪種氨基酸殘基可被置換、插入或缺失而不消除生物學(xué)活性或免疫學(xué)活性的原則。本文中也描述保守性置換的實(shí)例。術(shù)語(yǔ)"基因"廣泛地用來(lái)于生物學(xué)功能相關(guān)的任意核酸。因此，基因包括編碼序列和/或其表達(dá)所需要的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)"基因"適用于特定基因組序列，以及適用于由該基因組序列編碼的cDNA或mRNA。基因也包括不表達(dá)的核酸節(jié)段，其例如形成其它蛋白質(zhì)的識(shí)別序列。不表達(dá)的調(diào)節(jié)序列包括"啟動(dòng)子"和"增強(qiáng)子"，其中調(diào)節(jié)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子與所述啟動(dòng)子和增強(qiáng)子結(jié)合，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄相鄰或附近的序列。"組織特異性"啟動(dòng)子或增強(qiáng)子是調(diào)節(jié)特定組織類型或細(xì)胞類型中轉(zhuǎn)錄的那種啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。"基因的表達(dá)"或"核酸的表達(dá)"通常意指DNA轉(zhuǎn)錄成RNA(任選地包括修飾所述RNA，例如剪接)或RNA轉(zhuǎn)錄成mRNA、RNA翻譯成多肽(可能包括對(duì)所述多肽的后續(xù)修飾，例如翻譯后修飾)或意指轉(zhuǎn)錄和翻譯，如上下文所示。"開(kāi)放閱讀框"或"ORF'是DNA或RNA(例如基因)中可能翻譯的開(kāi)放閱讀框，所述的開(kāi)放閱讀框能夠翻譯成多肽。也就是說(shuō)，所述開(kāi)放閱讀框不由終止密碼子截?cái)?。然而，?yīng)當(dāng)指出術(shù)語(yǔ)ORF不必表示所述多核香酸實(shí)際上被翻譯成多肽。術(shù)語(yǔ)"載體"指核酸可以藉此而增殖和/或在生物、細(xì)胞或細(xì)胞組分之間轉(zhuǎn)移的手段。載體包括自主復(fù)制或可以整合至宿主細(xì)胞染色體的質(zhì)粒、病毒、噬菌體、前病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、人工染色體等。載體也可以是無(wú)法自主復(fù)制的棵RNA多核苷酸、棵DNA多核苷酸、在同一條鏈中由DNA和RNA組成的多核苷酸、聚賴氨酸綴合的DNA或RNA、肽綴合的DNA或RNA、脂質(zhì)體綴合的DNA或其它。在眾多但非全部的常見(jiàn)實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體是質(zhì)粒。"表達(dá)載體，，是能夠促進(jìn)整合于其中的核酸表達(dá)以及復(fù)制的載體，如質(zhì)粒。通常，待表達(dá)的核酸與啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子"可操作地連接(operablylinked)",并且接受所述啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié)控制。"雙向表達(dá)載體"以兩個(gè)這樣的備選啟動(dòng)子為特征，其中所述兩個(gè)啟動(dòng)子相對(duì)于在這兩個(gè)啟動(dòng)子之間存在的核酸具有對(duì)立方向，從而表達(dá)可以在兩個(gè)方向上啟動(dòng)，導(dǎo)致例如正鏈(+)或有義鏈RNA和負(fù)鏈(-)或反義鏈RNA的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)上下文，"氨基S交序列"是氨基酸殘基的聚合物(蛋白質(zhì)、多肽等。)或代表tt酸聚合物的字符串。"多肽"是包含兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的聚合物(例如多肽或蛋白質(zhì))。所述聚合物可以任選地包含修飾，如糖基化或其它等。所述多肽的氨基酸殘基可以是天然或非天然的并且可以是非取代的、非修飾的、取代的或修飾的。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"分離"指這樣的生物材沖牛，如病毒、核酸或蛋白質(zhì)，所述生物材料基本上沒(méi)有在其天然存在環(huán)境中通常與之相伴或相互作用的組分。分離的生物材料任選地包含在其天然環(huán)境中找不到伴隨所述生物材料的額外材料，例如細(xì)胞或野生型病毒。例如，若所述材料處于其天然環(huán)境如細(xì)胞中，則該材料可以位于該細(xì)胞中的如此位置(例如基因組或遺傳元件)內(nèi)，其中所述的位置對(duì)在此環(huán)境中存在的此材料而言不是天生的。例如，天然存在性核酸(例如編碼序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)變成分離的，若此核酸通過(guò)非天然存在性工具(例如載體，如質(zhì)粒或病毒載體或擴(kuò)增子)導(dǎo)入基因組中對(duì)于該核酸而言是非天生的基因座。此類核酸也稱作'異源性"核酸。分離的病毒例如處在并非是野生型病毒天然環(huán)境(例如感染個(gè)體的腸道或呼吸道)的環(huán)境中(例如細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或從細(xì)胞培養(yǎng)中純化)。術(shù)語(yǔ)"重組"表示所述材料(例如核酸或蛋白質(zhì))已經(jīng)因人工干預(yù)而受到人工或合成(非天性)改變。所述改變可以對(duì)位于其天然環(huán)境或狀態(tài)下或從其中取出的材料進(jìn)行。具體而言，例如當(dāng)通過(guò)表達(dá)重組核酸產(chǎn)生流感病毒時(shí)，該流感病毒是重組的。例如，"重組核酸，，是通過(guò)(例如克隆期間)使核酸重組或其它方法，或通過(guò)化學(xué)誘變法或其它誘變法所產(chǎn)生的核酸；并且"重組多肽"或"重組蛋白，，是通過(guò)表達(dá)重組核酸而產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)。當(dāng)指異源性或分離的核酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)"導(dǎo)入"指將核酸并入真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，其中所述核酸可以并入該細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)?；蚓€粒體DNA)、轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。該術(shù)語(yǔ)包括此類方法如"轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)導(dǎo)""。在本發(fā)明的上下文中，可以使用多種方法將核酸導(dǎo)入細(xì)胞，所述方法包括電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法(lipofection)等。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"意指含有異源性核酸如載體或病毒并支持所述核酸復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物、禽類或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞。示例性宿主細(xì)胞可以包括例如Vero(非洲綠猴腎細(xì)胞)細(xì)胞、BHK(乳倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞、原代雞腎(PCK)細(xì)胞、Madin畫(huà)Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞、Madin畫(huà)Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞、293細(xì)胞(例如293T細(xì)胞)和COS細(xì)胞(例如COSl、COS7細(xì)胞)等。流感病毒的"免疫學(xué)有效量"是足以增強(qiáng)個(gè)體(例如人)在暴露于流感病毒后自身免疫應(yīng)答的量。誘導(dǎo)免疫的水平可以通過(guò)測(cè)量中和性分泌抗體和/或血清抗體的量，例如通過(guò)蝕斑中和測(cè)定法、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法或微量中和測(cè)定法加以監(jiān)測(cè)?？沽鞲胁《镜?保護(hù)性免疫應(yīng)答，，指?jìng)€(gè)體(例如人)表現(xiàn)的如此免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答在該個(gè)體隨后暴露于野生型流感病毒和/或受其感染時(shí)保護(hù)其不受疾病影響。在一些情況下，野生型(例如天然循環(huán)型)流感病毒可以仍造成感染，不過(guò)它不能造成嚴(yán)重感染。一般，所述保護(hù)性免疫應(yīng)答產(chǎn)生可檢測(cè)水平的宿主產(chǎn)生的血清抗體和分泌型抗體，所述的抗體能夠在體外和體內(nèi)中和相同抹和/或亞群的病毒(并也可能中和不同的非疫苗林和/或亞群)。如本文中所用，"抗體"是包含基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼一條或多條多肽的蛋白質(zhì)。已識(shí)別的免疫球蛋白基因包括k、？ua、y、5、s和ji恒定區(qū)基因，以及繁多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為K或X。重鏈分類為y、p、a、5或s，它們轉(zhuǎn)而分別定義免疫球蛋白類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。常見(jiàn)免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每種四聚體由相同的兩對(duì)多肽鏈，每對(duì)多肽鏈具有一條"輕"鏈(約25kD)和一條"重，，鏈(約50-70kD)。每條鏈的氨基端定義主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的含約IOO個(gè)至110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的一個(gè)可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)指分別這些輕鏈和重鏈?？贵w作為完整免疫球蛋白或作為眾多充分表征的片段存在，其中所述的片段用多種肽酶消化而產(chǎn)生。因此，例如胃蛋白酶消化鉸鏈區(qū)中二辟"建以下的抗體以產(chǎn)生作為Fab二聚體的F(ab)'2，其中所述的Fab本身是通過(guò)二硫鍵與VH-CH1連接的輕鏈。F(ab)'2可以在溫和環(huán)境下被還原以破壞鉸鏈區(qū)中的二硫鍵，因而將所述(Fab')2二聚體轉(zhuǎn)化成Fab'單體。所述Fab'單體基本上是具有部分鉸鏈區(qū)的Fab(對(duì)其它抗體片段的更詳細(xì)描述，見(jiàn)《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology)，W.E.Paul編輯，RavenPress,N.Y.(1999))。盡管就消化完整抗體而言定義了多種抗體片段，技術(shù)人員將理解此類Fab'片段可以按照化學(xué)方式或通過(guò)使用重組DNA方法學(xué)從頭合成。因此，術(shù)語(yǔ)"抗體"如本文中所用，包括抗體或通過(guò)修飾完整抗體而產(chǎn)生或使用重組DNA方法學(xué)從頭合成的片段。抗體包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、多鏈或單鏈抗體，所述單鏈抗體包括其中可變重鏈和可變輕鏈(直接或通過(guò)肽接頭)連接在一起以形成連續(xù)多肽的單鏈Fv(sFv或scFv)抗體和人源化或嵌合抗體。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>流感病毒曱型流感病毒是感染類型廣泛的禽類和哺乳動(dòng)物種的有包膜負(fù)股單鏈RNA病毒。曱型流感病毒分成血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶5(NA)主要表面糖蛋白的血清學(xué)定義抗原亞型(WHO備忘錄1980BullWHO58:585-591)。該命名法滿足了對(duì)可由全部國(guó)家使用的簡(jiǎn)單系統(tǒng)的要求并且其從1980年以來(lái)一直有效。此命名法以源自包含血凝素和神經(jīng)氨酸酶抗原的雙向免疫擴(kuò)散(DID)反應(yīng)的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。雙向免疫擴(kuò)散(DID)試驗(yàn)如先前所述(Schild,GC等1980病毒學(xué)文獻(xiàn)(ArchVirol)63:171-184)進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，試驗(yàn)在瓊脂糖凝膠上實(shí)施(HGT瓊脂糖、1%磷酸鹽緩沖鹽水、pH7.2,含有0.01%疊氮鈉)。含有每毫升5-15mg病毒蛋白(或雞紅細(xì)胞的HA滴度為每0.25ml1055-1065血凝素單位)的純化病毒顆粒的制品以5-10|il體積添加至凝膠的孔內(nèi)。病毒顆粒在孔內(nèi)通過(guò)添加1%終濃度的去垢劑十二烷基肌氨酸鈉NL97加以破壞。將沉淀反應(yīng)照相而不染色，或?qū)⒛z干燥并用考馬斯亮蘭染色。當(dāng)使用對(duì)一種或另一種所述抗原為特異的超高免血清開(kāi)展DID試驗(yàn)時(shí)，該試驗(yàn)提供用于比較抗原關(guān)系的有價(jià)值方法?？乖g的相似性檢測(cè)為共同沉淀素線，其中當(dāng)使不同抗原^L射狀地對(duì)單種血清向內(nèi)擴(kuò)散時(shí)，抗原之間變異的存在由毛刺狀沉淀素揭示?；趯?duì)源自全部物種的甲型流感病毒的DID試驗(yàn)的結(jié)果，H抗原可以分成如表2中所示的16個(gè)亞型。表2從人、低等哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類分離的甲型流感病毒的血凝素亞型<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>顯示流感病毒參考株或來(lái)自該物種的首個(gè)分離株。b目前亞型命名。來(lái)自WHO備忘錄1980BullWHO58:585-591。曱型流感病毒基因組由8條單鏈負(fù)義RNA(single-strandnegative-senseRNA)分子組成(圖1)。三種膜整合蛋白-血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和少量M2離子通道蛋白-插入貫穿病毒包膜的脂質(zhì)雙層。認(rèn)為病毒粒子基質(zhì)蛋白Ml位于脂質(zhì)雙層下面，還與螺旋狀核糖核蛋白(RNPs)相互作用。在包膜內(nèi)存在以RNP形式包含的8節(jié)段單鏈基因組RNA(長(zhǎng)度范圍從2341至890核苷酸)。與RNP結(jié)合的少量由PB1、PB2和PA蛋白質(zhì)組成的轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體。所述8個(gè)RNA節(jié)段的編碼功能也在圖1中顯示。HA和NA由獨(dú)立的RNA分子編碼。HA參與病毒與宿主細(xì)胞糖蛋白上的末端唾液酸殘基和糖脂結(jié)合。在病毒進(jìn)入細(xì)胞的酸性內(nèi)吞體區(qū)室后，HA也參與同細(xì)胞膜的融合，這種融合導(dǎo)致病毒粒子內(nèi)容物釋放至胞內(nèi)。HA作為HAo前體合成，其中HAo前體形成病毒表面上非共價(jià)結(jié)合的同三聚體。所述HAo前體由宿主蛋白酶在保守的精胺酸殘基處切割以產(chǎn)生兩個(gè)由單個(gè)二碌L鍵連接的亞基HAi和HA2(圖2)。該切割事件是生產(chǎn)型感染所需要的。NA切割曱型流感病毒細(xì)胞受體的末端唾液酸殘基并參與成熟病毒粒子的釋放散播；它也可能對(duì)病毒初始進(jìn)入有貢獻(xiàn)。抗原轉(zhuǎn)變和漂移曱型流感病毒基因組的節(jié)段化有利于毒抹之間在兩種或多種毒抹感染相同細(xì)胞時(shí)的重配。重配可以產(chǎn)生重大遺傳變化，稱作抗原轉(zhuǎn)變。相反，抗原漂移是具有細(xì)微遺傳性變化的病毒抹的累積，其中所述的細(xì)微遺傳性變化主要是HA和NA蛋白中的氨基酸置換。由病毒編碼的RNA依賴性RNA聚合酶復(fù)合體進(jìn)行的曱型流感病毒核酸復(fù)制是相對(duì)易出錯(cuò)的，并且RNA基因組中的這些點(diǎn)突變(每個(gè)復(fù)制循環(huán)-l/104)是漂變的主要遺傳性變異源。選擇作用有利于具有涉及HA和NA蛋白的抗原轉(zhuǎn)變和漂移的人曱型流感病毒毒林，因?yàn)檫@些毒林能夠逃避來(lái)自先前感染和接種的中和抗體。這種選擇作用造成辛亞型(轉(zhuǎn)變)或相同病毒亞型(漂移)的病毒性再感染?？乖D(zhuǎn)變?cè)斐啥兰o(jì)三次主要曱型流感病毒大流行，包括1918H1N1(西班牙流感)、1957H2N2(亞洲流感)和1968H3N2(香港流感)暴發(fā)?？乖剖橇鞲辛餍械哪甓忍卣?。這還解釋了基于中和抗體的曱型流感病毒接種效力降低對(duì)于特定亞型，若接種中所用的HA蛋白的氨基酸序列不匹配流行期間遭遇的HA蛋白的氨基酸序列，抗體中和作用可能是無(wú)效的。組織嗜性的決定子甲型流感病毒HA對(duì)宿主細(xì)胞表面上整合型糖蛋白或糖脂的結(jié)合特異性似乎是特定曱型流感病毒亞型是否可以感染人的關(guān)鍵決定因素。禽流感病毒，如H5N1亞型，偏好性地結(jié)合至細(xì)胞表面受體，其中所述的細(xì)胞表面受體由與糖蛋白或糖脂的倒數(shù)第二個(gè)半乳糖殘基以2-3連接(NeurAc(a2-3)Gal)的末端唾液酸組成。相反，人系病毒，包括從1918年、1957年和1968年大流行早期分離的人系病毒，結(jié)合至其中這些末端唾液酸-半乳糖殘基具有2-6連接(NeurAc(a2-6)Gal)的受體。鳥(niǎo)和人的呼吸道上皮分別主要表達(dá)具有唾液酸的2-3連接和2-6連接的曱型流感病毒受體。載體啟動(dòng)子和表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明包括并入一個(gè)或多個(gè)在本文中所述核酸序列的重組構(gòu)建體。此類構(gòu)建體任選地包括其中已經(jīng)以正方向或反方向插入例如包含禽H5框架或其亞序列等的本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列的載體，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)等，其中所述的多核苷酸序列例如包含禽H5框架，所述的禽H5框架包含了改變?nèi)绫疚闹兴鍪荏w特異性的至少一種突變。例如，插入的核酸可以包含病毒染色體序列或cDNA，所述的病毒染色體序列或cDNA包括本發(fā)明的至少一種多核苷酸序列的全部或部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述構(gòu)建體還包含與所述序列有效連接的調(diào)節(jié)序列，包括例如啟動(dòng)子。種類眾多的合適載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且是市售的。可以在適于產(chǎn)生有義或反義RNA和任選地產(chǎn)生多肽(或肽)表達(dá)產(chǎn)物(例如本發(fā)明的血凝素分子或其片段)的多種載體之任一者中包含本發(fā)明的多核苷酸。此類載體載體包括染色體、非染色體和合成性DNA序列，例如SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA;桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；從質(zhì)粒與噬菌體DNA的組合中衍生的載體、病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒、腺病毒、腺聯(lián)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和眾多其它載體(例如pCMV/R)(Barouch等2005病毒學(xué)雜志(JVirol)79:8828-8834)?？梢允褂媚軌?qū)⑦z傳材料導(dǎo)入細(xì)胞并且若需要復(fù)制則可在相關(guān)宿主內(nèi)復(fù)制的任意載體。在表達(dá)載體中，目的HA多核苷酸序列以物理方式在距離和方向上與合適轉(zhuǎn)錄控制序列(例如啟動(dòng)子和任選地一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子,)排列以指導(dǎo)mRNA合成。也就是說(shuō)，目的多核苷酸序列有效地與適宜的轉(zhuǎn)錄控制序列連接。此類啟動(dòng)子的實(shí)例包括LTR或SV40啟動(dòng)子、大腸桿菌lac或trp啟動(dòng)子、噬菌體XPj^啟動(dòng)子和已知可控制基因在原核或真核細(xì)或其病毒中表達(dá)的其它啟動(dòng)子。多種啟動(dòng)子適用于表達(dá)載體中以調(diào)節(jié)流感病毒基因組節(jié),爻序列的轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方式中，使用細(xì)胞巨化病毒(CMV)DNA依賴性RNA聚合酶II(PolII)啟動(dòng)子。根據(jù)需要，例如為調(diào)節(jié)條件表達(dá)，可以取代以在指定條件下或在指定組織或細(xì)胞中誘導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄的其它啟動(dòng)子。眾多病毒啟動(dòng)子和哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子例如人啟動(dòng)子，是可獲得的或可以根據(jù)構(gòu)思的具體應(yīng)用加以分離。例如，從動(dòng)物和人病毒的基因組中獲得的備選啟動(dòng)子包括此類啟動(dòng)子，如腺病毒(如腺病毒2)、乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、多瘤病毒和猴病毒40(SV40)以及多種逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括其中所屬的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子等。轉(zhuǎn)錄任選地通過(guò)包含增強(qiáng)子序列而增加。增強(qiáng)子一般是同啟動(dòng)子協(xié)調(diào)發(fā)揮作用以增加轉(zhuǎn)錄的短的(例如10-500bp)、順式作用DNA元件。眾多增強(qiáng)子序列已經(jīng)從哺乳動(dòng)物基因(血紅蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰島素)和真核細(xì)胞,病毒中分離。增強(qiáng)子可以被剪接至載體內(nèi)位于異源性編碼序列的5'或3'，但是通常插入啟動(dòng)子的5'部位。通常，選擇啟動(dòng)子和根據(jù)需要選擇額外的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列以優(yōu)化在待導(dǎo)入所述異源性DNA的宿主細(xì)胞類型中的表達(dá)。任選地，所述擴(kuò)增子也可以含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。本發(fā)明的載體也有利地包含終止轉(zhuǎn)錄和為穩(wěn)定mRNA所必需的序列，如聚腺苷酸化位點(diǎn)或終止子序列。此類序列通?？蓮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA的3'非翻譯區(qū)及偶爾5'非翻譯區(qū)獲得。在一個(gè)實(shí)施方式中，牛生長(zhǎng)激素終止子可以提供聚腺苷酸化信號(hào)序列。此外，如上所述，所述表達(dá)載體任選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因以提供用于選擇已轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型性狀，除了先前所列的基因之外，標(biāo)記如如二氫葉酸還原酶或卡那霉素抗性適用于真核細(xì)胞培養(yǎng)中的選擇。含有如上所述適宜核酸序列以及適宜啟動(dòng)子或控制序列的載體可以用來(lái)轉(zhuǎn)化可允許所述蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主細(xì)胞。盡管本發(fā)明的載體可以在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制，然而常常需要將它們導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、COS細(xì)胞，或用于表達(dá)目的的其它細(xì)胞等。額外表達(dá)元件最常見(jiàn)地，編碼流感病毒HA蛋白的基因組節(jié)段包括對(duì)其表達(dá)(包括翻譯成功能性病毒蛋白)必需的任意額外序列。在其它情況下，可以使用編碼病毒蛋白例如HA蛋白的微型基因或其它人工構(gòu)建體。在如此情況下，再次地，常常需要包含輔助所述異源性編碼序列高效翻譯的特定起始信號(hào)。這些信號(hào)可以包括例如ATG起始密碼子及鄰近序列。為確保完整插入物的翻譯，將起始密碼子相對(duì)于病毒蛋白插在正確的開(kāi)放閱讀框內(nèi)。外源性轉(zhuǎn)錄性元件和起始密碼子可以具有多種來(lái)源，無(wú)論是天然的或合成的。表達(dá)效率可以通過(guò)包含適宜于所用細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子予以增強(qiáng)。根據(jù)需要，編碼額外表達(dá)的元件如信號(hào)序列、分泌或定位序列等的多核苷酸序列可以并入載體，通常符合于目的多核苷酸的開(kāi)放閱讀框，例如其目的是將多肽表達(dá)靶向所需的細(xì)胞區(qū)室或細(xì)胞器或指導(dǎo)多肽分泌至周質(zhì)間隙或進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)基。此類序列是技術(shù)人員已知的，并且包括分泌前導(dǎo)肽、細(xì)胞器定向序列(例如核定位序列、ER停留信號(hào)、線粒體轉(zhuǎn)移序列)、膜定位/錨定序列(例如終止轉(zhuǎn)運(yùn)序列、GPI錨定序列)等。在需要翻譯由本發(fā)明核酸序列編碼的多肽時(shí)，額外的特異性翻譯起始信號(hào)可以改善翻譯效率。這些信號(hào)可以包括例如ATG起始密碼子和鄰近序列、IRES區(qū)等。在一些情況下，例如，將包含編碼序列的全長(zhǎng)cDNA分子或染色體節(jié)段、翻譯起始密碼子和相關(guān)序列元件插入同時(shí)具有目的多核苷酸序列的適宜表達(dá)載體，其中所述的編碼序列并入例如本發(fā)明的多核香酸序列(例如在本文的序列中)。在這類情況下，往往不需要額外的翻譯控制信號(hào)。然而在其中僅插入多肽編碼序列或其部分的情況下，經(jīng)常提供例如包括ATG起始密碼子在內(nèi)的外源性翻譯控制信號(hào)以表勤目關(guān)序列。所述起始密碼子置于正確的開(kāi)放閱讀框中以確保目的多核苦酸序列的轉(zhuǎn)錄。外源性轉(zhuǎn)錄性元件和起始密碼子可以具有多種來(lái)源，無(wú)論是天然的或合成的。表達(dá)效率可以通過(guò)包含適宜于所用細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子予以增強(qiáng)。細(xì)胞培養(yǎng)和表達(dá)宿主本發(fā)明也涉及以本發(fā)明載體導(dǎo)入(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)的宿主細(xì)胞并涉及通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。宿主細(xì)胞用載體如本發(fā)明的表達(dá)載體進(jìn)行基因改造(即轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)。如上所述，所述載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。適宜表達(dá)宿主的實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌(Streptomyce)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium);真菌細(xì)胞如酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴#々德、畢赤酵母(Pichiapastoris)和鏈孑包霉(Neurosporacrassa);或昆蟲(chóng)纟田月包i口果蟲(chóng)龜(Drosophila)和草i也貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)。通常使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)本發(fā)明的HA分子。用于復(fù)制本文中HA序列的合適宿主細(xì)胞包括例如Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞和COS細(xì)胞、包括ing293T細(xì)胞、COS7細(xì)胞等。細(xì)胞一般在補(bǔ)充有血清(例如10%胎牛血清)的標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)培養(yǎng)基如Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基或無(wú)血清培養(yǎng)基中，在適用于維持中性緩沖pH(在7.0-7.2之間的pH上)的受控濕度和C02濃度下培養(yǎng)，任選地，所述培養(yǎng)基含有防止細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素(例如青霉素、鏈霉素等)和/或額外的營(yíng)養(yǎng)物(如L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸)、促進(jìn)有利的生長(zhǎng)特征的額外補(bǔ)充物，例如胰蛋白酶、P-巰基乙醇等。工程化的宿主細(xì)胞可以在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中所述的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基根據(jù)需要進(jìn)行改良以激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增所插入的多核苷S^f列。培養(yǎng)條件如溫度、pH等一般是先前隨所選用于表達(dá)的特定宿主細(xì)胞使用員而言和在本文中引用的參考文獻(xiàn)中是顯而易見(jiàn)的，所述的參考文獻(xiàn)Sambrook等，《分子克,隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)第三版》(MolecularCloning-ALaboratoryManual(3rdEd.))，第1-3巻，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpringHarborLaboratory),冷泉港(ColdSpringHarbor)，紐約(NewYork)，2001("Sambrook")和F.M.Ausubel等編輯《分子生物學(xué)最新方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),才各4木出片反十辦會(huì)公司(GreenePublishingAssociates,Inc.)和約翰威利國(guó)際出版公司(JohnWiley&Sons,Inc.)間的合資公司CurrentProtocols("Ausubel")。此外，此類方法中適應(yīng)于本發(fā)明的變體通過(guò)例行實(shí)驗(yàn)可輕易確定并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以使用眾多的表達(dá)系統(tǒng)如基于病毒的系統(tǒng)。在其中使用腺病毒作為表達(dá)載體的情況下，編碼序列任選地連接至由晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)體前導(dǎo)序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合體。在該病毒基因組的非必需性El或E3區(qū)內(nèi)的插入將產(chǎn)生能夠在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)目的多肽的活病毒。此外，可以使用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子如羅氏肉瘤病毒(RSV)增強(qiáng)子，來(lái)提高在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。任選地因其調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以想要的方式加工所表達(dá)蛋白質(zhì)的能力而選擇宿主細(xì)胞抹。對(duì)蛋白質(zhì)的此類修飾包括，但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂化和?；?。將蛋白質(zhì)的前體形式切割至成熟形式的翻譯后加工有時(shí)對(duì)于正確插入、折疊和/或功能是重要的。此外，在宿主細(xì)胞中的正確定位(例如在細(xì)胞表面上)也是重要的。不同宿主細(xì)胞如COS、CHO、BHK、MDCK、293、293T、COS7等具有特定細(xì)胞裝置和特征性機(jī)制用于此類后加工活性，并且可以進(jìn)行選擇以確保當(dāng)前導(dǎo)入的外來(lái)蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。任選地，使用穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)以長(zhǎng)期高率地產(chǎn)生重組蛋白，其中所述的重組蛋白由本發(fā)明的多核苷酸編碼或具有由所述多核苦酸序列編碼的亞序列。例如，穩(wěn)定表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞系使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)或內(nèi)源表達(dá)元件以及選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。例如，在導(dǎo)入載體后，使細(xì)胞在豐富培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2日，隨后將它們轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基內(nèi)。選擇性標(biāo)記的目的是賦予選擇抗性，并且選擇標(biāo)記的存在允許培育及回收成功表達(dá)所導(dǎo)入序列的細(xì)胞。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(例如從單一細(xì)胞類型衍生)的抗性團(tuán)簇可以使用適于所述細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)^t支術(shù)增殖。用編碼本發(fā)明多肽的核香酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞任選地在適于表達(dá)并從細(xì)胞培養(yǎng)中回收所編碼蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)?？梢苑诌x、分離和/或純化表達(dá)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞。由重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或其片段可以是分泌的、膜結(jié)合的或在細(xì)胞內(nèi)停留，這取決于所用的序列(例如取決于編碼膜停留信號(hào)或其它等的融合蛋白)和/或載體。對(duì)應(yīng)于本發(fā)明核酸的表達(dá)產(chǎn)物也可以在非動(dòng)物細(xì)胞如植物、酵母、真菌、細(xì)菌等中產(chǎn)生。參考上述的Sarnbrook和Ausubel。在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)所表達(dá)產(chǎn)物的預(yù)期用途，可以選擇多種表達(dá)載體。例如，當(dāng)需要大量多肽或其片段以產(chǎn)生抗體時(shí)，有利地使用指導(dǎo)可輕易純化的融合蛋白高水平表達(dá)的載體。此類載體包括，但不限于多功能大腸桿菌克隆及表達(dá)載體，如BLUESCRIPT(美國(guó)斯特瑞塔基因(Stmtagene));pIN載體；pET載體等，其中在所述BLUESCRIPT內(nèi)的目的編碼序列(例如包含本文中找到的那些序列等的序列)可以連接至該載體內(nèi)與用于氨基端翻譯的序列處于同一個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中所述的氨基端翻譯始自曱硫氨酸和P-半乳糖苷酶的后續(xù)7個(gè)殘基，從而產(chǎn)生具有催化活性的(3半乳糖苷酶融合蛋白。類似地，在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如a因子、醇核酸雜交可以使用比較雜交法來(lái)鑒定本發(fā)明的核酸，包括本發(fā)明核酸的保守性變異。這種比較雜交法是區(qū)別本發(fā)明核酸的優(yōu)選方法。此外，在高、超高和超超高嚴(yán)格性條件下與由序列代表的核酸雜交的靶核酸是本發(fā)明的特征。此類核酸的實(shí)例包括與給定核酸序列相比具有一個(gè)或數(shù)個(gè)沉默性或保守性核酸置換的那些核酸。聲稱試驗(yàn)輩巴核酸與探針核酸特異性雜交，此時(shí)所述靶核酸如雜交至完全匹配性互補(bǔ)靶那樣，以如此信噪比與所述探針充分雜交至少50%,其中所述的信噪比是所述探針在這樣的條件下與所述靶雜交時(shí)的信噪比的至少一半，其中在所述的條件下前述完全匹配性探針以這樣的信噪比與所述完全匹配性互補(bǔ)靶結(jié)合，該信噪比是對(duì)雜交至任意非匹配性靶核酸時(shí)所觀察到的信噪比的至少約5倍-10倍。核酸在其結(jié)合時(shí)通常在溶液中"雜交"。核酸因多種充分表征的物理化學(xué)力如氫鍵結(jié)合作用、溶劑排斥作用、堿基推疊作用等雜交。用于核酸雜交的多種方法是本領(lǐng)域眾所周知的。在上述的Sambrook和Ausubel中存在針對(duì)核酸雜交的一般指導(dǎo)。用于具有100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)性核酸在DNA印跡法或RNA印跡法中的濾膜上雜交的嚴(yán)格雜交條件實(shí)例是在42。C于含有1mg肝素的50%福爾馬林內(nèi)過(guò)夜實(shí)施雜交。嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例包括用0.2xSSC在65'C洗滌15分鐘。低嚴(yán)格性洗滌往往先于高嚴(yán)格性洗滌以出去背景探測(cè)信號(hào)。低嚴(yán)格性洗滌的實(shí)例是2xSSC在4(TC持續(xù)15分鐘。通常，在特定雜交測(cè)定法中比對(duì)于不相關(guān)探針?biāo)^察到的信噪比高5倍(或更高)的信噪比表示^r測(cè)到特異性雜交。在雜交后，不雜交的核酸可以通過(guò)一系列洗液去除，所述洗液的嚴(yán)格性可以根據(jù)想要的結(jié)果進(jìn)行調(diào)節(jié)。低嚴(yán)格性洗滌條件(例如使用更高的鹽濃度和更低的溫度)提高敏感性，但可以產(chǎn)生非特異性雜交信號(hào)和高背景信號(hào)。更高的嚴(yán)格性條件(例如使用更低的鹽濃度和與Tm更接近的更高溫度)降低所述背景信號(hào)，而一般主要留下特異性信號(hào)。"嚴(yán)格性雜交洗滌條件"在核酸雜交實(shí)驗(yàn)如DNA印跡雜交和RNA印跡雜交的上下文中是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。嚴(yán)格性雜交條件和洗滌條件可以對(duì)任意試驗(yàn)核酸以實(shí)驗(yàn)方式容易地確定。例如，在確定高度嚴(yán)格性雜交條件和洗滌條件中，逐步提高雜交條件和洗滌條件(例如在雜交或洗滌中通過(guò)提高溫度、降低鹽濃度、提高去垢劑濃度和/或提高有機(jī)溶劑(如福爾馬林)的濃度)，直至滿足所選的一組標(biāo)準(zhǔn)。例如，逐步提高雜交條件和洗滌條件直至探針以這樣的信噪比與完全匹配性互補(bǔ)靶結(jié)合，其中所述的信噪比是對(duì)前述探針雜交至非匹配性靶時(shí)所觀察到的信噪比的至少5倍。通常，在特定雜交測(cè)定法中比對(duì)于不相關(guān)探針?biāo)^察到的信噪比高至少2倍(或更高，例如至少5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多倍)的信噪比表示檢測(cè)到特異性雜交。在本發(fā)明的上下文中檢測(cè)到兩個(gè)序列之間的至少嚴(yán)格性雜交表示與例如本發(fā)明核酸的相對(duì)強(qiáng)的結(jié)構(gòu)相似性。選擇"極嚴(yán)格，，條件以等同于特定探針的解鏈溫度(Tm)。Tm是(在定義的離子強(qiáng)度和pH下)50%試驗(yàn)序列與完全匹配性探針雜交的溫度。出于本發(fā)明的目的，通常，選擇"高度嚴(yán)格"雜交條件和洗滌條件以低于所述具體序列在定義的離子強(qiáng)度和pH上(如下文所述，高度嚴(yán)格性條件也可以以比較性術(shù)語(yǔ)提及)的Tm約5°C?？梢栽趪?yán)格條件或高度嚴(yán)格性條件下鑒定與目的核苷酸序列(例如"探針")密切相關(guān)或相同的靶序列。更低嚴(yán)格性條件適用于互補(bǔ)性較低的序列。"超高嚴(yán)格性"雜交條件和洗滌條件是這樣的條件，其中提高雜交條件和雜交至任意非匹配性靶核酸時(shí)所觀察到M/信噪比的至少10倍。將此類條件下以這樣的信噪比與探針雜交的靶核酸稱作在超高嚴(yán)格性條件下與所述探針雜交，其中所迷的信噪比是完全匹配性互補(bǔ)靶核酸的信噪比的至少50%。在嚴(yán)格性或高度嚴(yán)格性雜交(或甚至更嚴(yán)格性雜交)條件和洗滌條件中，逐步提高雜交條件和洗滌條件(例如在雜交或洗滌中通過(guò)提高溫度、降低鹽濃度、提高去垢劑濃度和/或提高有機(jī)溶劑(如福爾馬林)的濃度)，直至滿足所選的一組標(biāo)準(zhǔn)。例如，根據(jù)需要，逐步提高雜交條件和洗滌條件，直至包含本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列(例如選自本文所給出那些多核苷酸序列的序列或亞序列和/或其互補(bǔ)性多核苷酸序列)的探針以這樣的信噪比與完全匹配性互補(bǔ)耙(再次，所述的耙是包含一種或多種核酸序列或選自本文所給出那些多核苷酸序列中的亞序列和/或其互補(bǔ)性多核苷酸序列)結(jié)合，其中所述的信噪比是對(duì)前述探針雜交至非匹配性靶(例如包含選自在提交時(shí)于公共數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank內(nèi)存在的已知流感病毒序列當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)序列或亞序列的多核苷酸序列，和/或其互補(bǔ)性多核苷酸序列)時(shí)所觀察到的信噪比的至少2倍(和任選5倍、10倍、100倍或更多倍)。類似地，甚至更高水平的嚴(yán)格性可以通過(guò)逐步提高相關(guān)性雜交測(cè)定法的雜交條件和/或洗滌條件而確定，例如這樣的雜交測(cè)定法，其中提高雜交條件和洗滌條件的嚴(yán)格性，直至揮:針與完全匹配性互補(bǔ)靶核酸結(jié)合的信噪是對(duì)雜交至任意非匹配性把核酸時(shí)所觀察到的信噪比的至少至少10倍、20倍、50倍、100倍，或500倍或更多倍。具體的信號(hào)將取決于相關(guān)性測(cè)定法中所用的標(biāo)記物，例如熒光標(biāo)記物、比色標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物等。將此類條件下以這樣的信噪比與探針雜交的靶核酸稱作在超超高嚴(yán)格性條件下與所述探針雜交，其中所述的信噪比是完全匹配性互補(bǔ)靶核酸的信噪比的至少二分之一。目的生物分子的克隆、誘變和表達(dá)適用于本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)如克隆\突變\細(xì)胞培養(yǎng)等的通用教材描述包括上文的Sambrook和Ausubel。這些教材描述誘變、載體用途、啟動(dòng)子和例如涉及產(chǎn)生HA分子等的眾多其它相關(guān)主題。在本發(fā)明中任選使用多種類型的誘變，例如旨在產(chǎn)生和/或分離例如新的或新分離的HA分子和/或旨在進(jìn)一步修飾/突變本發(fā)明的多肽(例如HA分子)。所述誘變包括但不限于位點(diǎn)定向誘變、隨機(jī)點(diǎn)突變、使用含尿嗜啶的模板的誘變、寡核苷酸定向誘變、硫代磷酸酯修飾的修飾的DNA誘變、使用帶缺口的雙鏈體DNA的誘變等。其它合適的方法包括點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、使用修復(fù)缺陷型宿主菌抹的誘變、限制作用-選擇作用和限制作用-純化作用、缺失誘變、通過(guò)基因總合成的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)等。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過(guò)天然存在分子或改變或突變的天然存在分子的已知信息例如序列、序列比較結(jié)果、物理屬性、晶體結(jié)構(gòu)等指導(dǎo)誘變。寡核苦酸，例如用于本發(fā)明誘變(例如致本發(fā)明HA分子突變或改變本發(fā)明HA分子的誘變)中的寡核苷酸,如Needham-VanDevanter等在1984《核酸研究》(NucleicAcidsRes)12:6159-6168中所述，一般根據(jù)Beaucage和Caruthers1981四面體快報(bào)(TetrahedronLetts)22:1859-1862描述的固相亞磷酰胺三酯方法，例如使用自動(dòng)合成儀化學(xué)地合成。此外，基本上任意的核酸可以從任意的多種商業(yè)來(lái)源自行訂購(gòu)或以標(biāo)準(zhǔn)方式訂購(gòu)。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的HA分子或其它多肽和/或核酸或在多種載體等當(dāng)中的此類HA或其它序列的宿主細(xì)胞和生物。宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體進(jìn)行基因改造(例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)，所述載體例如可以是克隆載體或表達(dá)載體。所述載體可以例如處于質(zhì)粒、細(xì)菌、病毒、棵多核苷酸或綴合的多核苷酸形式。載體通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法導(dǎo)入細(xì)胞和/或微生物，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括電穿孔法、病毒載體感染法、在小珠或顆粒的基質(zhì)內(nèi)部或表面攜帶核酸的小顆粒高速射彈穿透法。上述的Sambrook和Ausubel提供了多種適宜的轉(zhuǎn)化方法。幾種將靶核酸導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的熟知方法是可獲得的，其中任意者可以在本發(fā)明中使用。這些方法包括受者細(xì)胞與含有DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合法、電穿孔法、拋射體轟擊法和病毒載體感染法等。細(xì)菌細(xì)胞可以用來(lái)放大含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的質(zhì)粒數(shù)目。所述細(xì)菌培育致對(duì)數(shù)期并且該細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法(例如參見(jiàn)Sambrook)分。此外，用于從細(xì)菌中純化質(zhì)粒的多種試劑盒是市售的。隨后進(jìn)一步操作分離和純化的質(zhì)粒以產(chǎn)生其它質(zhì)粒，后者用來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞或引入相關(guān)載體以感染生物。常見(jiàn)載體含有轉(zhuǎn)錄及翻譯終止子、，轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列和用于調(diào)節(jié)特定靶核酸表達(dá)的啟動(dòng)子。所述載體任選地包含類屬性表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有至少一個(gè)獨(dú)立的終止子序列、允許該表達(dá)盒在真核生物或原核生物或者兩類生物中復(fù)制的序列(例如穿梭載體)和用于原核及真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。載體適用于在原核生物或真核生物或者優(yōu)選這兩類生物中復(fù)制和整合。見(jiàn)，Sambrook和Ausubel(上文)。例如在互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址ATCC.org處，提供用于克隆的細(xì)菌和噬菌體目錄。用于測(cè)序、克隆的其它基礎(chǔ)方法和分子生物學(xué)其它方面以及基礎(chǔ)性理論考慮也存在于Watson等(1992)重組D萌Re隱bi腿tDNA)第二版科學(xué)美國(guó)出版社(ScientificAmericanBooks),紐約(NY)。多肽的產(chǎn)生和回收在一些實(shí)施方式中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞系或菌抹并且將所述宿主細(xì)胞培育至適宜細(xì)胞密度后，所選擇的啟動(dòng)子通過(guò)合適方法(例如溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)并且將細(xì)胞培養(yǎng)額外一段時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，隨后從培養(yǎng)基中回收分泌型多肽產(chǎn)物，例如作為分泌型融合蛋白形式的HA多肽等?；蛘?，細(xì)胞可以通過(guò)離心法收獲、通過(guò)物理或化學(xué)方法破碎，并且留下所得的粗提物用于進(jìn)一步純化。用于表達(dá)蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞或微生物細(xì)胞可以由任意的常規(guī)方法破碎，所述的常規(guī)方法凍融循環(huán)法、超聲波處理法、機(jī)械破碎法或使用細(xì)胞裂解劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法。此外，表達(dá)本發(fā)明HA多肽產(chǎn)物的細(xì)胞可以在不從細(xì)胞中分離所述多肽的情況下使用。在這種情況下，本發(fā)明檢驗(yàn)(例如因具有HA分子或其片段，例如包括融合蛋白或其它等)。此類細(xì)胞也是本發(fā)明的特征。表達(dá)的多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的眾多方法之任意者從重組細(xì)胞培養(yǎng)中回收和純化，所述方法包括硫S交銨或乙醇沉淀法、酸提取法、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析(例如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意標(biāo)簽系統(tǒng))、羥基磷灰石層析和凝集素層析。蛋白質(zhì)再折疊步驟可以根據(jù)需要在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)象中使用。高效液相色譜層析(HPLC)也可以在最終純化步驟中使用?；蛘?，可以使用無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生包含本發(fā)明氨基酸序列或亞序列的多肽。眾多合適的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)是市售的。體外轉(zhuǎn)錄和翻譯方法的一般指南存在于Tymms(1995)分子生物學(xué)方法第37巻體外轉(zhuǎn)錄和翻譯操作(InvitroTranscriptionandTranslation'Protocols:MethodsinMolecularBiologyVolume37),花環(huán)出版社(GarlandPublishing),紐約(NY)。此外，多肽或其亞序列(例如包含抗原肽的亞序列)可以手工方式產(chǎn)生或通過(guò)使用自動(dòng)化系統(tǒng)，使用固相合成技術(shù)通過(guò)直接肽合成法產(chǎn)生(見(jiàn),MerrifieldJ1963美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(JAmChemSoc)85:2149-2154)。示例性自動(dòng)化系統(tǒng)包括應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems')431A肽合成儀(珀金埃爾默(PerkinElmer),福斯特市(FosterCity),加利福尼亞(CA))。根據(jù)需要，亞序列可以單獨(dú)修飾的氨基酸本發(fā)明表達(dá)的多肽可以含有一個(gè)或多個(gè)修飾的氨基酸。存在修飾的氨基酸可能是有利的，例如在于(a)增加多肽的血清半壽期、(b)降低/增加多肽的抗原性、(c)提高多肽的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性等。氨基酸在重組產(chǎn)生期間例如以共翻譯或翻譯后方式受到修飾(例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞期間在N-X-S/T基序處的N-連接糖基化)或通過(guò)人工方法修飾(例如通過(guò)PEG化)。修飾的氨基酸的非限制性實(shí)例包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、異戊烯化(例如法尼基化、雜牛兒基維牛兒基化)氨基酸、乙?；被?、酰化氨基酸、PEG化氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸等，以及通過(guò)與例如脂質(zhì)部分或其它有機(jī)衍生化劑綴合加以修飾的一元酸。足以指導(dǎo)修飾氨基酸的參考文獻(xiàn)見(jiàn)于諸多文獻(xiàn)。實(shí)例方法存在于Walker(1998)光盤(pán)版《蛋白質(zhì)方法》(蛋白質(zhì)ProtocolsonCD-ROM)人類出版社(HumanPress)，妥華達(dá)Towata,新澤西(NJ)。融合蛋白本發(fā)明也提供融合蛋白，其包含本發(fā)明(例如編碼HA多肽)的序列或其片段與例如免疫球蛋白(或其部分)、編碼例如GFP(綠色熒光蛋白)或其它類似標(biāo)記的序列等的融合物。編碼此類融合蛋白的核苷^f列是本發(fā)明的另一個(gè)方面。本發(fā)明的融合蛋白任選用于例如與本發(fā)明的非融合蛋白相似的應(yīng)用(包括如本文中所述的例如治療性、預(yù)防性、診斷性、實(shí)驗(yàn)性等應(yīng)用)。除了與免疫球蛋白序列和標(biāo)記序列融合之外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還任選地例如與將所述融合蛋白靶向特定細(xì)胞類型、區(qū)域等的序列融合?？贵w本發(fā)明的多肽可以用來(lái)產(chǎn)生對(duì)本文中所給出多肽或由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽具有特異性的抗體，如本文中所示的那些抗體，及其保守性變體。對(duì)上述多肽特異的抗體例如用于診斷性和治療性目的，例如涉及靶多肽的活性、分布和表達(dá)。例如，此類抗體可以任選地用來(lái)在與本文HA序列相同的毒抹中定義其它病毒。對(duì)本發(fā)明多肽特異的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法產(chǎn)生。此類抗體可以包括，但不限于多克隆、單克隆、嵌合、人源化、單鏈、Fab片段和由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段。對(duì)于產(chǎn)生抗體而言多肽不需要具有生物學(xué)活性(例如不需要全長(zhǎng)有功能的血凝素)。然而，多肽或寡肽必須是抗原肽。用來(lái)誘導(dǎo)特異性抗體的肽一般具有含至少約4個(gè)氨基酸且往往含至少5個(gè)或10個(gè)氨基酸的氨基酸序列。多肽短段可以與另一種蛋白質(zhì)(如匙孔血藍(lán)蛋白)和針對(duì)所述嵌合分子產(chǎn)生的抗體融合。用于產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體眾多多方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，和可以加以調(diào)整以產(chǎn)生對(duì)本發(fā)明的和/或本發(fā)明多核苦酸序列編碼的多肽具有特異性的抗體。見(jiàn)，例如Harlow和Lane(1988)《抗體實(shí)'瞼手冊(cè)》(Antibodies:ALaboratoryManual)冷泉港出版社，紐約(ColdSpringHarborPress,NY);和Kohler及Milstein(1975)自然(Nature)256:495-497。用于抗體制備的其它適用技術(shù)包括選擇噬菌體或相似載體中的重組抗體文庫(kù)。見(jiàn)，Huse等1989科學(xué)(Science)246:1275-1281;和Ward,等1989自然(Nature)341:544-546。特異性單克隆和多克隆抗體以及抗血清通常將以例如至少約O，l|lM、至少約0.01fiM或更佳并且一般至少約0.001或更佳的KD結(jié)合。對(duì)于特定治療性應(yīng)用，需要人源化抗體。用于制備嵌合(人源化)抗體的詳細(xì)方法可以在美國(guó)專利5,482,856中找到。關(guān)于人源化和其它抗體產(chǎn)生法的額外細(xì)節(jié)以及工程化技術(shù)可以在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中找到。通過(guò)免疫反應(yīng)性定義多肽因?yàn)楸景l(fā)明的多肽提供多種新多肽序列(例如包含HA分子，)，故所述多肽也產(chǎn)生可以識(shí)別、例如在免疫學(xué)測(cè)定中可識(shí)別的新結(jié)構(gòu)特征。產(chǎn)生特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗血清和由此類抗血清結(jié)合的多肽是本發(fā)明的特征。例如，本發(fā)明包括特異性地結(jié)合于或特異性地與抗體或抗血清發(fā)生免疫反應(yīng)的多肽(例如HA分子)，所述的抗體或抗血清針對(duì)包含選自本文所給出一個(gè)或多個(gè)序列中的氨基酸序列等的免疫原產(chǎn)生。為消除與其它同系物的交叉反應(yīng)性，以提交時(shí)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的HA分子如"對(duì)照"多肽扣減所述抗體或抗血清。在其余對(duì)照序列對(duì)應(yīng)于核酸的情況下，產(chǎn)生由該核酸編碼的多肽并用于抗體/抗血清扣減目的。在一種常見(jiàn)形式下，所述免疫測(cè)定法使用了針對(duì)一種或多種多肽所產(chǎn)生的多克隆抗血清，其中所述的多肽包含與本文序列等相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)序列或其絕大部分亞序列(即所提供全長(zhǎng)序列的至少約30。/。)。得自本發(fā)明序列的成套多種多肽免疫原在下文中整體地稱作"免疫原性多肽"。任選地選擇所得抗血清以與對(duì)照血凝素類似物具有低交叉反應(yīng)性，并且任何此類交叉反應(yīng)性在所述免疫測(cè)定法中使用多克隆抗血清之前例如通過(guò)免疫吸附加以消除。為了產(chǎn)生用于免疫測(cè)定法中的抗血清，如本文所述產(chǎn)生并純化一種或多種所述免疫原性多肽。例如，可以在重組細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白。將小鼠近交系(在本測(cè)定法中使用，原因是結(jié)果由于小鼠的虛擬遺傳同一性而具有更多可重復(fù)性)免疫以與標(biāo)準(zhǔn)佐劑如弗氏佐劑聯(lián)合的免疫原性蛋白和小鼠標(biāo)準(zhǔn)免疫程序(對(duì)于抗體產(chǎn)生、免疫測(cè)定模式和可以用來(lái)確定特異免疫反應(yīng)性的條件的標(biāo)準(zhǔn)描述，見(jiàn)例如Harlow和Lane(1988)《抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Antibodies:ALaboratoryManual)冷泉港出版社，紐約(ColdSpringHarborPress,NewYork))。其它參考文獻(xiàn)和對(duì)抗者，從本文公開(kāi)的序列中衍生的一種或多種合成多肽或重組多肽與載體蛋白綴合并且用作免疫原。將多克隆血清收集并在免疫測(cè)定法(例如具有固定在固相支持物上的一種或多種所述免疫原性蛋白的固相免疫測(cè)定法)中針對(duì)所述免疫原性多肽進(jìn)^f亍滴定。將具有106或更高滴度的多克隆抗血清選出、匯集并用對(duì)照血凝素多肽扣減以產(chǎn)生扣減的匯集滴定的多克隆抗血清。所述扣減的匯集滴定的多克隆抗血清在比較性免疫測(cè)定法中測(cè)試針對(duì)所述對(duì)照同系物的交叉反應(yīng)性。在這種比較測(cè)定法中，對(duì)所述扣減滴定的多克隆抗血清確定區(qū)分性結(jié)合條件，所述的區(qū)分性結(jié)合條件產(chǎn)生與結(jié)合至所述對(duì)照同系物時(shí)的信噪比相比，至少約5-10倍更高的所述滴定多克隆抗血清與所述免疫原性多肽結(jié)合的信噪比。即，結(jié)合反應(yīng)的嚴(yán)格性通過(guò)添加非特異性竟?fàn)幬锶绨椎鞍谆蛎撝楹?或通過(guò)調(diào)節(jié)鹽條件、溫度和/或其它因素等進(jìn)行調(diào)節(jié)。這些結(jié)合條件在后續(xù)測(cè)定法中使用以確定試驗(yàn)多肽(與所述免疫原性多肽和/或所述對(duì)照多肽比較的多肽)是否特異性地被所述匯集的扣減多克隆抗血清結(jié)合。尤其，與對(duì)照等相比，如此試驗(yàn)多肽與所述免疫原性多肽共有明顯的結(jié)構(gòu)相似性并且因此是本發(fā)明的多肽，其中所述的試驗(yàn)多肽在區(qū)分性結(jié)合條件下顯示比對(duì)照同系物高至少2-5倍的信噪比，和與所述免疫原性多肽相比至少約1/2的信噪比。在另一個(gè)實(shí)例中，使用竟?fàn)幮越Y(jié)合模式下的免疫測(cè)定法以檢測(cè)試驗(yàn)多肽。例如，如所述，將交叉反應(yīng)性抗體用對(duì)照多肽通過(guò)免疫吸附作用從匯集的抗血清混合物中除去。所述免疫原性多肽隨后固定至固相支持物，所述固相支持物暴露于所述扣減匯集的抗血清。將試驗(yàn)蛋白添加至測(cè)定法，以竟?fàn)帉?duì)所述扣減匯集的抗血清的結(jié)合作用。所述試驗(yàn)蛋白與所述固定蛋白質(zhì)相比而竟?fàn)帉?duì)所述扣減匯集抗血清結(jié)合的能力同添加至測(cè)定法中的免疫原性多肽竟?fàn)幗Y(jié)合作用的能力進(jìn)行比較(所述免疫原性多肽有效地同固定的免疫原性多肽竟?fàn)帉?duì)匯集抗血清的結(jié)合作用)。使用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算法計(jì)算所述試驗(yàn)蛋白的交叉反應(yīng)性百分?jǐn)?shù)。在平行測(cè)定法中，與所述免疫原性多肽竟?fàn)帉?duì)所述抗血清結(jié)合的能力相比較，任選地測(cè)定所述對(duì)照蛋白質(zhì)竟?fàn)帉?duì)所述扣減匯集抗血清結(jié)合的能力。再次地，使用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算法計(jì)算所述對(duì)照多肽的交叉反應(yīng)性百分?jǐn)?shù)。在所述試驗(yàn)多肽的交叉反應(yīng)性百分?jǐn)?shù)比對(duì)照多肽高至少5-10倍并且所述試驗(yàn)多肽的結(jié)合作用大致處在所述免疫原性多肽的結(jié)合作用范圍內(nèi)時(shí)，則稱所述試驗(yàn)多肽與所述匯集扣減的抗血清特異性結(jié)合。通常，免疫吸附且匯集的抗血清可以在如本文中所述的竟?fàn)幮越Y(jié)合免疫測(cè)定法中使用以將任意試驗(yàn)多肽與所述免疫原性多肽和/或?qū)φ斩嚯谋容^。為了開(kāi)展這種比較，所述免疫原性多肽、試驗(yàn)多肽和對(duì)照多肽分別在廣泛濃度范圍內(nèi)進(jìn)行分析，并且使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定每種多肽的如此量，其是抑制所述扣減抗血清對(duì)例如固定的對(duì)照蛋白、試驗(yàn)蛋白或免疫原性蛋白的50%結(jié)合作用所需要的。若該試驗(yàn)多肽對(duì)于在所述竟?fàn)幮詼y(cè)定法中結(jié)合所需的量比所述免疫原性多肽所需的量少兩倍，則稱所述試驗(yàn)多肽特異性地與針對(duì)所述免疫原性蛋白所產(chǎn)生的抗體結(jié)合，前提是所述的量比對(duì)照多肽的量高至少約5-10倍。作為特異性的額外測(cè)定，匯集的抗血清任選地用所述免疫原性多肽(而非所述對(duì)照多肽)充分地免疫吸附，直至很少檢測(cè)到或檢測(cè)不到所得的經(jīng)免疫原性多肽扣減的匯集抗血清對(duì)免疫吸附中所用免疫原性多肽的結(jié)合作用。隨后用所述試驗(yàn)多肽測(cè)試這種充分免疫吸附的抗血清的反應(yīng)性。若觀察到很少反應(yīng)性或觀察不到反應(yīng)性(即對(duì)這種充分免疫吸附的抗血清與所述免疫原性多肽的結(jié)合作用觀察到不超過(guò)2倍的信噪比)，則所述試驗(yàn)多肽被所述免疫原性蛋白激發(fā)的抗血清特異性結(jié)合。核酸和多肽序列變體如本文中所述，本發(fā)明為核酸提供多核香S吏序列并且對(duì)多肽提供氨基酸序列，例如血凝素序列，以及例如包含所述序列的組合物和方法。所述序列的實(shí)例在本文中披露。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明實(shí)際上不限于本文中披露的那些序列并且本發(fā)明也提供具有如本文中所述功能(例如編碼HA分子)的眾多相關(guān)和不相關(guān)序列。技術(shù)人員將理解眾本發(fā)明中包括所披露序列的多種變體。例如，發(fā)明中包括所披露序列的保守性變異，其中所述的保守性變異產(chǎn)生功能相同的序列。認(rèn)為本發(fā)明中包括核酸多核苷酸序列的如此變體，其中所述變體與至少一種所披露序列雜交。本發(fā)明中也包括本文所披露序列的亞序列沉默變異因遺傳密碼子的筒并性，任選地產(chǎn)生任意的編碼本發(fā)明多肽的多種核酸序列，其中某些核酸序列可以對(duì)本文中的HA核酸序列和多肽序列具有更低水平的序列同一性。指示遺傳密碼子的密碼子表存在于多種生物學(xué)和生物化學(xué)教材中。此類密碼子表顯示多種氨基酸由多于一種密碼子編碼。例如，密碼子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU均編碼精氨酸。因此，在本發(fā)明核酸中由密碼子指定精氨酸的每個(gè)位置內(nèi)，該密碼子可以變更為任意的上文所述相應(yīng)密碼子，而不改變所編碼的多肽。應(yīng)當(dāng)理解RNA序列中的U對(duì)應(yīng)于DNA序列中的T。此類"沉默變異"是下文討論的"保守性修飾變異"的一個(gè)類型。技術(shù)人員知道核酸中的每種密碼子(通常僅作為甲硫氨酸的密碼子的ATG和通常僅作為色氨酸的密碼子的TTG例外)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)加以修飾，以編碼功能相同的多肽。因此，在任意所述序列中內(nèi)在地包括編碼多肽的核酸的每種沉默變異。因而，本發(fā)明毫無(wú)疑問(wèn)地提供編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的每種和各種可能的變異，其中可以通過(guò)選擇基于密碼子可能選項(xiàng)(包括人偏好性密碼子)的組合而產(chǎn)生所述變異。這些組合根據(jù)如適用于編碼本發(fā)明血凝素多肽的核酸序列的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)密碼子而產(chǎn)生。通過(guò)考慮與遺傳密碼子相結(jié)合的序列，具體地提供和描述本文每種核酸的全部此類變異。使用本文中的方法，技術(shù)人員完全能夠使用本文方法產(chǎn)生這些沉默型置換。保守性變異鑒于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，"沉默型置換"(即核酸序列中不導(dǎo)致所編碼多肽中變更的置換)是編碼氨基酸的本發(fā)明每種核酸序列的暗含特征。類似地，在氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸內(nèi)，"保守性氨基酸置換"以具有高度相似屬性的不同氨基酸取代，也因極其相似于披露的構(gòu)建體如本文中的那些構(gòu)建體而輕易地得以鑒定。所披露的每種序列的此類保守性變異是本發(fā)明的特征。特定核酸序列的"保守性變異"指編碼相同或基本上相同氨基酸序列的那些核酸，或在所述核酸不編碼氨基酸序列的情況下，指基本上相同的序列，見(jiàn)下表3。技術(shù)人員會(huì)知道變更、添加或缺失編碼序列中單個(gè)氨基酸或小百分比(通常小于5%，更通常小于4%、3%、2%或1%)氨基酸的各個(gè)置換、缺失或添加是"保守性修飾變異"，其中所述改變導(dǎo)致缺失氨基酸、以化學(xué)相似的氨基酸添加氨基酸或置換氨基酸。因此，本發(fā)明所列多肽序列的"保守性變異"包括以相同保守性置換組中保守性選擇的氨基酸置換多肽序列中小百分?jǐn)?shù)的、通常小于5%，更通常小于4%、3%、2%或1%的氨基酸。最終，添加不改變核酸分子編碼活性的序列如添加非功能性序列，是所述基礎(chǔ)核酸的保守性變異。表3.保守性置換組<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>序列比較、同一性和同源性術(shù)語(yǔ)"相同"或"同一性"百分?jǐn)?shù)，在兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列或多肽序列的上下文中，指這樣的兩個(gè)或更多個(gè)序列或亞序列，它們?cè)诰妥畲髮?duì)應(yīng)性進(jìn)行比較時(shí)是相同的或具有具有指定百分?jǐn)?shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸，所述的最大對(duì)應(yīng)性如使用下文所述的序列比較算法之一(或術(shù)人員可獲得的其它算法)或通過(guò)目視檢查進(jìn)行測(cè)量。短語(yǔ)"明顯相同"，在兩種核酸或多肽(例如編碼HA分子的DNA或HA分子的氨基酸序列)的上下文中，指這樣的兩個(gè)或更多個(gè)序列或亞序列，它們?cè)诰妥畲髮?duì)應(yīng)性進(jìn)行比較時(shí)具有至少約90%、優(yōu)選91%、最優(yōu)選92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更大的核苷酸或氨基酸殘基同一化生，所述的最大對(duì)應(yīng)性如使用序列比較算法或通過(guò)目視檢查進(jìn)行測(cè)量。此類"基本上相同的"序列一般^L為"同源的"，而不涉及實(shí)際的祖先。優(yōu)選地，"明顯同一性，，存在于長(zhǎng)度至少約200個(gè)殘基的氨基酸序列區(qū)域內(nèi)，更優(yōu)選地存在于于長(zhǎng)度至少約250個(gè)殘基的區(qū)域內(nèi)，并且最優(yōu)選地，所述序列在至少約300個(gè)殘基、350個(gè)殘基、400個(gè)殘基、425個(gè)殘基、450個(gè)殘基、475個(gè)殘基、480個(gè)殘基、490個(gè)殘基、495個(gè)殘基、499殘基或500殘基范圍內(nèi)是明顯相同的，或當(dāng)所述氨基酸是血凝素或血凝素片段時(shí)在兩個(gè)待比較的序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)是明顯相同的。對(duì)于序列比較和同源性確定，一個(gè)序列通常充當(dāng)試驗(yàn)序列與之比較的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，試驗(yàn)序列和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，根據(jù)需要指定名亞序列坐標(biāo)，并且指定序列算法程序參數(shù)。所述序列比較算法隨后基于指定的程序參數(shù)而計(jì)算試驗(yàn)序列相對(duì)于參考序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。對(duì)于比較的序列最佳比對(duì)可以例如通過(guò)Sm他和Waterman應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(AdvApplMath)2:482(1981)的局部同源性算法、通過(guò)Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)48:443(1970)的同源性比對(duì)算法、通過(guò)Pearson和Lipman，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)85:2444(1988)的相似性搜索方法，通過(guò)計(jì)算機(jī)執(zhí)行算法如在維斯康辛遺傳軟件包-遺傳計(jì)算機(jī)群(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup),575科學(xué)(Science)Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA或通過(guò)目視力全查進(jìn)行。適于確定序列同一性百分?jǐn)?shù)和序列相似性的一個(gè)算法實(shí)例是BLAST算法，該算法在Altschul等，分子生物學(xué)雜志(JMolBiol)215:403-410(1990)中描述。用于開(kāi)展BLAST分析的軟件可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)上在ncbi.nlm.nih.gov處的美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開(kāi)地獲得。該算法包括首先通過(guò)鑒定查詢序列中長(zhǎng)度為W的短字而確定高記分序滿足某些陽(yáng)性e-值化閾值記分T。T稱作相鄰字記分閾值。這些初始相鄰字命中充當(dāng)種子用于啟動(dòng)搜索以找到含有它們的HSP。所述的字命中隨后沿每個(gè)序列的兩個(gè)方向擴(kuò)展，只要可以提高累積比對(duì)記分。對(duì)于核苷酸序列而言，使用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分；總是X))和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)計(jì)算累積記分。對(duì)于氨基S吏序列而言，使用一種記分矩陣來(lái)計(jì)算所述累積記分。當(dāng)所述累積比對(duì)記分從已實(shí)現(xiàn)的最大值跌落達(dá)量X;所述累積比對(duì)記分因積累一個(gè)或多個(gè)負(fù)向記分的殘基比對(duì)結(jié)果而至零或以下，或抵達(dá)任何一個(gè)序列的末尾時(shí)，所述字命中在每個(gè)方向上的擴(kuò)展終止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的敏感性和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用字長(zhǎng)度(W)11、期望(E)10、截值IOO、M=5、N;4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用字長(zhǎng)度(W)3、期望(E)11和BLOSUM62記分矩陣(見(jiàn)，Henikoff和Henikoff(1989)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)89:10915)。除了計(jì)算序列同一性百分?jǐn)?shù)之外，BLAST算法還開(kāi)展兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析(見(jiàn)，例如Karlin和Altschul，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)90:5873-5787(1993))。對(duì)BLAST算法產(chǎn)生的相似性的一種度量是最小總和概率(P(N)),其提供兩個(gè)序列之間的匹配原本偶爾發(fā)生的概率說(shuō)明。例如，若試驗(yàn)核酸與所述參考核酸比較的最小總和概率小于約0.1、更優(yōu)選小于約0.01并且最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為該核酸與參考序列相似。有用序列比對(duì)算法的另一個(gè)實(shí)例是PILEUP。PILEUP使用漸進(jìn)配對(duì)比對(duì)法從一組相關(guān)序列中產(chǎn)生多重序列比對(duì)結(jié)果。它也可以繪制顯示聚類關(guān)系的樹(shù)狀圖，后者用來(lái)產(chǎn)生所述比對(duì)結(jié)果。PILEUP使用Feng和Doolittle(1987)分子進(jìn)化雜志(J.Mol.Evol.)35:351-360的漸進(jìn)比對(duì)法的簡(jiǎn)化形式。所用方法與Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-153描述的方法相似。該程序可以比對(duì)例如至多達(dá)300個(gè)最大長(zhǎng)度5000字母的序列。這種多重比對(duì)方法始于兩個(gè)最相似序列的配對(duì)比對(duì)，這產(chǎn)生兩個(gè)比對(duì)序列的簇。這種蔟隨后可以與下一個(gè)最相關(guān)的序列或比對(duì)序列的簇比較。所述序列的兩個(gè)蔟的可以通過(guò)配對(duì)比對(duì)各自兩個(gè)序列的簡(jiǎn)單延伸加以比對(duì)。最終比對(duì)通過(guò)一系列漸進(jìn)配對(duì)比對(duì)而實(shí)現(xiàn)。此程序也可以用來(lái)繪制聚類關(guān)系的樹(shù)狀圖或樹(shù)狀顯示圖。此程序通過(guò)指定特定序列和其相對(duì)于序列比較區(qū)域的氨基酸或核苷酸坐標(biāo)而運(yùn)行。適于多重DNA序列或氨基酸序列比對(duì)的額外算法實(shí)例是CLUSTALW程序(Thompson,J.D.等(1994)核酸研究(NuclAcidsRes)22:4673-4680)。CLUSTALW執(zhí)行成組序列之間的多重配對(duì)比較并且基于同源性將它們裝配成多重比對(duì)結(jié)果?？瘴婚_(kāi)口罰分和空位延伸罰分可以例如分別是10和0.05。對(duì)于氨基酸比對(duì)，可以使用BLOSUM算法作為蛋白質(zhì)加權(quán)矩陣。見(jiàn)，例如Henikoff和Henikoff(1992)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)89:10915-10919.用于預(yù)防性施用疫苗的方法和組合物通常，本發(fā)明的實(shí)施方式可以按照免疫學(xué)有效量并在適宜載體或賦形劑中預(yù)防性地施用，以刺激針對(duì)如HA序列所決定的一種或多種流感病毒毒抹為特異的免疫應(yīng)答。通常，所述載體或賦形劑是藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，如無(wú)菌水、鹽水溶液、緩沖鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或其組合。制備保證無(wú)菌、pH、等張性和穩(wěn)定性的此類溶液根據(jù)本領(lǐng)域建立的方法進(jìn)行。一般而言，選擇載體或賦形劑旨在使過(guò)敏效應(yīng)和其它不良效應(yīng)最小化，并且旨在適合特定施用途徑，例如皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)等。本發(fā)明的相關(guān)方面提供用于刺激個(gè)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。在所述方法種，免疫學(xué)有效量的本發(fā)明實(shí)施方式例如本發(fā)明的HA分子)、免疫學(xué)有效量的本發(fā)明多肽和/或免疫學(xué)有效量的本發(fā)明核酸在生理可用的載體中施用至所述個(gè)體。通常，本發(fā)明的實(shí)施方式以這樣的量施用，所述的量足以刺激針對(duì)一種或多種流感病毒毒株(即針對(duì)本發(fā)明的HA毒抹)為特異的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，施用本發(fā)明的實(shí)施方式激發(fā)了針對(duì)此類毒抹的保護(hù)性免疫應(yīng)答。用于激發(fā)針對(duì)一種或多種流感病毒毒株的保護(hù)性免疫應(yīng)答的劑量和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一般，所述劑量將基于例如年齡、身體條件、體重、性別、施用時(shí)間和其它臨床因素在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。預(yù)防性疫苗制劑以全身方式施用，例如使用針頭和注射器或無(wú)針頭注射裝置通過(guò)皮下或肌內(nèi)施用。或者，該疫苗制劑以鼻內(nèi)方式通過(guò)滴劑、大顆粒氣霧劑(大于約IO微米)或噴霧劑施用至上呼吸道。盡管上述任意送遞途徑產(chǎn)生全身性保護(hù)免疫應(yīng)答，然而鼻內(nèi)施用在流感病毒進(jìn)入部位賦予激發(fā)粘膜免疫的額外益處。盡管優(yōu)選以單次給藥刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答，不過(guò)可以通過(guò)相同或不同突途徑施用額外的劑量以實(shí)現(xiàn)想要的預(yù)防效果。在新生兒和嬰兒，例如，可以需要多次施用以激發(fā)足夠水平的免疫。施用可以在整個(gè)兒童期根據(jù)需要間隔地不斷進(jìn)行，旨在維持足夠水平的抗野生型流感感染的保護(hù)作用。類似地，特別容易遭受反復(fù)或嚴(yán)重流感感染的成人，例如護(hù)工、日間護(hù)理員、幼童的家庭成員、老年人和心肺功能不足的個(gè)體，可能需要多次兔疫以建立和/或維持保護(hù)性免疫應(yīng)答。誘導(dǎo)免疫水平可以例如通過(guò)測(cè)量中和性分泌抗體和血清抗體的量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并且根據(jù)需要調(diào)節(jié)劑量或反復(fù)接種以激發(fā)和維持所需水平的保護(hù)作用。任選地，用于預(yù)防性施用本發(fā)明實(shí)施方式的制劑也含有一種或多種佐劑以增強(qiáng)針對(duì)流感病毒抗原的免疫應(yīng)答。合適的佐劑包括弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、皂苷、礦物凝膠如氫氧化鋁,和表面活性物質(zhì)如溶血磷脂、復(fù)合多元醇(pluronicpolyol)、聚陰離子、肽、油或烴乳液、卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌(CorynebacteriumParvum)以及合成佐劑QS-21和MF59。根據(jù)需要，本發(fā)明實(shí)施方式的預(yù)防性疫苗施用可以與施用一種或多種免疫刺激分子一起進(jìn)行。免疫刺激分子包括具有免疫刺激活性、免疫沉淀活性和促炎活性的多種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13);生長(zhǎng)因子(例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)-集落刺激因子(CSF))和其它免疫刺激分子如巨噬細(xì)胞炎性因子、Flt3配體、B7.1;B7.2施用。可以施用蛋白質(zhì)(例如本發(fā)明的HA多肽)或編碼所述蛋白質(zhì)的表達(dá)載體以產(chǎn)生免疫刺激作用。上文所述的方法用于通過(guò)將本發(fā)明的載體以體外、離體或體內(nèi)方式導(dǎo)入靶細(xì)胞群而治療性和/或預(yù)防性地治療疾病或病癥，通常是流感，其中所述的載體包含編碼有治療或預(yù)防活性的HA多肽(或肽)或HARNA(例如反義RNA或核酶)的異源性多核苷酸。通常，編碼所述多肽(或肽)或RNA的目的多核苷酸有效地連接至適宜的調(diào)節(jié)序列，例如本文中所述的調(diào)節(jié)序列。任選地，多于一種異源性編碼序列并入單一載體或病毒。例如，除了編碼有治療或預(yù)防活性的HA多肽或RNA的多核香酸之外，所述載體也可以包括額外的治療性或預(yù)防性多肽，例如抗原、共刺激分子、細(xì)胞因子、抗體等和/或標(biāo)記等?？梢詫⑶軭5HA轉(zhuǎn)換成人受體特異性的突變禽病毒結(jié)合至腸道中具有a2-3連接的唾液酸糖苷，而人適應(yīng)性病毒對(duì)呼吸道中的a2-6連接呈特異性。從a2-3至a2-6受體特異性的轉(zhuǎn)變是禽病毒適應(yīng)人宿主過(guò)程中的關(guān)鍵步驟并且似乎是絕大多數(shù)禽流感病毒(包括當(dāng)前禽H5毒抹)在禽至人感染后不容易從人傳播至人的原因之一。受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)性元件，即a-螺旋(190-螺旋、HA1第190至第197位)和兩個(gè)環(huán)(130-環(huán)，HA1第135-138位和220-環(huán)，HA1第221-228位)。眾多保守殘基參與受體結(jié)合，這些殘基包括第136、l卯、193、194、216、221、222、225、226、227和228位氨基酸。因此，產(chǎn)生如此問(wèn)題，即現(xiàn)有H5病毒如何能夠使其HA適應(yīng)結(jié)合至人受體。先前研究已經(jīng)在Hl、H2和H3血清型中確定參與禽至人受體特異性轉(zhuǎn)變的眾多關(guān)鍵性受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變。例如，發(fā)現(xiàn)1918Hl可能僅通過(guò)兩個(gè)突變(D190E和D225G)而從a2-6受體特異性轉(zhuǎn)變成經(jīng)典的禽a2-3特異性。反過(guò)來(lái)，具有a2-3特異性的禽Hl病毒通過(guò)E190D和G225D突變轉(zhuǎn)變成a2-6特異性(StevensJ等2006科學(xué)(Science)312:404-410)。然而，哪種突變有可能調(diào)節(jié)H5血清型中的受體特異性不是很清楚。在本研究中，我們通過(guò)在受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中或其周圍產(chǎn)生一系列突變體以探究H5HA是否可能通過(guò)突變輕易地適應(yīng)于人而4企驗(yàn)了H5病毒的結(jié)合和進(jìn)入條件，其中已知所述的突變?cè)诟淖僅l血清型中的受體特異性。我們?cè)贖A分子中涉及受體特異性的位置處鑒定了氨基酸差異性。分析了Hl血清型和H5血清型之間的結(jié)構(gòu)差異性和遺傳差異性，因?yàn)樗鼈兯坪醣菻3HA在結(jié)構(gòu)上更密切地相關(guān)。我們的結(jié)論是在H1框架上造成禽型轉(zhuǎn)變至人型特異性的突變也可以在H5禽框架上造成特異性的轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致進(jìn)入人細(xì)胞。參考表4，本發(fā)明的實(shí)施方式是包含至少一種突變的H5禽流感框架，其中所述的突變選自由S136T、E190D、E190N、E190G、K/R193S、K/R193A、K/R193T、K/R193N、L194I、L194F、R216E、S221P、K222W、G225D、G225N、Q226R、Q226L、S227A、S227H、S227P、S227E、S227N和G228S所組成的組中。因此，此類突變提供了一種可能途徑，通過(guò)該途徑H5病毒能在人群體中贏得立足點(diǎn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>aA/越南/CL01/2004例外，第190位置是D。bA/Dk/HN/303/2004例外，第193位置是S。三重突變體HA流感病毒進(jìn)入由其刺突糖蛋白即病毒血凝素(HA)介導(dǎo)，血凝素也是由預(yù)防性疫苗激發(fā)的保護(hù)性中和抗體的靶。H5N1禽流感病毒在結(jié)合細(xì)胞受體-唾液酸(SA)后進(jìn)入細(xì)胞，其中所述的唾液酸在禽宿主中表現(xiàn)與半乳糖的a-2，3連接。相反，人適應(yīng)型病毒偏好地利用增加上呼吸道中細(xì)胞感染的具有a-2，6連接的SA，這促進(jìn)人傳播。這里，我們定義了禽H5N1HA中提高其對(duì)人受體的親和力的突變，并且證明這些變化改變了HA對(duì)中和抗體的敏感性。結(jié)構(gòu)性和分子遺傳信息允許鑒定到受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中增強(qiáng)人細(xì)胞進(jìn)入作用超過(guò)IOO倍的位點(diǎn)，并且凝集素抑制法揭示了受體特異性的轉(zhuǎn)變。限于所述受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的3個(gè)點(diǎn)突變，偏好人的HA對(duì)抗H5中和抗體具有約10倍的更高抗性。這些突變使得所述HA對(duì)H5中和性單克隆抗體不敏感；然而，鑒定到另一種可以中和前述兩種HA的單克隆抗體。H5HA對(duì)利用人受體的適應(yīng)因此改變抗體敏感性，同時(shí)它改變受體特異性。這些研究結(jié)果提示禽流感病毒的適應(yīng)性突變可能使得現(xiàn)有疫苗效力更低。然而，這類修飾的HA為治療性抗體以及為新型預(yù)防性疫苗提供免疫原，其中所述的預(yù)防性疫苗預(yù)期在天然人適應(yīng)型H5N1抹出現(xiàn)之前開(kāi)發(fā)出來(lái)。由具有改變的受體結(jié)合特異性的禽H5流感病毒血凝素突變體進(jìn)行免疫HA中的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)由位于病毒刺突蛋白頂端外表面上的少于300個(gè)氨基酸組成(Gamblin，S丄等2004科學(xué)(Science)303:1838;Skehel，JJ.和Wiley,D.C.2000生物化學(xué)年度評(píng)論(AnnuRevBiochem)69:531;Steven、J.等2004科學(xué)(Science)303:1866;Steven、J.等2006科學(xué)(Science)312:404;Wilson，LA.等1981自然(Nature)289:366)。SA結(jié)合作用由以兩條脊作為邊界的腔體(圖4A)介導(dǎo)，所述的腔體由環(huán)220(第221位至第228位氨基酸)、環(huán)130(第135位至第138位氨基酸)和在第190位至第197位氨基酸處的螺旋狀結(jié)構(gòu)域(編號(hào)基于H3A/Aichi/2/68)(Wilson，I.A.等1981自然(Nature)289:366)組成。先前已經(jīng)描述了Hl、H5和H3HA的結(jié)構(gòu)(Gambling,S丄等2004科學(xué)(Science)303:1838;Shekel,J丄和Wiley，D.C.2000生物化學(xué)年度評(píng)論(AnnuRevBiochem)69:531;Steven、J.等2004科學(xué)(Science)303:1866;Steven、J.等2006科學(xué)(Science)312:404;Wilson,I.A.等1981自然(Nature)289:366),并且Hl和H5RBD彼此顯示的結(jié)構(gòu)和遺傳相似性高于與H3的結(jié)構(gòu)和遺傳相似性(圖4A)。為定義改變受體識(shí)別作用的突變，我們著眼于識(shí)別a2，6-SA連接的H5和Hl(A/南加利福尼亞/l/18)之間的差異，尤其第190、193和225位氨基酸(圖4B)。產(chǎn)生了創(chuàng)造假病毒的單個(gè)或組合突變，其中在特定位置上由氨基酸的單字母代碼描述的氨基酸被替換，如在位置190內(nèi)的天冬氨酸被谷氨酸替換置換(E190D)。我們也使用先前提示增加a2，6識(shí)別的突變Q226L，G228S(Steven、J.等2006科學(xué)(Science)312:404)。這些HA的表面表達(dá)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)(圖5A),和假型慢病毒載體在神經(jīng)氨酸酶(NA)共轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生。用螢光素E190D、K193、G225D三重突變體病毒顯示類似于野生型HA的進(jìn)入(圖5C),證實(shí)該突變體病毒的功能完整性；然而，受體特異性不可能通過(guò)這種方式定義。不同HA的SA特異性由改良聚糖微陣列法(Steven、J.等2006NatRevMicrobiol4:857)和再唾液酸化HA測(cè)定法(Paulson,J.C.和Roger、G.N.1987酶學(xué)方法《MethodsEnzymol》138:162)分析。對(duì)于聚糖陣列，HA隨NA共表達(dá)并加以純化(Steven、J.等2004科學(xué)(Science)303:1866)。與野生型蛋白相比，E190D、K193S、G225D突變?nèi)∠藢?duì)絕大多數(shù)a2,3-連接的底物的識(shí)別(圖6,A與B)。再唾液酸化HA測(cè)定法證實(shí)所述三重突變體中a2,3-SA識(shí)別作用的喪失和ot2，6結(jié)合作用的缺乏(表5A),該情況也在Q226L、G228S中見(jiàn)到。對(duì)先前所述突變體的分析(Yamada，S.等2006自然(Nature)444:378)也顯示無(wú)a2,6-SA識(shí)別作用(表5B)。最后，我們鑒定到提高a2，6-SA識(shí)別作用的突變(表5C),尤其改變了130環(huán)和190螺旋的S137A/T192I變體。這種改變的特異性在聚糖微陣列中得到證實(shí)(表6)。這些突變代表HA可以藉此調(diào)節(jié)其底物識(shí)別作用的替代形式；在最后提到的例子中，所述突變提高2，6-SA結(jié)合作用至與人適應(yīng)型流感病毒更相似(盡管不相同)的程度。具有改變的受體特異性的HA之間的免疫原性及抗原性差異通過(guò)用野生型或三重突變體HA接種小鼠并產(chǎn)生單克隆抗體(mAbs)進(jìn)行分析。每種mAb以差異的特異性識(shí)別與NA共表達(dá)的突變HA或野生型HA(圖7A)。一抹有效的H5特異性mAb9E8中和野生型H5,但是顯出針對(duì)三重突變體假病毒的顯著降低活性(圖7B，左側(cè))。與之相對(duì)，第二主這種單克隆10D10以最大抑制濃度同等地中和突變HA或野生型HA，盡管在中間濃度上觀察到較小差異(圖7B,中間)。在用三重突變體表達(dá)載體免疫后分離的第三mAb9Bll顯示相反的特異性，抑制所述三重突變體，但不影響野生型H5假病毒(圖7,B和C,右邊)。最終，盡管9E8中和野生型HA的效力比中和S137A/T192I變體的效力更高，另一種抗體11H12顯示對(duì)這兩者的可比較活性(圖7D)，從而證實(shí)該突變體的差異抗原性。對(duì)SA結(jié)合特異性的修飾因此改變中和敏感性并促進(jìn)可激發(fā)有效中和性mAb的疫苗的產(chǎn)生。在本報(bào)告中，我們鑒定到禽H5血凝素中改變其SA受體特異性的突變并中和敏感性用先前證實(shí)可定義眾多病毒進(jìn)入機(jī)制的慢病毒進(jìn)入測(cè)定法確定，其中所述的眾多病毒包括HIV、嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)病毒、埃博拉和馬爾堡出血熱病毒和最近包括流感病毒(Li，W.等2003自然(Nature)426:450;Yang,Z.等1998科學(xué)(Science)279:1034;Yang,Z,Y.等2004病毒學(xué)雜志(JVirol)78:5642)。抗體抑制作用決定中和敏感性(實(shí)施例1;Kong，W.-R等2006美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)103:15987)并與血凝抑制作用(免疫保護(hù)作用的一種傳統(tǒng)標(biāo)志)(表7)(Kong,W.P.等2006美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)103:15987)。用這種方法，無(wú)需為產(chǎn)生可復(fù)制性病毒所要求的分子適應(yīng)過(guò)程，4企驗(yàn)了所述HA的特異性，這可以鑒定到具有改變的SA特異性的幾種突變體。最近已經(jīng)定義了惡其它突變體，它們的識(shí)別作用以特異性更低的測(cè)定法評(píng)價(jià)(Yamada,S.等2006自然(Nature)444:378)，并且我們發(fā)現(xiàn)這些突變體在HA測(cè)定法中沒(méi)有獲得a2,6-SA識(shí)別作用(表5B;N186K,Q196R)。先前報(bào)道的Q226L，G228S突變體(Steven、J.等2006科學(xué)(Science)312:404)也不顯示a2,6-SA結(jié)合作用(表5A)。因此先前報(bào)道的HA突變體不太可能是人適應(yīng)性的，盡管本文的S137A，T192I可以代表該途徑中的一個(gè)步驟。仍未知a2,6-SA特異性的獲得是否將增加H5Nl傳染性。最近，證實(shí)1918病毒中導(dǎo)致人SA識(shí)別的HA突變?cè)鰪?qiáng)在雪貂中的傳染作用(Tumpey,T.M.等2007科學(xué)(Science)315:655)，這支持這種觀念并且提供了評(píng)價(jià)此類H5突變體的模型。合理設(shè)計(jì)人適應(yīng)型H5特異性疫苗的方法促進(jìn)了此類分析，以及促進(jìn)開(kāi)發(fā)先期對(duì)抗手段以對(duì)抗流感暴發(fā)。HA的五個(gè)主要抗原位點(diǎn)位于靠近RBD的可接近表面(Skehel,J丄和Wiley，D.C.2000生物化學(xué)年度評(píng)論(AnnuRevBiochem)69:531;Wiley，D.C.等1981自然(Nature)289:373;Kaverin,N.V.等2002普通病毒學(xué)雜志(JGenVirol)83:2497)。盡管針對(duì)該區(qū)域的抗體可以影響RBD特異性和中和敏感性(Skehel，J丄和Wiley,D.C.2000生物化學(xué)年度評(píng)論(AnnuRevBiochem)69:531,Laeeq,S.等1997病毒學(xué)雜志(JVirol)71:2600;Ilyushina，N.等2004病毒學(xué)月刊(Virology)329:33;Bizebarb，T.等1995自然(Nature)376:92;Fleury,D.等1999天然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(NatStructBiol)6:530)，不過(guò)僅在RBD中的變化還未證實(shí)可改變免疫原性。這里，基于結(jié)構(gòu)對(duì)RBD特異性的修飾促進(jìn)mAb的產(chǎn)生，而不依賴于所述主要抗原位點(diǎn)。針對(duì)功能性約束結(jié)構(gòu)域的這些抗體可以較不容易地發(fā)生抗性并且充當(dāng)這樣的疫苗原型，其中所述疫苗原型擬在人適應(yīng)興毒抹出現(xiàn)之前進(jìn)行開(kāi)發(fā)。單克隆抗體9B11、10D10、9E8和11H12在歷經(jīng)長(zhǎng)期有關(guān)多克隆抗體的科學(xué)研究后，1975年發(fā)展的單克隆抗體產(chǎn)生方法當(dāng)然是巨大的技術(shù)躍進(jìn)。單克隆抗體對(duì)于眾多任務(wù)而言是極有價(jià)值的，這些任務(wù)包括分析、表征和純化其對(duì)應(yīng)抗原。單克隆抗體對(duì)靶標(biāo)的敏銳特異性使它們成為藥物用途的突出候選物。然而，雜交瘤必須在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而非人中產(chǎn)生的事實(shí)使得雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體作為人治療物具有限用途。得自小鼠的抗體具有被人免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來(lái)物的序列，并且因此在施用至人時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈且潛在破壞性的免疫應(yīng)答。對(duì)抗體結(jié)構(gòu)的常年仔細(xì)研究導(dǎo)致這個(gè)方面的明顯進(jìn)展。在1983,嵌合抗體的改變變成現(xiàn)實(shí)。在嵌合抗體中，使用重組DNA技術(shù)將小鼠單克隆抗體或其它非人類單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)("供體")連接至人抗體的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。這極大地降低了抗體在人中的潛在免疫原性，同時(shí)保留其特異性。稍后幾年出現(xiàn)下一代技術(shù)突破一一"人源化"。在"人源化，，抗體中，僅3個(gè)CDR(互補(bǔ)決定區(qū))和有時(shí)來(lái)自每個(gè)供體抗體可變區(qū)的幾個(gè)仔細(xì)選擇的"框架區(qū)"殘基(可變區(qū)的非CDR部分)重組地黏附至人抗體序列的對(duì)應(yīng)框架區(qū)和恒定區(qū)。最近，該領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)展多種方法來(lái)產(chǎn)生"完全人"抗體例如通過(guò)產(chǎn)生來(lái)自經(jīng)遺傳修飾僅具有人員抗體基因的小鼠的雜交瘤或通過(guò)從人衍生抗體基因的噬菌體展示文庫(kù)中選擇而產(chǎn)生。然而，另一種變體結(jié)構(gòu)時(shí)單《連Fv或"scFv，，，其中單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)通過(guò)接頭序列重組地融合于抗體重鏈可變區(qū)。如本文中所用，"特異性結(jié)合，，指單克隆抗體結(jié)合對(duì)應(yīng)抗原的屬性，其中任意的單克隆抗體9B11、IODIO、9E8或11H12以如此親和力與所述對(duì)應(yīng)抗原結(jié)合，所述的親和力比該克隆抗體對(duì)除所述對(duì)應(yīng)抗原之外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的親和力高至少2倍、50倍、100倍、1000倍或更高倍。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"抗體"指包含至少一種和優(yōu)選兩種重(H)鏈可變區(qū)(本文中縮寫(xiě)為VH)以及至少一種及優(yōu)選兩種輕(L)鏈可變區(qū)(本文中縮寫(xiě)為VL)的蛋白質(zhì)。所述VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步再分成稱作"互補(bǔ)決定區(qū)"("CDR")的超變區(qū)，該超變區(qū)間插以稱作"框架區(qū)域"(FR)的更保守區(qū)域。所述框架區(qū)域和CDR的范圍已經(jīng)精確定義(見(jiàn)Kabat,E.A.,等(1991)免疫學(xué)目的蛋白質(zhì)的序列，第五版，美國(guó)衛(wèi)生與福利署，NIH出版編號(hào)91-3242(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanService、NIHPublicationNo.91-3242)和Chothia，C等(1987)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)196:901-917)。優(yōu)選地，每個(gè)VH和VL由從氨基端至羧基端以如下順序排列的三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體的VH或VL鏈可以還包括全部或部分的重鏈或輕鏈恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式，所述抗體是兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈由例如二硫鍵彼此連接。所述重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域Cffl、CH2和CH3組成。所述輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。所述重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)一般介導(dǎo)該抗體對(duì)宿主組織或因子的結(jié)合，所述的宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)及經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。術(shù)語(yǔ)"抗體"包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亞型)型完整免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的輕鏈可以是K或X型。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白，'指由基本上免疫球蛋白基因所編碼的一個(gè)或多個(gè)多肽組成的蛋白質(zhì)。已識(shí)別的人免疫球蛋白基因包括K、la(IgAl和lgA2)、y(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、5、s和ii恒定區(qū)基因，以及繁多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。全長(zhǎng)免疫球蛋白"輕鏈"(約25Kd或214個(gè)氨基酸)在氨基端處由可變區(qū)基因編碼(約110個(gè)氨基酸)并且在氣基端處由K或人恒定區(qū)基因編碼。全長(zhǎng)免疫球蛋白"重鏈"(約50Kd或446個(gè)氨基酸)類似地由一個(gè)可變區(qū)基因(約116個(gè)氨基酸)和前述其余恒定區(qū)基因之一例如y(編碼約330個(gè)氨基酸)編碼。術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"包括這樣的免疫球蛋白，其具有CDR,其來(lái)自非人類來(lái)源，例如來(lái)自非人類抗體，例如非人類抗體，例如小鼠免疫球蛋白或另一種非人類免疫球蛋白，來(lái)自共有序列或來(lái)自通過(guò)噬菌體展示法或產(chǎn)生多樣性的任何其它方法所產(chǎn)生的序列；并具有這樣的框架，其在人中比非人類框架區(qū)具有更少抗原性，例如在來(lái)自非人免疫球蛋白的CDR的情況下，比來(lái)自所述非人類CDR從中取得的非人類框架具有更少的抗原性。所述免疫球蛋白的框架可以是人、人源化非人類(例如小鼠)框架，其中將所述的框架修飾以減少在人中的抗原性，或合成性框架區(qū)，例如共有序列。這些抗體在本文中有時(shí)稱作修飾的免疫球蛋白。修飾的抗體或其抗原結(jié)合片段包括至少一條、兩條、三條或四條修飾的免疫球蛋白鏈，例如至少一條或兩條修飾的免疫球蛋白輕鏈和/或至少一條或兩條修飾的重鏈。在一個(gè)實(shí)施方式，所述修飾的抗體是兩條修飾的免疫球蛋白重鏈和兩條修飾的免疫球蛋白輕鏈的四聚體。如本文中所用、"同種型"指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgGl)。術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合片段"(或筒單稱作"抗體部分"或"片段")，如本文中所用、指特異性地與目的抗原結(jié)合的抗體部分，例如這樣的分子，其中一條個(gè)或多條免疫球蛋白鏈不是全長(zhǎng)的，但是特異性地與目的抗原結(jié)合。在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合片段"中包含的結(jié)合片段實(shí)例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)Fv片段，其由抗體的單條臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成；(v)dAb片段(Ward等、(1989)自然(Nature)341:544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR),具有足夠框架以特異性結(jié)合例如可變區(qū)的抗原結(jié)合部分。輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分和重鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合部分，例如，F(xiàn)v片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH可以使用重組方法例如通過(guò)合成接頭加以聯(lián)接，其中所述的合成接頭能夠使所述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域作為單一蛋白鏈產(chǎn)生，其中VL區(qū)和VH配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱作單鏈Fv(scFv);見(jiàn)，例如Bird等(1988)科學(xué)(Science)242:423-426;和Huston等(1988)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883)。術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合片段，，意圖包食此類單鏈抗體。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員抑制的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并且對(duì)所述片段如完整抗體那樣相同的方式篩選用途。術(shù)語(yǔ)"單特異性抗體"指對(duì)特定靶如表位顯示單一結(jié)合特異性和親和力的抗體。本術(shù)語(yǔ)包括"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"，其如本文中所用，指單一分子組合物的抗體或其片段的制備物。術(shù)語(yǔ)"重組"抗體，如本文中所用，指通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，如使用轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體，從重組組合抗體文庫(kù)中分離的抗體、從對(duì)人免疫球蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)中分離的抗體或通過(guò)任何其它方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體，其中所述的任何其它方法涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列。此類重組抗體包括人源化、CDR接枝、嵌合、(例如通過(guò)噬菌體展示)體外產(chǎn)生的抗體，并且可以任選地包含源自人種系免疫球蛋白序列的恒定區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，我們提供單特異性抗體(例如單克隆抗體)或其抗原結(jié)合片段。所述抗體(例如重組或修飾的抗體)可以是全長(zhǎng)的(例如IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(例如IgAl、IgA2)、IgD和IgE,不過(guò)優(yōu)選IgG)或可以僅包括抗原結(jié)合片段(例如Fab、F(ab')2或scFv片段、或一個(gè)或多個(gè)CDR)?？贵w或其抗原結(jié)合片段可以包含兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈，或可以是單鏈抗體。所述抗體可以任選地包含選自的恒定區(qū)k、人、a、y、S、s或ii恒定區(qū)基因。優(yōu)選的抗體包括基本上來(lái)自人抗體例如人IgGl恒定區(qū)或其部分的重鏈和輕鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人抗體?？贵w(或其片段)可以是鼠類或人抗體?？梢允褂玫膬?yōu)選單克隆抗體的實(shí)例包括9B11、IODIO、9E8和11H12抗體。本發(fā)明的范圍也包括使用如此抗體或其抗原結(jié)合片段的方法和組合物，其中所述的抗體結(jié)合本文所披露抗體的重疊表位或竟?fàn)幮缘匾种票疚乃犊贵w與對(duì)應(yīng)抗原的結(jié)合，例如這樣的抗體，其結(jié)合單克隆抗體9B11、IODIO、9E8或11H12的重疊表位或竟?fàn)幮砸种扑鰡慰寺】贵w與對(duì)應(yīng)抗原的結(jié)合?？梢允褂萌我獾目贵w組合，例如結(jié)合至對(duì)應(yīng)抗原不同區(qū)域的兩種或更多種抗體，例如結(jié)合至對(duì)應(yīng)抗原的兩種不同表位的抗體。在一些實(shí)施方式中，抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合至本文所述抗體例如9B11、IODIO、9E8和11H12的全部或部分表位。所述抗體可以抑制，例如竟?fàn)幮缘匾种票疚乃隹贵w例如9B11、IODIO、9E8和11H12抗體與對(duì)應(yīng)抗原的結(jié)合。抗體可以結(jié)合至這樣的表位，例如空間表位或線性表位，其中所述表位在被結(jié)合時(shí)阻止本文所述的抗體如抗體9B11、IODIO、9E8和11H12的結(jié)合。所述表位可以在空間上非常接近于或在功能上相關(guān)于或在構(gòu)象上非常接近于抗體9B11、IODIO、9E8和11H12識(shí)別的一個(gè)表位，例如線性序列中的重疊或相鄰表位。在其它實(shí)施方式中，抗體(或其片段)是重組或修飾的抗體，所述抗體選自例如嵌合、人源化、或體外產(chǎn)生的抗體。如本文中所討論，修飾的抗體可以是CDR接枝抗體、人源化抗體或更一般地是具有來(lái)自非人類抗體的CDR和如此框架的抗體，其中所述的框架因在人中較低的免疫原性而選擇，例如其免疫原性比其中天然存在鼠類CDR的鼠類框架更低。在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的抗體是抗體9B11、IODIO、9E8或11H12的人源化形式。在另一個(gè)方面，本發(fā)明以用于預(yù)防或治療流感病毒感染的組合物為特征。所述組合物包含如本文中所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。如本文中所述的抗體或其抗原結(jié)合片段可以全身地施用至受試者(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、通過(guò)輸注(例如使用輸注裝置)、皮下、經(jīng)皮或通過(guò)吸入)。在抗體或其抗原結(jié)合片段是小分子的那些實(shí)施方式中，可以口服地施用抗體。在其它實(shí)施方式，將抗體或其抗原結(jié)合片段局限地(例如局部)施用至受累區(qū)域，例^口p乎吸道。受試者可以是哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類，優(yōu)選高級(jí)靈長(zhǎng)類，例如人(例如患有流感病毒感染或有此風(fēng)險(xiǎn)的患者)。在另一方面，本發(fā)明以用于體外檢測(cè)樣品(例如生物樣品，如血漿、組織活抬r樣品)中對(duì)應(yīng)抗原存在性的方法為特征。所述組合物包含如本文中所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。所述主題方法可以用來(lái)評(píng)價(jià)例如流感病毒感染的診斷或階段。該方法包括(i)使所述樣品(和任選地，參考，例如對(duì)照樣品)與抗體或其觸；并且(ii)檢測(cè)復(fù)合物在所述抗體或其抗原結(jié)合片段與該樣品(和任選地，參考，例如對(duì)照樣品)之間的形成。所述復(fù)合物的形成表示存在對(duì)應(yīng)抗原，和可以指示本文中所述治療的適用性和需要。例如，相對(duì)于對(duì)照樣品，樣品中所述復(fù)合物形成的統(tǒng)計(jì)顯著變化表示該樣品中存在所述對(duì)應(yīng)抗原。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于體內(nèi)檢測(cè)受試者對(duì)應(yīng)抗原存在性的方法(例如受試者中體內(nèi)成像)。所述主題方法可以用來(lái)評(píng)價(jià)受試者例如哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類例如人中流感病毒感染的診斷或階段。該方法包括(i)將抗體下施用至受試者(和任選地，參考，例如對(duì)照受試者)；并且(ii)檢測(cè)復(fù)合物在所述抗體或其抗原結(jié)合片段與對(duì)應(yīng)抗原之間的形成。相對(duì)于所述參考例如對(duì)照受試者或受試者的基線，該受試者中所述復(fù)合物形成的統(tǒng)計(jì)顯著變化表示存在所述對(duì)應(yīng)抗原。'優(yōu)選地，抗體或其抗原結(jié)合片段直接或間接地用可檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)記以促進(jìn)檢測(cè)結(jié)合及未結(jié)合的物質(zhì)。合適的可檢測(cè)物質(zhì)包括多種有生物活性的酶、輔基、熒光材料、發(fā)黃材料、順磁性(例如核磁共振活性)材料和放射性材料。在一些實(shí)施方式中，抗體或其片段偶聯(lián)于放射性離子，例如銦(11In)、碘(1311或1251)、釔(90Y)、镥(177Lu)、僻(225Ac)、鉍。2Bi或犯Bi)、硫(35S)、碳("C)、氚(3H)、銠(188Rh)、锝("mTc)、鐠或磷(32P)。實(shí)施例1所用的Genbank登錄號(hào)是AY651364、AY555150、DQ868374和DQ868375。免疫原和質(zhì)粒構(gòu)建編碼H5N1(KAN-l)(Genbank登錄號(hào)AY555150)血凝素的質(zhì)粒先前已經(jīng)描述(W.-RKong等2006美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)l03:15987)并且使用人偏好性密碼子加以合成(GeneArt，德國(guó)雷根斯堡)。該序列已經(jīng)提交至GenBank，登錄號(hào)DQ868374。使用如文中所述的快速變化(QuickChange)試劑盒(Stratagene,拉荷亞(LaJolla)，加利福尼亞(CA))通過(guò)位點(diǎn)定向誘變制備突變的HA。蛋白質(zhì)表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析法證實(shí)(W.P.Kong等2003病毒學(xué)雜志(JVirol)77:12764)。DNA接種中所用的免疫原含有如前所述(W.-P.Kong等2006美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA):15987)(Genbank登錄號(hào)DQ868375)變成PQRETRG(SEQIDNO:4)的裂解位點(diǎn)突變(PQRERRRKKRG(SEQIDNO:3)。該修飾也稱作"mut.A"。表達(dá)分泌型三聚體形式HA和三重突變體HA(E190D/K193S/G225D)的質(zhì)粒通過(guò)將含有如上所述述切割位點(diǎn)突變的HA的第1-518位氨基酸與如所述的IDNO:5)融合而產(chǎn)生(J.Stevens等2006科學(xué)(Science)312:404)。該修飾也稱作"短"和"折疊子"，因?yàn)樗粌H含有三聚化位點(diǎn)，并且此融合導(dǎo)入HA蛋白在跨膜結(jié)構(gòu)域上游羧基末端10個(gè)氨基酸的截短。質(zhì)粒編碼Nl(KAN-l)(Genbank登錄號(hào)AY555150)也使用人偏好性密碼子合成(基因技術(shù)(GeneArt)，德國(guó)雷根斯堡)。接種6-8周齡雌性BALB/c小鼠(杰克森實(shí)驗(yàn)室(JacksonLabs))如前述進(jìn)行免疫(Z,Y.Yang等2004自然(Nature)428:561)。簡(jiǎn)而言之，小鼠用100|ilPBS(pH7.4)中的15嗎質(zhì)粒DNA以肌內(nèi)方式在第0、3、6周免疫三次，僅用于DNA免疫或用于初免-加強(qiáng)接種以產(chǎn)生中和性單克隆抗體，隨后用表達(dá)相同抗原的101()個(gè)重組腺病毒(rAd)顆粒在第8-10周進(jìn)行額外加強(qiáng)免疫。血清在最后接種10日后收集。雪貂類似地進(jìn)行免疫，除了使用200昭質(zhì)粒DNA以外。細(xì)胞系、抗體、凝集素和唾液酸類似物-人胚腎細(xì)胞系293T、293A和293F從英杰(Invitrogen)(卡爾斯巴德(Carlsbad),CA)購(gòu)買(mǎi)，分別作為病毒生產(chǎn)者和作為感染的靶細(xì)胞或用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生。它們先前已經(jīng)得到描述(Z,Y.Yang等2004病毒學(xué)雜志(JVirol)78:5642)。兔抗HA(H5N1)IgG,人免疫4支術(shù)(ImmuneTechnology)(紐約皇后區(qū)(Queens,NY))購(gòu)買(mǎi)。兔抗p24(HIV-l)抗血清從ABI(Columbia,MD)獲得。山槐(Maackiaamurensis)凝集素II(MAA)、紫云接骨木(Sambucusnigra)凝集素(SNA)、生物素化MAA或SNA以及FITC標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白來(lái)自載體實(shí)驗(yàn)室(VectorLaboratories)(伯4木蓋姆(Burlingame)，力口利一畐尼亞(CA))?？笻5小鼠單克隆抗體的產(chǎn)生雌性BALB/c小鼠用質(zhì)粒DNA免疫三次，隨后用表達(dá)相同抗原的1010個(gè)顆粒加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后3日，將脾臟從所述小鼠中收獲，勻漿成單個(gè)細(xì)胞混懸液，使用聚乙二醇與作為伴侶的骨髓瘤融合，并且在洛夫斯特瑞德實(shí)驗(yàn)室(LofstrandLabs)(蓋塞斯堡(Ga他ersburg),馬里蘭州(MD))于如前所述含HAT的培養(yǎng)基中選擇雜交瘤(G.Kohler和CMilstein1976歐洲免疫學(xué)雜志(EurJImmunol)6:511;S.N.Iyer等1998高血壓(Hypertension)31:699)。產(chǎn)生目的抗體的雜交體用ELISA進(jìn)行篩選，并且假型中和測(cè)定法如前所述進(jìn)行(W.-P.Kong等2006美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)103:15987)。分離到顯示強(qiáng)烈中和作用的三個(gè)克隆10D10、9E8和9B11,并且隨后使它們適應(yīng)于烏發(fā)血清培養(yǎng)基。具有中和活性的另一個(gè)克隆克隆11H12從后續(xù)融合中分離并且也用來(lái)表征S137A,T1921突變體。使用HiTrap蛋白G親和柱(阿莫仙(Amersham)，皮斯卡塔韋(Piscataway),新澤西(NJ))從無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基純化小鼠單克隆抗體。三聚體HA蛋白的產(chǎn)生和純化使用含有或不含有1/10比例NA(KAN-1)表達(dá)載體(重量:重量)的293轉(zhuǎn)染試劑(fectin)(Invitrogen，Carlsbad,CA),將表達(dá)分泌型三聚體HA和HA(E190D/K193S/G225D)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293F細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染72-96小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液收集、通過(guò)離心澄清、過(guò)濾并使用Ni瓊脂糖(Sepharose)TM高效親和柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare),Piscataway,新澤西(NJ))純化，如前所述(J.Stevens等2006科學(xué)(Science)312:404)。將級(jí)分合并并進(jìn)行離子交換層析(單-Q(mono-Q)HR10/10，通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare),皮斯卡塔韋(Piscataway,NJ))和凝膠過(guò)濾層析(Hiload16/60Superdex200pg，GEHealthcare,Piscataway，NJ)。將含有三聚體的級(jí)分合并，并對(duì)PBS透析。HA和a2，3及a2，6唾液酸的表面染色使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以表達(dá)野生型和H5突變體的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將細(xì)胞使用含2mMEDTA的PBS取出、收集和并以PBS洗滌。細(xì)胞用小鼠抗HA[H5N1(KAN-1)]血清(圖5A;黑色線，1:200)或免疫前血清對(duì)照(圖5A,灰色線，1:200)染色?；蛘撸設(shè).lw/w比的NA(KAN-l)共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與單克隆抗體(9E8、IODIO、9B11)(圖7A;黑色線，5pg/ml或同種型對(duì)照(圖7A，灰色線，5|ig/ml)在冰上孵育30分鐘、洗滌并且與AlexaFluor488-山羊抗小鼠IgG(Invitrogen,Carlsbad,CA)(1:2000)在冰上孵育。將樣品洗滌并使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(FlowCytometer)(碧迪公司(BD)，弗蘭克林湖(FranklinLakes),NJ)進(jìn)行分析。對(duì)于a2,3-和a2,6-SA的表面染色(圖5B),如上所述收集和分析293A細(xì)胞。與生物素化MAA(10|ig/ml)或生物素化SNA(10pg/ml)在冰上孵育30分鐘后，將細(xì)胞洗滌并與FITC標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白(10嗎/ml)在水上孵育30分鐘。假型慢病毒載體的產(chǎn)生表達(dá)螢光素酶報(bào)道基因的重組慢病每載體如前所述產(chǎn)生(L.Naldini等1996美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)93:11382)。簡(jiǎn)而言之，使用磷酸釣轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA),將10cm培養(yǎng)皿中的293T細(xì)胞用400ng的H5HA或HA突變體、50ng的NANA(H5N1/KAN-1)表達(dá)載體、7ng的pCMVAR8.2和7嗎的pHR/CMV-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染過(guò)夜，隨后用新鮮培養(yǎng)基恢復(fù)。48小時(shí)后，將上清液收獲、經(jīng)過(guò)濾0.45pm注射式濾器過(guò)濾，等份貯存并立即使用或凍存在-80。C。病毒輸入量通過(guò)所述病毒制備物中p24的量加以標(biāo)準(zhǔn)化。使用HIV-1p24抗原測(cè)定試劑盒(貝克曼庫(kù)爾特(BeckmanCoulter),富爾敦(Fullerton),CA)測(cè)量來(lái)自不同病毒原液的p24水平。在浮力密度離心后，使用蛋白質(zhì)印跡分析法證實(shí)對(duì)這些制備物中HA表達(dá)的分析，并且水平變化不超過(guò)l-2倍。用假型慢病毒載體感染細(xì)胞將總計(jì)30,000個(gè)293A細(xì)胞在感染前一日鋪種在48孔培養(yǎng)皿的每孔內(nèi)。細(xì)胞以三復(fù)孔lOOjxl病毒上清液/孔與HANA假型病毒聘育14-16小時(shí)病毒上清液在此時(shí)間結(jié)束時(shí)更換為新鮮培養(yǎng)基，并且使用"哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解緩沖液"和"螢光素酶測(cè)定試劑"(普洛麥格(Promega)，麥迪遜市(Madison)，威斯康辛(WI))根據(jù)制造商方案，在48小時(shí)后如前所述測(cè)量螢光素酶活性(Z.-Y.Yang等2004病毒學(xué)雜志(JVirol)78:5642)。通過(guò)小鼠抗血清和單克隆抗體抑制HANA假病毒進(jìn)入首先通過(guò)連續(xù)稀釋法滴定編碼螢光素酶的HANA假型慢病毒載體。隨后將相似量的病毒(p246.25ng/ml)與所示量的小鼠抗血清或單克隆抗體在室溫孵育20分鐘并且添加至293A細(xì)胞(10,000個(gè)細(xì)胞/孔在96孔培^m)(50pl/孔，三復(fù)孔)。將平板洗滌并在6小時(shí)候更換為新鮮培養(yǎng)基。24小時(shí)候，測(cè)量荄光素酶活性。血凝素的聚糖陣列分析通過(guò)將15(ilHA和7figAlexaFluor488標(biāo)記小鼠抗5xHis(凱杰(Qiagen),目錄號(hào)1019199)以2:1摩爾比在總體積50^1中混合而制備HA-抗體復(fù)合物，并將該混合物在水上孵育15分鐘。所述預(yù)復(fù)合物隨后用含有3%(w/v)牛血清白蛋白和0.05%吐溫(Tween)20的50微升PBS稀釋。等份的所述稀釋預(yù)復(fù)合物施加至蓋玻片下的微陣列(version3.0)并在黑暗、濕化室內(nèi)在室溫孵育1小時(shí)。將蓋玻片柔和地取下并且此蓋玻片隨后在含0.05。/oTween-20的PBS、PBS和去離子水中連續(xù)淋洗。為除去過(guò)多的水，此蓋玻片在蓋玻片微型離心機(jī)中離心30秒，并且結(jié)合圖像在微陣列掃描儀(ProScanArray，珀金埃爾默(PerkinElmer))內(nèi)讀取。使用Imaenev.6軟件(生物探索(BioDiscovery),埃爾塞貢多(ElSegundo),CA)開(kāi)展圖像分析，并且結(jié)果文件以Excel格式生成，其中在消除最高值或最低值后，將源于每種聚糖(表8)6個(gè)重復(fù)的相對(duì)熒光(RFU)報(bào)道為n=4的平均數(shù)。數(shù)據(jù)上載至互聯(lián)網(wǎng)上網(wǎng)址fimctionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp處的功能'l"生外唐類協(xié)會(huì)組數(shù)據(jù)庫(kù)(ConsortiumforFunctionalGlycomicsDatabase)。H5N1和測(cè)量受體特異性的其它假病毒的血凝作用雞RBC(CRBC)和酶修飾CRBC的血清作用如前所述進(jìn)行(L.Naldini等1996美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(ProcNatlAcadSciUSA)93:11382;LGlaser等2005病毒學(xué)雜志(JVirol)79:11533;T.GKsiazek等2003新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(NEnglJMed)348:1953;J.CPaulson和G.N.Rogers1987酶學(xué)方法《MethodsEnzymol》138:162)。為產(chǎn)生SAa2,3Gal或a2，6Gal再唾液酸化的CRBC,將0.6ml的10%(v/v)新鮮制備的CRBC(創(chuàng)新研究(InnovativeResearch),南田(Southfield),密歇根州(MI))用10mlPBS(pH7.4)洗滌三次并且用處理200mU霍亂弧菌(vibviocholerae)神經(jīng)氨酸酶(羅氏(Roche),印第安納波利斯(Indianapolis),印第安納州(IN))在37。C處理1小時(shí)。用1mlPBS洗滌三次后，將細(xì)胞重懸于1mlPBS中，與20mU的a2,3(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(卡爾生物化學(xué)(Calbiochem),LaJolla，CA)在37。C孵育30分鐘；或在1.5mlPBS中與Dr.JamesPaulson博士(斯克瑞普斯研究機(jī)構(gòu)(ScrippsResearchInstitute))友好提供的4.5mU的a2，6(N)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶外加1.5mMCMP-SA(西格瑪(Sigma)，圣路易斯(St.Louis)，密蘇里州(MO))在37。C將育45分鐘。再唾液酸化的CRBC在用PBS洗滌3次后以0.5%(v/v)重懸于PBS中。神經(jīng)氨酸酶處理的CRBC也在再唾液酸化之前與假型病毒載體孵育并且均勻地顯示《1:2的滴度。為通過(guò)血凝作用測(cè)量假病毒的結(jié)合活性，將PBS中的5(^11:5稀釋的H5N1假病毒添加至96孔圓底平板，并且進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋。分別添加50pi10.5%CRBC、a2，3或a2,6再唾液酸化CRBC,并將它們與病毒混合。60分鐘后通過(guò)目視檢查法確定HA滴度。表5.野生型和突變體HA的聚糖識(shí)別作用的特異性和進(jìn)入效率<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>如實(shí)施例1中所述使用來(lái)自泰國(guó)的H5突變體KAN-1或來(lái)自越南的VN1203和VN1194。通過(guò)再唾液酸化血凝試-險(xiǎn)(實(shí)施例1)對(duì)(A)喪失a2,3HA活性的KAN-1突變體和相關(guān)對(duì)照、(B)VN1203和先前描述的VN1194突變體(Yamada，S.等2006自然(Nature)444:378)和(C)a2，6-SA結(jié)合作用提高的KAN-1突變體測(cè)定所示HA結(jié)合a2,3-或a2，6-SA的能力。野生型和突變布支型慢病毒載體的病毒進(jìn)入過(guò)程如所述進(jìn)行測(cè)量(實(shí)施例1)。進(jìn)入程度如下+，<WT的25%;++,WT的25-50%;+++，WT的50-75%;++++，>WT的75%。本文的H5(KAN-l)與所述GenBank序列相同，并且與源自Yamada和合作者(Yamada,S.等2006自然(Nature)444:378)的序列在第186位氨基酸(N/K)處不同于，并且VN1194突變體根據(jù)替代性編號(hào)習(xí)慣與N182K和Q192R(Yamada,S.等2006自然(Nature)444:378)相同。表6通過(guò)聚糖微陣列分析，與野生型相比S137A、T192I的聚糖結(jié)合作用差異的匯總表<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>上表顯示如聚糖微陣列測(cè)定法確定的S137A，T192I相對(duì)于野生型(wt)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、連接和結(jié)合作用。聚糖陣列如圖6中所述進(jìn)行，從而對(duì)于絕大多1^物觀察到在線性范圍內(nèi)的結(jié)合作用(50%最大結(jié)合作用)。通過(guò)將S137A,T1921突變體的相對(duì)熒光單位(RFU)從對(duì)照的RFU中扣減而進(jìn)行差異分析。所述差異除以對(duì)照并且乘以100以獲得代表相對(duì)于對(duì)照數(shù)據(jù)的陽(yáng)性或陰性變化的百分比。針對(duì)三個(gè)群體呈現(xiàn)結(jié)果，包括含有Neu5Aca2-6GalNAc(31-4的9種不同結(jié)構(gòu)，與對(duì)照相比，其中7種結(jié)構(gòu)顯示因突變所致的結(jié)合作用明顯陽(yáng)性增加；帶有與聚乳糖胺連接的巖藻糖的四種化合物，它們顯示明顯更高的S137A,T192I結(jié)合作用；并且6種a2-3和a2-6SA,其相對(duì)于S137A，T1921,顯示更高的野生型結(jié)合作用?？傊@些分析證實(shí)了與野生型H5KAN-1HA相比，S137A,T192I增強(qiáng)的a2-6識(shí)別作用和改變的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)特異性。表7:通過(guò)不同測(cè)定法測(cè)定的接種動(dòng)物的中和性抗體應(yīng)答KAN-1VN(1203)VN(1203)KAN-1慢病毒動(dòng)物免疫原載體血凝抑制微量中和法抑制作用(IC80)雪貂1HA3xDNA+rAd40404202HA3xDNA+rAd160201557HA3xDNA+rAd>2560>2560198794HA3xDNA+rAd804012515HA3xDNA+rAd>2560>2560171866HA3xDNA+rAd160805627對(duì)照載體3xDNA+rAd101008對(duì)照載體3xDNA+rAd10100小鼠1HA蛋白質(zhì)320NDl卯42HA蛋白質(zhì)640ND13673HA蛋白質(zhì)640ND3457<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>通過(guò)多種方法評(píng)1介源自個(gè)體雪貂或小鼠組的血清，其中所述的雪貂和小鼠用由單獨(dú)DNA編碼的H5KAN-IHA、DNA加rAd(重組腺病毒)或純化的KAN-IHA蛋白免疫。血凝抑制和微量中和試驗(yàn)用如前所述的rgA/越南A203/2004xA/PR8/34重組4朱病毒VN(12(B)(J.J.Treanor等2006新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(NEnglJMed)354:1343)(南方研究院，伯明翰，阿拉巴馬州(SouthernResearchInstitute,Birmingham,AL))進(jìn)行。在上表中顯示終點(diǎn)稀釋度。使用A/泰國(guó)/KAN-112004HA慢病毒載體的慢病毒抑制試驗(yàn)如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。顯示了具有IC80活性的血清的稀釋度。Mab指圖7中所述的小鼠單克隆抗體。所述單克隆抗體的IC80基于純化IgG的濃度進(jìn)行計(jì)算。ND表示樣品沒(méi)有進(jìn)行測(cè)定。200780041962.X轉(zhuǎn)溢齒被62/685x表8由微陣列分析的聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和命名<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>化學(xué)結(jié)構(gòu)和連接、命名以及如前所述(J.Stevens等人.2006科學(xué)(5We"")312:404)表明的參考毒抹的結(jié)合得到顯示，為圖6中所示的野生型(wt)和三重突變HA提供了參考。符號(hào)象征是白色圓形(Gal)、黑色圓形(Glc)、黑色三角形(Fuc)、白色方形(GalNAc)、黑色方形(GlcNAc)、黑色菱形(唾液酸)、灰色圓形(人)以及白色菱形(N-乙醇酰基唾液酸(N-glycolylsialicacid))。承**應(yīng)當(dāng)理解本文中所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅出于說(shuō)明目的并且在其影響下作出的多種修改和改變將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員存在提示，并且應(yīng)當(dāng)包括在本申請(qǐng)的精神及范圍和所附帶任意權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文中提及的全部圖、表和附錄以及出版物、專利和專利申請(qǐng)因而通過(guò)引用的方式并入用于全部目的。權(quán)利要求1.分離或重組的血凝素(HA)多肽、所述多肽選自由以下項(xiàng)所組成的組中(a)具有SEQIDNO2的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO82的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO84的氨基酸序列的多肽；(d)由多核苷酸序列編碼的多肽，其中，所述的多核苷酸在高度嚴(yán)格性條件下與編碼(a)、(b)或(c)的多核苷酸序列的基本上全長(zhǎng)雜交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含與所述(a)、(b)或(c)中連續(xù)的至少約350個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約400個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約450個(gè)氨基酸或連續(xù)的至少約500個(gè)氨基酸基本上相同的氨基酸序列；和(f)H5HA多肽；其中所述多肽包含S137除S之外的氨基酸的突變，并任選包含T192除T之外的氨基酸的又一個(gè)突變。2.多肽，包含這樣的序列，所述的序列對(duì)權(quán)利要求l中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少98%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少98.5%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求l中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.2%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.4%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.6%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.8%序列同一性或?qū)?quán)利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.9%序列同一性。3.多肽，包含這樣的序列，所述的序列對(duì)權(quán)利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少95%序列同一性。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中，所述的多肽具有免疫原性。5.組合物，其包含權(quán)利要求1的一種或多種多肽。6.多肽，其特異性地由針對(duì)至少一種抗原產(chǎn)生的多克隆抗血清結(jié)合，所述抗原包含權(quán)利要求1的至少一種氨基酸序列。7.對(duì)權(quán)利要求1的多肽特異的抗體。8.免疫原性組合物，其包含免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求1的多肽。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其還包含至SEQIDNO:4的裂解位點(diǎn)的修飾。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其還包含替代跨膜結(jié)構(gòu)域的SEQIDNO:5的外部三聚區(qū)的氛基末端的修飾。11.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苦酸序列，并且所述多核苷酸序列選自由以下項(xiàng)所組成的組中(a)編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，或其互補(bǔ)多核苷酸序列；(b)編碼具有SEQIDNO:82的氨基S吏序列的多肽的多核香酸序列，或其互補(bǔ)多核苷S臾序列；(c)編碼具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽的多核香酸序列，或其互補(bǔ)多核苷酸序列；(d)多核苷酸序列，其在高度嚴(yán)格性條件下與多核苷酸序列(a)、(b)或(c)的基本上全長(zhǎng)雜交；(e)編碼多肽序列的多核苷酸序列，所述多肽序列包含由(a)、(b)或(c)編碼的多肽的片段，所述多肽包含這樣的氨基,列，所述氨基酸序列與由(a)、(b)或(c)編碼的所述多肽中連續(xù)的至少約350個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約400個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約450個(gè)氨基酸或連續(xù)的至少約500個(gè)氨基酸基本上相同；和(f)編碼H5HA多肽的多核苷酸序列；其中所述多核苦酸序列編碼這樣的多肽，所述多肽包含S137除S之外的氨基酸的突變，并任選包含T192除T之外的氨基酸的又一個(gè)突變。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸，其中，所述核酸是DNA。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸，其中，所述核酸是RNA。14.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序歹'J,并且所述多核苷I^f列對(duì)權(quán)利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少98%同一性、對(duì)權(quán)利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少98.5%同一性、對(duì)權(quán)利要求ll中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99%同一性、對(duì)權(quán)利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.2%同一性、對(duì)權(quán)利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.4%同一性、對(duì)權(quán)利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.6%同一性、對(duì)權(quán)利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核香酸具有至少99.8%同一性或?qū)?quán)利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.9%同一性。15.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，并且所述多核苷S^f列對(duì)權(quán)利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少95%同一性。16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸，其中，所述的多核香酸編碼免疫原性多肽。17.組合物，其包含權(quán)利要求11的一種或多種核酸。18.免疫原性組合物，其包含免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求11的核酸。19.載體，其包含權(quán)利要求11中所述的一種或多種核酸。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的載體，其中，所述載體包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的載體，其中，所述載體包括表達(dá)載體。22.細(xì)胞，其被權(quán)利要求19的載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)。23.用于在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生血凝素(HA)多肽的方法，所述方法包括將權(quán)利要求19的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；并且回收所述血凝素(HA)多肽。24.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求l的多肽。25.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求11的核酸。26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的組合物，該組合物還包含賦形劑。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的組合物，其中，所述賦形劑是藥學(xué)上可接受的賦形劑。28.預(yù)防性或治療性治療受試者中流感感染的方法，所述方法包括以產(chǎn)生針對(duì)所述流感感染的免疫原性應(yīng)答的有效量，施用包含權(quán)利要求1的多肽的免疫原性組合物或包含權(quán)利要求11的核酸的免疫原性組合物至所述受試者。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是人。31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述組合物以有效預(yù)防性或治療性治療所述流感感染的量施用至該受試者。32.分離或重組的血凝素(HA)多肽，所述多肽選自由以下多肽所組成的組中(a)具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:82的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽；(d)由多核苷酸序列編碼的多肽，其中所述的多核苷酸序列在高度嚴(yán)格性條件下與編碼(a)、(b)或(c)的多核香酸序列的基本上全長(zhǎng)雜交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含與所述(a)、(b)或(c)中連續(xù)的至少約350個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約400個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約450個(gè)氨基酸、或連續(xù)的至少約500個(gè)氨基酸基本上相同的氨基酸序列；(f)H5HA多肽；其中，所述多肽包含K/R193除K或R之外的氨基酸的突變和選自由以下突變所組成的組中的至少一種突變S136除S之外的氨基酸的突變、El卯除E之外的氨基酸的突變、L194除L之外的氨基酸的突變、R216除R之外的氨基酸的突變、S221除S之外的氨基酸的突變、K222除K之外的氛基酸的突變、G225除G之外的氨基酸的突變、Q226除Q之外的氨基酸的突變、S227除S之外氨基酸的突變和G228除G之外的氨基酸的突變。33.多肽，包含這樣的序列，所述的序列對(duì)權(quán)利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少98%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少98.5%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.2%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.4%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.6%序列同一性、對(duì)權(quán)利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.8%序列同一性或?qū)?quán)利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.9%序列同一性。34.多肽，包含這樣的序列，所述的序列對(duì)權(quán)利要求32中所述的(a)、(b)或'(c)的至少一種多肽具有至少95%序列同一性。35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的多肽，其中，所述的多肽具有免疫原性。36.組合物，其包含權(quán)利要求32的一種或多種多肽。37.多肽，其特異性地由針對(duì)至少一種抗原產(chǎn)生的多克隆抗血清結(jié)合，所述抗原包含權(quán)利要求32的至少一種氨基酸序列。38.對(duì)權(quán)利要求32的多肽特異的抗體。39.免疫原性組合物，其包含免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求32的多肽。40.根據(jù)權(quán)利要求32所述的多肽，其還包含至SEQIDNO:4的裂解位點(diǎn)的修飾。41.根據(jù)權(quán)利要求32所述的多肽，其還包含替代跨膜結(jié)構(gòu)域的SEQIDNO:5的外部三聚區(qū)的羧基末端的修飾。42.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，并且所述多核苷酸序列選自由以下項(xiàng)所組成的組中(a)編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，或其互補(bǔ)多核苷S交序列；(b)編碼具有SEQIDNO:82的氨基S吏序列的多肽的多核苦酸序列，或其互補(bǔ)多核香酸序列；(c)編碼具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，或其互補(bǔ)多核苷酸序列；(d)多核苷酸序列，其在高度嚴(yán)格性條件下與多核苦酸序列(a)、(b)或(c)的基本上全長(zhǎng)雜交；(e)編碼多肽序列的多核香酸序列，所述多肽序列包含由(a)、(b)或(c)編碼的多肽的片段，所述多肽包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與由(a)、(b)或(c)編碼的所述多肽中連續(xù)的至少約350個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約400個(gè)氨基酸、連續(xù)的至少約450個(gè)氨基酸或連續(xù)的至少約500個(gè)氨基酸基本上相同；和(f)編碼H5HA多肽的多核香酸序列；其中，所述多核苷酸序列編碼這樣的多肽，所述多肽包含K/R193除K或R之外的氨基酸的突變和選自由以下突變所組成的組中的至少一種突變S136除S之外的氨基酸的突變、E190除E之外的氨基酸的突變、L194除L之外的氨基酸的突變、R216除R之外的氨基酸的突變、S221除S之外的氨基酸的突變、K222除K之外的氨基酸的突變、G225除G之外的氨基酸的突變、Q226除Q之外的氨基酸的突變、S227除S之外氨基酸的突變和G228除G之外的氨基酸的突變。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的核酸，其中，所述核酸是DNA。44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的核酸，其中，所述核酸是RNA。45.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，并且所述多核苷S臾序列對(duì)權(quán)利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少98%同一性、對(duì)權(quán)利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少98.5%同一性、對(duì)權(quán)利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99%同一性、對(duì)權(quán)利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.2%同一性、對(duì)權(quán)利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苦酸具有至少99.4%同一性、對(duì)權(quán)利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.6%同一性、對(duì)權(quán)利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.8%同一性或?qū)?quán)利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.9%同一性。46.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，并且所述多核苷酸序列對(duì)權(quán)利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苦酸具有至少95%同一性。47.根據(jù)權(quán)利要求42所述的多肽，其中，所述多核苦酸編碼免疫原性多肽。48.組合物，其包含權(quán)利要求42的一種或多種核酸。49.免疫原性組合物，其包含免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求42的核酸。50.載體，其包含權(quán)利要求42的一種或多種核酸。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的載體，其中，所述載體包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的載體，其中，所述載體包括表達(dá)載體。53.細(xì)胞，其被權(quán)利要求50的載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)。54.用于在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生血凝素(HA)多肽的方法，所述方法包括將權(quán)利要求50的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；并且回收所述血凝素(HA)多肽。55.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求32的多肽。56.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求42的核酸。57.根據(jù)權(quán)利要求55或56所述的組合物，其還包含賦形劑。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中，所述賦形劑是藥學(xué)上可接受的賦形劑。59.預(yù)防性或治療性治療受試者中流感感染的方法，所述方法包括以產(chǎn)生針對(duì)所述流感感染的免疫原性應(yīng)答的有效量，施用包含權(quán)利要求32的多肽的免疫原性組合物或包含權(quán)利要求42的核酸的免疫原性組合物至所述受試者。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述受試者是哺乳動(dòng)物。61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是人。62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述組合物以有效預(yù)防性或治療性治療所述流感感染的量施用至該受試者。63.抗體或其抗原結(jié)合片段，其竟?fàn)幮砸种七x自由9B11、IODIO、9E8和11H12所組成的組中的單克隆抗體結(jié)合。64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的抗體.瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的抗體66.根據(jù)權(quán)利要求63所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的抗體或其抗原結(jié)合片段包含這樣的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含選自由9E8的CDR的氨基酸序列所組成組中的至少一種CDR。67.根據(jù)權(quán)利要求63所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的抗體或其抗原結(jié)合片段包含這樣的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含選自由11H12的CDR的氨基S^列所組成組中的至少一種CDR。68.根據(jù)權(quán)利要求63所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的抗體或其抗原結(jié)合片段包含這樣的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含選自由9E8的CDR的氨基酸序列所組成組中的至少一種CDR。69.根據(jù)權(quán)利要求63所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的抗體或其抗原結(jié)合片段包含這樣的重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含選自由11H12的CDR的氨基酸序列所組成組中的至少一種CDR。70.根據(jù)權(quán)利要求63所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的抗體或其抗原結(jié)合片段包含來(lái)自9E8的全部6個(gè)CDR。71.根據(jù)權(quán)利要求63所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述的抗體或其抗原結(jié)合片段包含來(lái)自11H12的全部6個(gè)CDR。72.特異性地結(jié)合對(duì)應(yīng)抗原的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述的對(duì)應(yīng)抗原特異性地由選自由9B11、IODIO、9E8和11H12所組成的組中的單克隆抗體結(jié)合。全文摘要本發(fā)明提供因突變而適應(yīng)于人的H5血凝素(HA)多肽和相關(guān)多核苷酸、方法、組合物和疫苗，其中所述的突變改變H1血清型的受體特異性。文檔編號(hào)C07K14/11GK101627050SQ200780041962公開(kāi)日2010年1月13日申請(qǐng)日期2007年10月10日優(yōu)先權(quán)日2006年10月10日發(fā)明者加里·J.·納貝爾,嵐吳,楊志勇,江永佩,魏智仁申請(qǐng)人:美國(guó)國(guó)有健康與人類服務(wù)部(馬里蘭州)