專利名稱：：抗人delta樣配體4的人抗體的制作方法抗人DELTA樣配體4的人抗體
背景技術(shù)：
：Notch信號通道是一種細胞間通訊系統(tǒng)，被多種真核細胞用于許多生物過程，例如分化、增殖和自體調(diào)節(jié)。Delta樣4(D14)或delta樣配體4(D114)(以下稱為"D114")是Notch配體Delta家族的一個成員，它顯示出血管內(nèi)皮的高選擇性表達(Shutteretal.(2000)GenesDevelop.14:1313-1318)。D114是Notch受體包括Notch1和Notch4的配體。人D114的核酸和氨基酸序列分別如SEQIDNO:l-2所示。產(chǎn)生(參閱如美國6，949，245號專利)。請參閱關(guān)于能產(chǎn)生人抗體的非人轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)方法的資料，例如WO94/02602(Abgenix)和美國6,596,541號專利(RegeneronPharmaceuticals)。日本專利申請書2003/047470A2(AsahiKaseiKogyo)敘述了人Notch配體蛋白的細胞外部分的抗體。發(fā)明概述在第一個方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人delta樣配體4(hD114)的人抗體，更佳的是重組人抗體。這些抗體的特點是它以高度親和力與hD114結(jié)合并具有中和D114活性的能力。本發(fā)明的抗體能夠阻斷D114與其Notch受體的結(jié)合，從而抑制D114的信號傳遞。這些抗體可以是全長的(例如，IgGl或IgG4抗體)，或可僅包括一個抗原結(jié)合部分(例如Fab、F(ab，)2或scFv片段)，并可加以修飾以實現(xiàn)其功能，例如消除殘余的效應子功能(Gluwhicheliminatesresidualeffectorfunctions(消除殘余的效應子功能的Glu),Reddyetal.(2000)J.Immunol.164:1925-1933)。在一個實施方案中，本發(fā)明之抗體包括一個選自下列序列的重鏈可變區(qū)(HCVR):SEQIDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、397、413、429、445、461、477、493、509、525、541、557、573、589、605、621、637、653、669、685、701、717、733、749、765、781、797、813、893、897、901、905、909、913、917、921、925、935、939、943和947,或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個首選的實施方案中，該HCVR是SEQIDNO:429或901氨基酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明之抗體包括一個選自下列序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR):SEQIDNO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、405、421、437、453、469、485、501、517、533、549、565、581、597、613、629、645、661、677、693、709、725、741、757、773、789、805、821、895、899、903、907、911、915、919、923、927、937、941、945和949,或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個首選的實施方案中，該LCVR是SEQIDNO:437或903氨基酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明之抗體包含一個選自下列序列的HCVR:SEQIDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、397、413、429、445、461、477、493、509、525、541、557、573、589、605、621、637、653、669、685、701、717、733、749、765、781、797、813、893、897、901、905、909、913、917、921、925、935、939、943和947，或一種與其實質(zhì)上相同的序列；并包含一個選自下列序列的LCVR:SEQIDNO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、405、421、437、453、469、485、501、517、533、549、565、581、597、613、629、645、661、677、693、709、725、741、757、773、789、805、821、895、899、903、907、911、915、919、923、927、937、941、945和949，或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個首選的實施方案中，該HCVR/LCVR是SEQIDNO:429/437或901/903氨基酸序列對。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個重鏈互補決定區(qū)1(CDR1)的人抗體或抗體片段，該重鏈互補決定區(qū)l選自下列序列SEQIDNO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、399、415、431、447、463、479、495、511、527、543、559、575、591、607、623、639、655、671、687、703、711119、735、751、767、783、799、815、831、847、863和879,或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個重鏈CDR2的人抗體或抗體片段，該重鏈CDR2選自下列序列SEQIDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577、593、609、625、641、657、673、689、705、721、737、753、769、785、801、817、833、849、865和881，或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個重鏈CDR3的人抗體或抗體片段，該重鏈CDR3選自下列序列SEQIDNO:IO、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579、595、611、627、643、659、675、691、707、723、739、755、771、787、803、819、835、851、867和883，或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種人抗體或抗體片段，它包含一個選自下列序列的重鏈CDR1:SEQIDNO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、399、415、431、447、463、479、495、511、527、543、559、575、591、607、623、639、655、671、687、703、711119、735、751、767、783、799、815、831、847、863和879，或一種與其實質(zhì)上相同的序列；一個選自下列序列的重鏈CDR2:SEQIDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577、593、609、625、641、657、673、689、705、721、737、753、769、785、801、817、833、849、865和881，或一種與其實質(zhì)上相同的序列；以及一個選自下列序列的重鏈CDR3:SEQIDNO:IO、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579、595、611、627、643、659、675、691、707、723、739、755、771、787、803、819、835、851、867和883,或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個首選的實施方案中，該抗體或抗體片段包含選自下列序列的重鏈CDR1、CDR2和CDR3:SEQIDNO:431/433/435;374/376/378;783/785/787;以及799層細。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個輕鏈CDR1的人抗體或抗體片段，該輕鏈CDR1選自下列序列SEQIDNO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、407、423、439、455、471、487、503、519、535、551、567、583、599、615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839、855、871和887,或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個輕鏈CDR2的人抗體或抗體片段，該輕鏈CDR2選自下列序列SEQIDNO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、409、425、441、457、473、489、505、521、537、553、569、585、601、617、633、649、665、681、697、713、729、745、761、777、793、809、825、841、857、873和889，或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個輕鏈CDR3的人抗體或抗體片段，該輕鏈CDR3選自下列序列SEQIDNO:18、34、50、66、82、98、11、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587、603、619、635、651、667、683、699、715、731、747、763、779、795、811、827、843、859、875和891，或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種人抗體或抗體片段，它包含一個選自下列序列的輕鏈CDR1:SEQIDNO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、407、423、439、455、471、487、503、519、535、551、567、583、599、615、631、647、663、679、695、711、727、743、759、775、791、807、823、839、855、871和887,或一種與其實質(zhì)上相同的序列；一個選自下列序列的輕鏈CDR2:SEQIDNO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、409、425、441、457、473、489、505、521、537、553、569、585、601、617、633、649、665、681、697、713、729、745、761、777、793、809、825、841、857、873和889,或一種與其實質(zhì)上相同的序列；以及一個選自下列序列的輕鏈CDR3:SEQIDNO:18、34、50、66、82、98、11、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587、603、619、635、651、667、683、699、715、731、747、763、779、795、811、827、843、859、875和891，或一種與其實質(zhì)上相同的序列。在一個首選的實施方案中，該抗體或抗體片段包含選自下列序列的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3:SEQIDNO:439/441/443;382/384/386;791/793/795;以及807/809/811。在第二個方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明之抗體或抗原結(jié)合部分的核酸分子。本發(fā)明還包括運載本發(fā)明抗體編碼核酸的重組表達載體，以及引入這類載體的宿主細胞，并包括通過培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞來制造本發(fā)明抗體的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明之抗體包含一個由選自下列序列的核苷酸序列編碼的HCVR:SEQIDNO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、396、412、428、444、460、476、492、508、524、540、556、572、588、604、620、636、652、668、684、700、716、732、748、764、780、796、812、892、896、900、904、908、912、916、920、924、934、938、942和946，或一種與其實質(zhì)上相似具有至少95%同源性的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明之抗體包含一個由選自下列序列的核苷酸序列編碼的LCVR:SEQIDNO:ll、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、404、420、436、452、468、484、500、516、532、548、564、580、596、612、628、644、660、676、692、708、724、740、756、772、788、804、820、894、898、902、906、910、914、918、922、926、936、940、944和948，或一種與其實質(zhì)上相似具有至少95%同源性的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明之抗體包含一個由選自下列序列的核苷酸序列編碼的HCVR:SEQIDNO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、396、412、428、444、460、476、492、508、524、540、556、572、588、604、620、636、652、668、684、700、716、732、748、764、780、796、812、892、896、900、904、908、912、916、920、924、934、938、942和946,或一種與其實質(zhì)上相似具有至少95%同源性的序列；并包含一個由選自下列序列的核苷酸序列編碼的LCVR:SEQIDNO:ll、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、404、420、436、452、468、484、500、516、532、548、564、580、596、612、628、644、660、676、692、708、724、740、756、772、788、804、820、894、898、902、906、910、914、918、922、926、936、940、944和948，或一種與其實質(zhì)上相似具有至少95%同源性的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個重鏈CDR1的人抗體或抗體片段，該重鏈CDR1由選自下列序列的核苦酸序列編碼SEQIDNO:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373、398、414、430、446、462、478、494、510、526、542、558、574、590、606、622、638、654、670、686、702、718、734、750、766、782、798、814、830、846、862和878，或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個重鏈CDR2的人抗體或抗體片段，該重鏈CDR2由選自下列序列的核苷酸序列編碼SEQIDNO:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、100、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375、400、416、432、448、464、480、496、512、528、544、560、576、592、608、624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848、864和880,或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個重鏈CDR3的人抗體或抗體片段，該重鏈CDR3由選自下列序列的核苷酸序列編碼SEQIDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、402、418、434、450、466、482、498、514、530、546、562、578、594、610、626、642、658、674、690、706、722、738、754、770、786、802、818、834、850、866和882，或一種與其實質(zhì)上相似具有至少95%同源性的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種人抗體或抗體片段，它包含一個由選自下列序列的核苷酸序列編碼的重鏈CDR1:SEQIDNO:5、21、37、53、69、85、101、m、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373、398、414、430、446、462、478、494、510、526、542、558、574、590、606、622、638、654、670、686、702、718、734、750、766、782、798、814、830、846、862和878,或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列；并包含一個由選自下列序列的核苷酸序列編碼的重鏈CDR2:SEQIDNO:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、100、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375、400、416、432、448、464、480、496、512、528、544、560、576、592、608、624、640、656、672、688、704、720、736、752、768、784、800、816、832、848、864和880,或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列；還包含一個由選自下列序列的核香酸序列編碼的重鏈CDR3:SEQIDNO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、402、418、434、450、466、482、498、514、530、546、562、578、594、610、626、642、658、674、690、706、722、738、754、770、786、802、818、834、850、866和882，或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列。在一個首選的實施方案中，該抗體或抗體片段包含由選自下列序列的核酸序列編碼的重鏈CDR1、CDR2和CDR3:SEQIDNO:430/432/434;373/375/377;782/784/786;以及798/800/802。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個輕鏈CDR1的人抗體或抗體片段，該輕鏈CDR1由選自下列序列的核苷酸序列編碼SEQIDNO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381、406、422、438、454、47Q、486、502、518、534、550、566、582、598、614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838、854、870和886,或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個輕鏈CDR2的人抗體或抗體片段，該輕鏈CDR2由選自下列序列的核苷酸序列編碼SEQIDNO:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383、408、424、440、456、472、488、504、520、536、552、568、584、600、616、632、648、664、680、696、712、728、744、760、776、792、808、824、840、856、872和888,或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種包含一個輕鏈CDR3的人抗體或抗體片段，該輕鏈CDR3由選自下列序列的核苷酸序列編碼SEQIDNO:17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、410、426、442、458、474、490、506、522、538、554、570、586、602、618、634、650、666、682、698、714、730、746、762、778、794、810、826、842、858、874和890,或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的特點是一種人抗體或抗體片段，它包含一個由選自下列序列的核苷酸序列編碼的輕鏈CDR1:SEQIDNO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381、406、422、438、454、470、486、502、518、534、550、566、582、598、614、630、646、662、678、694、710、726、742、758、774、790、806、822、838、854、870和886,或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列；并包含一個由選自下列序列的核苷酸序列編碼的輕鏈CDR2:SEQIDNO:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383、408、424、440、456、472、488、504、520、536、552、568、584、600、616、632、648、664、680、696、712、728、744、760、776、792、808、824、840、856、872和888，或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列；還包含一個由選自下列序列的核香酸序列編碼的輕鏈CDR3:SEQIDN0:17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369、385、410、426、442、458、474、490、506、522、538、554、570、586、602、618、634、650、666、682、698、714、730、746、762、778、794、810、826、842、858、874和890,或一種與其實質(zhì)上相似的具有至少95%同源性的序列。在一個首選的實施CDR1、CDR2和CDR3:SEQIDNO:438/440/442;381/383/385;79(V792〃94;以及806/808/810。在第三個方面，本發(fā)明的特點是一種分離的抗體或抗體片段，它能特異性結(jié)合hD114并包含選自下列序列的CDR1、2和3:(a)—個含有結(jié)構(gòu)式為X1—X2—X3_X4—X5-X6—X7—X8的氨基酸序列(SEQIDNO:928)的重鏈CDR1區(qū)，其中Xi是Gly;X"是Phe或Tyr;X3是Thr;X"是Phe;x5是Ser、Thr或Asn;乂6是Ser、Asn或Tyr;X是Tyr或Phe;以及X8是Gly或Ala;(b)—個含有結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3—X4—X5-X6-X7_X8的氨基酸序列(SEQIDNO:929)的重鏈CDR2區(qū)，其中X1是lie或Leu;x2是Trp或Ser;x3是Tyr、Ala或Gly;x4是Asp、Ser或Tyr;X5是Gly或Asp;乂6是Ser、Gly、Thr或Val;X是Asn或Asp;以及乂8是Lys或Arg;(c)—個含有結(jié)構(gòu)式為X1—X2-X3—X4—X5—X6-X7—X8-X9-X1。-X11—X12—X13—X14—X15—X16的氨基酸序列(SEQIDNO:930)的重鏈CDR3區(qū)，其中Xi是Ala或Ser;乂2是Arg或Lys;乂3是Asp或Tyr;乂4是Ser、Gly或His;乂5是Asp、Ala或Trp;乂6是Asn、或Phe;X是Tyr、Arg或Lys;乂8是His或Ser;乂9是Gly或Trp;X"是Tyr或Phe;X"是Glu或Asp;X。是Gly、His或Pro;X13是Tyr、Trp或缺位；X"是Phe或缺位；X"是Asp或缺位；以及X"是Pro或缺位。在一個首選的實施方案中，抗體或抗體片段包含選自下列序列的重鏈CDR1、2和3:(a)—個含有結(jié)構(gòu)式為X1—X2—X3—X4—X5—X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDNO:928)的重鏈CDR1區(qū)，其中X"是Gly;X2是Phe;x3是Thr;乂4是Phe;x5是Ser或Asn;x6是Ser或Asn;X是Tyr或Phe;以及乂8是Gly或Ala;(b)—個含有結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4—X5—X6—X7—X8的氨基酸序列(SEQIDNO:929)的重鏈CDR2區(qū)，其中X1是lie或Leu;X2是Trp或Ser;X3是Tyr或Gly;X4是Asp或Ser;乂5是Gly;乂6是Ser、Thr或Val;X是Asn或Asp;以及乂8是Lys或Arg;(c)—個含有結(jié)構(gòu)式為X1—X2-X3—X4—X5-X6—X7-X8—X9-X10-X11-X12-X13—X14—X15—X16的氨基酸序列(SEQIDNO:930)的重鏈CDR3區(qū)，其中Xi是Ala或Ser;乂2是Arg或Lys;乂3是Asp;乂4是Gly或His;x5是Asp或Ala;x6是Phe;x7是Tyr或Arg;乂8是Ser;X9是Gly;X，是Tyr;X"是Glu;X"是Gly或His;X"是Tyr或Trp;X14是Phe或缺位；X"是Asp或缺位；以及X"是Pro或缺位。在一個進一步的實施方案中，該分離的抗體或抗體片段進一步包含(d)—個含有結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-乂7的氨基酸序列(SEQIDNO:931)的輕鏈CDR1區(qū)，其中X1是Gin;X2是Ser;X3是Val;x4是Arg、Ser或Thr;x5是Ser或Gly;x6是Ser或Tyr;以及X7是Tyr或缺位；(e)—個含有結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3的氨基酸序列(SEQIDNO:932)的輕鏈CDR2區(qū)，其中乂i是Gly或Asp;X是Ala或Thr;以及乂3是Ser;以及(f)一個含有結(jié)構(gòu)式為X1-X2—X3-X4—X5—X6—X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQIDNO:933)的輕鏈CDR3區(qū)，其中X!是Gln;X2是Gln或His;x3是Tyr、Arg或Ser;x4是Gly、Ser或Ala;乂5是Ser、Asn或Phe;x6是Trp或Ser;X是Pro;xS是Trp、Pro或Arg;以及X9是Thr。在一個首選的實施方案中，該分離的抗體或抗體片段進一步包含(d)一個含有結(jié)構(gòu)式為X1_X2—X3—X4—X5—X6—X7的氨基酸序列(SEQIDNO:931)的輕鏈CDR1區(qū)，其中X1是Gln;乂2是Ser;乂3是Val;X"是Arg或Ser;乂5是Ser;乂6是Ser或Tyr;以及X是Tyr或缺位；(e)—個含有結(jié)構(gòu)式為X1-X2-乂3的氨基酸序列(SEQIDNO:932)的輕鏈CDR2區(qū)，其中Xi是Gly或Asp;x2是Ala或Thr;以及乂3是Ser;以及(f)一個含有結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQIDNO:933)的輕鏈CDR3區(qū)，其中乂!是Gln;X"是Gln或His;X3是Tyr或Arg;乂4是Gly或Ser;乂5是Ser或Asn;乂6是Tip或Ser;X7是Pro;x8是Pro或Arg;以及x9是Thr。在第四個方面，本發(fā)明的特點是一種完全人源化抗體或抗體片段；經(jīng)體外試驗或基于ELISA的D114阻斷試驗測定(如下所述)，該抗體或抗體片段與hD114結(jié)合時ICso低于約10nM。在一個首選的實施方案中，本發(fā)明的抗體展示的ICso為約500pM或以下。在一個更為首選的實施方案中，本發(fā)明的抗體展示的ICs。為約100pM或以下。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種完全人源化單克隆抗體，它能特異性結(jié)合和抑制人D114,如使用hD114-Fc的Notch誘導的熒光素酶生物鑒定所測定，它展示了低于或等于約150pM、100pM、75pM或50pM的IC5o。如以下實驗部分所示，本發(fā)明的抗hD114抗體與密切相關(guān)的delta蛋白如hDlll和hDU3不發(fā)生交叉反應。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，它能與hD114結(jié)合，經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測定(BIACORETM),例如用二聚hDU4測定，其親和常數(shù)KD小于約500pM、較佳的是小于約300pM、更佳的是小于約100pM、小于約50pM、小于約10pM(表2)。本發(fā)明包括具有一種經(jīng)修飾的糖基化模式的抗hDU4抗體。在某些應用中，進行修飾以除去某些不希望的糖基化位點或除去寡糖鏈上缺乏巖藻糖基的抗體也許是有益的，例如，可提高抗體依賴細胞毒性(ADCC)功能(參閱Shieldetal.(2002)JBC277:26733)。在其它一些應用中,為了改變補體依賴細胞毒性(CDC),可進行半乳糖基化的修飾。本發(fā)明包括能與hD114的特定表位結(jié)合并能阻斷hD114生物活性的抗hD114抗體。D114的胞外結(jié)構(gòu)域是由一個N端結(jié)構(gòu)域、一個Delta/Serrate/Lag-2(DSL)結(jié)構(gòu)域，以及8個類表皮生長因子(EGF)構(gòu)成的一串重復序列所組成的。一般而言，EGF結(jié)構(gòu)域大約出現(xiàn)在hD114(SEQIDNO:2)的氨基酸殘基218-251(結(jié)構(gòu)域1)、252-282(結(jié)構(gòu)域2)、284-322(結(jié)構(gòu)域3)、324-360(結(jié)構(gòu)域4)和362-400(結(jié)構(gòu)域5)處，DSL結(jié)構(gòu)域大約出現(xiàn)在氨基酸殘基173-217處，N端結(jié)構(gòu)域大約出現(xiàn)在氨基酸殘基27-172處。在一個實施方案中，本發(fā)明的封閉抗體與SEQIDNO:2序列上的27至524位氨基酸殘基結(jié)合。在一個較特殊的實施方案中，本發(fā)明的封閉抗體與SEQIDNO:2的N端-DSL結(jié)構(gòu)域27-217內(nèi)的表位結(jié)合；在一個更特殊的實施方案中，該封閉抗體與大約27-172位氨基酸殘基(N端結(jié)構(gòu)域)或173-217(DSL結(jié)構(gòu)域)內(nèi)的表位結(jié)合。在另一個實施方案中，本發(fā)明的封閉抗體與SEQIDNO:2序列上大約252-282位氨基酸殘基內(nèi)的EGF-2表位結(jié)合。在第五個方面，本發(fā)明的特點是一種含有抗人D114重組人抗體和可接受載體的組合物。進一步包括在本發(fā)明中的是一些載體以及含有載體的宿主細胞，這些宿主細胞含有編碼本發(fā)明抗D114人抗體的核酸分子；本發(fā)明還包括生產(chǎn)這些新穎抗體的方法，這些方法包括在允許生產(chǎn)蛋白和收集如此生產(chǎn)的蛋白的條件下，培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明抗D114人抗體或抗體片段的核酸分子的宿主細胞。在第六個方面，本發(fā)明的特點是一些利用本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分來抑制hD114活性的方法。在一個具體實施方案中，該方法包括讓hDU4接觸本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分，使得hD114被禁止與Notch受體例如Notch-l結(jié)合。在另一個具體實施方案中，該方法包括給患有某種通過抑制D114活性可得以減輕的病癥的人類患者施用一種本發(fā)明的抗體或抗體片段。所治療的病癥是一種通過消除、抑制或降低D114活性可得以改善、減輕、抑制或預防的疾病或癥狀，例如與腫瘤血管生成和癌癥相關(guān)的病理性血管生成、免疫缺陷性疾病、移^L排斥或炎癥；以及神經(jīng)變性癥狀，例如與朊病毒疾病相關(guān)的神經(jīng)變性癥狀。本發(fā)明還包括在用于減輕或抑制D114介導的人類疾病或病癥的藥劑制造過程中，應用如上所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。通過審閱以下的詳細說明，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)越性將變得很明顯。
發(fā)明內(nèi)容在描述本發(fā)明的方法之前，應該理解，本發(fā)明并非局限于所描述的具體方法和實驗條件，因為這些方法和條件是可以改變的。還應理解，本文所用的術(shù)語僅出于描述具體實施方案的目的，并非意在限制本發(fā)明，因為本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書的限定。本說明書和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式也具有復數(shù)的含義，除非上下文另行明確規(guī)定。因此，例如，當提及"一種方法"時，它也包括本文所述的一種或多種方法和/或步驟，和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開書時將顯而易見的內(nèi)容。除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語將具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述的方法和材料類似或相當?shù)娜魏畏椒ê筒牧隙伎捎糜诒景l(fā)明的實施或試驗，但現(xiàn)將描述的是首選的方法和材料。定義"Delta樣配體4"、D114"、"hD114"可互換地用來表示由SEQIDNO:1核酸序列編碼的蛋白質(zhì)和具有SEQIDNO:2氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本文所用的術(shù)語"抗體，，意指由四條多肽鏈即兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)通過二硫鍵相互連接而組成的免疫球蛋白分子。每條重鏈均由重鏈可變區(qū)(本文簡稱HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域即CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈均由輕鏈可變區(qū)(本文簡稱LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域即CL組成。VH區(qū)和VL區(qū)可進一步細分為^皮稱為互4卜決定區(qū)(CDR)的超可變區(qū)。這些超可變區(qū)之間散布著被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的較保守區(qū)域。每個VH和VL均由三個CDR和四個FR組成，從氨基端到羧基端按以下順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術(shù)語"高親和力，，抗體是指經(jīng)表面等離子共振技術(shù)例如BIACORE或溶液親和ELISA法測定，其與hD114的結(jié)合親和力為至少10—8M、較佳的是1(T9M、更佳的是10'1QM的抗體。術(shù)語"慢解離速率(slowoffrate)"或"Koff，是指經(jīng)表面等離子共振技術(shù)例如BIACORETM測定，以1xl(T3s"或更低、較佳的是以1x10-4s-1或更低的速率常數(shù)從hD114解離的抗體。"中和抗體"或"封閉抗體，，意指其與D114的結(jié)合將導致D114生物活性被抑制的抗體。這種D114生物活性的抑制可通過測量D114生物活性的一個或多個指標來評估。D114生物活性的這些指標可通過本領(lǐng)域內(nèi)周知的若干標準體外或體內(nèi)測定法(參閱下文實施例)中一種或多種方法進行評估?？贵w中和D114活性的能力最好是以對D114與Notch受體結(jié)合的抑制程度來評估。本文所用的抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡稱"抗體部分"或"抗體片段")這一術(shù)語是指抗體中一個或多個保持了與抗原(例如hD114)特異性結(jié)合能力的片段。業(yè)已證實，抗體的抗原結(jié)合功能可通過一個全長抗體的各個片段來實現(xiàn)。抗體的"抗原結(jié)合部分"這一術(shù)語所涵蓋的結(jié)合片段的實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CHI等結(jié)構(gòu)域所組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，即包含由鉸鏈區(qū)二硫鍵橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH結(jié)構(gòu)域和CHI結(jié)構(gòu)域所組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域所組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域所組成的dAb片段(Wardetal.(1989)Nature241:544-546)以及(vi)分離的CDR。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域即VL和VH是由分別的基因所編碼，但可用重組方法通過一個合成接頭將它們連接在一起；該合成接頭能夠使它們成為一條單一的蛋白質(zhì)鏈，鏈中的VL區(qū)和VH區(qū)會配對而形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參閱例如Birdetal.(1988)Science242:423-426;和Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這種單鏈抗體也被涵蓋在抗體的"抗原結(jié)合部分"這一術(shù)語之中。其它形式的單鏈抗體如雙抗體(diabody)也被涵蓋在內(nèi)。雙抗體是雙價雙特異性抗體，其中的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域被表達在單一多肽鏈上，但所使用的接頭太短以致于同一鏈上的這兩個結(jié)構(gòu)域無法配對，從而迫使這兩個結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(參閱例如Holligeretal.(1993)Proc.Natl.AcadSci,USA90:6444-6448;Poljaketal.(1994)Structure2:1121-1123)。此外，一個抗體或其抗原結(jié)合部分可以是一個較大的免疫黏附分子的一部分；該免疫黏附分子是該抗體或抗體部分與一個或多個其它的蛋白質(zhì)或肽通過共價或非共價締合所形成的。這種免疫黏附分子的實例包括使用鏈霉親和素核心區(qū)來制備四聚scFv分子(Kipriyanovetal.(1995)HumanAntibodiesandHybridomas6:93-101)，以及j吏用半胱氨酸殘基、標記肽和C端聚組氨酸標簽來制備二價和生物素酰化的scFv分子(Kipriyanovetal.(1994)Mol,Immunol.31:1047-1058)?？贵w部分如Fab片段和F(ab')2片段可用常規(guī)的技術(shù)如對完整抗體分別進行木瓜蛋白酶消化或胃蛋白酶消化等技術(shù)從完整抗體制備。此外，如本文所述，抗體、抗體部分和免疫翻附分子還可用標準的重組DNA技術(shù)獲得。本文所用的術(shù)語"人抗體"意在涵蓋含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機誘變或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細胞突變所引入的突變)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括這樣的氨基酸殘基。但是，本文所用的術(shù)語"人抗體"并不意圖包括其中衍生自另一哺乳動物物種如小鼠的CDR序列被嫁接到人構(gòu)架序列上的抗體。本文所用的術(shù)語"重組人抗體"意在包括所有以重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的人抗體，例如用轉(zhuǎn)染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體(將在下文進一步描述)，從重組的組合人抗體庫分離的抗體(將在下文進一步描述)，從人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)分離的抗體(參閱例如Tayloretal.(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287-6295)，或者以任何其它涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列上的方法所制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這類重組人抗體含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。但是，在某些實施方案中，這類重組人抗體經(jīng)受體外誘變(或者當使用人免疫球蛋白序列轉(zhuǎn)基因動物時，經(jīng)受體內(nèi)體細胞誘變)，從而使得重組抗體的vh區(qū)和vl區(qū)的氨基酸序列成為這樣的序列它們雖然衍生自人種系vh序列和vl序列并與人種系vh序列和vl序列有親緣關(guān)系，但也許并不天然地存在于所有的體內(nèi)人種系抗體之中。本文所用的"分離抗體"意指實質(zhì)上不含其它具有不同抗原特異性的抗體的抗體(例如特異性結(jié)合hD114的分離抗體就實質(zhì)上不含能特異性結(jié)合hD114之外抗原的抗體)。但是，特異性結(jié)合hD114的分離抗體對于其它抗原如來自其它物種的hD114分子可具有交叉反應性。此外，分離抗體可實質(zhì)上不含其它細胞材料和/或化學物質(zhì)。本文所用的術(shù)語"表面等離子共振"是指一種光學現(xiàn)象?；谶@種光學現(xiàn)象可利用例如BIACOREtm系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N丄)來檢測生物傳感器基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度的變化，從而對實時生物特異性相互作用進行分析。本文所用的術(shù)語"KD"意指特定的抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。術(shù)語"表位"包括任何能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或t細胞受體的決定簇，較佳的是多肽決定簇。在某些實施方案中，表位決定簇包括分子的化學活性表面基團，如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；惢蚧酋；?；在某些實施方案中，表位決定簇可具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征和/或特定電荷特征。表位是抗原中與抗體結(jié)合的區(qū)域。在某些實施方案中，當一種抗體在蛋白質(zhì)和/或大分子的復雜混合物中優(yōu)先識別它的靶標抗原時，就被稱為是特異性地與抗原結(jié)合。在某些首選的實施方案中，當平衡解離常數(shù)小于或等于io—sm，更佳的是當平衡解離常數(shù)小于或等于10—9m,最佳的是當平衡解離常數(shù)小于或等于10-"m時，就被稱為是特異性地與抗原結(jié)合。當?shù)鞍踪|(zhì)或多肽樣品的至少約60-75%顯示為單一多肽時，該蛋白質(zhì)或多肽則被稱為"實質(zhì)上純的"、"實質(zhì)上均一的"或"實質(zhì)上純化的"。該多肽或蛋白質(zhì)可以是單體或多聚的。實質(zhì)上純的多肽或蛋白質(zhì)通常會占蛋白質(zhì)樣品的約50%、60、70%、80%或90%(重)，更經(jīng)常地為約95%純，較佳的是純度為99%以上。蛋白質(zhì)的純度或均一性可通過本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的許多方法來顯示，例如對蛋白質(zhì)樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的著色劑對凝膠染色以顯現(xiàn)單一的多肽條帶。出于某些目的，可采用HLPC或本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的其它純化方法，來達到更高的分辨率。本文所用的術(shù)語"多肽類似物或變體"是指由一個由至少25個氨基酸的片段所組成的多肽，該氨基酸片段與某氨基酸序列的一部分具有實質(zhì)的同一性，且具有至少一種下列性質(zhì)(1)在適宜的結(jié)合條件下與hD114特異性結(jié)合，或者(2)能夠阻斷D114與Notch受體的結(jié)合。通常，相對于天然的序列，多肽類似物或變體包含一個保守的氨基酸取代(或者插入或缺失)。類似物的長度通常為至少20個氨基酸，較佳的是至少50、60、70、80、90、100、150或200個氨基酸或更長，且往往可以和全長的天然多肽一樣長。首選的氨基酸取代是這樣的氨基酸取代，它們(l)能降低對蛋白水解的敏感性，(2)能降低對氧化的敏感性，(3)能改變形成蛋白質(zhì)復合物的結(jié)合親和力，(4)能改變結(jié)合親和力，和(4)[sic]能賦予或修飾這種類似物的其它物理化學性質(zhì)或功能性質(zhì)。除了天然肽序列之外，類似物可包括各種各樣的序列突變。例如，可在天然序列中實現(xiàn)(較佳的是在多肽中形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外的部分中實現(xiàn))單個或多個氨基酸取代(較佳的是保守的氨基酸取代)。保守的氨基酸取代不應在實質(zhì)上改變母體序列的結(jié)構(gòu)特征(例如取代的氨基酸不應損壞母體序列中出現(xiàn)的螺旋，或者破壞其它類型的作為母體序列特征的二級結(jié)構(gòu))。Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(蛋白、結(jié)構(gòu)與分子原J里)(Creighton1984W.H.FreemanandCompany,NewYork)、IntroductiontoProteinStructure(蛋白結(jié)構(gòu)導論)(Branden&Tooze，eds"1991，GarlandPublishing,NY),以及Thorntonetat.1991，Nature354:105都描述了本領(lǐng)域內(nèi)公認的多肽二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的實例。非肽類似物在制藥工業(yè)中常作為性質(zhì)類似于模板肽的藥物來使用。這類非肽化合物被稱為"肽模擬物"或"模擬肽，，(參閱例如Fauchere(1986)J.Adv.DrugRes.15:29;和Evansetal.(1987)J.Med.Chem.30:1229)。也可用同一類型的D-氨基酸對共有序列的一個或多個氨基酸進行系統(tǒng)性取代(例如用D-賴氨酸取代L-賴氨酸)，以產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。另外，可通過本領(lǐng)域內(nèi)周知的方法(Rizoetal.(1992)Ann.Rev.Biochem.61:387)，例如通過加入能夠形成使肽環(huán)化的分子內(nèi)二碌^橋4定的內(nèi)部半胱氨酸殘基，來產(chǎn)生包含一個共有序列或?qū)嵸|(zhì)上相同的共有序列變異的受約束的肽。在涉及核酸序列的情形下，術(shù)語"序列同一性百分數(shù)"是指對兩個序列進行最大對應程度的比對時兩個序列中相同的殘基。序列同一性比較的長度可以是至少約9個或更多的核苷酸，通常至少約18個核苷酸，更通常至少約24個核苷酸，典型的是至少約28個核苷酸，更典型的是至少約32個核苷酸，最好是至少約36、48個或更多的核苷酸。本領(lǐng)域內(nèi)已知有多種不同的算法可用于測量核苷酸序列同一性。例如，可采用FASTA、Gap或Bestfit來比較多核苷酸序列，它們是WisconsinPackageVersion10.0(GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wis)中的程序。FASTA包括例如FASTA2程序和FASTA3程序，能提供被查詢序列和被檢索序列之間的最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分數(shù)(Pearson(1990)MethodsEnzymol.183:63-98和(2000)MethodsMol.Biol.132:185-219)。除非另有規(guī)定，否則將使用具體程序或算法的默認參數(shù)。例如，各核酸序列之間的序列同一性百分數(shù)，可用FASTA以其默認參數(shù)(字長6,記分矩陣的NOPAM因子)進行測定，或者用Gap以其在GCGVersion6.1中提供的默認參數(shù)進行測定。當提到核苷酸序列時，也包括其互補序列，除非另有說明。因此，若提及某個具有特定序列的核酸分子時，應理解為包括它的具有互補序列的互補鏈。通常，本領(lǐng)域的術(shù)語"序列同一性百分數(shù)，，、"序列相似性百分數(shù)，，和"序列同源性百分數(shù)，，可互換使用。在本申請書中，對于核酸序列而言，這些術(shù)語將具有相同的含義。當提及核酸或其片段時，術(shù)語"實質(zhì)的相似性"或"實質(zhì)的序列相似性，，表示該核酸或其片段在以適當?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔c另一核酸(或其互補鏈)進行最佳比對時，經(jīng)用任何眾所周知的序列同一性算法例如上述的FASTA、BLAST或Gap測定，在至少約90%、較佳的是至少約95%、更佳的是至少約96%、97%、98%或99%的核苷酸堿基中存在著核苷酸序列同一性。當用于多肽時，術(shù)語"實質(zhì)的同一性"或"實質(zhì)上相同"是指兩個肽序列在通過例如GAP程序或BESTFIT程序以默認空隙分量進行最佳比對時，共享至少80%的序列同一性，較佳的是至少90%或95%的序列同一性，更佳的是至少98%或99%的序列同一性。最好的是，不相同的殘基位置的差別僅在于保守的氨基酸取代。"保守的氨基酸取代"是指這樣一種取代，即一個氨基酸殘基被另一個含有化學性質(zhì)(例如電荷或疏水性)相似側(cè)鏈(R基團)的氨基酸殘基所取代。一般而言，保守的氨基酸取代不會在實質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個或更多的氨基酸序列相互之間的差別僅在于保守的取代的情況中，可將序列同一性百分數(shù)或相似性程度向上調(diào)整，以針對取代的保守特性作出校正。進行這種調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參閱例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331。含有化學性質(zhì)相似側(cè)鏈的氨基酸分類的實例包括l)脂族側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂族羥基側(cè)鏈絲氨酸和蘇氨酸；3)含酰胺側(cè)鏈天冬氨酸和谷氨酰胺；4)芳族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和6)含硫側(cè)鏈半胱氨酸和曱硫氨酸。首選的保守氨基酸取代是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代是Gonnetetal.(1992)Science256:144345中所公開的PAM250對數(shù)似然矩陣(PAM250log-likelihoodmatrix)中任何正值的變化。"中度保守的"取代是PAM250對數(shù)似然矩陣中非負值的任何變化。多肽的序列相似性，也稱為序列同一性，通常是用序列分析軟件來測量的。蛋白質(zhì)分析軟件是用指定給各種取代(包括保守氨基酸取代)、缺失和其它修飾的相似性程度對相似的序列進行比對。例如，GCG含有諸如"Gap"和"Bestfit，，的程序，可以默認參數(shù)使用這些程序，以確定緊密相關(guān)的多肽例如來自不同生物物種的同源多肽之間的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白質(zhì)及其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參閱例如GCGVersion6.1。還可以用GCGVersion6.1中的FASTA程序以默認參數(shù)或推薦參數(shù)來比較多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查詢序列和被搜索序列之間的最佳重疊區(qū)域的比對和序列同一性百分數(shù)(Pearson(2000)，出處同上)。當將本發(fā)明的序列與含有大量的來自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫進行比較時，另一首選的算法是BLAST計算機程序，尤其是blastp或tblastn,使用默認參數(shù)。參閱例如Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403410和Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389402。進行同源性比較的多肽序列的長度一般是至少約16個氨基酸殘基，通常是至少約20個殘基，更通常是至少約24個殘基，典型的是至少約28個殘基，最好是多于約35個殘基。當搜索含有來自大量不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫時，最好是比較氨基酸序列。人抗體的制備產(chǎn)生人抗體的方法包括例如VELOCIMMUNE(RegeneronPharmaceuticals)、XENOMOUSEtm技水(Abgenix)、"微小基因座"法以及喧菌體展示技術(shù)。VELOCIMMUNE⑧技術(shù)(美國專利6,596,541)包括一種針對選定抗原而產(chǎn)生高特異性完全人抗體的方法。這種技術(shù)涉及到這樣一種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生該小鼠的基因組包含一些與內(nèi)源小鼠恒定區(qū)基因座有效地連接(operablylinked)的人重鏈和輕鏈可變區(qū)，使得該小鼠能響應抗原刺激而產(chǎn)生一種包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。將編碼該抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA分離出來，并與編碼人重^^和輕鏈恒定區(qū)的DNA有效地連接。然后在能夠表達完全人抗體的細胞中表達該DNA。在具體的實施方案中，該細胞是一種CHO細胞。XENOMOUSEtm才支木(Greenetal.(1994)NatureGenetics7:13-21)能產(chǎn)生一種小鼠，它同時具有來自重鏈基因座和K鏈基因座的人可變區(qū)和恒定區(qū)。在一種供選擇的途徑中，其他一些人采用了"微小基因座"法。其中，通過將來自該免疫球蛋白基因座的各個基因包括在內(nèi)的方式模擬了一種外源免疫球蛋白基因座(參閱例如美國專利5,545,807)。編碼可變區(qū)的DNA可在與編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA有效地連接或不連接的情況下進行分離。其它產(chǎn)生人抗體的方法，包括從人供體分離的方法，是眾所周知的。參閱例如美國專利6，787，637?？贵w可在治療過程中用于阻斷配體-受體之間的相互作用或者抑制受體組分之間的相互作用，而不是通過固定補體和參與補體依賴性細胞毒性(CDC)機制來殺滅細胞。抗體的恒定區(qū)對于抗體固定補體和參與CDC或者通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)來引導細胞殺滅的能力是重要的。因此，可根據(jù)抗體固定補體的需求來選擇抗體的同型。人免疫球蛋白可以兩種與鉸鏈異質(zhì)性有關(guān)的形式存在。在一種形式中，免疫球蛋白分子包含一種約150-160kDa的穩(wěn)定的四鏈構(gòu)建物，其中兩個二聚體通過一個重鏈間的二硫鍵連接在一起。在第二種形式中，該二聚體不是通過重鏈間的二硫鍵連接在一起，而是形成了一個由單一輕鏈和重鏈組成的約75-80kDa的分子。這兩種形式一直難以分離，甚至在親和純化之后也是如此。第二種形式在各種完整IgG同型中的出現(xiàn)頻率，是由于但不限于與抗體的鉸鏈區(qū)同型相關(guān)的結(jié)構(gòu)差異。事實上，人IgG4鉸鏈的鉸鏈區(qū)中的單一氨基酸取代，能使第二種形式的出現(xiàn)頻率(Angaletal.1993MolecularImmunology30:105)顯著地降到使用人IgGl鉸鏈時通常觀察到的水平。本發(fā)明包括在鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)或CH3區(qū)中含有一個或多個突變的抗體。所述的突變可能是合乎需要的，例如在生產(chǎn)中用于提高產(chǎn)率或調(diào)節(jié)效應子功能。本發(fā)明的抗體最好是用VELOCIMMUNE技術(shù)來制備。用目的抗原攻擊其內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)被相應的人可變區(qū)取代的轉(zhuǎn)基因小鼠，從表達抗體的小鼠回收淋巴細胞(如B細胞)?？蓪⒃摿馨图毎c骨髓型細胞系融合，以制備無限增殖的雜交瘤細胞系，再篩選這種雜交瘤細胞系，以鑒別能產(chǎn)生對目的抗原具有特異性的抗體的雜交瘤細胞系?？蓪⒕幋a重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA分離出來，并與合乎需要的重鏈和輕鏈的同型恒定區(qū)連接。這種抗體蛋白可在一種細胞如CHO細胞中產(chǎn)生?；蛘撸部蓮目乖禺愋粤馨图毎苯臃蛛x編碼抗原特異性嵌合抗體的DNA。在各種實施方案中，轉(zhuǎn)基因小鼠包含12個功能性人源可變重鏈基因和11個功能性人源可變k輕鏈基因；25-30個人源重鏈可變基因和18-20個人源可變k輕鏈基因；43-48個人源重鏈可變基因和20-22個人源可變k輕鏈基因；或者約80個人源重鏈可變基因和40個人源可變k輕鏈基因。一般而言，本發(fā)明的抗體具有非常高的親和力，當根據(jù)其與固定在固相或溶液相的抗原之間的結(jié)合進行測量時，通常具有約10力M至約l(T11M的KD。用合乎需要的人恒定區(qū)取代小鼠恒定區(qū)，以產(chǎn)生本發(fā)明的完全人抗體，例如野生型的或經(jīng)修飾的IgGl或IgG4(例如SEQIDNO:950、951或952)。所選擇的恒定區(qū)可根據(jù)具體的用途而改變，但高親和力抗原結(jié)合特性和靶標特異性特性存在于可變區(qū)中。癌癥、傳染病、自身免疫性、免疫缺陷、移植、炎癥、損傷和退行性病癥均可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而進行治療。在因免疫系統(tǒng)功能不當或活性過高所導致的疾病如自身免疫性或炎癥的情況下，可通過抑制免疫細胞功能或減少免疫細胞數(shù)目來改善疾病狀況。這一步可通過阻斷施加在對疾病過程很關(guān)鍵的免疫細胞群體上的正信號，或者刺激施加在這些免疫細胞群體上的負信號來實現(xiàn)。所述的免疫細胞群體如T細胞、B細胞或NK細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞、抗原呈遞細胞、肥大細胞或其它細胞類型。也可通過消除各種免疫細胞群體來抑制過高的活性，例如刺激細胞凋亡，用消耗性抗體或抗體-藥物綴合物靶向特定的表面受體，或者阻斷或改變免疫細胞譜系或特定細胞類型的分化。效率低的或降低的免疫功能可導致各種疾病如癌癥、傳染病和其它免疫缺陷，或使病情惡化。免疫系統(tǒng)的活性減退可通過激活免疫細胞來改善，例如通過用交聯(lián)抗體或激動性抗體刺激正信號，或者通過阻斷負信號來激活免疫細胞。免疫細胞群體可通過刺激某些或所有免疫細胞譜系的發(fā)育、防止細胞凋亡，或者消除抑制性信號來增加。在一個具體的應用中，本發(fā)明的抗體被用于治療、抑制或改善病癥或疾病，例如癌癥、免疫缺陷、移植排斥或炎癥。表位作圖和相關(guān)技術(shù)為篩選能結(jié)合特定表位的抗體(例如能阻斷IgE與其高親和力受體結(jié)合的抗體)，可進行常規(guī)的交聯(lián)-阻斷分析，如HarlowandLane(1990)(出處同上)描述的交聯(lián)-阻斷分析。其它方法包括丙氨酸掃描突變體分析、肽印跡分析(Reineke(2004)MethodsMolBiol248:443-63)或肽切割分析。另外，還可采用諸如抗原的表位切除、表位提取和化學修飾的方法(Tomer(2000)ProteinScience9:487-496)。術(shù)語"表位"是指抗原上B細胞和/或T細胞能對其作出響應的位點。B細胞表位可從毗連的氨基酸形成，或者從通過蛋白質(zhì)的三級折疊而并列在一起的非毗連的氨基酸形成。從毗連的氨基酸形成的表位在接觸變性溶劑時通常可得以保留，而通過三級折疊形成的表位在用變性溶劑處理時通常會失去。表位通常包括至少3個、更經(jīng)常是至少5個或8-10個以獨特空間構(gòu)象出現(xiàn)的氨基酸。修飾輔助概況分析(Modification-AssistedProfiling,MAP),也被稱為基于抗原結(jié)構(gòu)的^元體積X況分一斤(AntigenStructure-basedAntibodyProfiling,ASAP),是一種根據(jù)每種抗體與經(jīng)化學或酶學修飾的抗原表面的結(jié)合狀況的相似性對大量的抗同一抗原的單克隆抗體(mAbs)進行分類的方法(美國專利公開說明書2004/0101920號)。每一類別均可反映與另一類別所代表的表位截然不同或部分重疊的獨特表位。這種技術(shù)可以快速過濾遺傳上相同的抗體，從而可使鑒定工作集中在遺傳上不同的抗體上。當應用于雜交瘤篩選時，MAP有助于鑒定能產(chǎn)生具有預期特性的mAbs的罕見雜交瘤克隆。MAP可用來將本發(fā)明的hD114抗體分類成結(jié)合不同表位的抗體組?？捎糜诟淖児潭ɑ乖慕Y(jié)構(gòu)的物質(zhì)有酶類，例如蛋白水解酶，如胰蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶Glu-C、內(nèi)切蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等。可用于改變固定化抗原的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)還可以是化學物質(zhì)，如琥珀酰亞胺酯類和它們的衍生物、含伯胺的化合物、肼和碳酰肼、游離氨基酸等?？乖鞍卓晒潭ɑ谏飩鞲衅餍酒砻婊蚓郾揭蚁┲榱Ｉ?。后者可用例如多重LUMINEXTM檢測測定法(LuminexCorp.,Austin,TX)之類的測定法進4亍處理。由于LUMINEXTM具有以最多可達100種不同類型的珠粒處理多重分析的能力，LUMINEXtm可提供幾乎無限的包含各種修飾的抗原表面，從而使經(jīng)由生物傳感器測定進行的抗體表位概況分析的分辨率得以提高。治療給藥和制劑本發(fā)明的治療劑將與適宜的載體、賦形劑和其它被加入到制劑中使轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性等得到改進的物質(zhì)一起施用。在雷氏藥學大全(Remington'sPharmaceuticalSciences,15thed.,MackPublishingCompany,Easton,PA)這一所有藥劑師都知道的處方集里，可找到多種適當?shù)膭┬?。這些制劑包括例如散劑、糊劑、軟膏劑、凝膠劑、蠟劑、油劑、脂質(zhì)劑、含脂質(zhì)(陽離子型或陰離子型)的嚢劑(如LIPOFECTIN)、DNA綴合物、無水吸收糊劑、水包油型或油包水型乳劑、carbowax乳劑(不同分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠劑和含有carbowax的半固體混合物。任何前述混合物在按照本發(fā)明的治療和療法中都可能是適宜的，其前提是該制劑不會使制劑中的活性成分失活，且該制劑在生理上與給藥途徑是相容的和可接受的。有關(guān)藥劑師眾所周知的賦形劑和載體的進一步4言息,可參閱Powelletal."Compendiumofexcipientsforparenteralformulations"PDA(1998)JPharmSciTechnol.52:238-311及其中的引用文獻。實施例實施例1:抗人D114的人抗體的產(chǎn)生可通過本領(lǐng)域內(nèi)周知的任何方法進行小鼠的免疫(參閱例如HarlowandLane，出處同上)。在一個實施方案中，將hD114抗原隨佐劑一起，直接給予包含編碼人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和k輕鏈可變區(qū)的DNA基因座的VELOCIMMUNE⑧小鼠，以刺激免疫應答。這種佐劑包括完全和不完全弗氏佐劑、MPL+TDM佐劑系統(tǒng)(Sigma)或RIBI(胞壁酰二肽)(參閱O，Hagan2000VaccineAdjuvant,HumanPress,Totawa，NJ)。以才示準的抗原特異性免疫測定法監(jiān)測抗體免疫應答。當達到預期的免疫應答時，收獲表達抗體的B細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合以保存它們的存活力，從而形成雜交瘤細胞系。用下文描述的測定法，對這種雜交瘤細胞系進行篩選和選擇，以鑒定出能產(chǎn)生抗原特異性抗體的細胞系?；蛘?，可通過流式細胞術(shù)分離抗原特異性雜交瘤細胞。簡言之，在雜交瘤細胞與骨髓瘤細胞融合后，將其集中在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。然后收獲細胞，用2mg/ml的生物素標記D114染色1小時，然后加入藻紅蛋白-鏈霉親和素。將熒光標記的細胞以流式細胞術(shù)分選(向含有雜交瘤生長培養(yǎng)基的96孔平板的每孔中加入單個細胞)，培養(yǎng)8-10天，如下所述對經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基進行篩選，以確定功能上合乎需要的單克隆抗體是否存在。通過直接分離脾細胞產(chǎn)生的抗hD114抗體。如美國專利公開書2007/0280945A1中所述，抗原特異性抗體還可從經(jīng)抗原免疫而不與骨髓瘤細胞融合的B細胞直接分離。從分離出的正確重組子建立穩(wěn)定的表達抗體的重組CHO細胞系。實施例2:抗原結(jié)合親和力測定抗原與上述選定抗體結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Ko值)，根據(jù)實時生物傳感器表面等離子共振分析(BIACORE2000)的表面動力學進行測定。將抗體捕獲在通過與BIACORETM芯片直接化學偶聯(lián)而產(chǎn)生的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體表面上，以形成捕獲抗體表面。將不同濃度的單聚hD114或二聚hD114-hFc注射在捕獲抗體表面，實時監(jiān)測抗原-抗體結(jié)合和解離情況。進行動力學分析，以計算抗原/抗體復合物解離的解離速率常數(shù)Kd和半壽期(表1)。應用類似的方法來測量單一B細胞衍生的、經(jīng)修飾含有人lgG恒定結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體。抗體通過固定在BIACORE芯片上的山羊抗hFc多克隆抗體試劑(JacksonImmunoResearchLab)呈遞，并接觸二聚D114-mFc或單聚D114蛋白(表2)?？贵w-抗原結(jié)合親和力還可用基于ELISA的溶液竟爭分析進行評估。簡言之，在96孔微量滴定板上，將抗體(純化的蛋白質(zhì)或者在經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基中)與0-10pg/ml的抗原蛋白(單聚或二聚)系列稀釋液進行預混合，并保持抗體濃度恒定?？乖c抗體溫育2小時后，將各溶液轉(zhuǎn)移到用抗原預包被的微量滴定板以測量游離抗體(MAXISORBTM，VWR,WestChester,PA)。該微量滴定板是用1|ig/mlhD114-hFc蛋白的PBS溶液于4°C包被過夜，非特異性結(jié)合位點用BSA封閉2小時。轉(zhuǎn)移后經(jīng)溫育1小時后，洗滌該微量滴定板，用HRP綴合的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體試劑(JacksonImmunoLaboratory)4全測與板結(jié)合的抗體，用比色底物(OPTEIA;BDBiosciencesPharmingen，SanDiego，CA)顯色。用1M磷酸終止酶促反應，記錄450nm處的光吸收，數(shù)據(jù)用S形劑量響應^^莫型(sigmoidaldose-responsemodel)進4亍分才斤，并才艮告ICso^(直(表1)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實施例3:D114與Notch相互作用的抑制用基于ELISA的免疫測定法，評估抗體阻斷D114與Notch結(jié)合的能力。簡言之，將Notch-hFc重組蛋白以在PBS緩沖液中1mg/ml的濃度在96孔板上于4°C包被過夜，用BSA封閉非特異性結(jié)合位點。此板用于測量來自抗體滴定樣品溶液的游離生物素-D114-hFc。為制備抗體滴定樣品，將25pM的恒定量的生物素-D114-hFc與不同數(shù)量的抗體預混合；所述抗體或置于粗雜交瘤調(diào)理培養(yǎng)基中，或以純化的抗體蛋白使用，在系列稀釋液中的濃度為0至約50nM;接著在室溫下溫育2小時，讓抗體-抗原結(jié)合達到平衡。然后將平衡的樣品溶液轉(zhuǎn)移到Notch-hFc包被的板上，以測量游離的生物素-D114-hFc。結(jié)合1小時后，洗滌該板，用HRP綴合的鏈霉親和素(PolyHRPstreptavidin,PierceEndogen)檢測結(jié)合的生物素-D114-hFc，用TMB底物(BDPharmigen)顯色。用GraphPadPrism軟件分析數(shù)據(jù)，確定與包被^1上Notch-Fc結(jié)合的生物素-D114-hFc減少達50%所需的抗體量即為ICso值(表3)(*經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>仍使用上述的基于ELISA的免疫測定法，評估選定的經(jīng)純化的抗hD114抗體阻斷D114與Notch結(jié)合的能力，但對該測定法作出如下修改用30pM的生物素-D114-hFc替代25pM的生物素-D114-hFc,并將抗體-抗原溫育時間從2小時減到1小時。為方便起見，將抗體318518-01A10-D8重新命名為"REGN281"(HCVR/LCVRSEQIDNO:429/437和hlgGlSEQIDNO:950)。受試的書亍生抗體包括REGN421(HCVR/LCVRSEQIDNO:901/903、hlgGlSEQIDNO:950)和REGN422(HCVR/LCVRSEQIDNO:901/903,經(jīng)修飾的hlgG4SEQIDNO:952)。結(jié)果如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>使用表達D114的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC),在體外測試抗體中和D114介導的細胞功能的能力。如下所述，監(jiān)測衍生抗體對HUVEC中Notch介導的hHesl和EphB2基因表達的抑制將低傳代HUVEC在MCDB-131培養(yǎng)基(VecTechnologies)中培養(yǎng)。在分析前一天，以2x105個細胞/孔的密度將HUVEC細胞接種在培養(yǎng)基總體積為1ml的24孔板中。將試驗抗體或其它抑制劑一式三份直接加到各個樣品孔中，然后于37°C培養(yǎng)5小時。在培養(yǎng)期末，除去培養(yǎng)基，用QIAZOIJM和脂EASYtmLipidTissueKit(Qiagen)分離總RNA。采用PCR和熒光5，核酸酶分析法(TAQMANassay,AppiedBiosystems)定量分析mRNA水平。對于每個樣品，從l-2mg的總RNA合成cDNA。將從等量的原始RNA(通常25ng)產(chǎn)生的cDNA—式三份加載于ABIPRISMtm光學反應板上。對于每個RNA樣品，還進行其中未加入反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的"無RT"對照試驗，以便減去基因組DNA對信號的任何潛在影響。在每個反應中加入2xMastermix(TAQMAN2xPCRMastermix;ABI)直至lx的終濃度。另外，在每個反應中加入目的基因的TAQMAN⑧探針和引物。每種引物均以900nM的終濃度使用，探針以200nM的終濃度加入。以人基因組DNA作為標準物。分析是在標準的TAQMAN⑧條件下在ABI7900HT儀器上進^亍的。測量Hesl和EphrinB2的水平，并參照內(nèi)源對照基因(親環(huán)蛋白)進行歸一化(表5)。探針和引物人Hesl探針(SEQIDNO:387),引物hHesl-869F(SEQIDNO:388)，hHesl-940R(SEQIDNO:389);人ephrinB2探針hEphB2-773T(SEQIDNO:390),引物hEphB2-752F(SEQIDNO:391),hEphB2-812R(SEQIDNO:392);人親環(huán)蛋白探針人親環(huán)蛋白-343T(SEQIDNO:393)，引物人親環(huán)蛋白-323F(SEQIDNO:394),人親環(huán)蛋白-389R(SEQIDNO:395)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>HUVEC增殖分析。在體外細胞增殖分析中，測試抗體阻斷D114介導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)生長抑制的能力。獲得低傳代HUVEC細胞，并在MCDB-131培養(yǎng)基(VecTechnologies)培養(yǎng)。在分析前一天，將各個12孔組織培養(yǎng)板用hD114-hFc的PBS溶液于4°C包被過夜(0.2pg/ml;0.5mlPBS/孔)。用PBS洗滌(lx)各板，以4xl03個細胞/孔的密度將HUVEC細胞接種在總體積為1.0ml的培養(yǎng)基中。在加入細胞后，隨即加入各種濃度的抗hD114抗體，總體積為0.5ml,以產(chǎn)生抑制曲線。細胞于37。C生長96小時。細胞數(shù)量用CCK-8試劑(Dojindo)定量。所有分軒都重復三次。(表6,NB:不封閉)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>Notch可誘導螢光素酶分析。開發(fā)了一種生物分析法，使用組成性表達人Notchl和含有Notch響應性啟動子驅(qū)動螢光素酶(Notch-responsivepromoterdrivingluciferase)的經(jīng)工程改造的HEK293細胞系(ATCC),測定選定的經(jīng)純化抗體在體外中和D114介導的細胞功能的能力。按照如下所述測定Notch可誘導螢光素酶活性的抑制在測定前一天，將不透明96孔組織培養(yǎng)板的每個孔用100pi的1nM或1.5nMhD114-hFc的PBS溶液于4。C包被過夜。以2xl(^個細胞/孔(培養(yǎng)基中)的密度將細胞接種到經(jīng)包被的板上。將純化的抗體蛋白與細胞于37。C溫育24小時；所述抗體蛋白是在細胞培養(yǎng)基中的系列稀釋液，起始濃度為2nM。螢光素酶活性是通過加入相等孔體積的STEADY-GLO⑧底物(Promega)測定的(表7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實施例4:Notchl切割的抑制通過用SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡法檢查總的被切割Notchl蛋白，來測試選定的抗hD114抗體抑制Notchl切割的能力。如上所述培養(yǎng)低傳代HUVEC細胞。在分析前一天，將各個6孔板用hD114-hFc的PBS溶液于4。C包被過夜(0.2嗎/ml;1.0mlPBS/孔)。用PBS洗滌(lx)各板，以7.5乂105個細胞/孔的密度將HUVEC細胞接種在總體積為2.0ml的培養(yǎng)基中。在細胞接種后，隨即向每孔加入抗hD114抗體，終濃度為10nM。讓細胞于37°C生長24小時，然后制備全細胞提取物，并進行SDS-PAGE分析。用抗被切割的Notchl(Val1744)的抗體(CellSignaling)和標準的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，測定被切割的Notchl的水平。抗hD114抗體能夠完全阻斷包祐:才反上hD114-hFc所誘導的Notchl切割(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例5:ADCC測定和CDC測定用一組具有不同hD114表達水平的八個靶標細胞系，評估兩種試驗抗體(REGN421、REGN422)所誘導的抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)。這八個靶標細胞系是(1)HUVEC;(2)用10nMVEGF刺激24小時的HUVEC;(3)Colo205;(4)表達eGFP的經(jīng)工程改造的C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞；(5)表達hD114的經(jīng)工程改造的C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞；，(6)表達eGFP的經(jīng)工程改造的HT1080細胞；(7)表達hDU4的經(jīng)工程改造的HT1080細胞；和(8)HT29。通過反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染將人D114或eGFP整合到C6細胞或HT1080基因組中。簡言之，首先將每個靶標細胞系的細胞(10,000個細胞/孔，50|al)與等體積的經(jīng)系列稀釋的REGN421或REGN422混合(該系列稀釋產(chǎn)生的最終抗體濃度為0.169pM-10nM),然后在96孔板中于室溫溫育10分鐘(對照=無抗體的孔)。另外，按照常規(guī)的Ficoll-Hypaque梯度離心富集程序，制備人外周血單核細胞(PBMC,效應子細胞)。將大約300,000PBMC加入每個抗體-靶標細胞混合物，使效應子細胞與靶標細胞的最終比例大約為30:1。然后將該96孔板在37。C、5%C02條件下溫育4小時，接著以250xg進行離心。收獲上清液，用CYTOTOX96@非放射性細胞毒性測定系統(tǒng)(Promega)測定乳酸脫氬酶(LDH)活性。結(jié)果如表8所示。REGN421誘導的劑量依賴性細胞裂解僅在表達hD114的C6細胞中觀察到(第5列)，該細胞在所有細胞系中顯示出最高的hD114表達水平(由免疫沉淀法/蛋白質(zhì)印跡法和流式細胞計量法測出)。C6-hD114細胞系中的最大細胞毒性在20%-60%之間。在其余七個靶標細胞系中沒有觀察到REGN421誘導的細胞裂解。REGN422在任何靶標細胞系中都沒有誘導細胞裂解。表8抗體最大細胞毒性％1245678REGN421000020-60000REGN42200000000用上述的同一組細胞系，評估REGN421誘導的補體依賴性細胞毒性(CDC)。簡言之，首先將每個耙標細胞系的細胞(50,000個細胞/孔，50pl)與等體積的經(jīng)系列稀釋的REGN421混合(該系列稀釋產(chǎn)生的最終抗體濃度為0.169pM-10nM),然后在96孔板中于室溫下溫育10分鐘。向每孔加入帶補體成分的正常人血清(QuidelCorp.，SanDiego，CA)，產(chǎn)生的最終血清濃度為5%。然后將各板在37。C、5。/oC02條件下溫育2小時，接著加入CELLTITER-BLUE⑧試劑(Promega)(對照二無抗體的孔和有抗體但無血清的孔)。將各^反溫育過夜，測定細月包存活率(CDC水平)。Daudi細胞用利妥昔單抗處理，作為陽性對照。REGN421沒有顯示對任何受試靶標細胞系的CDC(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例6:表位作圖和特異性為了測定表位結(jié)合特異性，產(chǎn)生了一系列共七個嵌合D114蛋白，其中特定的人D114結(jié)構(gòu)域按照如下所述被置換進一個小鼠D114蛋白#1含有人N端結(jié)構(gòu)域和DSL結(jié)構(gòu)域(S27-Q218);#2含有人N端結(jié)構(gòu)域、DSL結(jié)構(gòu)域和EGF-1結(jié)構(gòu)域(S27-N252);#3含有人N端結(jié)構(gòu)域、DSL結(jié)構(gòu)域、EGF-1結(jié)構(gòu)域和EGF-2結(jié)構(gòu)域(S27-Q283);糾含有人N端結(jié)構(gòu)域、DSL結(jié)構(gòu)域、EGF-1結(jié)構(gòu)域、EGF-2結(jié)構(gòu)域、EGF-3結(jié)構(gòu)域、EGF-4結(jié)構(gòu)域和EGF-5結(jié)構(gòu)域；#5含有人N端結(jié)構(gòu)域(S27-R172);#6含有人DSL結(jié)構(gòu)域(V173-Q218);#7含有人EGF-2結(jié)構(gòu)域(E252-D282)。將各嵌合蛋白與小鼠IgG2a-Fc片段融合，并在CH0-K1細胞中表達。收獲經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基，通過蛋白質(zhì)印跡法證實蛋白質(zhì)表達。按如下所述測試試驗抗體與hD114、mD114及嵌合蛋白弁l、#2、#3和糾的結(jié)合特異性將純化的抗體22G12、VAW3A7-2和15E10在CM5芯片上進行胺偶聯(lián)(5000-6000RU之間)。依序注入來自CHOKl細胞的含有嵌合D114蛋白、hD114-mFc和mD114-mFc的經(jīng)調(diào)理培養(yǎng)基，接著在抗體偶聯(lián)的表面上進行表面再生。以空白的胺偶聯(lián)流通池(flowcell)表面作為經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基的非特異性結(jié)合的對照。其結(jié)果總結(jié)在表9中。22G12結(jié)合hDU4的S27-Q218之間的表位；VAW3A7-2結(jié)合hDU4的Q283-E400的表位；15E10結(jié)合hDU4的E252-D282之間的表位。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>測定了純化的試驗單克隆抗體與hD114、mD114和嵌合蛋白(如上所述)的結(jié)合特異性(REGN279=314266-6F12-B7;REGN287=318518-1G04-F3;REGN289=318518-1H08-E9;REGN290=318518-2A07畫B3;REGN306=318518-3F06-A3)。簡言之，將每個D114蛋白捕獲(70-130RU)在山羊抗小鼠IgG抗體的表面，然后注入濃度為100^g/ml的試驗單克隆抗體。以結(jié)合mD114-mFc的抗體作為陽性對照(陽性對照=6C10)。結(jié)果(表10)顯示REGN279結(jié)合hDU4的S27-Q218之間的表位；REGN287在hD114的Q283-E400之間結(jié)合；REGN289、REGN290和REGN306在hDU4的S27-E400之間結(jié)合。表IO<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>用下列純化試驗抗體，按照如上所述進行更多的表位結(jié)合特異性測定REGN281=318518-1A10-D8;REGN305=318518-3F04-A6;REGN309=318518-14A07-C4;REGN310=318518-14D08-G1;REGN421和REGN422。簡言之，將每個D114蛋白捕獲(240-470RU)在山羊抗小鼠IgG抗體的表面，然后注入濃度為100|ag/ml的試-驗抗體(表11)。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>[sic]蛋白質(zhì)印跡分析。以蛋白質(zhì)印跡分析法測定選定的抗體與嵌合的小鼠和人D114的結(jié)合特異性。簡言之，使用非還原性樣品緩沖液，使hD114-mFc(200ng/泳道)、mD114-mFc(200ng/泳道)和嵌合蛋白弁l畫#7(大約150ng/泳道)在雙份SDS-PAGE凝膠上進行電泳。然后將每份凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。讓各印跡首先接觸0.2|ig/ml的REGN421,然后接觸HRP綴合的抗hlgG抗體(Pierce)。讓對照印跡接觸HRP綴合的抗mFc抗體(Pierce)。結(jié)果:REGN421識別出hD114-mFc和含有人N端結(jié)構(gòu)域(#5)、人DSL結(jié)構(gòu)域(#6)或者這兩個結(jié)構(gòu)域(#1、#2、#3和#4)的嵌合蛋白。REGN421未識別出含有人GF-2結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白(#7)。蛋白酶消化分析。用HPLC1100(Agilent)和LCQClassical離子阱質(zhì)譜儀(Thermo),通過保護性蛋白酶消化和液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)進一步評估REGN281和hD114之間的結(jié)合。簡言之，將摩爾比為1:5的hD114和REGN281的混合物或單獨的hD114,與蛋白酶于25°C(對于GluC蛋白酶)或于37。C(對于胰蛋白酶)溫育過夜。然后將所得的每一種蛋白水解消化混合物以LC/MS分析。在REGN281不存在的條件下進行的蛋白水解其消化物中存在著獨特的肽峰，而在REGN281存在的條件下進行的蛋白水解其消化物中這些肽峰變小或消失。這些肽峰表示hD114上由于REGN281與hD114的結(jié)合而受到保護免被蛋白酶消化的潛在REGN281結(jié)合位點。通過質(zhì)譜對這些獨特的肽峰進行分析。這些肽的觀測質(zhì)量、預測質(zhì)量和N端序列如表12中所示。表12峰觀測質(zhì)量預測質(zhì)量hD114肽(SEQIDNO:2)蛋白酶結(jié)構(gòu)城Gl521521.5Phe37-Glu40GluCN端G21362.81363.4Alal21-Glu132GluCN端Tl758760.8Pro49-Arg55胰蛋白酶N端T2587.1587.2Tyrl69-Arg172胰蛋白酶N端T31607.41607.6Vall73-Arg186胰蛋白酶DSLT413991400.7Gly42-Arg55胰蛋白酶N端T5569.2569.3Thr56-Arg59胰蛋白酶N端T726152613.4Hel43-Arg166胰蛋白酶N端T8腦.2畫.9Ser27-Arg41胰蛋白酶N端實施例7:純化的抗體與人和猴D1W的結(jié)合親和力用BIACORE2000和3000,對選定的純化抗體與hDU4單體、馬來獼猴(M/ac^cw/a&)D114單體(mfDU4，SEQINNO:956),以及恒河獼猴(Mmw/a加)D114單體(mmD114,SEQIDNO:957)的結(jié)合親和力進行測定。用固定在BIACOREtm芯片上的山羊抗hFc多克隆抗體試劑呈遞REGN281、REGN421和REGN422以不同濃度的每種蛋白質(zhì)hDU4(12.5nM-100nM)、mfDU4(3.13.nM-100nM)或mmDU4U2.5nM-100nM)作為被分析物，注射在抗體表面上。實時監(jiān)測結(jié)合的復合物的抗原-抗體結(jié)合和解離情況(表13)。表13ka(M-ls國l)kd(s-l)KD(nM)hDU4m咖4mmDU4h加4mfDU4mmDU4tiDU4mfD114mmDU4REGN2811.56x1056.64x1049.27x1042.30x10-52.04x10-53.05x10-50.1480.3070.329REGN4211.63x1057.28x1049.70x1042.17x10-52.02x10-53.23x10-50.1330.2780.333REGN4221.64x1058.01x1049.27x票2.36x10-52.88x10-53.41x10-50.1440.3600.375仍使用BIACORE2000和上述方法，但用hD114-mFc(3.13nM-100nM)代替hDU4或者用mmD114-mFc(0.78nM-25nM)代替mmDU4作為被分析物，測定了抗hD114抗體對hDU4二聚體和mmD114二聚體的結(jié)合親和力(表14)。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實施例8:抗體對hDlll、hDU3、mDU4或mfDU4的交叉反應性測定了抗體對人Delta樣配體1蛋白(SEQIDNO:953)和人Delta樣配體3蛋白(SEQIDNO:954)的交叉反應性。REGN281、REGN421和REGN422通過固定在BIACOREtm芯片上的山羊抗人k(hK)多克隆抗體試劑(SouthernBiotech)呈遞，以100jug/ml的hD114-hFc蛋白或hDlll-hFc蛋白作為被分析物注射在抗體表面上。所有三種抗hD114抗體僅與hD114-hFc結(jié)合，但不與hDlll-hFc結(jié)合。用另選的BIACOREtm模式(format)，評估抗hDU4抗體和hDlll-hFc或hD113-hFc之間的交叉反應性。簡言之，將配體hD114-hFc、hDlll-hFc和hD113-hFc分別通過胺偶聯(lián)共價連接到CM-5芯片上至約8,000-10,000的RU范圍。將300lig/ml的REGN421注射到每個芯片的表面。REGN421僅與hD114-hFc結(jié)合；未觀察到其與hDlll-hFc或hD113-hFc的結(jié)合。用REGN422代替REGN421也觀察到相同的結(jié)果。采用基于OCTET的結(jié)合測定法，來測定選定的經(jīng)純化的抗hD114抗體和hD114-hFc、hD113-hFc、hDlll-hFc、mfD114-mmh或mD114-mFc之間的結(jié)合。簡言之，將鏈霉親和素高結(jié)合FA生物傳感器(ForteBio,Inc.，MenloPark,CA)首先與5^ig/ml的生物素-抗hK于30。C溫育10分鐘，以達到飽和。接著將生物素-抗hK結(jié)合的生物傳感器與20pg/ml的抗體REGN281、REGN421或REGN422于30。C溫育10分鐘，以達到飽和。然后將抗體結(jié)合的生物傳感器與200nM的hD114-hFc或hD113-hFc、hDlll-hFc或mD114-mFc或100nM的mfD114-mmh于30。C溫育10分鐘。然后將抗體結(jié)合的生物傳感器與200nM的hD114-hFc或hD113-hFc、h謹-hFc或mD114畫mFc或100nM的mfD114-mmh于30。C溫育IO分鐘。測量每次溫育后生物層的厚度的變化。hD114-hFc和mfD114-mmh結(jié)合了抗hDU4抗體結(jié)合的生物傳感器，而hD113-hFc、hDlll-hFc和mD114-mFc未與抗hD114抗體結(jié)合的生物傳感器結(jié)合。實施例9:抗hD114抗體對肺瘤生長的影響在表達人源化D114蛋白的嚴重復合型免疫缺乏癥(SCID)小鼠(SCIDxhD114)體內(nèi)所植入的肺瘤上，評估REGN421對腫瘤生長的影響。簡言之，該人源化D114小鼠是這樣制備的用胚胎千(ES)細胞中人D114基因(7kb)的相應胞外區(qū)取代小鼠D114基因的整個胞外域。產(chǎn)生出純合的hD114小鼠，并繁殖到SCID背景中。然后給每只小鼠皮下(SC)植入2.5x106個人HT1080肺瘤細胞。待腫瘤在小鼠中定植后(~100-150mm3,植入后18天)，對各小鼠進行測量并用hFc、hD114-Fc或REGN421處理。將總共7只小鼠分成三組。第一組(n=3)用25mg/kg的hFc皮下處理；第二組(n=l)用25mg/kg的hD114-Fc處理；第三組(n=3)用10mg/kg的REGN421處理。這類處理是從第18天開始每48小時重復進行。體內(nèi)腫瘤測量值是在初始處理前三天(第15天)、每次處理的當天(第18、20和22天)和在第25天獲得。腫瘤大小用公式lxw"2計算。結(jié)果如表15所示。在第25天，對小鼠施以安樂死，移取每個腫瘤，進行離體(exvivo)測量及計算(長x寬x高)(表16)。另外，給一組表達內(nèi)源mD114的SCID小鼠(n=2)植入腫瘤細胞，并按相同的劑量方案用hD114-Fc(25mg/kg)進行處理。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>權(quán)利要求1.一種特異性結(jié)合人delta樣配體4(hDll4)的人抗體或抗體片段，經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測量，其親和常數(shù)(KD)等于或小于約500pM。2.如權(quán)利要求l所述的人抗體或抗體片段，其特征為親和常數(shù)Ko等于或小于約400pM。3.如權(quán)利要求1或2所述的人抗體或抗體片段，它包括一個選自下列序列的重鏈可變區(qū)(HCVR):SEQIDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、397、413、429、445、461、477、493、509、525、541、557、573、589、605、621、637、653、669、685、701、717、733、749、765、781、797、813、893、897、901、905、909、913、917、921、925、935、939、943和947。4.如權(quán)利要求3所述的人抗體或抗體片段，它包括一個選自下列序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR):SEQIDNO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、405、421、437、453、469、485、501、517、533、549、565、581、597、613、629、645、661、677、693、709、725、741、757、773、789、805、821、895、899、903、907、911、915、919、923、927、937、941、945和949。5.如權(quán)利要求4所述的人抗體或抗體片段，其特征為該HCVR/LCVR是選自SEQIDNO:429/437和901/903序列。6.如權(quán)利要求5所述的人抗體或抗體片段，其進一步包括一個選自SEQIDNO:950、951和952的恒定區(qū)。7.如權(quán)利要求1或2所述的人抗體或抗體片段，它包括一個重鏈互補決定區(qū)3(CDR3)和一個輕鏈CDR3，其特征為該重鏈CDR3包含一個結(jié)構(gòu)式為X1—X2—X3-X4-X5-X6—X7-X8—X9—X10-X11—X12-X13-X14—X15-X16的氨基酸序列(SEQIDNO:930)，其中X!是Ala或Ser;乂2是Arg或Lys;乂3是Asp;乂4是Gly或His;x5是Asp或Ala;乂6是Phe;x7是Tyr或Arg;乂8是Ser;乂9是Gly;X"是Tyr;X11是Glu;X12是Gly或His;X13是Tyr或Trp;X"是Phe或缺位；X"是Asp或缺位；以及X"是Pro或缺位；且該輕鏈CDR3包含一個結(jié)構(gòu)式為X1-X2—X3-X4-X5-X6-X7-X8一乂9的#、基酸序列(SEQIDNO:933)，其中乂！是Gin;乂2是Gki或His;x3是Tyr或Arg;x4是Gly或Ser;x5是Ser或Asn;x6是Trp或Ser;X7APro;x8是Pro或Arg;以及x9是Thr。8.如權(quán)利要求7所述的人抗體或抗體片段，它進一步包括一個包含結(jié)構(gòu)式為X1，X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDNO:928)的重鏈CDR1區(qū)，其中乂i是Gly;乂2是Phe;乂3是Thr;乂4是Phe;乂5是Ser或Asn;x6是Ser或Asn;x7是Tyr或Phe;以及x8是Gly或Ala;一個包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDNO:929)的重鏈CDR2區(qū)，其中乂!是lie或Leu;X"是Tip或Ser;乂3是Tyr或Gly;乂4是Asp或Ser;乂5是Gly;乂6是Ser、Thr或Val;X是Asn或Asp;以及乂8是Lys或Arg;一個包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7的氨基酸序列(SEQIDNO:931)的輕鏈CDR1區(qū)，其中乂!是Gin;X"是Ser;乂3是Val;X"是Arg或Ser;乂5是Ser;乂6是Ser或Tyr;以及X是Tyr或缺位；以及一個包含結(jié)構(gòu)式為X1-X2-X3的氨基酸序列(SEQIDNO:932)的輕鏈CDR2區(qū)，其中乂！是Gly或Asp;X"是Ala或Thr;以及乂3是Ser。9.如權(quán)利要求1或2所述的人抗體或抗體片段，它包括一個選自下列序列的重鏈CDR3區(qū)SEQIDNO:IO、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、403、419、435、451、467、483、499、515、531、547、563、579、595、611、627、643、659、675、691、707、723、739、755、771、787、803、819、835、851、867和883;以及一個選自下列序列的輕鏈CDR3區(qū)SEQIDNO:18、34、50、66、82、98、11、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、411、427、443、459、475、491、507、523、539、555、571、587、603、619、635、651、667、683、699、715、731、747、763、779、795、811、827、843、859、875和891。10.如權(quán)利要求9所述的人抗體或抗體片段，它進一步包括一-個選自下列序列的重鏈CDR1區(qū)SEQIDNO:6、22、354、7086、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、399、415、431、447、463、479、495、511、527、543、559、575、591、607、623、639、655、671、687、703、711119、735、751、767、783、799、815、831、847、863和879;-個選自下列序列的重鏈CDR2區(qū)SEQIDNO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、401、417、433、449、465、481、497、513、529、545、561、577、593、609、625、641、657、673、689、705、721、737、753、769、785、801、817、833、849、865和881;一個選自下列序列的輕鏈CDR1區(qū)78、94、110、126、142、158、174、270、286、302、318、334、350、366471、487、503、519、535、551、567663、679、695、711、727、743、759855、871和887;以及一個選自下列序列的輕鏈CDR2區(qū)80、96、112、128、144、160、176、272、288、304、320、336、352、368473、489、505、521、537、553、569665、681、697、713、729、745、761857、873和889。11.一種編碼上述任何一項權(quán)利要求所述抗體或抗原結(jié)合片段的分離的核酸分子。12.—種含有如權(quán)利要求11所述核苷酸序列的載體。13.—種宿主-載體系統(tǒng)，用于生產(chǎn)特異性結(jié)合人D114的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，并在適宜的宿主細胞中含有如權(quán)利要求12所述的載體。14.一種如權(quán)利要求11所述的宿主-載體系統(tǒng)，其特征為該宿主細胞是一種選自大腸桿菌或CHO細胞的原核細胞或真核細胞。15.—種生產(chǎn)抗人D114抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，它包括在允許生產(chǎn)抗體或其片段以及收集如此生產(chǎn)的抗體或其片段的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求13或14所述宿主-載體系統(tǒng)的細胞。SEQIDNO:14、30、46、62、l卯、206、222、238、254、、382、407、423、439、455、、583、599、615、631、647、、775、791、807、823、839、SEQIDNO:16、32、48、64、192、208、224、240、256、、384、409、425、441、457、、585、601、617、633、649、、777、793、809、825、841、16.在用于減輕或抑制D114介導的人類疾病或病癥的藥劑制造過程中，應用如權(quán)利要求1至10中任何一項所述的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。17.如權(quán)利要求16所述的應用，其中所述D114相關(guān)的癥狀或疾病是病理性血管生成、癌癥、免疫缺陷性疾病、移植排斥或炎癥。全文摘要一種分離的人抗體或人抗體片段，它能特異性結(jié)合人delta樣配體4(hDll4)并阻斷hDll4與Notch受體的結(jié)合。該抗hDll4人抗體或抗體片段能與hDll4結(jié)合，經(jīng)表面等離子體共振技術(shù)測量，其親和常數(shù)≤500pM。文檔編號C07K16/18GK101611055SQ200780046030公開日2009年12月23日申請日期2007年12月14日優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日發(fā)明者E·史密斯,G·瑟斯頓,I·諾古埃拉-特羅伊塞,J·H·瑪丁,N·J·帕帕多波洛斯申請人:里珍納龍藥品有限公司