專利名稱：：與胰腺導(dǎo)管腺癌相關(guān)的新型抗原和抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于診斷和治療人類癌癥，特別是胰源癌癥的新手段(means)。技術(shù)背景胰腺導(dǎo)管腺癌(PDA)是最常見的胰腺癌，而且，在美國和歐洲，胰腺導(dǎo)管腺癌是癌癥死亡的第四誘因。確診后大多數(shù)患者在12個月內(nèi)死亡，存活5年的僅有2%。胰腺切除術(shù)仍然是PDA治療和4匕療的基礎(chǔ)，^旦其^是供了邊纟彖存活-文益(marginalsurvivalbenefit)(LahemD和JaffeeM，2005;KleefJetal"2006)。盡管手術(shù)和藥物治療(包括采用單克隆抗體、疫苗和化療)已有所改進，但目前用于早期PDA診斷的標志物仍然極少且可信度較差。最常用于胰腺癌診斷的血清標志物是唾液酸化的Lewis血型抗原CA19-9,但其用途主要為了監(jiān)測對治療的反應(yīng)而非PDA診斷。實際上，在患良性胰腺疾病(例如慢性胰腺炎或膽道阻塞)的患者血清中，該抗原也以較高濃度存在而提供假陽性，而且其不能應(yīng)用于所有的患者，因為其在5-10%的人群中才艮本不表達(OkusakaTetal.,2006)。正是由于這些原因，人們正在評估用于PDAi貪斷的可^^4戈性生物標志物(或生物標記，biomarker)，目的在于減少介入性才乘作如活組織才全查和組織病理學(xué)評估(BouvetM，2004;BrandR，2001;GogginsM,2005;LeungTetal"2005),以及用于評估候選藥物(CohenS和MeropolN，2002;JimenoA和HidalgoM，2006)。最近已采用多種技術(shù)利用大規(guī)模的蛋白表達分析(基于RNA或蛋白水平)來鑒定候選的PDA生物標志物。特別;也，通過比壽交由雙向凝月交電泳(或二維凝月交電泳，2-DE)所分辨的、由癌癥患者的血清抗體所識別的、以及利用質(zhì)i普法所鑒定的蛋白，已經(jīng)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)4支術(shù)來沖企測PDA患者的血清中"i秀發(fā)體液應(yīng)答的抗原(GorgAetal.,2004;GrahamDetal.,2005)。文獻中以不同的名稱描述了用于蛋白質(zhì)分離、選擇和表征的方法的多種變型，如SERPA(KladeCetal.,2001)、PROTEOMEX(LichtenfelsRetal.,2003)、或SPEAR(U層inRetal"2003)。這些方法學(xué)共同的作用前提是，通過表征對抗癌癥特異性表達的4元原的B細力包庫(所謂的人類癌癥免疫纟且)，應(yīng)該能夠確定在癌癥免疫監(jiān)視(immunosurveillance)和免疫編輯(immunoediting)中涉及的特異性把標，并理解導(dǎo)致細力包增殖和轉(zhuǎn)移失控的一幾制(DrakeCetal"2006;DunnGetal.，2004)。已表明免疫療法是一種用于治療膽i^癌的有用途徑(LahemD和JaffeeM，2005)。事實上，已經(jīng)才艮據(jù)其RNA水平的表達升高(WO04/55519)，或者血清樣品和/或胰腺樣品的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析(BhattacharyyaSetal"2004;CaoDetal"2005;CecconiDetal"2003;ChenRetal"2005;GronborgMetal.，2006;HondaKetal"2005;KoomenJetal"2005;RodriguezJetal"2005;ShenJetal"2004,RostyC和GogginsM,2005;SinhaPetal"1999;YuYetal"2005)而產(chǎn)生了一系列候選的PDA特異性蛋白。血清中用于PDA^珍斷的^美選蛋白為纖維蛋白原y(Bloomstonmetal.,2006)、DEAD國Box蛋白48(XiaQetal.,2005)、MIC-1(KoopmannetJal"2004)、PTH相關(guān)蛋白(BouvetMetal.,2001)和4丐網(wǎng)織蛋白(HongSetal.，2004)。然而，仍然需要用于PDA早期檢測以及將其與其他胰腺病癥或癌癥區(qū)分開的可靠的生物標志物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于以下觀察結(jié)果，即，與健康個體或患其他病癥個體的血清相比，PDA患者的血清包含抗特異蛋白的抗體，而該特異蛋白在源于胰腺癌的細胞系中表達。在獲自正常胰尿袈組織和PDA胰腺組織的提取物中，利用特異于這些蛋白的純化抗體可確定這些蛋白的存在。本發(fā)明的一個主要目的是新型的、至少在3個4立點被z疇酸化的人類a-烯醇化酶(ENOA)的PDA相關(guān)同種型(亞型，isoform),并且這些位點已在a-烯醇化酶的新同種型中的一種中得到確定。本發(fā)明的另一個目的是結(jié)合這些ENOA磷酸化同種型并將它們與其他ENOA同種型區(qū)分開的抗體。所述抗體可以為任何恰當?shù)男问?，例如單克隆抗體(特別是人類單克隆抗體)和抗體片段。本發(fā)明中已限定為PDA相關(guān)的蛋白及結(jié)合它們的抗體(以及用于^:測它們的^f壬4可其他4爭定方式)均可用于PDAi貪斷的方法中，以及用來鑒定用于治療PDA的藥劑。具體地，在獲自患者的生物學(xué)樣品(如血清或活枱r組織)中基于抗體沖僉測PDA相關(guān)的ENOA磷酸化同種型可用于PDA診斷、評估疾病進展(progression)或評4古用于治療PDA的藥物療凌丈的方法中。本發(fā)明的其他目的是用于PDA診斷、評估疾病進展、或評估用于治療PDA的藥物療歲文的i式劑盒，該試劑盒包纟舌至少一種本發(fā)明所述的PDA相關(guān)蛋白和/或結(jié)合它們的抗體。下文的說明中還將提供本發(fā)明的其他目的，包括那些與胰腺癌i貪斷和治療中的特異性抗a-烯醇4匕酶抗體的限定和應(yīng)用相關(guān)的目的。圖1:SERPA法的示意圖，SERPA法用于利用CF-PAC-1細胞(腫瘤細胞)和來自PDA(腫瘤)患者或?qū)φ?健康)供體的血清來表征PDA相關(guān)蛋白抗原和抗體。圖2:(A)2-DE凝膠，利用來自CF-PAC-1細胞系的蛋白提取物而制備，作為用于^r測PDA相關(guān)蛋白表達的測定。細胞提:f又物中的蛋白根據(jù)其分子量和pl而在凝膠中分離并利用銀染色而顯現(xiàn)。指出了采用PDA血清而非對照血清的蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)中存在的斑點的位置(表I中列出了對應(yīng)于每一個編號的特定蛋白的名稱)。(B)柱狀圖，表示患有慢性胰腺炎(CP)或不同分期(11、III、IV)PDA的患者(每一組中患者總數(shù)以n表示)血清中包含識別所指出的PDA相關(guān)蛋白的抗體的百分比。表I中指出了對應(yīng)于縮寫的蛋白質(zhì)全名。圖3:人a-烯醇化酶(ENOA;SWISSPROTAcc.No.P06733;SEQIDNO:l)與人y烯醇化酶(ENOGSWISSPROTAcc.No.P09104;SEQIDNO:2)蛋白序列的比對(兩種蛋白質(zhì)中相同的氨基酸用":"表示，而那些僅保守的氨基酸則用"."表示)。在2-DE凝膠斑點中已通過質(zhì)譜法鑒定且用來將ENOA同種型分配到這些斑點的肽序列用下劃線表示。圖4:人a-烯醇化酶(ENOA)蛋白序列中的磷酸化位點(加并且、有下劃線)的位置，其通過不同的算法來預(yù)測和/或通過實-驗來鑒定(蛋白序列下面的小寫字母；參見圖注)。在ENOA中已鑒定為在ENOA同種型3中發(fā)生磷酸化的肽用實線框出。ENOA同種型3中鑒定為未磷酸化的肽用虛線框出。圖5:(A)通過不同方式檢測6種a-烯醇化酶同種型(ENOAl、2、3、4、5、6)。ENOA1/2、和3的4立置用白色箭頭表示。(B)沖企測正常胰腺組織或PDA患者胰腺組織的蛋白提取物中的6種a-烯醇化酶同種型(1、2、3、4、5、6),其已轉(zhuǎn)移至月莫上，隨后用抗-ENOA作為第一抗體通過蛋白質(zhì)印跡法進行檢測。ENOA1/2同種型的位置用白色箭頭表示。作為凝膠上樣以及轉(zhuǎn)移至膜上的蛋白量的對照，用多克隆兔抗人肌動蛋白抗體(稀釋度1:10000;SigmaChemicalCo.)對月莫進4亍4企測。圖6:利用PDA患者血清作為第一抗體，通過2-DE凝膠和蛋白質(zhì)印跡法檢測CF-PAC-1細胞提取物中的6種a-烯醇化酶同種型(斑點l、2、3、4、5、6),該血清已用或未用重組人a-烯醇化酶進行預(yù)吸附(十rENOA或-rENOA)?？商娲兀肞DA患者血清池(pool)作為第一抗體進行蛋白質(zhì)印跡法前，用磷酸酶(+人PPASE)乂t該力莫進^亍予貞處理。具體實施例方式生物化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)4支術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可鑒定并評估與疾病有關(guān)的生物學(xué)才羊品中存在的特有蛋白(individualproteins)。本發(fā)明中，這種類型的分沖斤最初旨在用于癌癥(PDA),并利用兩種來源的疾病相關(guān)分子源自人胰腺導(dǎo)管腺癌(PDA)的細胞系(CF-PAC-1)和獲自一大組PDA患者的血清，其可能包含與PDA腫瘤形成和/或進展相關(guān)的抗體。通過這些血清的蛋白質(zhì)印跡分析在CF-PAC-1提取物中才全測到的免疫活性蛋白i普與利用不同對照群體(健康個體、非PDA腫瘤患者、慢性胰腺炎患者)的血清所獲得的蛋白譜進行比較，以確定CF-PAC-1蛋白質(zhì)組中候選的PDA相關(guān)抗體和相關(guān)抗原(圖1)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有已清楚了解的生物學(xué)活性的有限數(shù)量的蛋白(包括代謝酶和細胞骨架蛋白)的抗體選4奪性地存在于PDA患者的血清中，表明這些蛋白是PDA相關(guān)的，且可在PDA患者而非健康個體或非PDA癌癥患者中誘發(fā)體內(nèi)抗體應(yīng)答。本發(fā)明中已確定為PDA相關(guān)的蛋白和抗體(以及用于4企測它們的任何其他特定方式)，均可用于PDA診斷的方法中，并可用來鑒定用于治療PDA的藥劑。已經(jīng)采用用于蛋白分離和分析的2-DE和質(zhì)譜4支術(shù)確定了一組PDA相關(guān)的人類蛋白(包括a-烯醇化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、視黃醛脫氬酶-1、葡萄糖-6-磷酸鹽-l-脫氫酶、延伸因子Tu和異檸檬酸鹽脫氫酶、I型角蛋白細胞骨架IO、Cofilin1;圖2B和表I)為用于PDA血清中特異性存在的抗體的抗原。此外，針對這些抗原的純化抗體確^人了它們的差異表達，并/人而確i^了用于4企測它們的4壬4可基于蛋白質(zhì)的方式(包括血清、完全或部分純化的抗體、多克隆抗體制備物、和肽)用于PDA早期^診斷并用于評估患者體內(nèi)這種癌癥的進展的有歲丈性。因而這些蛋白均可單獨或組合^f吏用，用作PDA早期i貪斷以及用于評估患者體內(nèi)這種癌癥進展的生物標志物。在這些生物標志物中，ENOA1/2(a-烯醇化酶同種型1和同種型2)和COF1(Cofilin1)，如利用2-DE和蛋白質(zhì)印跡法鑒定的，看來是最可靠的PDA相關(guān)蛋白抗原。如在實施例中所示出的，結(jié)合這些PDA相關(guān)抗原的抗體可用于上文列出的范圍。因此，包括檢測生物學(xué)樣品(如血清、活檢組織(biopsies),或細胞/組織蛋白#是取物)中這些抗原和/或抗體的方法可實現(xiàn)PDA早期診斷以及對患者體內(nèi)PDA進展的評估。除了在下文所述的一種情形中，對PDA相關(guān)抗原的表征不能推廣至對PDA相關(guān)蛋白的任何翻譯后^f多飾的定義。婆t據(jù)表明，任何特異性結(jié)合給定抗原的全部同種型所共有的表位(如表I使用的純化抗體，右列)或包含PDA相關(guān)的翻譯后修飾的一種或多種同種型所^又有的表位(如PDA患者血清中存在的以及在PDA進展過禾呈中;f企測到的抗體；參見圖2B)的抗體或肽，均可用于確定PDA-^斷和進展。考慮到人們對提供用于治療PDA的新型治療化合物的興趣，包括"險測生物學(xué)樣品中PDA相關(guān)抗原和抗體(以及它們的結(jié)合特性)的方法還可用來評估用于治療PDA的4美選藥物。該方式適用于一些分析中，其中可比較PDA相關(guān)蛋白和/或抗體的存在，如在ENOA同種型(ENOA1/2)的實例中所示出的。在暴露于候選化合物之后而發(fā)生的這些特性的改變，可利用實施例和文獻中所描迷的生物化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)而確認，其可表明導(dǎo)致PDA肺瘤形成和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)途徑。例如，通過4企測患者或動物模型的血清中抗PDA相關(guān)抗原的第一抗體的消失、以及利用抗原特異性抗體在細胞提取物中通過蛋白質(zhì)印跡法檢測斑點數(shù)目的減少而確認化合物的PDA特異性活性是可能的。候選化合物可針對任何可能的PDA治療性革巴標，包括那些在本發(fā)明中確定為PDA相關(guān)蛋白的靶標(如COF1或ENOA1/2)。例如，這些化合物的形式可為結(jié)合它們的抗體(大體上或僅特定的同種型)，或為通過調(diào)節(jié)^f奮飾它們的酶的活性而改變其表達或翻i奪后修飾的小分子。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)合人a-烯醇化酶的抗體(如鼠單克隆抗體)抑制胰腺源轉(zhuǎn)化細胞系(呈現(xiàn)(presenting)6種a烯醇化酶同種型(即包括ENOA1/2,如利用PDA患者血清在蛋白質(zhì)印跡法中4企測到的))的體外生長和增殖。在非胰腺源轉(zhuǎn)化細胞系(呈現(xiàn)這6種a烯醇化酶同種型)中也^見察到了這種對體外生長和增殖的抑制效應(yīng)，^E對于僅呈現(xiàn)3種非;岸酸化同種型的非胰&i源轉(zhuǎn)化細胞系則未》見察到該效應(yīng)(實施例3;圖5B;表IV)，表明利用抗-ENOA抗體治療PDA的可能性。隨后可利用細胞系或動物才莫型在任何用于胰腺細胞的增殖分析中評估這些可能的治療特性，并已力口以^^測來證實不同化合物如肽、肽類似物和影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子的效應(yīng)(BakerCetal.,2002;BauerTetal.，2005;B腿sCetal"2000;LeeLetal.,2002;LevitzkiA和MishaniE,2006;QinYetal.,1995;YezhelyevMetal.，200+Rubio-ViqueiraBetal.,2006)。此外，已經(jīng)^L實了聯(lián)用4十對不同分子耙標的化合物從而更加有效地治療胰腺癌的可能性。例如，聯(lián)合給予化療藥物和特異于細胞膜受體的激酶抑制劑可抑制實驗性人胰A泉癌的生長并顯著延長動物才莫型的存活期(YokoiNetal.,2005)?？蒦^4戈地，已有文獻描述，如果將兩種或更多種針對病毒或人類乾^標的抗體結(jié)合于藥物組合物中，則不僅由于加合作用(additiveeffect)而且由于協(xié)同效應(yīng)而可使所得的組合物表現(xiàn)出改善的治療和/或診斷有效性(LogtenbergT，2007)。包含抗PDA相關(guān)蛋白(如ENOA1/2)的抗體的藥物組合物可纟合予人類用于治療和i貪斷目的。因此，用于PDA治療或i貪斷的方法可包括給予包含抗PDA相關(guān)蛋白(如ENOA1/2)的抗體的藥物組合物。所述組合物可包括常用的藥物賦形劑，且可以單劑量或多劑量和/或利用適合的裝置通過不同的途徑月幾內(nèi)、l爭月永內(nèi)、皮下、局部、經(jīng)粘膜、以不可生物降解/可生物降解的基質(zhì)材料、或利用顆粒藥物遞送系統(tǒng)而纟合予。特別的，該組合物應(yīng)該可有效纟合予至膽J^或任^可其他存在PDA相關(guān)蛋白的組織。藥物組合物應(yīng)該為患者l是供治療或預(yù)防有效量的化合物，允許該化合物可在足夠長的時間內(nèi)發(fā)揮其活性。期望的效果是通過控制PDA生長和增殖，并通過減少至少部分PDA臨床表現(xiàn)而改善PDA患者的病況。例如，才艮據(jù)給藥途徑以及個體狀況不同，該組合物應(yīng)該以約0.005至約50mg/kg體重的有效量給予。當組合物具有診斷性用途時，則該化合物應(yīng)該利用通常在臨床和研究實-驗室中所建立的用于4企測生物才羊品中的病毒的4支術(shù)力口以檢測(例如，ELISA或其他血清學(xué)分析)，或者當體內(nèi)給予患者時，則至少在給予后l、2、5、10、24或更多個小時進行檢測。PDA相關(guān)蛋白和/或抗體的檢測可利用本發(fā)明的PDA相關(guān)蛋白和/或抗體在已建立的用于診斷PDA的已知方法和步驟之后實施或者與其聯(lián)合實施。PDA治療和/或"i貪斷的臨床開發(fā)(clinicaldevelopment)和應(yīng)用，應(yīng)該基于抗體藥^動力學(xué)和藥效動力學(xué)的特4i(LoboEetal.,2004)、臨床前詳口臨床安全凄史才居(datapreclinicalandclinicalsafety)(TabriziM和RiskosL,2007)，并遵守關(guān)于人類治療和體內(nèi)i貪斷性應(yīng)用的單克隆抗體的生產(chǎn)和質(zhì)量4空制的國際^見定(HarrisRetal.2004)。用于患者PDAi，斷的試劑盒可包4舌一種或多種上文限定的如本發(fā)明中所限定的。這些試劑盒可包括未標記/標記的抗原、抗體或在與這些抗原相互作用后#1改性(modified)的底物(例如，已鑒定為具有酶活性的那些)。在對PDA的體液應(yīng)答的耙標中，人們特別感興趣的是發(fā)現(xiàn)新型的a-烯醇化酶的磷酸化同種型可由PDA血清識別。人oc-烯醇化酶(ENOA)的該新型同種型在至少三個位置發(fā)生磷酸化，而且已經(jīng)鑒定了全部七個^粦酸化位點(圖4)。這個發(fā)現(xiàn)的重要性通過利用獲自PDA患者的血清或在獲自PDA患者的胰腺組織中特異性檢測到兩種高度石粦酸化的ENOA同種型(ENOA1/2)而^尋到i正實(圖2B、圖5和圖6;表I和表II)。PDA患者呈J見有(present)可特異性結(jié)合本發(fā)明所述高度磷酸化ENOA同種型的抗體。實施例表明，即使ENOA序列中的若干個位置可以發(fā)生磷酸化，但在細胞系和PDA組織中，蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸殘基的豸青確組合實際上發(fā)生^岸酸化，且可通過PDA患者產(chǎn)生的人類抗體而沖全觀'J。凈爭另U^;,蘇氛酸55、賂氛酸57、酷氛酸200、酷氛酸236、蘇氨酸237、酪氨酸257和絲氨酸419的磷S臾化存在于ENOA同種型3中，3口ENOA1/2,其表i見出可經(jīng)石粦酸酶處理而改變的蛋白石粦酸化語。蛋白磷酸化的類似改變可應(yīng)用于診斷PDA以及利用獲自患者的生物學(xué)樣品而評估疾病進展。在完整ENOA1/2同種型的替換中，產(chǎn)生呈現(xiàn)(present)相同的ENOA1/2磷酸化殘基(如圖4中所鑒定的那些(參見加框的序歹'J))的ENOA源性單肽、包括其的蛋白質(zhì)序列或文庫及它們的組合也是有用的。用于產(chǎn)生并利用這些石岸酸化蛋白和肽的方法在文獻中有所披露(ConradsTetal.，2002;US5763164;WO97/30097)。a-烯醇化酶同種型(特別是ENOA1/2)中翻譯后修飾的數(shù)目和步文應(yīng)可進一步通過已^^支術(shù)(KalumeDetal.,2003;MachidaKetal.，2003;MannMetal.，2002;RushJetal.，2005;MolinaHetal"2007;SchmelzleK和WhiteF，2006;WuJetal.，2005)在PDA相關(guān)的和對照樣品中加以證實。其他已知的ENOA磷酸化和/或》務(wù)飾(表in)可存在于ENOA1/2中，且與這些同種型的#元原性和生物學(xué)活性以及其利用同種型特異性抗體進行^^測相關(guān)。與疾病特定分期/分型相關(guān)的翻i奪后Y多飾可通過幾種方法進^"才全測，包括直接蛋白分析或抗體區(qū)分具有特定j務(wù)飾的同種型，如其他蛋白所示(EdbergDetal.,2005;MandellJ,2003)?？贵w，尤其是單克隆抗體，通過其與利用2-DE和蛋白質(zhì)印跡法在非PDA/PDA蛋白提取物中差異表達的蛋白同種型的結(jié)合而得以確定，可應(yīng)用于治療在2-DE和蛋白質(zhì)印跡法中具有類似i普的癌癥。因此，結(jié)合a-烯醇化酶(大體上；或特別地，特定的磷酸化同種型)的抗體可應(yīng)用于制備用于PDA治療的藥物組合物以及用于PDA患者或表現(xiàn)出類似的a烯醇化酶表達語(即，表達本發(fā)明所述的在至少3個位置發(fā)生磷酸化的新型人a-烯醇化酶同種型)的癌癥患者的治療性處理方法中?？贵w可用于癌癥(如PDA)的4企測或治療，所述癌癥特征在于患者血清中存在》粦酸化a-烯醇化酶同種型。這些抗體可通過利用用于鑒定、表征和產(chǎn)生診斷性或治療性抗體的任何已知技術(shù)而產(chǎn)生(JainMetal.,2007;LafflyE和SodoyerR，2005)。該抗體可以以用于功能性抗體的任何蛋白形式而產(chǎn)生，如完整抗體(或完全抗體，fullantibody)(如單克隆抗體，特別是人或人源4b單克隆抗體)、抗體片段、抗原結(jié)合蛋白以及其他基于基因工程抗體的融合蛋白和肽，它們在文獻中以不同命名得到描述，如Scfv(單鏈片段可變區(qū))、Fab(可變區(qū)重/輕鏈異源二聚體)、雙價抗體(或雙體，diabody)、分離的重《連或輕鏈、肽體(或多聚肽體，peptabody)或雙特異性抗體。本發(fā)明的抗體可通過結(jié)合(conjugate)(利用化學(xué)接頭(或化學(xué)連4妾體，chemicallinker)或聚合體)或融合于治療性、穩(wěn)、定性、標記性、或診斷性試劑而加以改善。這些試劑的實例是可被結(jié)合的可4企測性標記分子(例如》文射性同位素、熒光化合物、毒素、金屬原子、化學(xué)發(fā)光化合物、生物發(fā)光化合物、生物素、酶底物或酶)。ENOA特異性活性還可以通過與另一種治療性蛋白如可在it斷性或治療性應(yīng)用中改變代謝和/或穩(wěn)定性的蛋白或聚合物融合而得到增強。文獻中提供了用于選才奪和設(shè)計蛋白成分、配體和恰當接頭的方式以及用于構(gòu)建、純化、才企測和應(yīng)用融合蛋白的方法和策略(Nilssonetal.,1997;"ApplicationsOfChimericGenesAndHybridProteins"MethodsEnzymol.Vol.326-328,AcademicPress,2000;WO01/77137),且通?？稍谂R床和科研實驗室中采用。例如，融合蛋白可包含由商品化抗體識別的序列(包括標簽，如多組氨酸、FLAG、c-Myc或HA標簽)，其可促進該融合蛋白的體內(nèi)和/或體外鑒定或者其純化。其他蛋白序列可通過直接熒光分析(如綠色熒光蛋白)，或通過特異性底物或酶(例如應(yīng)用蛋白水解位點)而容易地鑒定。識別PDA特異性蛋白序列(如ENOA1/2)的抗體，或源自這種抗體的任何其他蛋白序列，均可利用這種用于轉(zhuǎn)化恰當宿主細胞的栽體而表達為重組蛋白，所述宿主細月包可以是原沖亥或真核宿主細胞且應(yīng)該可實現(xiàn)所需重組蛋白的分泌。用于產(chǎn)生這種蛋白的方法包括培養(yǎng)宿主細胞，其在適于蛋白表達的條件下用包含其編碼序列的表達載體而轉(zhuǎn)化，并乂人宿主細胞培養(yǎng)物中回收蛋白。在原核或真核宿主細胞內(nèi)表達的載體在關(guān)于如何克隆和產(chǎn)生重組蛋白的書籍和綜述中有所描述，包括由OxfordUniv.Press出版的系列叢書《APracticalApproach》中的題目("DNACloning2:ExpressionSystems",1995;"DNACloning4:MammalianSystems",1996;"ProteinExpression",1999;"ProteinPurificationTechniques",2001)。其他蛋白序列可結(jié)合所需抗體形式(Scfv、FAb、抗體片段、完全人抗體等)、或結(jié)合一個或多個內(nèi)部氨基酸的插入、取代或去除而力口入。這些才支術(shù)也可以用于進一步的結(jié)構(gòu)和功能表;f正以及蛋白質(zhì)(一般而言)、特別是抗體的治療特性的優(yōu)化(KimSetal.,2005)。接下來，本發(fā)明將借助下列實施例進行闡述，其不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明。實施例實施例1:在CP-PAC-1細胞系的蛋白質(zhì)組中檢測PDA相關(guān)的體液抗原才才#牛&方法在得到患者和健康供體的知情同意和臨床研究機構(gòu)倫理委員會批準后，從靜脈血分離血清樣品。使用前，將樣品儲存于-80°C。從70位PDA患者(31位男性，39位女性；年齡范圍32-86歲；年齡平均值士標準差67±11)獲得血清，并按照通用的分類(FariaSetal.,2004)和UICC(國際抗癌聯(lián)合會)分類分組為如下不同的臨床分期II期17人(未轉(zhuǎn)移，中度分化)、III期17人(未轉(zhuǎn)移，低分化)，以及IV期36人(遠端轉(zhuǎn)移，未分化)。將這些血清的反應(yīng)性與無癌癥或自身免疫疾病史的用估文對照的40個健康個體(14位男性，26位女性；年齡范圍57-77歲；年齡平均值士標準差70±7)的血清反應(yīng)性進行比較。此外，將這些血清的反應(yīng)性與30位非PDA癌癥患者(9位肝細胞癌患者，12位乳腺癌患者、8位結(jié)腸癌患者和1位卵巢癌患者；ll位男性，19位女性；年齡范圍44-79歲；年齡平均值士標準差66±10)和15位慢性胰腺炎患者(9位男性，6位女性；年齡范圍49-76歲；年齡平均^直士標準差59±8)的血清反應(yīng)性進4亍比專交。提供血清的不同組的患者的年齡和性別分布，經(jīng)非配對雙尾學(xué)生氏14全-弓全(unpaired2-tailedStudent'st-test)^H古，未表J見出統(tǒng)i十學(xué)顯著性差異。僅在慢性胰腺炎的組中，這兩組的年齡(而非性別)分布顯著不同，因為該疾病通常發(fā)生于比PDA較年輕的年齡(平均約44歲)。細應(yīng)系和細應(yīng)炎取教的刺備收集源于月夷&，導(dǎo)管&泉癌(SchoumacherRetal"1990)的CF畫PAC-1細胞系(ECACCRef.no.91112501)的細胞(107)，并用Hank's平4lf鹽;容液(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)洗滌。將該細胞團(或細胞沉淀，pellet)冷凍-干燥過夜并儲存于-80°C。將該細胞團重懸浮于200(al再水合緩沖液[5M尿素、2M硫脲、4%w/vCHAPS(SigmaChemicalCo.)、2%v/vIPG緩沖液3-10NL(GEHealthcareBio-Sciences，Uppsala,Sweden)、80mMDTT(SigmaChemicalCo.)]和痕量溴酚藍(SigmaChemicalCo.)中。通過Bradford分析測定蛋白質(zhì)濃度(Bio-Rad實驗室)。雙向凝y^^泳("2-D五J將100嗎來自CF-PAC-1細胞系的蛋白提取物通過凝膠中再水合(ge/rehydration)上沖羊于7cmIPG月交條(strip)上(pH3-10NL),用于分析和制備型凝月交。在IPGphorIEFunitsystem(GEHealthcareBio-Sciences)上實施等電聚焦(IEF),電壓梯度達5000V,共16000Vh。SDS-PAGE運行前，將IPG膠條用Tris/HCl緩沖液(50mM;pH8.8)、尿素(6M)、甘油(30%v/v)、SDS(2%w/v)和DTT(2%w/v)的溶液平衡15分鐘，隨后在含石典乙酰胺(2.5%w/v)和溴酚藍(而非DTT)的相同緩沖液中再平衡5分鐘。為了進行雙向電泳，利用NovexX-CellIITMMini-cellsystem(Invitrogen),4吏7cm的月交條(strip)以恒定200V在小NuPAGENovex4-12%Bis-TrisZoom預(yù)制凝膠(Invitrogen,才各羅寧才艮(Groningen),荷蘭)上進4亍電泳(run)，并利用NovexX-CellIITMBlotModule(Invitrogen)轉(zhuǎn)移至HybondECL硝'基纖維素膜(GEHealthcareBio-Sciences)上或者經(jīng)名艮染用于質(zhì)i普分才斤(ShevchenkoAetal.，1996)。利用GEHealthcareBio-Sciences4是供的pH梯度圖，/人蛋白斑點在2-DE凝膠上的位置估計蛋白斑點的p/值。通過與已知分子量的SeeBluePlus2預(yù)染標準(Invitrogen)的遷移比較，計算蛋白質(zhì)的分子量。用"ImageScanner"(GEHealthcareBio-Sciences)獲取2-DE凝月交圖象并用"ImageMasterLabscanVer3.00"4欠4牛(GEHealthcareBio-Sciences)記錄為TIFF才各式。蛋白l伊遊^^f用封閉緩沖液(由含5%脫脂奶粉的TBS組成)將膜在4。C卯孚育15小時，然后用血清(工作稀釋度1:200,用含0.05。/。Tween20和5%脫脂奶粉的TBS稀釋)孵育4小時。洗滌后，將膜用結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)的兔抗人免疫球蛋白G(IgG)抗體(SantaCruzBiotechnology)以1:1000的稀釋度在室溫下孵育90分4中?？蒦l代地，對于利用純化的第一抗體的蛋白質(zhì)印跡分析，從2-DE凝膠印跡而來的硝基纖維素膜(nitrocellulosemembranes)用1:1000稀釋的抗體于25。C聘育1小時進行檢測，所述第一抗體為小鼠源的[例如單克隆抗體抗烯醇化酶19/128(MoscatoSetal.，2000中表征的克隆19/12的亞克隆)、抗-磷酸丙糖異構(gòu)酶1(AbnovaCorporation)、4元陽角蛋白10(ChemiconInternational)、才元-延4申因子tu(AbnovaCorporation)]或兔源的[例如多克隆抗體抗-乙醛脫氫酶1(ChemiconInternational)、抗-葡萄沖唐-6-石粦酸鹽1-脫氫酶(Bethyllaboratories)、才元-異4寧4蒙酸鹽脫氫酶(BiogenecisLtd)和4元-cofilin1(CellSignaling)]。隨后，按照生產(chǎn)商的說明書，將膜用結(jié)合HRP的4爭異性第二羊抗體，抗小鼠IgG或抗兔IgG(SantaCruzBiotechnoly)孵育1小時。胰腺組織的蛋白質(zhì)印跡分析利用共30-50mg新鮮冰凍組織實施，該組織在400^裂解緩沖液(包含50mMTRIS/HC1pH7.4、150mMNaCl、1%NP40、1%TritonX-100、lmMDTT、10jil/ml抑制性混合物、1mMPMSF(均購自SigmaChemicalCo.)和10pl/ml核酸酶混合物(GEHealthcareBio-Sciences))中于;水上進4亍勻質(zhì)化處理(T18basicUltraTurrax)。用超聲4義(ultrasoundsonicator)(HielscherUP200S，3x40秒，振幅40%，周期(cycle)0.5)進行超聲降解(sonication)后，將該混合物離心(4。C,13000rpm/min，30分鐘)。上清中包含20嗎蛋白提取物并用Bradford分析(Bio-RadLaboratories)進4亍測定，在小NuPAGENovex4-12%Bis-Tris(雙[三(羥甲基)]氨基甲烷)預(yù)制凝膠(pre-castgel)(Invitrogen)上進行電泳，并如上所述轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜上。免疫檢測利用ECL(增強化學(xué)發(fā)光，GEHealthcareBio-Sciences)實施,隨后在hyperfilm(GEHealthcareBio-Sciences)上進4亍方丈射自顯影。用"ImageScanner"(GEHealthcareBio-Sciences)獲取已顯影的膜的圖4象，并用"ImageMasterLabscanVer3.00"軟件(GEHealthcareBio-Sciences)i己錄為TIFF才各式并用ImageMaster2DEliteversion3.1軟件(GEHealthcareBio-Sciences)進行分析。為了進行MS分析，將感興趣的斑點從制備型2-DE凝膠上切割下來，并利用基質(zhì)輔助的激光解吸電離/飛行時間(MALDI-TOF)進行分析，必要時，利用電噴霧電離(ESI)進行分析。用25mM碳酸氫銨和50%乙腈的溶液將蛋白脫色過夜，隨后用胰蛋白酶(Promega,Madison,WI，USA)進行凝膠中消化，如前所述(HellmanUetal.，1995)。為了進行MALDI-TOFMS,將每一種肽混合物0.5pl置于目標盤(targetdisk)中并4吏其風(fēng)干。隨后，將0.5(il基質(zhì)溶液(1%w/va-氰基-4-羥基肉桂酸/30。/o乙腈，0.1%TFA)應(yīng)用于干燥才羊品，并^f吏其再次干燥。利用BmkerReflexIIIMALDI-TOF質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜。蛋白消化物的MSi普的判讀(interpretation)矛J用MS畫Fit專欠4牛(http:〃prospector.ucsf.edu;ChamradDetal.,2004)通過"肽質(zhì)量指紋(peptidemassfingerprinting)，，(PMF)而進行。為了實施MS/MS實驗，將胰蛋白酶肽混合物脫鹽并在ZipTipds儀(Millipore)中濃縮。用60%甲醇加1%曱酸洗脫后，將4.5pi胰蛋白酶肽混合物吸入涂有金的硅硼毛細管(gold-coatedborosilicatecapillaryXProxeonBiosystems)并在安裝有纟內(nèi)ESI源、(纟內(nèi)電噴霧離子源，nanoESIsource)的LCQThermo(ThermoFinnigan)離子阱質(zhì)譜儀中分析。將毛細管電壓設(shè)為46V,噴霧電壓設(shè)為1.8kV。收集來自全掃描質(zhì)譜的最穩(wěn)定信號，并通過低能石並撞-誇導(dǎo)解離(CID)進行碎裂，標準化碰撞能量范圍為22-24%。某些蛋白還利用裝配有ESI離子源的LCQDECAXPPlus離子阱質(zhì)i普4義(ThermoFinnigan)通過LC-MS/MS來鑒定。利用Surveyor(自動采才羊器和泵)4義(ThermoFinnigan),以10jal注射體積、200(il/min流速，在C18柱Luna,150x2.0mm(Phenomenex)上進行層析分離，其后為MS分析4義。為了進行所有MS/MS數(shù)據(jù)分析，采用Bioworks3.0(ThermoFinnigan)庫欠件，并利用FASTA壽欠件(http:〃www.ebi.ac.uk/fasta33/:JohnsonRetal.,2005)一等戶斤4尋序歹'J與EBI數(shù)據(jù)庫中存在的人蛋白序列進行比較。影,為、浙所有的統(tǒng)計均利用GraphPadPrism軟件進行計算。數(shù)據(jù)以均值士SEM(均值的標準誤差)示出。利用非配對雙尾f檢驗估計PDA和正常胰腺組織中不同蛋白表達的顯著性。雙側(cè)P值0.05可認為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。結(jié)果CF-PAC-1細胞系的蛋白質(zhì)組，常用作用于PDA相關(guān)蛋白表達和細胞增殖的才莫型(BouvetMetal.，2001;SzepeshaziKeta1.，2005),其用來利用PDA患者的血清作為第一4元體的來源而鑒定與PDA相關(guān)的蛋白和抗體的存在。來自該細胞系的蛋白提取物利用2-DE進行分析，通過銀染色確定代表性的雙向圖譜。該途徑可將該提取物中所包含的蛋白分離為根據(jù)其在2-DE凝膠中的密度和位置而分類的"斑點"，且由此可大致確定蛋白質(zhì)的量、分子量和pl。將2-DE凝膠轉(zhuǎn)移至膜上，以通過蛋白質(zhì)印跡法利用一組來自PDA患者或非PDA患者(包括^建康個體、患其他癌癥的患者以及患慢性胰腺炎的患者)的血清進行分析。不同的斑點圖譜之間(以及2-DE凝膠的銀染圖像與相對應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡圖像之間)的比較，可實現(xiàn)PDA相關(guān)斑點的鑒定，該PDA相關(guān)斑點可例如通過蛋白片,殳的質(zhì)譜分析進一步表征，而該蛋白片l殳利用以受控方式消化蛋白的酶從這些斑點中^是取(圖1)。利用這種途徑，篩選出10個斑點并將其進一步表征為可利用來自PDA患者的血清抗體而唯一識別(圖2A)。該分析限于人IgG抗體，因為已采用的第二抗體特異于這種同型(isotype)。將該10個斑點從制備型凝月交切割下來，并通過MALDI-TOFMS進行分析以鑒定其對應(yīng)于哪種人類蛋白。利用該途徑，將9種不同蛋白鑒定為PDA相關(guān)抗原。兩對斑點對應(yīng)于相同蛋白的同種型，一個斑點包含屬于兩種不同蛋白質(zhì)但不能利用2-DE完全分離的序列。在利用對照血清而實施的蛋白質(zhì)印跡法中，所有這些斑點均不存在或幾乎4全測不到。結(jié)合這些斑點中的一種或多種蛋白的第一抗體可在顯著比例的獲自PDA患者的血清中鑒別出(表I)。在這些PDA相關(guān)抗原性蛋白中，可^^艮據(jù)生物學(xué)活性的類型(其在文獻中已指出)區(qū)分為兩類蛋白。第一組蛋白包括代謝酶a-烯醇化酶(存在于兩個斑點中，每一個斑點對應(yīng)于一個特定的同種型)、；粦酸丙并唐異構(gòu)酶(存在于兩個斑點中，每一個斑點對應(yīng)于一個特定的同種型)、視黃醛脫氫酶-1、葡萄糖-6-磷酸鹽-l-脫氬酶、延伸因子Tu、和異檸檬酸鹽脫氫酶。第二組蛋白中的大多數(shù)被表征為細月包骨架蛋白I型角蛋白細月包骨架lO和Cofilinl。除了利用CF-PAC-1細月包和人血清得到的結(jié)果，將從Y建康和PDA個體中獲得的胰腺提取物利用抗這些蛋白的純化抗體(而非人血清)作為第一抗體在蛋白質(zhì)印跡法中進4亍比4交。該分析可實現(xiàn)蛋白總量(而非限制于一種同種型)的定量，但其表明在獲自PDA患者的活檢組織的胰腺組織中這些蛋白均有不同程度的過表達(表1)。這些蛋白(以及PDA血清中針對其的特異性抗體的存在)的診斷價值通過區(qū)分對應(yīng)于PDA血清中每一種蛋白的斑點是否存在而進一步評估，PDA血清獲自根據(jù)疾病分期而分組的患者，并采用患慢性胰腺炎患者的血清作為對照。蛋白質(zhì)印跡分析表明，針對不同蛋白的自身抗體的存在及其量在不同PDA分期的患者中并非均一分布(圖2B)。在對照血清中，針對大多數(shù)蛋白的自身抗體均不存在，而在II期PDA患者中，除了ENOAl/2是明顯例外，對大多數(shù)蛋白而言，PDA血清包含其的頻率略微升高(低于25%)。自身抗體生成譜中，這些頻率在大多數(shù)晚期得到了證實，其中，鑒于III期和IV期PDA中其頻率持續(xù)增加，因此針對a-烯醇化酶同種型的自身抗體同樣是人們最感興趣的。結(jié)論一種基于血清學(xué)的方法，其結(jié)合人胰腺腫瘤細胞系(CF-PAC-1)的2-DE表達譜和蛋白質(zhì)印跡分析(利用PDA患者血清中的人IgG作為第一抗體)，可鑒定有限數(shù)量的人蛋白及其同種型，而PDA患者針對這些蛋白和同種型產(chǎn)生特異性體液應(yīng)答。除了僅有的一個例夕卜(AL1A1),這些蛋白的表達在PDA活組織才金查中均上調(diào)。此外，針對這些PDA相關(guān)蛋白的抗體的產(chǎn)生，至少對某些抗原而言，看來在疾病B免期顯著增加。這些結(jié)果證實了血清學(xué)方法在鑒定早期PDA診斷的可能標志物(在本情形中，大多數(shù)位于細胞內(nèi))方面的適用性。免疫系統(tǒng)對細胞內(nèi)蛋白發(fā)生反應(yīng)的機制尚不清楚，但可能依賴于腫瘤形成的獨特環(huán)境，其能夠改變腫瘤細胞中細胞內(nèi)酶的定位。Cofilinl(COFl)，作為一種在4曼入偽足(invadopodium)的形成中所涉及的月幾動蛋白解聚酶，在月幾動蛋白重塑、遷移和癌癥中發(fā)揮作用(YamaguchiHetal.,2005),且可能是胂瘤細胞應(yīng)答趨向性或生長因子剌i敫的方向'f生(directionality)所必需的(MouneimneGetal.，2004)。之前曾觀察到COF1的過表達與PDA動物才莫型相關(guān)(CecconiDetal.,2003;SinhaPetal.,1999)。a-烯醇化酶是一種高度保守的代謝酶，具有多種特性且可在不同玉不境中4企觀'J至'J(Pancholi^V,2001;PiastMetal.，2005;TerrierBetal.，2007)。其在細力包表面上作為纖；容酶原受體而表達(Lopez-AlemanyRetal.，2003)并可由B纟田胞識另'J,可能用作一種B細胞激活劑(BabuJetal.，2002)。在胰腺腺癌中已經(jīng)檢測到兩種同種型，但未描述其在翻i斧后Y務(wù)飾方面的分子特征(ShenJetal.,2004)。4十對a-烯醇化酶的自身抗體已經(jīng)在多個不同的生物學(xué)和疾病才莫型中得到鑒定，如癌癥相關(guān)的一見網(wǎng)月莫病(AdamusGetal.，1998;AdamusGetal.，1996)、非小纟田胞肺癌(non-smalllungcancer)和其4也非月夷&泉的癌癥(WO07/072219;US20070172487:HePetal.,2007)、膽;十'性肝石更4匕(AkisawaNetal.，1997)、月S病(FujiiAetal.,2005)和自身免疫病(BallotEetal"2003;Bogda應(yīng)Detal.，2004;GitlitsVetal.,2001),其中a-烯醇化酶作為一種同種型或多種同種型而存在(但還沒有ENOA磷酸化同種型特異性表達的證據(jù))。人們已經(jīng)利用p藍菌體展示(ArzaBetal.,1997;KempEetal.，2002)或肽(AdamusGetal"1998;SatoNetal"2000;WalterMetal"1995;FujiiAetal.，2005)研究了a-烯醇化酶及a-烯醇化酶特異性抗體或自身抗體的特4正。本發(fā)明的結(jié)果證實，鑒于PDA患者血清中抗該蛋白的兩種特定同種型(ENOA1/2)的自身抗體的出現(xiàn)頻率和特異性生成，特定的a-烯醇化酶同種型及用于4企測它們的抗體可作為一種用于PDAi貪斷特別有用的工具(表I和圖2B)。所述抗體可特異于全部或多凄史同種型共有的表位(如實-瞼中采用的純化抗體)或?qū)DA相關(guān)同種型與其他同種型區(qū)分的表位(如那些在PDA血清中存在的抗體)。此夕卜，PDA從II期至IV期進展的特征在于抗ENOA1/2自身抗體生成的極顯著增加，表明與肺瘤大小和生長能力直接關(guān)聯(lián)。對這些同種型的更加詳細的分析不^f義對于確定自身抗體對PDA診斷的預(yù)測價值非常重要，而且對于更加深入理解將其與PDA及與抗該癌癥的可能治療方法聯(lián)系的分子才幾制非常重要。實施例2:分析CF-PAC-1細胞中由自身抗體險測的a-烯醇化酶同種型才才泮十&方法MS為、浙將斑點從制備型2-DE凝膠上切割下來并通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離/飛行時間(MALDI-TOF)進行分析。蛋白用含0.025mol/L碳酸氫銨和50%乙腈的溶液脫色過夜，隨后用胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)進4亍凝月交中消化，如前所述(HellmanUetal.,1995)。為了進行MALDI-TOFMS,將每一種肽混合物0.5pl置于目標盤中，并使其風(fēng)干。隨后，將0.5基質(zhì)溶液(1%w/va-氰基-4-羥基肉桂酸/30%乙腈，0.1%TFA)應(yīng)用于干燥樣品，并再次使其干燥。利用BrukerReflexIIIMALDI-TOF譜儀(Bremen,Germany)獲得譜圖。蛋白消化物的MS譜的判讀利用MS-Fit軟件通過"肽質(zhì)量指紋"(PMF)來進行。碌凝化為、浙人a-烯醇化酶蛋白序列的分析利用下列可在因特網(wǎng)上使用的軟件而實施NetPhos[http:〃www.cbs.dtu.dk/services/;(BlomNetal.,1999)]、NetPhosK[http:〃www.cbs.dtu.dk/services/;(BlomNetal"2004)]、dbPTM[http:〃dbPTM.mbc.nctu.edu.tw/;(LeeTetal.,2006)]、PPSP[http:〃bioinformatics.lcd-ustc.org/PPSP/;(XueYetal.,2006)]和GPSI"http:〃bioinformatics.lcd-ustc.org/gps.—web/predict.php;(XueYetal.,2005)]。^口前戶斤述(YamagataAetal.,2002),采用XPPase(NewEnglandBiolabslnc.)實施磷酸酶處理，并做了如下改良。將團狀(pelleted)CF-PAC-1細胞(30xl()6)重懸浮于1ml裂解緩沖液(1%w/vNP40、1%w/vSDS、50mMTrispH7.6和150mMNaCl蛋白酶抑制劑混合物)中達15小時。用去離子水將裂解物(120相當于2mg蛋白)調(diào)至終體積1240pl，然后力口入20(il的20mMMnCl2溶液和201^1的XPPase緩沖液。添加完成后，輕輕地將溶液混勻。將該混合物分為幾等份，其中每一等份中加入600單位的XPPase?；靹蚝?，將這些等^f分于30°C孵育15小時。蛋白經(jīng)丙酮和氯仿沉淀并用于2-DE分析(參見實施例1)?；谌玖蠙z測磷蛋白是在2-DE凝膠中利用ProQ磷蛋白熒光染Ruby染色(Bio-Rad)而實施的，如生產(chǎn)商說明書和文獻中所述(WuJetal.,2005)。簡言之，在2-DE之后，通過首先在50%甲醇/10%醋酸中固定凝膠30分鐘而實施Pro-Q染色。隨后用雙蒸水洗滌凝月交，并對其進4亍Pro-QDiamond石岸蛋白染色4小時。在用SyproRuby熒光染料染色(過夜)前，通過用含20%乙腈的50mM醋酸鈉，pH4.0連續(xù)洗滌而進4亍脫色。來々活#會逸織的腐#秉紐織^五iV04/^7神型表這的為、^f將從健康個體或PDA患者(II期)活檢組織獲得的胰腺組織在400pi裂解緩沖液(包含5mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%w/vCHAPS、2%v/vIPG緩沖液非線性pH3-10、0.08mol/L二石危蘇糖醇(DTT)、10[Al/mL核酸酶混合物和痕量溴酚藍)中在;水上進4亍勻質(zhì)4匕(Tl8basicUltraTurrax，IKA)。用超聲4義(ultrasoundsonicator)(HielscherUP200S,3x40s,振幅40%,周期0.5，HielscherUltrasonicsGmbH)進4亍超聲降解(sonication)后，將該混合物離心(4°C,13000rpm，30分鐘)，其中蛋白溶液包含于上清中。蛋白濃度用Bradford分析進行測定。如實施例1中所述，將30lag蛋白4是取物在小NuPAGENovex4-12%Bis-Tris預(yù)制凝月交上電泳，轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜、用抗a-烯醇化酶單克隆抗體19/128(MoscatoSetal.，2000)于4°C溫育過4艾，并在蛋白質(zhì)印跡中顯王見。4:成重紐鈕凌^y力記的"V04—￡^04;。從已用編碼融合于組氨酸標簽的人ENOA(僅缺少最開始9個氨基酸)序列的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染的大腸桿菌細胞中純化重組蛋白。簡言之，通過離心從1升培養(yǎng)物中收集細菌細胞，并將細胞團重懸浮于20ml添加了溶菌酶(100昭/ml)和0.7%十二烷基肌氨酸鈉的非變性結(jié)合緩沖液(NBB，20mM磷酸鈉和500mM氯化鈉，pH7.8)中。將該懸浮液于4°C緩')"曼搖動15分鐘。于水上通過10次40秒的高強度脈沖對細胞裂解物進行超聲裂解。將該裂解物以10000rpm于4°C離心5分鐘，以沉淀(pellet)不溶性成分，將其重懸浮于10ml富含蛋白酶抑制劑的胍鹽裂解緩沖液(6M鹽酸胍、20mM磷酸鈉、500mM氯化鈉，pH7.8)中，在室溫下10分鐘。將該裂解物加至已平4紆的柱(Ni-NTA瓊月旨并唐柱，Invitrogen)中通過輕柔搖晃在4°C經(jīng)30分鐘而結(jié)合于樹脂。樹脂用NBB洗滌兩次，隨后用非變性洗滌緩沖液(NWB;NBB,pH6.0)洗滌兩次。洗脫利用10ml咪唑洗脫緩沖液(350mMpH6)來實施，生成重組組氨酸標記的ENOA(rENOA)。將洗脫出的成分在無菌水中透析(dialyse),然后將其凍干并重懸浮于無菌無致熱源的杜爾貝科磷酸鹽緩沖溶液(DPBS,Sigma)中。將各等份儲存于-20。C。在鱟變形細胞溶解須寸定(LimulusAmebocyteLysateassay(Pyrogent;BioWhittaker))中，內(nèi)毒素水平低于0.03EU/ml。^/席,悉者A清和蛋^l伊跡法為V^CF-iMC-/哞^7W24這如前所述，將CF-PAC-12-DE凝月交電轉(zhuǎn)移至HybondECL硝基纖維素膜(GEHealthcare)上。用含5%脫脂奶粉的TBS封閉1小時后，在不同條件下用ENOA1/2+患者的三份血清池(用TBS1:100#希釋)孵育印跡。在一系列實驗中，孵育該膜之前，首先于4。C將血清池(poolofsera)在震蕩器上與20嗎/ml的重組a-烯醇化酶(rENOA)—起孵育15小時。在另外一系列實驗中，首先將膜用2ml含600單位XPPase的PBS、40|il20mM的MnCl2溶液和40(il入PPase緩沖液于30。C孵育15小時。再將月莫封閉1小時、用TTBS洗滌3次(15分鐘)并用混合血清(稀釋度1:100)孵育。如實施例1中所述，血清中抗體與ENOA同種型的結(jié)合利用標記的抗人抗體在蛋白質(zhì)印跡法中顯現(xiàn)。作為所固定的ENOA量的對照，膜用鼠單克隆抗體抗烯醇化酶19/128進行再次檢測(參見實施例1)。結(jié)果在證實PDA患者血清中的抗體特異性檢測到兩種人a-烯醇化酶的同種型后，我們利用不同方法表征這些同種型(以及CF-PAC-1細胞中存在的該蛋白的任何其他同種型)的特征。比較利用抗a-烯醇化酶的純化抗體或不同PDA患者的血清所獲得的蛋白質(zhì)印跡、2-DE凝膠的銀染色以及質(zhì)譜分析，表明2-DE凝月交中還存在另夕卜4個斑點(對應(yīng)于與PDA不相關(guān)的其他a-烯醇化酶同種型)，具有相似分子量但實驗性pi值低于ENOA1/2(表II)。這些證據(jù)是利用CF-PAC-l或MiaPaCa-2細胞提取物在2-DE凝膠分析中獲得的。從這些斑點獲得的肽與ENOA片段相同(且明顯不同于高度相似的人Y-烯醇化酶；圖3),i正實了蛋白質(zhì)印跡"i正據(jù)，即這些斑點應(yīng)該只于應(yīng)于ENOA同種型，其中僅ENOA1/2是PDA相關(guān)的。翻譯后修飾是通常將一種同種型與其他同種型相區(qū)別的特征。初步分析似乎排除了糖基化(鑒于分子量的改變有限)，而暗示了磷酸化修飾(鑒于pl下降)。人a-烯醇化酶的序列包含幾個酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基，它們是可被不同激酶磷酸化的可能靶標。這種假設(shè)通過在2-DE分離之前將蛋白掮j又物暴露于廣泛有效的石粦酸酶來》見察采用石粦酸化依賴性抗體所檢測的斑點強度是否發(fā)生變化而力^以檢測，如關(guān)于其他蛋白的文獻中所示出的(KumarYetal.，2004)。實際上，對應(yīng)于多數(shù)酸性同種型(其為PDA相關(guān)的ENOA1/2和ENOA同種型3;表II)的ENOA斑點的強度在磷酸酶預(yù)處理的CF-PAC-l細胞提取物中明顯下降。此夕卜，ENOA同種型3(比ENOA1/2豐度更高)的質(zhì)譜分析表明，該同種型中殘基55、57、200、236、237、257、和419發(fā)生了磷酸化(圖4)。之前關(guān)于a-烯醇化酶體內(nèi)或體外磷酸化的報道(CooperJeta.，1984;EigenbrodtEetal"1983^MarcusKetal.，2000;RushJetal"2005;StasykTetal"2005;MolinaHetal"2007)大體上均未指出至少三個特定殘基可同時發(fā)生磷酸化，尤其是，ENOA同種型中的殘基55、57、200、236、237、257、#口419發(fā)J見可發(fā)生石粦酸4匕。jt匕夕卜，ENOA同種型3中磷酸化殘基的組合很難利用對ENOA蛋白序列基于軟件的分析而加以預(yù)測，因為其中存在大量的候選磷酸化位點(圖4)。不能排除ENOA同種型3可能具有在質(zhì)譜分析階段未檢測到的其他磷酸化位點，〗旦ENOA1/2應(yīng)該含有翻i奪后^f務(wù)飾的殘基(根據(jù)pi值及采用磷酸酶得到的結(jié)果，極可能也發(fā)生了磷酸化)，這些翻譯后#~飾的殘基將其與ENOA同種型3相區(qū)分。很明顯，多于一種的從ENOA3同種型獲得的肽未表現(xiàn)出這種酸化位點。例如，文獻中特異性鑒定為在已建立的白血病T細胞系中發(fā)生磷酸化的酪氨酸44(RushJetal.,2005)在ENOA同種型3中則未發(fā)現(xiàn)磷酸化。類似地，如在ENOA同種型3中(圖4)，已鑒定殘基57與殘基63共同磷酸化(MolinaHetal.,2007),而不是與殘基55共同》粦酸化。通過將蛋白質(zhì)印跡法中獲得的圖像與利用染料染色2-DE凝膠中總蛋白"艮染或SyproRuby)或特異于石粦蛋白(Pro-QDiamond)的染料染色得到的圖像進行比較而進一步分析利用PDA血清和ENOA特異性抗體檢測到的ENOA同種型中的磷酸化。該分析證實在CF-PAC-1細胞中僅ENOA1/2和3發(fā)生了磷酸化(圖5A;表II)。還通過蛋白質(zhì)印跡法才企測了獲自經(jīng)手術(shù)治療的PDA患者(II期；n=7)的組織和正常胰腺組織(n=l)中的ENOA表達，所采用的抗烯醇化酶抗體結(jié)合在PDA患者血清中檢測到的全部六種同種型共有的特定表4立。在7例PDA活枱riEL織中，有6例中4全測到了全部六種ENOA同種型。相比之下，在正常胰腺中僅四種同種型(ENOA3、4、5和6)可清晰才企測到(圖5B)。因ot匕，可以4,斷出不僅PDA患者產(chǎn)生抗ENOA1/2的抗體，而且這些同種型在PDA胰腺組織中顯著過表達。采用CF-PAC-1細胞提取物在2-DE和蛋白質(zhì)印跡中進一步研究PDA患者血清抗石粦S臾4匕ENOA的反應(yīng)性，以了解該反應(yīng)性是否特異性針對它們的磷酸化表位。因為PDA患者血清對全部6種同種型均發(fā)生反應(yīng)，因此其可能包含對磷酸化或非磷酸化表位均發(fā)生反應(yīng)的抗體。在第一系列實驗中，血清用不含磷酸化殘基的重組人ENOA提前孵育，以觀察暴露于ENOA抗原是否改變血清識別參照胰腺細胞系中ENOA同種型的能力。實際上，2-DE蛋白質(zhì)印跡分析表明，非磷酸化ENOA僅顯著降低了對同種型3、4、5和6的反應(yīng)性，而未影響對ENOA1/2同種型的反應(yīng)性。這種跡象在另一系列實驗中進一步得到了證實，其中膜用磷酸酶(XPPase)提前孵育，以確定患者血清中是否包含對磷酸化的ENOA1/2同種型發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體。如果不存在XPPase,該血清則識別全部ENOA同種型，其中XPPase處理顯著降低了血清對ENOA1/2的反應(yīng)性(圖6)。在經(jīng)過處理或未經(jīng)處理的月莫中，抗ENOAmAb同才羊4企測到了全部同種型(數(shù)據(jù)未示出)，這些數(shù)據(jù)證明，PDA患者血清中的抗體與^壽酸化的ENOA1/2同種型發(fā)生了特異性反應(yīng)。結(jié)論利用不同的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，已經(jīng)鑒定了多種ENOA同種型以及針對這些同種型的抗體(AdamusGetal.，1998;AdamusGetal.，1996;AkisawaNetal.,1997;BallotEetal"2003;BrybomMetal"2005;LubecGetal.，2003;O，DwyerDetal"2002)。然而，這些才PL道未明確證實磷酸化狀態(tài)和位置與PDA進展中抗特定同種型的自身抗體的產(chǎn)生之間的相關(guān)性。其他文章報道了例如采用患者血清在2-DE凝膠的蛋白質(zhì)印跡中所才全測到的與4爭歹木細月包處理(BatyJetal.,2005;BottalicoLetal.,1993;KanamotoTetal.，2002)或疾病(ByrjalsenIetal.,1999;ClauserKetal"1995;NakanishiTetal"2006;TanakaYetal.,2006;US20070172487)相關(guān)的a-烯醇化酶斑點的強度和/或數(shù)量的變化，表明其可能是由于諸如磷酸化的翻譯后修飾。其他才艮道中，還指出了在通過2-DE凝膠分析的PDA樣品中，人a-烯醇化酶是幾種過表達的蛋白之一，并在mRNA和免疫細胞化學(xué)水平得到了確認，但未;H到那些可表征與PDA相關(guān)的a-烯醇化酶的同種型的特異性磷酸化(WO04/55548;ShenJetal"2004;NakanishiTetal"2006;MikuriyaKetal"2007)。在a-烯醇化酶中檢測到的大量翻譯后修飾(表III)中，較早的文獻表明在體內(nèi)和體外均已4企測到磷酸化(CooperJetal.,1984;CoussensPetal"1985;EigenbrodtEetal"1983;GoldenAetal"1986)。最近，已經(jīng)利用2D凝膠、商品化小鼠抗磷酸酪氨酸的抗體(clone4G10,cod.05-321;Biomol)和質(zhì)i普在人血小板中(MarcusKetal.,2000);險測到了a-烯醇化酶的兩種磷酸化同種型。利用2D-凝膠、》文射性標記和質(zhì)譜在TGF(31處理的細胞(MCF-7細胞系)(StasykTetal.，2005)中或者在MIAPaCa細胞(一種胰&良癌細胞系)中沖企測到了a-蹄醇化酶的一種磷酸化變異體(variant),其中烯醇化酶磷酸化隨著用黃酮類處理而降^氐(LeeLetal.，2002)。此夕卜，雙石粦酸化位點位于酪氨酸殘基(44和286;RushJetal.,2005)或酪氨酸與絲氨酸殘基(57和63;MolinaHetal"2007)。然而，這些文獻均未將PDA與已在至少三個位點發(fā)生》粦酸化的a-烯醇化酶同種型的額外石粦酸化、以及與結(jié)合其的抗體關(guān)聯(lián)起來。實施例3:結(jié)合a-烯醇化酶的抗體對表達a-烯醇化酶磷酸化同種型的轉(zhuǎn)化細胞系的生長和增殖的影響材泮+&方法f勿應(yīng)屑增遂^為V,采用完全細胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的RPMI-1640)通過在96孔孩丈孔一反(microplate)中4妄種2-10xl03細月包/孔而實施指定細月包系的體外細胞增殖分析，含有或不含抗a-烯醇化酶的單克隆抗體72/1(MoscatoSetal.,2000)或小鼠IgG1同型對照單克隆抗體(R&DSystems)用估文陰性對照。44或68小時后，每個孑L中力口入20|il曱基四p坐(methyltetrazolium)溶液(MTT;5mg/ml),于37°C再孑咅養(yǎng)4小時。棄去培養(yǎng)基，用DMSO溶解細胞。培養(yǎng)板通過分光光度計在540納米下讀數(shù)。結(jié)果如通過2-DE和蛋白質(zhì)印跡法測定的，抗a-烯醇化酶的抗體對呈現(xiàn)不同a-烯醇化酶表達語的細胞系生長的影響是通過測定MTT的摻入(incorporation)而枱r測的，MTT是一種可4參入存活細月包內(nèi)的化合物，與活性細胞生長、代謝和增殖有關(guān)。利用基于MTT的比色測定，在表達全部六種同種型的轉(zhuǎn)化細胞系中均得到了細胞增殖的顯著抑制，與其是胰腺來源還是非胰腺來源無關(guān)。利用IgG1同型(isotype-matched)只于照單克隆抗體或不表達所述三種磷酸化ENOA同種型的細胞系，該影響則極低(表IV)。因此，抗a-烯醇化酶的抗體能夠抑制(至少部分地)具有特定(x-蹄醇化酶^粦酸化"i普的細月包系生長和增殖，a-烯醇化酶可在PDA相關(guān)生物學(xué)樣品中檢出(如血清或來自活檢的組織)。結(jié)論即便人們通常認為ot-烯醇化酶是一種纟田胞質(zhì)蛋白(cytoplasmaticprotein)，其4乃纟《可凈皮表達為一種纟田月包表面上的生凈勿學(xué)活性蛋白(ArzaBetal"1997;BergmanAetal.,1997;MoscatoSetal"2000;Lopez-AlemanyRetal.，2003)以及一種可溶性因子(BabuJetal.，2002;DemirAetal"2005)。體外數(shù)據(jù)表明，只要轉(zhuǎn)化細胞系表達a-烯醇化酶的磷酸化同種型，該轉(zhuǎn)化細胞系的生長就會由于抗體結(jié)合于在胞外空間中表達的a-烯醇化酶同種型(作為一種細月包表面受體和/或作為一種可溶性蛋白)中所存在的表位而減慢。因此，特異性結(jié)合呈現(xiàn)a-烯醇化酶磷酸化同種型的細胞的單克隆抗體，可抑制轉(zhuǎn)化細胞系的增殖?？刂萍毎鲋车倪@種一幾制看來不^f又存在于PDA中，還存在于其他表現(xiàn)出該分子特4正的癌癥形式中，且可^L'除當?shù)膯慰寺】贵w作為^^標，用于癌癥相關(guān)的治療性應(yīng)用，例如制備用于PDA治療的藥劑以及用于i貪斷和治療PDA患者的方法。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>ND:不確定a通過銀染和蛋白質(zhì)印跡法在2-DE凝膠中檢測為PDA特異性(見圖IB中相應(yīng)斑點編號的4立置)b用特異于每一種蛋白的抗體實施蛋白質(zhì)印跡法。反應(yīng)性線(reactiveline)的強度表示為任意單位的標準化線強度(normalizedlineintensity)(三次實驗的均值士SEM)c采用配對雙尾t檢驗估計所選蛋白標準化線強度的統(tǒng)計學(xué)顯著性d這些蛋白共定4立(colocalize)于同一個斑點中<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表IV:體外增殖分析的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>參考文獻AdamusGetal.(1998).JAutoimm叫11,671-7.Ad則usGctal.(19%).Clin.ImmunolImmunopathol，78，120-9.Aki幼waNetal.，(！的7).JH鄰ato1,26,845-51.ArzaBetal.,(1997).Tli鵬bHa函st,78,1097-〗03.Avr細Dctal"《2004).Proteomics,4，2397-407.BabuJSetal.,(2002).ClinImmunol,104，293-304.BakerCHetid,(2002).CancerRes,62，1996-2003.BalkrtEctal.(2003),ClinChc叫49，634-43,BatyJWctal.(2005).BiochcmJ,389，785-95.BauerTW改al.(2005).CancerRes,65,7775-81.BlwrtadwryyaSetd.(2004),Neoptesia，6,674-86.BergmanActal.,(1997).FEBSLett,417,17-20.BlomNetal.(1999),JMolBiol,294,1351-62.BlomNetal.(2004).Proteomics,4，163349.Bl細幽Metal.(2006).CancerRcs,66,2592-9.BogdanosDPetal.(2004).JAutoimmuneDis,1,4.BottalicoLAetal.(1993).ArteriosclcrThromb,13,264-75.BouvctM(2004),AnnSurgOncol,Ii,637-8,Bo歸tMetal.(200).JClinEndocrinolMeteb,X6,310-6.BrandR.(2001).CancerJ，7，2X7-97.B,CJctal..(2000).CancerRcs,60,2926-35.BrybornMctal.(2005).RcspirRcs、6，，18.ButtcrfieldDAetal.(2006).NeurobiolDis,22,223-32,ByrjalsmIetal.(1999).MolHumReprod,5,748-56.CaoDctai,(2005).ModPathol，18，752-61.CasoniFctal.(2005).JBiolCherry280,16295-304.CastegnaAetal.(2002).JNeurochcr^82，1524-32.CccconiDctal.(2003).Electrophoresis,24,4291-303.ChamradDetal"(2004).Proteomics,4:619-28.ChenRetal.(2005),MolCe!lProteomics,4，523-33,Cla隨Kctal.(1995).ProcNatlAcadSciUSA,92,5072-6.CohenSandMeropolN(2002).IntJGastrointestCancer,32，91-106.ConradsTctal,(2002).BiochemBiophysRcsComm叫290，885-90,CooperJetai.(1984).JBiolChem，259，7835-41.Coi,ssensPctal.(1985).MolCdlBbl,5,2753-63.DemirAetal.,(2005)CeltTissueRes,322，299-311.DraieCetal,(2006).AdvJ讓加ol，卯，51-81,Du纖Getal.(2004),Immunity,2i,137-48,EdbergDetal,(2005》,JBio!Chem，280',1-73.EigenbrodtEctal.(簡).EmboJ，2，1565-70.FariaSetal.(2004),SeminRoentgenol,39，397-41FischerDetal.,(,).JImmunol.125:463-5.Fuj"Act(2005).J.Neuroinim.162:130-6.GitliteVMetal,(2001),』InvestigMed,49，138-45,GogginsM(2005).JClinOncoL23，4524-31,GotoAetal"(,)PracNatlAcadSciUSA,83，852-6.GorgAet(2004).Proteomics,4,3665-85.GrahamDRetal.(2005).〗Physiol，563，1-9.G,旨gMctd.(2006).MolCellProteomks，5,157-7i.HarrisRetal.(2004).DrugDevelopmentResearch.61,137-154.HePetaL,(2007).CancerSci,訴12344240.HcllmanUctal.(簡).AnalBiochetn，224,451-5.Ho油Kcta.(2005).CancerRes，65,賜13-22.HongSHetal.(2004).CancerRes,64，5504-10.shiiTandUchidaK(2,,ChernRes丁oxico〗，17，1313-22,lwabata.Hetal.(2005).Protcomics,5，4653-64.JainMetal"(2007).TrendsBiotedmoL25:307-16.JimcnoAandHidalgoM(2006).MolCancerTher,5,787-%.Jdm幼nRct(2005).Methods.35:223-36.KalumcDEctal.(2003).CurrOpinChcmBiol，7,64-9.Kanamo言oTetal.(2002).EmboJ，21，1219-30.KanskiJetid.(2005).AmJPhysiolHeartCircPhysiol,288，H371-81.KapphahnRetal.(2006).ExpEyeRes,83:，65-75.KempEHetal.(2002).BiochemBiophysResCom,,298,169-77.KhnSetal.,(2005).MolCdk20:17-29,KinlochActal(2005),ArthritisResTher,7，R1421-9.KladeCSetal.(2001》.Protcomics,1,,-8.KleefJetat,(2006).P歸微33:111-118.KoomenJMetal.(2005).ClinCancerRes,i1,1110-8.Koop,nJctal.(2004).ClinCancerRes,10，2386-92.KumarYetal.(2004).Protcomics，4，1672-83.LafflyEandSodoyerR,(2005).HumAntibodies..14:33-55.LaheruDandJaffeeE，(2005).NatRevCancer.5:459-67.LeeLct政(2002).AnticancerRes.22:1615-27.LeeTetal.《2006).NucleicAcidsRes.34:D622-7,LeungTctal.(2005).WorldJGastroenterol.11:5075-8.LevitzkiAandMishatiiE.(2006).AnnuRevBiochcm.75:93-109.LichtenfckRetal.(2003—).BiocWtn脇physActa.1646:21-3〗.LoboEetal.，(2004).』PharmSci.93:2645-68.LogtenbergT'(2007).TrendsBiotechnol.Doi:10.1016(Mibtech.2007.07.005.Lopez-AlemaiiyRetal,(2003).ThnwnbHaemost.90:724-33,LubecGetai.(2003).ProgNeurobiol,69:193-2H,MachidaKct汰L(2003).MolCellProtcomi"s.2:215-33.Matide直lJW.(2003).AmJPathol.163:1687-98.Ma加Mctai.(2002).Trends跟oteclmol.20:261-8.MareusKetal.(2000).Electrophoresis.21:2622-36.MikuriyaKctal.,(2007).lmJOncol.30:849-855.MdinaHetal.,(20O7).Proc,翻,Acad,Sci,U.S.A.畫:2，99-2204.MoscMoSetd.(2000),EurJTmmu加，.30:3575-84.Mo匿imncGctal.(2004).JCellBiol.166:697-708.Nak肌ishiTctal.，<2006).JChromatogrBAnalytTecBiomedLifeSci.838:15-20.NUssonJctal.，(1997).Protein.ExprPurif11:J-16.O'DwyerDetal.(2002).ArchPhysiolBiochem.110:94-8.Okusaka丁etal"(2006).JOPJPancreas.7:332-6.PancholiV.(2001).CellMoiLifeSci.58:902-20.PetMgiMctal.(2005).固CellProtcomics.4:1,-61.PiastMetal.(2005).ActaBiochimPol.52:507-13.QinYetal.(1995),lntJC薩r.60:694-700,RodriguezJAetal.(2005).WorldJSurg.29:297-305.RostyCandGogginsM(2005).MethodsMolMed,103: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