專(zhuān)利名稱(chēng)：光可斷裂的標(biāo)記核苷酸和核苷與標(biāo)記的核苷酸和核苷以及其在dna測(cè)序中的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及用于DNA測(cè)序和其它類(lèi)型DNA分析的化合物和方法。更具體而言，本發(fā)明涉及利用光可斷裂基團(tuán)標(biāo)記的核苷酸和核苷、利用不可斷裂基團(tuán)標(biāo)記的核苷酸和核苷以及其在DNA測(cè)序和分析中的使用方法。

背景技術(shù)：
快速DNA測(cè)序方法已經(jīng)成為分析種群中疾病和突變以及開(kāi)發(fā)治療方法的需求。最常觀察到的人序列變異形式是單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其以大約1/300至1/1000個(gè)基因組序列堿基對(duì)而存在。基于人基因組全序列，正在努力通過(guò)繪制SNP譜或直接關(guān)聯(lián)來(lái)確認(rèn)成為常見(jiàn)疾病原因的基因關(guān)聯(lián)?；诳焖佟⒏咄亢偷统杀镜腄NA測(cè)序技術(shù)的開(kāi)發(fā)將促進(jìn)對(duì)遺傳信息(例如SNP)在應(yīng)用醫(yī)學(xué)中的理解和應(yīng)用。
一般而言，10％-15％的SNP將通過(guò)改變特定氨基酸殘基來(lái)影響蛋白質(zhì)功能、通過(guò)改變剪切機(jī)制來(lái)影響對(duì)基因的適當(dāng)加工、或者通過(guò)改變調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)影響基因或蛋白質(zhì)的正常表達(dá)水平。設(shè)想信息性SNP的鑒定將導(dǎo)致對(duì)遺傳病的更準(zhǔn)確診斷、對(duì)風(fēng)險(xiǎn)易感性的更好預(yù)測(cè)、或?qū)M織中偶發(fā)性突變的識(shí)別。個(gè)體SNP特性的一個(gè)應(yīng)用將是利用預(yù)防性藥物治療來(lái)顯著延遲疾病的發(fā)生或進(jìn)展。
此外，藥物代謝基因的SNP特性可用于制定具體的給藥方案以提供更安全和更有效的結(jié)果。為實(shí)現(xiàn)這些宏大的目標(biāo)，基因組測(cè)序?qū)⑦M(jìn)入具有對(duì)大多數(shù)種群進(jìn)行部分測(cè)序可能性的重測(cè)序(resequencing)階段，其將涉及對(duì)特定區(qū)域或分布在整個(gè)人類(lèi)基因組中的單堿基對(duì)進(jìn)行平行測(cè)序以獲得特定復(fù)雜疾病的SNP特性。
成為大多數(shù)常見(jiàn)疾病原因的序列變異很可能與分散在全部相關(guān)基因中并以低頻率存在的多個(gè)SNP有關(guān)。因此，與僅靶向已知SNP的技術(shù)相比，利用從頭測(cè)序策略的DNA測(cè)序技術(shù)更可能檢測(cè)和/或發(fā)現(xiàn)這些少見(jiàn)的、廣泛分布的變異體。
傳統(tǒng)上，通過(guò)“Sanger”法或“雙脫氧”法實(shí)現(xiàn)DNA測(cè)序，其包括通過(guò)利用DNA聚合酶引入2’，3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP)的DNA合成的鏈終止(Sanger，F(xiàn).，Nicklen，S.，and Coulson，A.R.(1977)DNAsequencing with chain-terminating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467)。所述反應(yīng)還包括天然2’-脫氧核苷酸(dNTP)，其通過(guò)DNA合成擴(kuò)增DNA鏈。鏈擴(kuò)增與鏈終止之間的大體平衡的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致形成一系列套式DNA(nested DNA)片段，其均勻地分布在數(shù)以千計(jì)的堿基中并且在堿基對(duì)增長(zhǎng)尺寸方面不同。利用電泳根據(jù)套式DNA片段的各自尺寸對(duì)其進(jìn)行拆分。測(cè)序反應(yīng)中的dNTP/ddNTP比決定鏈終止的頻率，并因此決定終止鏈的長(zhǎng)度分布。然后，當(dāng)利用合適的激光源照射時(shí)，通過(guò)之前的4種不同熒光團(tuán)與4種DNA堿基(即A、C、G和T)的結(jié)合發(fā)出其各自顏色的熒光來(lái)檢測(cè)所述片段。目前，Sanger測(cè)序通過(guò)直接PCR測(cè)序(Gibbs，R.A.，Nguyen，P.-N.，McBride，L.J.，Koepf，S.M.，and Caskey，C.T.(1989)Identification of mutationsleading to the Lesch-Nyhan syndrome by automated direct DNAsequencing of in vitro amplified cDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1919-1923)或基因組測(cè)序(Hunkapiller，T.，Kaiser，R.J.，Koop，B.F.，and Hood，L.(1991)Large-scale and automated DNA sequencingDetermination.Science 254，59-67；International Human GenomeSequencing Consortium.Initial sequencing and analysis of the humangenome.(2001)Nature 409，860-921)已經(jīng)成為用于發(fā)現(xiàn)SNP的最廣泛應(yīng)用的方法。
另一種具有前景的測(cè)序方法是周期可逆終止(CRT)，其為一種測(cè)多模板的同步單個(gè)堿基加成的周期性方法。該方法本身與Sanger法(Metzker，M.L.(2005)Genome Rex 15，1767-1776)的不同之處在于其可不需要凝膠電泳(其為推進(jìn)該領(lǐng)域的主要瓶頸)而進(jìn)行。然而，與Sanger測(cè)序相似，讀取長(zhǎng)度較長(zhǎng)意味著需要較少次測(cè)序試驗(yàn)來(lái)覆蓋整個(gè)基因組。
仍然難于實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)CRT讀取的目標(biāo)，因?yàn)槔每缮藤?gòu)的DNA聚合酶，可逆的終止子通常起到弱底物的作用。利用3’-O-阻滯基團(tuán)和通過(guò)連接基團(tuán)與熒光染料結(jié)合的核堿基構(gòu)成可逆的終止子。在隨后的堿基加成之前，阻滯基團(tuán)和染色基團(tuán)均需要除去。這些核苷酸修飾不能良好地耐受DNA聚合酶，這可通過(guò)多種策略進(jìn)行突變來(lái)提高酶性能。脫保護(hù)時(shí)，將核堿基連接物置于一邊，隨著其后的CRT循環(huán)，在生長(zhǎng)中的DNA雙螺旋中進(jìn)行依次累積。據(jù)信弱的酶動(dòng)力學(xué)和隨后修飾的DNA雙螺旋限制了較長(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度。本發(fā)明部分地描述了需要終止部分和熒光染色部分的單一結(jié)合來(lái)提高酶動(dòng)力學(xué)和脫保護(hù)效率的新的可逆核苷酸結(jié)構(gòu)。這些可逆終止子通過(guò)多種可商購(gòu)的DNA聚合酶而被有效地引入，所述生長(zhǎng)中的DNA雙螺旋通過(guò)脫保護(hù)步驟轉(zhuǎn)變?yōu)槠涮烊粻顟B(tài)。
CRT技術(shù)的DNA測(cè)序讀取長(zhǎng)度由每個(gè)核苷酸加成循環(huán)的總效率所決定。例如，如果認(rèn)為50％原始材料的終點(diǎn)具有可接受的信噪比，那么下述等式可用于評(píng)價(jià)循環(huán)效率對(duì)讀取長(zhǎng)度的作用(RL)Ceff＝0.5，其中RL是堿基的讀取長(zhǎng)度，Ceff是總循環(huán)效率。換句話(huà)說(shuō)，可以通過(guò)90％的總循環(huán)效率實(shí)現(xiàn)7個(gè)堿基的讀取長(zhǎng)度，通過(guò)99％的循環(huán)效率實(shí)現(xiàn)70個(gè)堿基的讀取長(zhǎng)度，可通過(guò)99.9％循環(huán)效率實(shí)現(xiàn)700個(gè)堿基的讀取長(zhǎng)度。為實(shí)現(xiàn)對(duì)大長(zhǎng)度測(cè)序的目標(biāo)，所述方法必須提供非常高的循環(huán)效率或者所述恢復(fù)可降至可接受的信噪比以下。表現(xiàn)出較高引入效率和脫保護(hù)效率的可逆終止子將實(shí)現(xiàn)較高的循環(huán)效率，因而實(shí)現(xiàn)較大的讀取長(zhǎng)度。
為使CRT終止子適當(dāng)?shù)仄鹱饔?，必須在溫和條件下有效地?cái)嗔训羲霰Ｗo(hù)基。保護(hù)基的除去通常涉及利用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿、催化或化學(xué)還原的處理，或者這些方法的組合。這些條件對(duì)于所述DNA聚合酶、核苷酸、寡核苷酸引物模板、或固體載體而言可能是反應(yīng)活性的，產(chǎn)生不希望的結(jié)果。使用光化學(xué)保護(hù)基是一種有吸引力的替代強(qiáng)烈化學(xué)處理的方法，并且可以非侵入方式進(jìn)行使用。
已有多種光可除去的保護(hù)基(例如2-硝基芐基、芐氧基羰基、3-硝基苯基、苯甲酰甲基、3，5-二甲氧基苯偶姻基(3，5-dimethoxybenzoinyl)、2，4-二硝基苯硫基及其各自的衍生物)被用于合成肽、多糖和核苷酸(Pillai，V.N.R.(1980)Photoremovable Protecting Groups in OrganicSynthesis.Synthesis，1-26)。在這些保護(hù)基中，光敏感的2-硝基芐基保護(hù)基已成功用于以下的基團(tuán)用于二核糖核苷合成的核糖核苷的2’-OH(Ohtsuka，E.，Tanaka，S.和Ikehara，M.(1974)Studies on transferribonucleic acids and related compounds.IX(I)Ribooligonucleotidesynthesis using a photosensitive o-nitrobenzyl protection at the2′-hydroxyl group.Nucleic Acids Res.1，1351-1357)、自動(dòng)化核酶合成中的核苷亞磷酰胺(ribophosphoramidite)的2’-OH(Chaulk，S.G.和MacMillan，A.M.(1998)Caged RNAphoto-control of a ribozyme.Nucleic Acids Res.26，3173-3178)、Affymetrix化學(xué)中用于寡核苷酸合成的亞磷酰胺的3’-OH(Pease，A.C，Solas，D.，Sullivan，E.J.，Cronin，M.T.，Holmes，C.P.和Fodor，S.P.A.(1994)Light-generatedoligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5022-5026)以及用于DNA測(cè)序應(yīng)用的3’-OH(Metzker，M.L.，Raghavachari，R.，Richards，S.，Jacutin，S.E.，Civitello，A.，Burgess，K.和Gibbs，R.A.(1994)Termination of DNAsynthesis by novel 3′-modified deoxyribonucleoside triphosphates.Nucleic Acids Res.22，4259-4267)。在脫保護(hù)條件(紫外線(xiàn)＞300nm)下，可以在不影響嘧啶或嘌呤堿基的情形下有效地?cái)嗔?-硝基芐基(Pease，A.C，Solas，D.，Sullivan，E.J.，Cronin，M.T.，Holmes，C.P.和Fodor，S.P.A.(1994)Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNAsequence analysis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5022-5026)以及(Bartholomew，D.G.和Broom，A.D.(1975)One-step ChemicalSynthesis of Ribonucleosides bearing a Photolabile Ether ProtectingGroup.J.Chem.Soc.Chem.Commun.，38)。
在當(dāng)今跨越不同研究部門(mén)(包括比較基因組學(xué)和進(jìn)化學(xué)、法醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)、以及用于診斷和治療的應(yīng)用醫(yī)學(xué))的應(yīng)用下，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的測(cè)序技術(shù)的需求從來(lái)沒(méi)有這樣強(qiáng)烈過(guò)。對(duì)于在人序列變異研究中的廣泛應(yīng)用而言，目前的測(cè)序技術(shù)太昂貴、費(fèi)力且耗時(shí)?；蚪M中心的成本是基于每1,000個(gè)Q20堿基的美元數(shù)來(lái)計(jì)算的，并且通常可分成儀器、人員、試劑、材料以及管理花費(fèi)等類(lèi)別。目前，這些中心以不到1美元/1,000個(gè)Q20堿基進(jìn)行運(yùn)作，其中至少50％的成本單獨(dú)由DNA測(cè)序儀器產(chǎn)生。對(duì)于新的檢測(cè)方法、儀器小型化、微流體分離技術(shù)的開(kāi)發(fā)以及每次運(yùn)行的試驗(yàn)數(shù)的增加將最有可能對(duì)降低成本產(chǎn)生最大的影響。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可用于在高通量測(cè)序反應(yīng)中對(duì)基因組信息進(jìn)行有效測(cè)序的新化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供新的試劑和試劑組合，所述新的試劑和試劑組合可以有效并可買(mǎi)得起的方式提供基因組信息。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于診斷方法和用于開(kāi)發(fā)針對(duì)個(gè)體的靶向治療劑的試劑的文庫(kù)和陣列。


發(fā)明內(nèi)容
光可斷裂的標(biāo)記核苷酸和核苷 本發(fā)明提供了可用在DNA測(cè)序技術(shù)中的核苷化合物及其磷酸酯和鹽。所述化合物任選地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用熒光染料標(biāo)記的光可斷裂基團(tuán)。所述包含光可斷裂保護(hù)基的核苷酸和核苷化合物被設(shè)計(jì)成終止DNA合成然后有效斷裂，使得可以平行模式對(duì)所述核酸寡聚體進(jìn)行快速測(cè)序。所述核苷酸和核苷化合物上這種利用熒光染料標(biāo)記的可斷裂基團(tuán)的存在可提高對(duì)大的DNA寡聚體進(jìn)行平行測(cè)序的速度和準(zhǔn)確度，以使得可進(jìn)行例如對(duì)整個(gè)基因組的快速測(cè)序以及對(duì)多態(tài)性和其它有價(jià)值遺傳信息的鑒定。
提供了含有核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多種核苷酸和核苷化合物，其包含可斷裂基團(tuán)和/或可被衍生化而包含可檢測(cè)的標(biāo)記物(例如染料)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷的堿基與2-硝基芐基共價(jià)連接，所述2-硝基芐基的α碳位置任選地被本文中所述的一個(gè)烷基或芳基取代。所述2-硝基芐基可被官能化以提高終止性能和光催化的脫保護(hù)速率。即使在核糖上的3’-OH基未被封閉時(shí)，與所述核堿基相連的2-硝基芐基或α碳被取代的2-硝基芐基的終止性能仍然存在。這些3’-OH基未封閉的終止子可良好耐受多種可商購(gòu)的DNA聚合酶，這代表了優(yōu)于3’-O封閉的終止子的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)。所述α碳被取代的2-硝基芐基還可被衍生化而包含所選的熒光染料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷的堿基與2-硝基芐基共價(jià)連接，所述2-硝基芐基任選地被本文中所述的供電子和吸電子基團(tuán)中的一種或多種所取代。所述2-硝基芐基可被官能化以提高光催化脫保護(hù)的速度。所述2-硝基芐基還可被衍生化而包含可檢測(cè)的熒光染料。
具體而言，通過(guò)利用2-硝基芐基修飾的四種核苷三磷酸化合物和本文所述的利用不同熒光染料標(biāo)記的衍生物的組合，提供了用于DNA測(cè)序的方法，其可用于鑒別所引入的堿基以揭示作為其基礎(chǔ)的DNA序列。
標(biāo)記的核苷酸和核苷 還提供了可用在DNA測(cè)序技術(shù)中的核苷化合物及其磷酸酯和鹽。所述化合物任選地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用熒光染料標(biāo)記的不可斷裂基團(tuán)。所述核苷酸和核苷化合物被設(shè)計(jì)成終止DNA合成，使得可以平行模式對(duì)核酸寡聚體進(jìn)行快速測(cè)序。提供了含有核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多種核苷酸和核苷化合物，其可被衍生化而包含可檢測(cè)的標(biāo)記物(例如染料)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷的堿基與芐基共價(jià)連接，所述芐基的α碳位置任選地被本文中所述的一種烷基或芳基所取代。所述芐基可被官能化以提高終止性能。即使在核糖上的3’-OH基未被封閉時(shí)，與核堿基相連接的任選地α碳被取代的芐基的終止性能仍然存在。這些3’-OH基未封閉的終止子可良好耐受多種可商購(gòu)的DNA聚合酶，這代表了優(yōu)于3’-O封閉的終止子的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)。所述連接基團(tuán)還可被衍生化而包含所選的熒光染料。
具體而言，通過(guò)利用不可斷裂的終止基團(tuán)修飾的四種核苷三磷酸化合物和本文所述的利用不同熒光染料標(biāo)記的衍生物的組合，提供了用于DNA測(cè)序的方法，其可用于鑒別所引入的堿基以揭示作為其基礎(chǔ)的DNA序列。

具體實(shí)施例方式 光可斷裂標(biāo)記的核苷酸和核苷 本發(fā)明提供了可用在快速DNA測(cè)序技術(shù)中的核苷酸和核苷化合物及其鹽、酯和磷酸酯。所述化合物任選地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用熒光染料標(biāo)記的光可斷裂基團(tuán)。所述核苷酸和核苷化合物包含被設(shè)計(jì)成終止DNA合成以及快速斷裂的光可移除保護(hù)基，使得這些單體可用于以平行模式快速測(cè)序。所述核苷酸和核苷化合物上這種利用熒光染料標(biāo)記的可快速斷裂基團(tuán)的存在可提高大的DNA寡聚體的平行測(cè)序的速度和準(zhǔn)確度，以使得可以例如對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行快速測(cè)序以及鑒定多態(tài)性和其它有價(jià)值的遺傳信息。
提供了包含核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多種核苷酸和核苷化合物，其包含可斷裂基團(tuán)和/或可被衍生化而包含可檢測(cè)的標(biāo)記物(例如染料)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物可與光可除去的保護(hù)基如2-硝基芐基共價(jià)連接。所述2-硝基芐基可被衍生化以提高其對(duì)DNA合成的終止以及脫保護(hù)速度，因此增強(qiáng)了其在DNA測(cè)序中的用途。還可利用熒光染料通過(guò)與光可除去的保護(hù)基共價(jià)連接而對(duì)所述光可除去的保護(hù)基(例如2-硝基芐基)進(jìn)行衍生化。
I.光可斷裂的標(biāo)記核苷酸和核苷化合物用于測(cè)序的優(yōu)點(diǎn) 提供了可用于DNA測(cè)序技術(shù)的核苷酸和核苷化合物。循環(huán)可逆終止(CRT)是一種檢測(cè)多個(gè)模板的同步、單個(gè)堿基加成的周期性方法。該方法本身與Sanger法的不同之處在于其可以在不需要凝膠電泳和高度平行的模式下(其為推進(jìn)該領(lǐng)域的主要瓶頸)進(jìn)行，。然而，與Sanger測(cè)序相似，較長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度意味著需要較少次測(cè)序試驗(yàn)來(lái)需要覆蓋整個(gè)基因組。所述CRT循環(huán)包括三個(gè)步驟引入、成像和脫保護(hù)。對(duì)于該過(guò)程而言，循環(huán)效率、循環(huán)時(shí)間和靈敏度是重要的因素。循環(huán)效率是脫保護(hù)和引入效率的結(jié)果，并且決定了CRT讀取長(zhǎng)度。CRT循環(huán)時(shí)間是引入、成像和脫保護(hù)時(shí)間的總和。對(duì)于針對(duì)整個(gè)基因組測(cè)序的快速CRT而言，可使用本文所公開(kāi)的可表現(xiàn)出快速和有效的脫保護(hù)性能的核苷酸和核苷化合物。這些化合物可利用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，直接與2-硝基芐基相連，從而提供具有相似脫保護(hù)性能的熒光可逆終止子。CRT技術(shù)的讀取長(zhǎng)度由每個(gè)核苷酸加成循環(huán)、脫保護(hù)和引入效率的結(jié)果的總效率決定。例如，如果認(rèn)為50％原始材料的終點(diǎn)具有可接受的信噪比，那么下述等式可用于評(píng)價(jià)循環(huán)效率對(duì)讀取長(zhǎng)度的作用 (RL)Ceff＝0.5 其中RL是堿基的讀取長(zhǎng)度，Ceff是總循環(huán)效率。換句話(huà)說(shuō)，可以通過(guò)90％的總循環(huán)效率實(shí)現(xiàn)7個(gè)堿基的讀取長(zhǎng)度，可通過(guò)99％的循環(huán)效率實(shí)現(xiàn)70個(gè)堿基的讀取長(zhǎng)度，可通過(guò)99.9％循環(huán)效率實(shí)現(xiàn)700個(gè)堿基的讀取長(zhǎng)度。本發(fā)明化合物的引入效率可以為引入類(lèi)似的天然核苷的約70％至約100％。優(yōu)選地，所述引入效率為約85％至約100％。光可斷裂的效率優(yōu)選為約85％至約100％。此外，當(dāng)引入本發(fā)明化合物時(shí)，核酸延伸的終止為約90％至約100％。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸和核苷化合物的循環(huán)效率為至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。當(dāng)用于基因組DNA時(shí)，可將所述化合物用在CRT中以直接由基因組DNA進(jìn)行讀取。片段基因組DNA可與含有橫跨所選染色體的引發(fā)位點(diǎn)的高密度寡核苷酸芯片進(jìn)行雜交。通過(guò)CRT法的所評(píng)估的讀取長(zhǎng)度來(lái)分離每個(gè)引發(fā)序列。在兩次堿基加成之間，熒光成像儀可同時(shí)對(duì)整個(gè)高密度芯片成像，評(píng)價(jià)在速度和靈敏度方面的提高。通過(guò)紫外照射除去本文所述的與所述2-硝基芐基相連的熒光團(tuán)或其衍生物，釋放出2-硝基芐基用于下一輪的堿基加成。然后在大約500個(gè)CRT循環(huán)后，可將所述完全的且不間斷的基因組序列信息與參比人基因組相比較，以確認(rèn)單個(gè)樣品中序列變異的程度和類(lèi)型。
II.光可斷裂的標(biāo)記核苷酸和核苷化合物 本發(fā)明提供了多種核苷以及其單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯化合物。所述化合物可用于DNA測(cè)序技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用熒光染料標(biāo)記的光可斷裂的終止基團(tuán)，所述熒光染料可在CRT反應(yīng)中被檢測(cè)到并有效斷裂。所述核苷酸和核苷化合物可轉(zhuǎn)化成其各自的天然核苷單磷酸酯用于隨后的DNA聚合酶反應(yīng)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了含有脫氧核糖或核糖和堿基的核苷酸和核苷化合物，其中所述堿基與光可斷裂的終止基團(tuán)2-硝基芐基共價(jià)連接。所述2-硝基芐基可被提高DNA合成終止和脫保護(hù)速度的基團(tuán)所取代。此外，所述2-硝基芐基可通過(guò)與報(bào)告物基團(tuán)(例如染料)相連而可被檢測(cè)。所述染料可任選地通過(guò)雙官能團(tuán)連接物與2-硝基芐基相連。本發(fā)明的化合物可通過(guò)下式表示
其中R1是H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，堿基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤或其天然衍生物，可斷裂的終止部分是賦予所述化合物聚合酶終止性能的基團(tuán)，連接物是雙官能團(tuán)，染料是熒光團(tuán)。本發(fā)明的化合物可被設(shè)計(jì)為可用于DNA合成測(cè)序中的熒光的、光不穩(wěn)定的可逆終止子。所述化合物可被優(yōu)化為可逆終止子，被修飾以具有在水溶液中的快速有效脫保護(hù)行為和良好的熒光性能。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有式I-VII結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽或酯或其對(duì)映體、外消旋混合物或立體異構(gòu)體
式I式II
式III 式IV
式V式VI
式VII 其中R1＝H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2＝H或OH，R3和R4各自獨(dú)立地選自H、C1-C12直鏈或支鏈烷基、C2-C12直鏈或支鏈烯基或多烯基(polyenyl)、C2-C12直鏈或支鏈炔基或多炔基(polyalkynyl)、以及芳香基(例如苯基、萘基或吡啶環(huán))，前提是R3和R4中至少一個(gè)是H；R5、R6、R7和R8各自獨(dú)立地選自H、OCH3、NO2、CN、鹵化物、C1-C12直鏈或支鏈烷基、C2-C12直鏈或支鏈烯基或多烯基、C2-C12直鏈或支鏈炔基或多炔基、以及芳香基(例如苯基、萘基或吡啶環(huán))，和/或下述一般結(jié)構(gòu)的連接基團(tuán)
X＝CH2、CH＝CH、C≡C、O、S或NH，Y＝CH2、O或NH，n＝0-12的整數(shù)；m＝0-12的整數(shù)，染料＝熒光團(tuán)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在本發(fā)明提供的含有衍生的2-硝基苯環(huán)的化合物(例如式I-VII的化合物)中，可通過(guò)在2-硝基苯環(huán)的4-位引入供電子基團(tuán)或者在5-位引入吸電子基團(tuán)而提高DNA測(cè)序過(guò)程中2-硝基苯基的脫保護(hù)和去除速度。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R3和R4選自但不限于-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、異丙基、叔丁基、苯基、2-硝基苯基以及2，6-二硝基苯基。或者，R3和R4選自但不限于烷基和芳香性基團(tuán)，所述烷基和芳香性基團(tuán)的烷基或芳香性基團(tuán)中任選地含有至少一個(gè)雜原子，此外，其中所述芳香性基團(tuán)可任選地是芳基(例如苯基)或多環(huán)基團(tuán)(例如萘基)。在某些實(shí)施方案中，R5、R6、R7和R8是選自芳基和多環(huán)基團(tuán)的芳香性基團(tuán)。
或者，光可斷裂的終止部分可具有下述一般結(jié)構(gòu)
例如，含有這些光可斷裂的終止部分的化合物可具有下述結(jié)構(gòu)
其中所述可斷裂的終止部分通過(guò)選自以下的鍵與所述堿基相連接芐胺、芐醚、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基甲酸2-(鄰硝基苯基)乙酯以及碳酸2-(鄰硝基苯基)乙酯。這些實(shí)施方案均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
對(duì)熒光染料沒(méi)有特別限制。例如，所述熒光團(tuán)可以選自但不限于BODIPY、熒光素、羅丹明、香豆素、呫噸、花青、芘、酞菁、藻膽蛋白、alexa、squarene染料、產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移染料的組合、及其衍生物。
優(yōu)選的實(shí)施方案包括但不限于下述化合物

III.光可斷裂的核苷酸和核苷化合物的合成 本文所公開(kāi)的化合物通?？扇绫疚闹兴_(kāi)并利用本領(lǐng)域中可利用的方法進(jìn)行合成。例如，下述一般方案表示腺苷化合物的合成 合成腺苷N6-修飾化合物的一般方案
合成鳥(niǎo)苷O6-修飾化合物的一般方案
合成鳥(niǎo)苷8-氧代-修飾化合物的一般方案
合成尿苷5-HOMe-修飾化合物的一般方案
合成胞苷5-HOMe-修飾化合物的一般方案
合成胞苷N4-修飾化合物的一般方案
其它細(xì)節(jié)在實(shí)施例部分提供。
標(biāo)記的核苷酸和核苷 本發(fā)明提供了可用在快速DNA測(cè)序技術(shù)中的核苷酸和核苷化合物及其鹽、酯和磷酸酯。所述化合物任選地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用熒光染料標(biāo)記的不可斷裂基團(tuán)。所述核苷酸和核苷化合物被設(shè)計(jì)成終止DNA合成，使得這些單體可用于平行模式的快速測(cè)序。所述核苷酸和核苷化合物上這些利用熒光染料標(biāo)記的基團(tuán)的存在可提高對(duì)大的DNA寡聚體進(jìn)行平行測(cè)序的速度和準(zhǔn)確度，以使得可以例如進(jìn)行對(duì)整個(gè)基因組的快速測(cè)序和對(duì)多態(tài)性以及其它有價(jià)值遺傳信息的鑒定。
提供了含有核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多種核苷酸和核苷化合物，其包含不可斷裂的終止部分和/或其可被衍生化而包含可檢測(cè)的標(biāo)記物(例如染料)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物可通過(guò)不可斷裂的終止部分與染料共價(jià)相連，所述不可斷裂的終止部分可被衍生化以提高其對(duì)DNA合成的終止并因此增強(qiáng)其在DNA測(cè)序中的有用性。
I.標(biāo)記的核苷酸和核苷化合物用于測(cè)序的優(yōu)點(diǎn) 提供了可用在DNA測(cè)序技術(shù)中的核苷酸和核苷化合物。本發(fā)明化合物的引入效率可以為類(lèi)似的天然核苷的引入效率的約70％至約100％。優(yōu)選地，所述引入效率為約85％至約100％。此外，當(dāng)引入本發(fā)明化合物時(shí)，核酸延伸的終止為約90％至約100％。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸和核苷化合物的終止效率為至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。
II.標(biāo)記的核苷酸和核苷化合物 提供了多種核苷以及其單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯化合物。所述化合物可用于測(cè)序技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核苷化合物包含可被有效檢測(cè)到的熒光基團(tuán)。所述核苷化合物可轉(zhuǎn)化成其各自的三磷酸酯用于DNA聚合酶反應(yīng)。本發(fā)明的化合物可通過(guò)下式表示
其中R1是H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，堿基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤或其天然衍生物，所述不可斷裂的終止部分是賦予所述化合物聚合酶終止性能的基團(tuán)，連接物是雙官能團(tuán)，所述染料是熒光團(tuán)。本發(fā)明的化合物可被設(shè)計(jì)為可用在DNA合成測(cè)序中的熒光的、穩(wěn)定的不可逆終止子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有式I-VII結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽或酯或其對(duì)映體、外消旋混合物或立體異構(gòu)體
式I 式II
式III 式IV
式V 式VI
式VII 其中R1＝H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，R3和R4各自獨(dú)立地選自H、C1-C12直鏈或支鏈烷基、C2-C12直鏈或支鏈烯基或多烯基、C2-C12直鏈或支鏈炔基或多炔基、以及芳香性基團(tuán)(例如苯基、萘基或吡啶環(huán))；R5、R6和R7各自獨(dú)立地選自H、OCH3、NO2、CN、鹵化物、C1-C12直鏈或支鏈烷基、C2-C12直鏈或支鏈烯基或多烯基、C2-C12直鏈或支鏈炔基或多炔基、以及芳香性基團(tuán)(例如苯基、萘基或吡啶環(huán))，和/或具有下述一般結(jié)構(gòu)的連接基團(tuán)
X＝CH2、CH＝CH、C≡C、O、S或NH，Y＝CH2、O或NH，n＝0-12的整數(shù)；m＝0-12的整數(shù)，染料＝熒光團(tuán)；R8和R9如上述針對(duì)R5、R6和R7所定義，前提是R8和R9不是NO2。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，R3和R4選自但不限于-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、異丙基、叔丁基、苯基、2-硝基苯基以及2，6-二硝基苯基?；蛘?，R3和R4選自但不限于烷基和芳香性基團(tuán)，所述烷基和芳香性基團(tuán)在烷基或芳香性基團(tuán)中任選地含有至少一個(gè)雜原子，并且其中所述芳香性基團(tuán)可任選地是芳基(例如苯基)或者是多環(huán)基團(tuán)(例如萘基)。在某些實(shí)施方案中，R5、R6、R7和R8是選自芳基和多環(huán)基團(tuán)的芳香性基團(tuán)。
或者，連接物可具有下述一般結(jié)構(gòu)
例如，含有這些連接物的化合物可具有下述結(jié)構(gòu)
其中所述不可斷裂的終止部分通過(guò)選自以下的鍵與所述堿基相連接芐胺、芐醚、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基甲酸2-(鄰硝基苯基)乙酯和/或碳酸2-(鄰硝基苯基)乙酯。
對(duì)熒光染料沒(méi)有特別限制。例如，所述熒光團(tuán)可以選自但不限于BODIPY、熒光素、羅丹明、香豆素、呫噸、花青、芘、酞菁、藻膽蛋白、alexa、squarene染料、產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移染料的組合、及其衍生物。
優(yōu)選的實(shí)施方案包括但不限于下述化合物

III.標(biāo)記的核苷酸和核苷化合物的合成 本文所公開(kāi)的化合物通?？扇绫疚乃_(kāi)并利用本領(lǐng)域中可利用的方法進(jìn)行合成。例如，下述一般方案表示腺苷化合物的合成 合成腺苷N6-修飾化合物的一般方案
合成鳥(niǎo)苷O6-修飾化合物的一般方案
合成鳥(niǎo)苷8-氧代-修飾化合物的一般方案
合成尿苷5-HOMe-修飾化合物的一般方案
合成胞苷5-HOMe-修飾化合物的一般方案
合成胞苷N4-修飾化合物的一般方案
IV.本發(fā)明化合物的使用方法 本發(fā)明公開(kāi)的核苷酸和核苷化合物可在DNA測(cè)序技術(shù)中用于多個(gè)目的。與本發(fā)明化合物聯(lián)合使用的聚合酶可以是天然的聚合酶或修飾的聚合酶。聚合酶包括但不限于Taq DNA聚合酶、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、Pfu(exo-)DNA聚合酶以及DeepVent(exo-)DNA聚合酶。修飾的聚合酶包括但不限于TaqFSDNA聚合酶、ThermoSequenase DNA聚合酶、ThermoSequenase IIDNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶、Therminator II DNA聚合酶以及Vent(exo-)A488L DNA聚合酶。優(yōu)選地，以等于或接近天然核苷酸引入水平的水平引入本發(fā)明化合物，從而不導(dǎo)致對(duì)本發(fā)明化合物的偏差。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明化合物與可商購(gòu)的聚合酶相容。
光可斷裂的標(biāo)記核苷酸和核苷 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物可用在循環(huán)可逆終止(CRT)中，其是一種檢測(cè)多個(gè)模板的同步、單個(gè)堿基加成的周期性方法。較長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度意味著需要較少次測(cè)序試驗(yàn)來(lái)覆蓋整個(gè)基因組。合成核酸的方法包括下述步驟 a)將引物的5’-末端與固體表面相連接； b)將靶核酸與所述連接到固體表面上的引物進(jìn)行雜交； c)加入下式的一種或多種化合物
其中R1是H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，堿基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤或其天然衍生物。可斷裂的終止部分是賦予所述化合物聚合酶終止性能的基團(tuán)，連接物是雙官能團(tuán)，染料是熒光團(tuán)； d)將DNA聚合酶加入到所述雜交的引物/靶核酸復(fù)合物中以將前述步驟的化合物引入到生長(zhǎng)中的引物鏈中，其中所引入的化合物以約90％至約100％的效率終止聚合酶反應(yīng)； e)任選地清洗所述固體表面以除去未引入的成分； f)檢測(cè)所引入的熒光團(tuán)，其中所述檢測(cè)器任選地是用于使熒光染料成像的脈沖多線(xiàn)激發(fā)檢測(cè)器(pulsed multiline excitation detector)； g)任選地加入一種或多種化合物以給未延伸的引物永久性加帽； h)將所述固體載體暴露于光源以除去光可斷裂的部分，得到含有天然成分的延伸的引物；以及 i)清洗所述固體表面以除去所述斷裂的保護(hù)基；并以循環(huán)方式重復(fù)上述步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可用在測(cè)定核酸分子序列的方法中，所述方法包括以下步驟將靶核酸分子加入到測(cè)序儀器中；將一種或多種本發(fā)明化合物加入到所述測(cè)序儀器中；將聚合酶和任選地天然核酸成分加入到所述測(cè)序儀器中，進(jìn)行聚合酶反應(yīng)以將前述步驟的至少一種化合物引入到生長(zhǎng)中的核酸鏈中，以及分析引入本發(fā)明至少一種化合物的聚合酶反應(yīng)的結(jié)果。所述步驟可以任意順序和任意重復(fù)次數(shù)進(jìn)行。優(yōu)選地，在引入步驟之后，以約90％至約100％的比率終止鏈生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物的引入比率是引入相似堿基的天然底物的約70％至約100％，使得不出現(xiàn)顯著的偏差。例如，所述引入比率可以是引入相應(yīng)核苷酸堿基的正常比率的約85％至約100％。一個(gè)重要的實(shí)施方案包括以下步驟將由引入修飾的核苷酸而得到的核酸分子暴露于紫外線(xiàn)或其它光源以除去核酸中光可斷裂的終止部分。優(yōu)選地，所述光斷裂步驟的效率是暴露于紫外線(xiàn)或其它光源的約85％至約100％。
本發(fā)明的方法可以單獨(dú)實(shí)施或組合實(shí)施。例如，可將核酸分子的測(cè)序方法部分地作為將非天然成分引入到核酸分子中的方法或者在引入本發(fā)明化合物后將核酸分子中的非天然成分轉(zhuǎn)化為天然成分的單獨(dú)方法來(lái)實(shí)施。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在引入未保護(hù)的3’-OH核苷酸后終止核酸合成的方面。有利地，與天然核苷酸相比較而言，可通過(guò)聚合酶以更高的水平引入未保護(hù)的3’-OH核苷酸，導(dǎo)致聚合酶反應(yīng)中存在更低水平的修飾核苷酸和更低的偏差。因此，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括終止核酸合成的方法，所述方法包括以下步驟將3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷置于聚合酶環(huán)境中，使得可將3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷引入核酸分子中，其中所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷是具有下式的化合物
其中R1是H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，R2是H或OH，堿基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤或其天然衍生物，可斷裂的終止部分是賦予所述化合物聚合酶終止性能的基團(tuán)，連接物是雙官能團(tuán)，染料是熒光團(tuán)。優(yōu)選地，當(dāng)引入所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷時(shí)，所述方法的終止效率為約90％至約100％?；蛘撸c具有相同堿基的天然核苷酸或核苷的引入效率相比較而言，所述方法引入3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷的效率為約70％至約100％。
可將所述核苷酸和核苷化合物用于CRT以直接從基因組DNA中進(jìn)行讀取。片段基因組DNA可與含有橫跨所選染色體的引發(fā)位點(diǎn)的高密度寡核苷酸芯片進(jìn)行雜交。通過(guò)CRT法的所評(píng)估的讀取長(zhǎng)度來(lái)分離每個(gè)引發(fā)序列。在堿基加成之間，熒光成像儀(例如脈沖多線(xiàn)激發(fā)(PME)檢測(cè)器)可同時(shí)對(duì)整個(gè)高密度芯片成像，評(píng)價(jià)在速度和靈敏度方面的提高。通過(guò)紫外線(xiàn)或其它光照射除去與所述堿基上可斷裂的終止基團(tuán)相連的熒光團(tuán)，從而將所述修飾的核苷酸轉(zhuǎn)為其天然形式用于下一輪的堿基加成。然后在大約500個(gè)CRT循環(huán)后，可將所述完全的且不間斷的基因組序列信息與參比人基因組相比較以確認(rèn)單個(gè)樣品中序列變異的程度和類(lèi)型。本領(lǐng)域中已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于循環(huán)可逆終止的方法并且可按例如WO2003/021212中所述進(jìn)行使用，WO2003/021212的公開(kāi)內(nèi)容在此通過(guò)引用并入本文。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了在聚合酶反應(yīng)中于核苷酸類(lèi)似物被引入到生長(zhǎng)中的DNA鏈中之后通過(guò)檢測(cè)核苷酸類(lèi)似物的身份來(lái)進(jìn)行核酸測(cè)序的方法，所述方法包括下述步驟 (a)將核酸的5’-末端與固體表面相連接； (b)將引物與所述已連接到固體表面上的核酸相連接； (c)將聚合酶和一種或多種不同的核苷三磷酸化合物加入到所述核酸中，其中引入所述核苷三磷酸化合物，然后終止聚合酶反應(yīng)，其中各核苷三磷酸化合物包含選自腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶及其類(lèi)似物的堿基和與所述堿基相連接的光可斷裂的終止基團(tuán)以及脫氧核糖或核糖，所述光可斷裂基團(tuán)含有可檢測(cè)標(biāo)記物； (d)任選地清洗所述固體表面以除去未引入的核苷類(lèi)似物； (e)例如利用PME檢測(cè)并從而確定與所述終止的核苷三磷酸相連的可檢測(cè)標(biāo)記物，例如熒光染料或報(bào)告物分子； (f)任選地加入一種或多種化合物，以給與所述核酸相連的引物上任意未反應(yīng)的-OH永久性加帽，或者給通過(guò)將一種或多種核苷酸添加到所述引物上而形成的引物延伸鏈上的任意未反應(yīng)的-OH永久性加帽； (g)將所述固體表面暴露于光源以除去含有獨(dú)特標(biāo)記物或報(bào)告物分子的光可斷裂保護(hù)基，其中余下的所引入核苷單磷酸單元與天然、未加工的或未修飾的核酸分子相類(lèi)似； (h)清洗所述固體表面以除去所述斷裂的保護(hù)基；以及 (g)重復(fù)步驟(c)至(h)用于檢測(cè)確定被引入到生長(zhǎng)中的引物鏈中的被鑒定核苷酸類(lèi)似物的序列。
標(biāo)記的核苷酸和核苷 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括測(cè)定靶核酸序列的方法，所述方法包括(i)將靶核酸加入到Sanger或Sanger型測(cè)序儀器中，(ii)將一種或多種本發(fā)明化合物加入到所述測(cè)序儀器中，前提是在存在一種以上類(lèi)型的堿基的情況下，各堿基與不同的熒光團(tuán)相連接；(iii)加入互補(bǔ)引物和聚合酶；(iv)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)以將步驟(ii)的至少一種化合物引入到生長(zhǎng)中的核酸鏈中，以及(v)利用熒光測(cè)序儀器或通過(guò)脈沖多線(xiàn)激發(fā)熒光來(lái)分析Sanger測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果，其中步驟(i)-(iii)可以任意順序進(jìn)行。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(iv)的引入至少一種化合物之后，以約90％至約100％的效率終止鏈生長(zhǎng)。或者，步驟(iv)的引入至少一種化合物的效率是聚合酶反應(yīng)中引入含有相同堿基的天然底物的約70％至約100％，或更優(yōu)選約85％至約100％。
本發(fā)明的方法還包括將非天然成分引入到核酸中的方法，所述方法包括(i)將靶核酸加入到測(cè)序儀器中，(ii)將一種或多種本發(fā)明化合物加入到所述測(cè)序儀器中，前提是在存在一種以上類(lèi)型堿基的情況下，各堿基與不同的熒光團(tuán)相連接；(iii)加入聚合酶；以及(iv)進(jìn)行聚合酶反應(yīng)以將步驟(ii)的至少一種化合物引入到生長(zhǎng)中的核酸鏈中，其中步驟(i)-(iii)可以任意順序進(jìn)行。所述方法還可包括(v)分析用于步驟(ii)的引入至少一種化合物的聚合酶鏈反應(yīng)的結(jié)果。
本發(fā)明的一個(gè)替代性實(shí)施方案是終止核酸合成的方法，所述方法包括以下步驟將本發(fā)明的3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷置于聚合酶環(huán)境中，使得可將所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷引入到核酸中。所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案是當(dāng)引入所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷時(shí)具有約90％至約100％的終止效率；其中所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷的引入效率與具有相同堿基的天然核苷酸或核苷的引入效率相比而言為約70％至約100％。
本發(fā)明還包括進(jìn)行Sanger或Sanger型測(cè)序的方法，所述方法包括將本發(fā)明化合物加入到Sanger或Sanger型測(cè)序方法中。一種包括將本發(fā)明化合物加入到微測(cè)序或微測(cè)序型測(cè)序方法中而進(jìn)行微測(cè)序或微測(cè)序型測(cè)序的方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
PME檢測(cè)器 在一個(gè)使用任一種前述標(biāo)記的和/或光可斷裂的核苷和核苷酸的實(shí)施方案中，如2003年3月27日公開(kāi)的US 2003/0058440或2003年3月13日公開(kāi)的WO 2003/021212中所述，可以使用用于色盲熒光檢測(cè)的脈沖多線(xiàn)激發(fā)(“PME”)。該技術(shù)提供了熒光檢測(cè)用于信息性SNP的高通量鑒別，用于更準(zhǔn)確地診斷遺傳病、更好地預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)易感性或識(shí)別組織中的偶發(fā)性突變。所述PME技術(shù)具有兩個(gè)顯著提高熒光靈敏度的主要優(yōu)點(diǎn)(1)基因組分析中所有熒光團(tuán)的最佳激發(fā)和(2)“色盲”檢測(cè)，其收集比標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)分辨檢測(cè)(standard wavelength resolved detection)顯著更多的光。該技術(shù)與用于DNA序列鑒別的特征在于單一源激發(fā)和色散的DNA測(cè)序儀器顯著不同。所述技術(shù)可用在臨床診斷學(xué)、法醫(yī)學(xué)和一般測(cè)序法中并且具有針對(duì)大部分種群的靶序列變異進(jìn)行分析的能力、適應(yīng)性和可移動(dòng)性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用用于高通量DNA序列鑒別的儀器和方法。使用用于分析含有一種或多種熒光物的樣品的脈沖多線(xiàn)激發(fā)儀器，其包括被配置而發(fā)射兩條或更多條激發(fā)線(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)激光器，每條激發(fā)線(xiàn)具有不同的波長(zhǎng)；與一個(gè)或多個(gè)激光器相連的定時(shí)電路，所述定時(shí)電路被配置成根據(jù)定時(shí)程序依次形成兩條或更多條激發(fā)線(xiàn)以從樣品中產(chǎn)生與時(shí)間相關(guān)的熒光發(fā)射信號(hào)；所布置的非色散檢測(cè)器(non-dispersivedetector)，以收集樣品發(fā)射的與時(shí)間相關(guān)的熒光發(fā)射信號(hào)；以及分析儀，所述分析儀與檢測(cè)器相連接并被配置成將與時(shí)間相關(guān)的熒光發(fā)射信號(hào)與定時(shí)程序相關(guān)聯(lián)以鑒定樣品成分。
所述檢測(cè)器和所述分析儀可以是一體的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩條或更多條激發(fā)線(xiàn)在樣品中相互交叉，或所述兩條或更多條激發(fā)線(xiàn)可被配置成使得它們不在樣品中相互交叉。所述兩條或更多條激發(fā)線(xiàn)可以是同軸的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述儀器還可包含與所述一個(gè)或多個(gè)激光器配合操作的一個(gè)或多個(gè)棱鏡的裝置，其被配置成使得發(fā)射基本上同線(xiàn)和/或同軸的兩條或更多條激發(fā)線(xiàn)。所述儀器可具有多條激發(fā)線(xiàn)，例如分別具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多條激發(fā)線(xiàn)。所述樣品可被包含在多種容器例如毛細(xì)管中，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、多達(dá)20、多達(dá)24、多達(dá)28、多達(dá)36、多達(dá)48、多達(dá)64、多達(dá)96、多達(dá)384或更多個(gè)毛細(xì)管中?？梢允褂们柿鞒亍?br> 所述定時(shí)程序可包括每個(gè)激光器點(diǎn)火之間的約10飛秒至約5秒、約1毫秒至約100毫秒、或約50皮秒至約500皮秒的延遲。脈沖產(chǎn)生一條或多條激發(fā)線(xiàn)。所述脈沖激發(fā)線(xiàn)可通過(guò)TTL邏輯裝置或機(jī)械裝置或電子裝置來(lái)控制。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述儀器可產(chǎn)生一序列離散的激發(fā)線(xiàn)，所述激發(fā)線(xiàn)與來(lái)自樣品的熒光發(fā)射信號(hào)是時(shí)間相關(guān)的。所述激光器可獨(dú)立地包含二極管激光器、半導(dǎo)體激光器、氣體激光器(例如氬離子、氪或氦-氖激光器)、二極管激光器、固態(tài)激光器(例如包含離子增益介質(zhì)(例如YAG和釩酸釔(YV04)的釹激光器)，或者二極管泵浦固態(tài)激光器。還可使用其它在一個(gè)或多個(gè)離散的激發(fā)波長(zhǎng)下發(fā)光的裝置代替所述激光器。所述激光器還可包括與至少一個(gè)激光束配合操作的拉曼轉(zhuǎn)換器。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，各激光器提供的激發(fā)波長(zhǎng)任選地與各熒光團(tuán)的吸收波長(zhǎng)相匹配。
所述檢測(cè)器可包括電偶裝置、光電倍增管、硅雪崩光電二極管或硅PIN檢測(cè)器。裝置的占地面積優(yōu)選小(例如小于4英尺×4英尺×2英尺，小于1英尺×1英尺×2英尺)，并且可以制成1英寸×3英寸×6英寸一樣小。另一方面包括鑒定樣品成分的方法，所述方法包括(a)制備含有樣品成分、第一染料和第二染料的樣品；(b)將所述樣品置于第一激發(fā)線(xiàn)和第二激發(fā)線(xiàn)的光路中；(c)依次對(duì)所述第一激發(fā)線(xiàn)和所述第二激發(fā)線(xiàn)點(diǎn)火；(d)收集作為時(shí)間函數(shù)的樣品熒光信號(hào)；以及(e)通過(guò)每條激發(fā)線(xiàn)的在線(xiàn)窗(其中樣品成分被鑒定)將熒光分類(lèi)。本發(fā)明的一個(gè)方面是從離散的時(shí)間段中收集熒光信號(hào)，在所述離散的時(shí)間段中沒(méi)有與樣品相關(guān)的激發(fā)線(xiàn)，并且所述時(shí)間段存在于兩條激發(fā)線(xiàn)點(diǎn)火之間。該技術(shù)稱(chēng)為“黑暗中觀察”。另一個(gè)方面是所述第一染料的最大吸收值基本上與所述第一激發(fā)線(xiàn)的激發(fā)波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)。所述第二染料的最大吸收值基本上與所述第二激發(fā)線(xiàn)的激發(fā)波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)。在又一個(gè)方面中，存在第三和第四染料以及第三和第四激發(fā)線(xiàn)，其中所述第三和第四染料的最大吸收值分別基本上與所述第三和第四激發(fā)線(xiàn)的激發(fā)波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)。類(lèi)似地，可存在5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多種染料，其中所述染料的最大吸收值分別基本上與第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16或第更多條激發(fā)線(xiàn)的激發(fā)波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)。所述染料可以是呫噸(zanthene)、熒光素、羅丹明、BODIPY、花青、香豆素、芘、酞菁、藻膽蛋白、alexa、squarene染料或某些其它合適的染料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品成分能進(jìn)行SNP的測(cè)定。所述方法可用于信息性SNP的高通量鑒定。所述SNP可直接從基因組DNA物質(zhì)、PCR擴(kuò)增物質(zhì)或克隆DNA物質(zhì)中得到，并且可利用單核苷酸引物延伸法進(jìn)行分析。所述單核苷酸引物延伸法可包括利用單一的未標(biāo)記dNTP、單一的標(biāo)記dNTP、單一的3’-修飾的dNTP、單一的堿基修飾的3’-dNTP、單一的α-硫代dNTP或單一標(biāo)記的2’，3’-二脫氧核苷酸。微測(cè)序法可包括利用單一的未標(biāo)記dNTP、單一的標(biāo)記dNTP、單一的3’-修飾的dNTP、單一的堿基修飾的3’-dNTP、單一的α-硫代dNTP或單一標(biāo)記的2’，3’-二脫氧核苷酸。所述SNP可直接從基因組DNA物質(zhì)、PCR擴(kuò)增物質(zhì)或克隆DNA物質(zhì)中得到。還預(yù)見(jiàn)到用于檢測(cè)核酸的方法?？梢栽换蚶糜糜跈z測(cè)核酸的多種凝膠、印跡和相似方法(例如美國(guó)專(zhuān)利7,125,660中所公開(kāi)的，在此通過(guò)引用并入本文)來(lái)檢測(cè)核酸。
實(shí)施例 光可斷裂的標(biāo)記核苷酸和核苷 實(shí)施例1dA化合物 3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷三磷酸(WW1p108)的合成 方案.3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、DMF，室溫，過(guò)夜；Boc2O、DMAP、DMF，室溫，過(guò)夜，83％；(ii)n-Bu4NF、THF、0℃，然后逐漸升至室溫，96％；(iii)TBSCl、咪唑、DMF，83％；(iv)n-Bu4NOH、NaI、NaOH、CH2Cl2/H2O、2-硝基芐基溴，室溫，91％；(v)SiO2、高真空，70-80℃，24小時(shí)，91％；(vi)n-Bu4NF、THF、0℃，然后逐漸升至室溫，23％；(vii)POCl3、(MeO)3PO、零下20℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，31％。
N6，N6-雙-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.01) 根據(jù)Furrer和Giese(Furrer，E.and Giese，B.(2003)On thedistance-independent hole transfer over long(A·T)n-sequences in DNA.Helvetica Chimica Acta，86，3623-3632)所述步驟合成化合物dA.01。室溫下將2’-脫氧腺苷dA(2.5g，10mmol)、咪唑(4.5g，66mmol)和TBSCl(4.82g，32mmol)在無(wú)水DMF(25mL)中的溶液攪拌過(guò)夜。加入甲醇(20mL)，攪拌混合物20分鐘，然后在真空下濃縮。將殘留物溶解在無(wú)水DMF(15mL)中，然后加入DMAP(3.66g，30mmol)和Boc2O(6.55g，30mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)過(guò)夜，然后在真空下濃縮。將殘留物溶液在CH2Cl2(100mL)中，利用飽和NH4Cl溶液清洗兩次(每次50mL)。利用CH2Cl2(50mL)萃取合并的水層。然后利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫的N6，N6-雙-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.01(5.66g，83％)。
N6，N6-雙-叔丁氧羰基-2’-脫氧腺苷(dA.02) 0℃下將Bu4NF(7.85g，30mmol)在THF(30mL)中的溶液加入到化合物dA.01(6.78g，10mmol)在THF(30mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸升至室溫，攪拌2小時(shí)，然后在真空下濃縮。將殘留物溶解在CH2Cl2(100mL)中，利用飽和NH4Cl溶液清洗兩次(每次100mL)。利用Na2SO4干燥有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫的N6，N6-雙-叔丁氧羰基-2’-脫氧腺苷dA.02(4.34g，96％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.84(s，1H，H-8)，8.20(s，1H，H-2)，6.41(dd，1H，J＝5.6Hz和9.2Hz，H-1’)，4.77(d，1H，H-4’)，4.21(s，1H，H-3’)，3.98(dd，1H，H-5’a)，3.80(m，1H，H-5’b)，3.00(m，1H，H-2’a)，2.36(m，1H，H-2’b)，1.47(s，18H，(CH3)3CO). N6，N6-雙-叔丁氧羰基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.03) 0℃下將TBSCl(1.88g，12.5mmol)在無(wú)水DMF(5mL)中的溶液加入到化合物dA.02(4.34g，9.6mmol)和咪唑(1.3g，19.2mmol)在無(wú)水DMF(20mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸升至室溫，攪拌2天。加水(50mL)，利用乙酸乙酯萃取混合物3次(每次40mL)，利用飽和NH4Cl溶液(50mL)清洗合并的有機(jī)層，利用Na2SO4干燥，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫的N6，N6-雙-叔丁氧羰基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.03)(4.68g，83％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.84(s，1H，H-8)，8.42(s，1H，H-2)，6.57(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.69(m，1H，H-4’)，4.10(m，1H，H-3’)，3.89(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.70(m，1H，H-2’a)，2.58(m，1H，H-2’b)，1.44(s，18H，(CH3)3CO)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si). N6，N6-雙-叔丁氧羰基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷(dA.04) 將化合物dA.03(1.13g，2mmol)在CH2Cl2(3mL)中的溶液與n-Bu4NOH(0.94mL，4mmol，55％水溶液)和NaI(20mg，催化量)在NaOH(1M；3mL)中的溶液相混合。逐滴將2-硝基芐基溴(1.3g，6mmol)在CH2Cl2(2mL)中的溶液加入到所述混合物中，室溫下于黑暗中攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)。分離有機(jī)層，利用CH2Cl2萃取水層2次(每次10mL)。利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫的N6，N6-雙-叔丁氧羰基-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷dA.04(1.28g，91％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.85(s，1H，H-8)，8.43(s，1H，H-2)，8.10(dd，1H，Ph-H)，7.81(d，1H，Ph-H)，7.70(t，1H，Ph-H)，7.51(t，1H，Ph-H)，6.57(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，4.98(dd，2H，PhCH2)，4.45(m，1H，H-4’)，4.33(m，1H，H-3’)，3.90(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.73(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.46(s，18H，(CH3)3CO)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C33H49N6O9Si[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為701.3330，實(shí)測(cè)質(zhì)量為701.3317。
5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷(dA.05) 將硅膠60(10g，100-200目，通過(guò)在減壓下加熱至70-80℃24小時(shí)活化)加入到化合物dA.04(1.28g，1.8mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液中，將混合物在真空下蒸干。將所得殘留物在減壓下加熱至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次50mL)，利用布氏漏斗過(guò)濾。在真空下濃縮合并的濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫的5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷dA.05(0.83g，91％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.34(s，1H，H-8)，8.15(s，1H，H-2)，8.09(d，1H，Ph-H)，7.81(d，1H，Ph-H)，7.67(t，1H，Ph-H)，7.47(t，1H，Ph-H)，6.50(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，6.03(bs，2H，6-NH2)，4.96(dd，2H，PhCH2)，4.43(m，1H，H-4’)，4.30(m，1H，H-3’)，3.88(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.71(m，2H，H-2’a和H-2’b)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C23H33N6O5Si[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為501.2282，實(shí)測(cè)質(zhì)量為501.1702。
3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷(dA.06) 0℃下將n-Bu4NF(314mg，1.2mmol)在THF(1.2mL)中的溶液加入到化合物dA.05(400mg，0.8mmol)在THF(3mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸升至室溫，攪拌4小時(shí)。加入甲醇(10mL)以溶解反應(yīng)過(guò)程中形成的沉淀，然后加入硅膠60(1.5g)。將混合物在真空下蒸干，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫的3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷dA.06(72mg，23％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.35(s，1H，H-8)，8.13(s，1H，H-2)，8.06(d，1H，Ph-H)，7.79(m，2H，Ph-H)，7.60(m，1H，Ph-H)，7.34(bs，2H，6-NH2，與D2O可交換)，6.33(dd，1H，J＝4.8和6.8Hz，H-1’)，5.40(t，1H，與D2O可交換，5’-OH))，4.92(s，2H，PhCH2)，4.36(m，1H，H-4’)，4.12(m，1H，H-3’)，3.59(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.85(m，1H，H-2’a)，2.54(m，1H，H-2’b)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H19N6O5[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為387.1417，實(shí)測(cè)質(zhì)量為387.1350。
3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW1p108) 將POCl3(26μL，0.24mmol)加入到化合物dA.06(72mg，0.18mmol)在磷酸三甲酯(1mL)中的溶液中，并在零下20-30℃保持2.5小時(shí)。加入雙-三-正丁胺焦磷酸鹽(427mg，0.9mmol)和三正丁胺(0.2mL)在無(wú)水DMF(2mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后冷凍至干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分，冷凍干燥得到白色蓬松固體的3’-O-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸WW1p108(38mg，31％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.50(s，1H，H-8)，8.24(s，1H，H-2)，8.10(d，1H，Ph-H)，7.78(d，1H，Ph-H)，7.62(m，1H，Ph-H)，6.50(dd，1H，J＝6.8和8Hz，H-1’)，5.03(dd，2H，Ph-CH2)，4.65(m，1H，H-4’)，4.53(m，1H，H-3’)，4.22(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.80(m，2H，H-2’a和H-2’b)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.54(d，J＝19.4Hz)，-10.85(d，J＝19.4Hz)，-21.31(t，J＝19.4Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H21N6O14P3Na[M+Na]+而言，計(jì)算質(zhì)量為649.0226，實(shí)測(cè)質(zhì)量為649.0212。
利用不帶紫外檢測(cè)的制備HPLC進(jìn)一步純化所述三磷酸酯，得到不含天然核苷酸雜質(zhì)(例如dATP)的樣品。通過(guò)UV/VIS測(cè)量利用ε260＝20,800的消光系數(shù)進(jìn)行所述三磷酸酯溶液濃度的測(cè)定。
N6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW1p129)的合成
方案.N6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)Mg(ClO4)2、THF，50℃，68％；(ii)NaH、DMF、2-硝基芐基溴，0℃，然后逐漸升至室溫，49％；(iii)SiO2，真空，70-80℃，87％；(iv)n-Bu4NF、THF，43％；(v)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1MHNEt3HCO3；60％。
N6-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.07) 將Mg(ClO4)2(155mg，0.7mmol)加入到化合物dA.01(2.36g，3.5mmol)在無(wú)水THF(35mL)中的溶液中，在50℃攪拌過(guò)夜。在真空下除去溶劑，通過(guò)硅膠柱色譜純化粗產(chǎn)物，得到黃色泡沫狀的N6-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.07(1.39g，68％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.74(s，1H，H-8)，8.29(s，1H，H-2)，8.24(s，1H，6-NHBoc)，6.49(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.60(m，1H，H-4’)，4.02(m，1H，H-3’)，3.86(dd，1H，H-5’a)，3.77(dd，1H，H-5’b)，2.62(m，1H，H-2’a)，2.47(m，1H，H-2’b)，1.54(s，9H，(CH3)3CO)，0.90(s，18H，(CH3)3CSi)，0.08(2s，12H，(CH3)2Si). N6-叔丁氧羰基-N6-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.08) 在0℃下將NaH(5.3mg，0.22mmol，干燥的)加入到化合物dA.07(116mg，0.2mmol)在無(wú)水DMF(2mL)中的溶液中，攪拌30分鐘。逐滴加入2-硝基芐基溴(43mg.0.2mmol)在無(wú)水DMF(0.5mL)中的溶液。將混合物逐漸升至室溫并攪拌2小時(shí)。在真空下除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯(20mL)中，利用飽和NH4Cl溶液清洗2次(每次10mL)，用水清洗1次(10mL)。利用乙酸乙酯(10mL)萃取合并的水層，利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到粘性油狀的N6-叔丁氧羰基-N6-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.08(70mg，49％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.69(s，1H，H-8)，8.38(s，1H，H-2)，8.05(dd，1H，Ph-H)，7.77(d，1H，Ph-H)，7.56(m，1H，Ph-H)，7.40(m，1H，Ph-H)，6.51(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.63(s，2H，Ph-CH2)，4.63(m，1H，H-4’)，4.03(m，1H，H-3’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.46(m，1H，H-2’b)，1.40(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(2s，12H，(CH3)2Si-)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C34H55N6O7Si2[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為715.3671，實(shí)測(cè)質(zhì)量為715.3661。
N6-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.09) 將硅膠60(3.5g，100-200目，通過(guò)在減壓下加熱至70-80℃24小時(shí)活化)加入到化合物dA.08(325mg，0.45mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液中，將混合物在真空下蒸干。將所得殘留物減壓下加熱至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次20mL)，利用布氏漏斗過(guò)濾。在真空下濃縮合并的濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到黃色泡沫狀的N6-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.09(238mg，86％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.37(s，1H，H-8)，8.09(s，1H，H-2)，8.07(d，1H，Ph-H)，7.74(d，1H，Ph-H)，7.56(m，1H，Ph-H)，7.42(m，1H，Ph-H)，6.57(t，1H，6-NH)，6.44(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.19(bs，2H，Ph-CH2)，4.61(m，1H，H-4’)，4.00(m，1H，H-3’)，3.86(dd，1H，H-5’a)，3.76(dd，1H，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.43(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C29H47N6O5Si2[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為615.3147，實(shí)測(cè)質(zhì)量為615.2288。
N6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷(dA.10) 在0℃下將n-Bu4NF(216mg，0.83mmol)在THF(1mL)中的溶液加入到化合物dA.09(202mg，0.33mmol)在THF(5mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸升至室溫并攪拌2小時(shí)。加入硅膠60(1.5g)。將混合物在真空下蒸干。將殘留物通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷dA.10(55mg，43％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.48(br s，1H，與D2O可交換，6-NH)，8.41(s，1H，H-8)，8.16(s，1H，H-2)，8.04(dd，1H，Ph-H)，7.66(d，1H，Ph-H)，7.51(m，2H，Ph-H)，6.35(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.32(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.17(t，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.97(bs，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-3’)，3.60(m，1H，H-5’a)，3.52(m，1H，H-5’b)，2.71(m，1H，H-2’a)，2.28(m，1H，H-2’b)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H19N6O5[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為387.1417，實(shí)測(cè)質(zhì)量為387.1186。
N6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW1p129) 將POCl3(19μL，0.2mmol)加入到化合物dA.10(52mg，0.13mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2.5小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(308mg，0.65mmol)和三正丁胺(130μL)在無(wú)水DMF(1.3mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后冷干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的N6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸WW1p129(53mg，60％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.42(s，1H，H-8)，8.13(s，1H，H-2)，8.09(d，1H，Ph-H)，7.55(m，2H，Ph-H)，7.45(m，1H，Ph-H)，6.46(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.05(bs，2H，Ph-CH2)，4.29(s，1H，H-3’)，4.21(m，2H，H-5’a and H-5’b)，2.78(m，1H，H-2’a)，2.59(m，1H，H-2’b)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.86(d，J＝16.2Hz)，-10.78(d，J＝16.2Hz)，-19.22(t，J＝16.2Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H22N6O14P3[M-H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為625.0250，實(shí)測(cè)質(zhì)量為625.0231。
利用不帶紫外檢測(cè)的制備HPLC進(jìn)一步純化所述三磷酸酯，得到不含天然核苷酸雜質(zhì)的樣品。通過(guò)UV/VIS測(cè)量利用ε260＝20,800的消光系數(shù)進(jìn)行三磷酸酯溶液濃度的測(cè)定。
N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷三磷酸(WW2p005)的合成
方案.N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)NaH、DMF、4-甲氧基-2-硝基芐基溴，0℃，然后逐漸升至室溫，64％；(ii)SiO2，高真空，70-80℃，24小時(shí)，84％；(iii)n-Bu4NF、THF，99％；(iv)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF；1M HNEt3HCO3；40％。
N6-叔丁氧羰基-N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.11) 在0℃下將NaH(26mg，1.1mmol，干燥的)加入到化合物dA.07(580mg，1.0mmol)在無(wú)水DMF(5mL)中的溶液中，攪拌45分鐘。逐滴加入4-甲氧基-2-硝基芐基溴(260mg.1.05mmol)在無(wú)水DMF(1.0mL)中的溶液。將混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝兀瑪嚢柽^(guò)夜。在真空下除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯(50mL)中，利用飽和NH4Cl溶液清洗2次(每次30mL)。利用乙酸乙酯(20mL)萃取合并的水層，利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到粘性油狀的N6-叔丁氧羰基-N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.11(480mg，64％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.68(s，1H，H-8)，8.37(s，1H，H-2)，7.66(d，1H，J＝8.7Hz，Ph-H)，7.55(d，1H，J＝2.7Hz，Ph-H)，7.10(dd，1H，J＝2.7和8.7Hz，Ph-H)，6.51(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.55(s，2H，Ph-CH2)，4.63(m，1H，H-4’)，4.03(m，1H，H-3’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.84(s，3H，OCH3)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.44(m，1H，H-2’b)，1.41(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(2s，12H，(CH3)2Si-)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C35H57N6O8Si2[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為745.3776，實(shí)測(cè)質(zhì)量為745.3782。
N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.12) 將硅膠60(5g，100-200目，通過(guò)在減壓下加熱至70-80℃24小時(shí)活化)加入到化合物dA.11(530mg，0.71mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液中，將混合物在真空下蒸干。將所得殘留物于減壓下加熱至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次20mL)，利用布氏漏斗過(guò)濾。在真空下濃縮合并的濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到黃色泡沫狀的N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.12(385mg，84％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.37(s，1H，H-8)，8.08(s，1H，H-2)，7.66(d，1H，J＝8.5Hz，Ph-H)，7.57(m，1H，J＝2.7Hz Ph-H)，7.09(dd，1H，J＝2.7和8.7Hz Ph-H)，6.52(t，1H，6-NH)，6.43(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.07(bs，2H，Ph-CH2)，4.60(m，1H，H-4’)，4.00(m，1H，H-3’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.85(s，3H，OCH3)，3.76(dd，1H，H-5’b)，2.62(m，1H，H-2’a)，2.43(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C30H48N6O6Si2[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為645.3252，實(shí)測(cè)質(zhì)量為645.3248。
N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷(dA.13) 在0℃下將n-Bu4NF(353mg，1.35mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到化合物dA.12(350mg，0.54mmol)在THF(5mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝兀瑪嚢?小時(shí)。加入硅膠60(1.5g)。將混合物在真空下蒸干，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到黃色泡沫狀的N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷dA.13(225mg，99％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.40(bs，1H，與D2O可交換，6-NH)，8.39(s，1H，H-8)，8.15(s，1H，H-2)，7.54(d，1H，J＝2.7Hz，Ph-H)，7.44(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.24(d，1H，J＝2.7和8.7Hz，Ph-H)，6.33(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，5.32(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.17(t，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.88(bs，2H，Ph-CH2)，4.40(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-3’)，3.81(s，3H，OCH3)，3.60(m，1H，H-5’a)， 3.52(m，1H，H-5’b)，2.70(m，1H，H-2’a)，2.26(m，1H，H-2’b)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C18H21N6O6[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為417.1523，實(shí)測(cè)質(zhì)量為417.1458。
N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p005) 將POCl3(19μL，0.2mmol)加入到化合物dA.13(42mg，0.1mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃3小時(shí)。加入雙-三正丁銨焦磷酸鹽(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在無(wú)水DMF(1mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的N6-(4-甲氧基-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸WW2p005(28mg，40％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.41(s，1H，H-8)，8.17(s，1H，H-2)，7.64(d，1H，J＝2.7Hz，Ph-H)，7.47(d，1H，J＝8.7Hz，Ph-H)，7.15(d，1H，J＝2.7和8.7Hz，Ph-H)，6.46(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，4.97(bs，2H，Ph-CH2)，4.29(s，1H，H-3’)，4.20(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.84(s，3H，OCH3)，2.80(m，1H，H-2’a)，2.60(m，1H，H-2’b)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.97(d，J＝19.9Hz)，-11.07(d，J＝19.3Hz)，-21.76(t，J＝19.3Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C18H21N6O15P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為677.0175，實(shí)測(cè)質(zhì)量為677.0197。
利用不帶紫外檢測(cè)的制備HPLC進(jìn)一步純化所述三磷酸酯，得到不含天然核苷酸雜質(zhì)的樣品。通過(guò)UV/VIS測(cè)量利用ε260＝20,800的消光系數(shù)進(jìn)行三磷酸酯溶液濃度的測(cè)定。
6-FAM標(biāo)記的N6-[(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基芐基)]-2’-脫氧腺苷三磷酸(WW2p055)的合成

方案.6-FAM標(biāo)記的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷三磷酸的合成。(i)NaH、DMF、4-碘-2-硝基芐基溴，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?1％；(ii)PdCl2(PPh3)2、CuI、Et3N、THF，回流，94％；(iii)SiO2，真空，70-80℃，82％；(iv)n-Bu4NF、THF、0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?3％；(v)POCl3，質(zhì)子海綿體(proton sponge)，(MeO)3PO，零下20-30℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF，2分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)；72％；(vi)6-FAM-SE，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2。
N6-叔丁氧羰基-N6-(4-碘-2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.14) 在0℃下將NaH(40mg，1.66mmol，干燥的)加入到化合物dA.07(875mg，1.51mmol)在無(wú)水DMF(10mL)中的溶液中，攪拌45分鐘。逐滴加入4-碘-2-硝基芐基溴(516mg.1.51mmol)在無(wú)水DMF(2mL)中的溶液。將混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪?小時(shí)。在真空下除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯(50mL)中，利用飽和NH4Cl溶液(30mL)清洗，利用水清洗2次(每次30mL)。利用乙酸乙酯(20mL)萃取合并的水層，利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N6-叔丁氧羰基-N6-(4-碘-2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.14(777mg，61％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.66(s，1H，H-8)，8.38(s，1H，H-2)，8.34(d，1H，J＝1.1Hz，Ph-H)，7.85(dd，1H，J＝1.1和8.3Hz，Ph-H)，7.50(d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，6.50(t，1H，J＝6.3Hz，H-1’)，5.54(s，2H，Ph-CH2)，4.63(m，1H，H-3’)，4.03(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.62(m，1H，H-2’a)，2.46(m，1H，H-2’b)，1.41(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CS)，0.10(2s，12H，(CH3)2Si). N6-叔丁氧羰基-N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.15) 在N2氣氛下，將化合物dA.14(730mg，0.87mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(183mg，1.2mmol)、CuI(33mg，0.17mmol)，雙(三苯基膦)氯化鈀(II)(61mg，0.087mmol)和Et3N(1.6mL，11.57mmol)在無(wú)水THF(7.5mL)中的混合物于黑暗中回流6小時(shí)。在真空下濃縮混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到黃色泡沫狀的N6-叔丁氧羰基-N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.15(706mg，94％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.67(s，1H，H-8)，8.39(s，1H，H-2)，8.06(d，1H，J＝1.5Hz，Ph-H)，7.73(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.56(dd，1H，J＝1.5和8.2Hz，Ph-H)，7.28(br s，1H，NH)，6.51(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.59(s，2H，Ph-CH2)，4.63(m，1H，H-3’)，4.37(m，2H，CH2)，4.03(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.48(m，1H，H-2’b)，1.40(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(2s，12H，(CH3)2Si-). N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.16) 將硅膠60(3.5g，100-200目，通過(guò)在減壓下加熱至70-80℃24小時(shí)活化)加入到化合物dA.15(507mg，0.59mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液中，將混合物在真空下蒸干。將所得殘留物于減壓加熱至70-80℃42小時(shí)，利用甲醇清洗3次(每次20mL)，利用布氏漏斗過(guò)濾。在真空下濃縮合并的濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到黃色泡沫狀的N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.16(366mg，82％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(s，1H，H-8)，8.12(s，1H，H-2)，8.05(d，1H，J＝1.3Hz，Ph-H)，7.66(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.48(dd，1H，J＝1.3和8.0Hz，Ph-H)，7.20(bs，1H，NH)，6.54(t，1H，NH)，6.44(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.16(bs，2H，Ph-CH2)，4.61(m，1H，H-4’)，4.39(d，2H，CH2)，4.00(m，1H，H-3’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’b)，2.62(m，1H，H-2’a)，2.44(m，1H，H-2’b)，1.40(s，9H，(CH3)3CO)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-). N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧腺苷(dA.17) 在0℃下將n-Bu4NF(282mg，1.08mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到化合物dA.16(330mg，0.43mmol)在THF(5mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪?小時(shí)。加入甲醇(5mL)和硅膠60(2g)，將混合物在真空下蒸干。通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫狀的N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧腺苷dA.17(75mg，33％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.08(t，1H，與D2O可交換，NH)，8.50(brs，1H，與D2O可交換，NH)，8.42(s，1H，H-8)，8.16(s，1H，H-2)，8.06(d，1H，J＝1.6Hz，Ph-H)，7.71(dd，1H，J＝1.6和8.1Hz，Ph-H)，7.51(m，1H，Ph-H)，6.35(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.30(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.13(br s，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.96(br s，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-4’)，4.29(d，2H，CH2)，3.87(m，1H，H-3’)，3.60(m，1H，H-5’a)，3.51(m，1H，H-5’b)，2.72(m，1H，H-2’a)，2.27(m，1H，H-2’b). N6-[4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(dA.18) 將POCl3(8.5μL，0.09mmol)加入到化合物dA.17(32mg，0.06mmol)和質(zhì)子海綿體(19mg，0.09mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(142mg，0.3mmol)和三正丁胺(60μL)在無(wú)水DMF(0.6mL)中的溶液。攪拌2分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；5mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在0℃下逐滴加入濃氫氧化銨(10mL，27％)。室溫下再攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將所得殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯dA.18(31mg，72％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.47(s，1H，H-8)，8.23(s，1H，Ph-H)，8.20(s，1H，H-2)，765(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.57(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.52(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.14(br s，2H，Ph-CH2)，4.31(s，1H，H-4’)，4.21(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.60(s，2H，CH2)，2.82(m，1H，H-2’a)，2.62(m，1H，H-2’b) 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.43(d，J＝15.4Hz)，-10.46(d，J＝15.6Hz)，-18.85(t，J＝15.6Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C20H23N7O14P3[M-H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為678.0516，實(shí)測(cè)質(zhì)量為678.0857。
6-FAM標(biāo)記的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p055) 將6-FAM-SE(6.7mg，0.014mmol)在無(wú)水DMSO(70μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.18(4.4μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH9.2；3mL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到6-FAM標(biāo)記的三磷酸酯WW2p055(2.6mg，49％)。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mMTEAA。利用5-20％B 20分鐘，然后20-90％B 20分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行洗脫。利用6-FAM染料的消光系數(shù)(即在494nm下的68,000)通過(guò)吸收光譜評(píng)價(jià)WW2p055的濃度。
31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.87(d，J＝19.8Hz)，-11.01(d，J＝19.1Hz)，-21.76(t，J＝19.8Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C41H35N7O20P3[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為1038.1150，實(shí)測(cè)質(zhì)量為1138.1281。
5(6)-SFX標(biāo)記的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷三磷酸(WW2p052)的合成
方案.5(6)-SFX標(biāo)記的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷三磷酸的合成。(i)5(6)-SFX，0.1M NaHCO3/NaCO3，pH 9.2。
5(6)-SFX標(biāo)記的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)-2-硝基芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p052) 將5(6)-SFX(1.5mg，2.55μmol)在無(wú)水DMSO(30μL)中的溶液加入三磷酸酯dA.18(0.54μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；0.8mL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化得到5(6)-SFX標(biāo)記的三磷酸酯WW2p052。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-20％B 20分鐘，然后20-90％B 20分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行洗脫。利用6-FAM染料的消光系數(shù)(即在494nm下的68,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW2p052的濃度。
N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧腺苷三磷酸(WW3p006)的合成
方案.N6-[(1-(2-硝基苯基)乙基)-2’-脫氧腺苷三磷酸的合成。(i)1-(2-硝基苯基)乙胺、BOP、DIPEA、DMF，室溫，過(guò)夜，42％；(ii)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO、0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)。
N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧腺苷(dA.19) 向2’-脫氧肌苷(100mg，0.4mmol)和苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP，210mg，0.48mmol)在無(wú)水DMF(1mL)中的混懸液中加入N，N-二異丙基乙胺(100μL，0.6mmol)，然后加入1-(2-硝基苯基)乙胺(250mg，1.51mmol)在DMF(1mL)中的溶液。室溫下攪拌反應(yīng)64小時(shí)。加入硅膠60(1g，60-200目)，將混合物在真空下蒸干。通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫狀的N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧腺苷dA.19(67mg，42％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.68(br s，1H，與D2O可交換，NH)，8.42(br s，1H，H-8)，8.16和8.06(2s，1H，H-2)，7.88(m，2H，Ph-H)，7.69(m，1H，Ph-H)，7.46(m，1H，Ph-H)，6.34(m，1H，H-1’)，5.79(m，1H，Ph-CH)，5.32(br s，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.16(br s，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.42(m，1H，H-3’)，3.88(m，1H，H-4’)，3.61(m，1H，H-5’a)，3.53(m，1H，H-5’b)，2.71(m，2H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b)，1.68(d，3H，J＝6.8Hz，CH3) N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p006) 將化合物dA.19(30mg，0.075mmol)和質(zhì)子海綿體(32mg，0.15mmol)在無(wú)水吡啶(2mL)中蒸發(fā)3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.5mL)中。加入POCl3(10.5μL，0.11mmol)，在0℃攪拌混合物2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(178mg，0.38mmol)和三正丁胺(75μL)在無(wú)水DMF(0.75mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化部分溶液得到N6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸WW3p006(非對(duì)映體的1∶1混合物)。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行洗脫。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，D2O)δ8.47(s，1H，H-8)，8.12(2s，1H，H-2)，8.02(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.78(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，7.67(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.49(t，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，6.49(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.89(bs，1H，Ph-CH)，4.29(m，1H，H-4’)，4.23-4.15(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.81(m，1H，H-2’a)，2.58(m，1H，H-2’b)，1.74(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)； 非對(duì)映體的31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.65(m)，-10.52(d，J＝19.6Hz)，-21.32(m)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C18H21N6O14P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為661.0226，實(shí)測(cè)質(zhì)量為661.0492。
6-FAM標(biāo)記的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷三磷酸(WW3p015)的合成
方案.6-FAM標(biāo)記的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷三磷酸的合成。(i)1-(4-碘-2-硝基苯基)乙胺、BOP、DIPEA、DMF，室溫，65％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、無(wú)水DMF，4.5h，94％；(iii)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO、0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)；(iv)6-FAM-SE，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小時(shí)。
N6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧腺苷(dA.20) 向2’-脫氧肌苷(150mg，0.6mmol)和苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP，379mg，0.86mmol)在無(wú)水DMF(1.5mL)中的混懸液中加入N，N-二異丙基乙胺(186μL，1.1mmol)，然后加入1-(4-碘-2-硝基苯基)乙胺(460mg，1.57mmol)在無(wú)水DMF(0.5mL)中的溶液。在氮?dú)鈿夥障聰嚢杌旌衔?8小時(shí)。真空下除去DMF，通過(guò)硅膠柱色譜純化粗產(chǎn)物，得到白色泡沫狀的N6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧腺苷dA.20(204mg，65％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.72(br m，1H，與D2O可交換，NH)，8.42(br s，1H，H-8)，8.20(s，1H，H-2)，8.06(m，2H，Ph-H)，7.65(m，1H，Ph-H)，6.34(m，1H，H-1’)，5.70(br s，1H，PhCH)，5.32(br s，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.15(br m，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.42(m，1H，H-4’)，3.88(m，1H，H-3’)，3.61(m，1H，H-5’a)，3.53(m，1H，H-5’b)，2.71(m，1H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b)，1.65(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)； 非對(duì)映體的13C NMR(100MHz，MeOH-d4)δ153.39(CH)，151.94(C)，150.65(C)，143.44(CH)，141.82(C)，141.40(C)，133.77/133.69(CH)，130.55/130.52(CH)，121.37(C)，92.09(C)，91.87(C)，89.97(CH)，87.21(CH)，73.18/73.15(CH)，65.78/65.76(CH2)，47.12(CH)，41.62(CH2)，37.14/37.10(CH3)； ES-MS(ESI)m/e 525[M-H]-. N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷(dA.21) 室溫下將化合物dA.20(108mg，0.21mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(127mg，0.84mmol)、CuI(11mg，0.06mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(33mg，0.03mmol)和Et3N(80μL，0.56mmol)在無(wú)水DMF(1.5mL)中的溶液攪拌4.5小時(shí)。在真空下濃縮混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷dA.21(106mg，94％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.10(br m，1H，與D2O可交換，NH)，8.71(br m，1H，與D2O可交換，NH)，8.43(br s，1H，H-8)，8.15和8.06(2s，1H，H-2)，7.93(s，1H，Ph-H)，7.86(m，1H，Ph-H)，7.75(m，1H，Ph-H)，6.35(br m，1H，H-1’)，5.73(br m，1H，Ph-CH)，5.31(br s，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.15(br m，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.40(m，1H，H-4’)，4.31(d，2H，J＝5.3Hz，CH2)，3.88(m，1H，H-3’)，3.62(m，1H，H-5’a)，3.51(m，1H，H-5’b)，2.71(m，1H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b)，1.67(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)； 非對(duì)映體的13C NMR(100MHz，MeOH-d4)δ157.85/157.48(C)，152.26(CH)，149.50(C)，140.27(C)，136.04(CH)，128.02(CH)，127.07(CH)，122.56(C)，120.25(C)，117.81(C)，114.96(C)，88.85(CH)，86.08(CH)，85.81(C)，80.67(C)，72.07/72.04(CH)，62.66/62.63(CH2)，48.30(CH)，40.47(CH2)，29.46(CH2)，24.26(CH3)； N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(dA.22) 將化合物dA.21(44mg，0.08mmol)和質(zhì)子海綿體(34mg，0.16mmol)在無(wú)水吡啶(2mL)中蒸發(fā)3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.5mL)中。加入POCl3(11μL，0.12mmol)，在0℃攪拌混合物2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(190mg，0.4mmol)和三正丁胺(80μL)在無(wú)水DMF(0.8mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化部分溶液，得到N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。然后室溫下利用濃氫氧化銨(1mL，27％)處理N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸1小時(shí)，得到N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸dA.22(非對(duì)映體的1∶1混合物)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.45(s，1H，H-8)，8.08(2s，1H，H-2)，7.95(s，1H，Ph-H)，7.65(m，1H，Ph-H)，7.53(m，1H，Ph-H)，6.45(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.80(brs，1H，Ph-CH)，4.28(s，1H，H-4’)，4.18(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.64(s，2H，CH2)，2.78(m，1H，H-2’a)，2.57(m，1H，H-2’b)，1.69(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.29(d，J＝20.1Hz)，-10.45(d，J＝19.1Hz)，-21.08(t，J＝19.6Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C21H25N7O14P3[M-H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為692.0672，實(shí)測(cè)質(zhì)量為692.0757。
6-FAM標(biāo)記的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p015) 將6-FAM-SE(1.5mg，3.15μmol)在無(wú)水DMSO(30μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.22(0.34μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH9.2；100μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化得到6-FAM標(biāo)記的三磷酸酯WW3p015。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN中的100mM TEAA(30∶70)。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-FAM染料的消光系數(shù)(即在494nm下的68,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW3p015的濃度。
非對(duì)映體N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(dA.22dS1和dA.22dS2)的分離 利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC進(jìn)行dA.22的兩種非對(duì)映體的分離，以得到N6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷三磷酸dA.22dS1(單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)和N6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷三磷酸dA.22dS2(單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-25％B 50分鐘，然后25-50％B 30分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。

6-FAM標(biāo)記的單一非對(duì)映體N6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p021)的合成
方案.6-FAM標(biāo)記的單一非對(duì)映體N6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)6-FAM-SE，0.1MNaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小時(shí)。
6-FAM標(biāo)記的單一非對(duì)映體N6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p021) 將6-FAM-SE(0.75mg，1.57μmol)在無(wú)水DMSO(15μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.22ds1(0.26μmol，單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；150μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到6-FAM標(biāo)記的單一非對(duì)映體三磷酸酯WW3p021。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-FAM染料的消光系數(shù)(即在494nm下的68,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW3p021的濃度。
6-FAM標(biāo)記的單一非對(duì)映體N6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己?；?氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p032)的合成
方案.6-FAM標(biāo)記的單一非對(duì)映體N6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己?；?氨基-1-丙炔基]2-硝基苯基}乙基}-2’-脫氧腺苷三磷酸的合成。(i)N-(三氟乙?；?氨基己酸N-琥珀酰亞胺酯，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)；(ii)6-FAM-SE，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小時(shí)。
N6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己?；?氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(單一非對(duì)映體dA.23ds1) 將6-N-(三氟乙酰基)氨基己酸N-琥珀酰亞胺酯(0.5mg，1.54μmol)在無(wú)水DMSO(10μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.22ds1(0.25μmol，單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH9.2；200μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。加入NH4OH(500μL，25％水溶液)，混合物在室溫下再孵育1小時(shí)。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到三磷酸酯dA.23ds1(單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mMTEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。
6-FAM標(biāo)記的單一非對(duì)映體N6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW3p032)的合成 將6-FAM-SE(0.5mg，1.05μmol)在無(wú)水DMSO(10μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.23ds1(0.196μmol，單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；200μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到6-FAM標(biāo)記的單一非對(duì)映體三磷酸酯WW3p032。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-FAM染料的消光系數(shù)(即在494nm下的68,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW3p032的濃度。
實(shí)施例2dT化合物 N3-(2-硝基芐基)-胸苷-5’-三磷酸(WW1p050)的合成
方案.N3-(2-硝基芐基)-胸苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、無(wú)水CH2Cl2，室溫，過(guò)夜，58％；(ii)2-硝基芐基溴，n-Bu4NOH、NaI、NaOH(1M)、CHCl3，室溫，過(guò)夜，37％；(iii)n-Bu4NF、THF、25℃，45分鐘，80％；(iv)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO、0℃，6小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)，56％。
5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(dT.01) 在N2氣氛和室溫下攪拌胸苷dT(2.85g，11.76mmol)、咪唑(2.44g，35.80mmol)和TBSCl(1.77g，11.76mmol)在無(wú)水CH2Cl2(20mL)中的溶液過(guò)夜。然后在真空下將反應(yīng)混合物濃縮成粘性油，然后加入乙醚(60mL)和水(60mL)。分離有機(jī)層，用水清洗2次(每次20mL)，用乙醚(20mL)萃取合并的有機(jī)層。利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色固體的5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷dT.01(3.44g，82％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.35(br s，1H，H-3)，7.53(d，1H，J＝1.2Hz，H-6)，6.39(dd，1H，J＝8.3，5.6Hz，H-1’)，4.45(m，1H，H-4’)，4.07(m，1H，H-3’)，3.87(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.99(br.s，1H，3’-OH)，2.38(m，1H，H-2’b)，2.09(m，1H，H-2’b)，1.91(d，3H，J＝1.2Hz，5-Me)，0.92(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si). N3-(2-硝基芐基)-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(dT.02) 將2-硝基芐基溴(400mg，1.85mmol)在CHCl3(5mL)中的溶液逐滴加入到化合物dT.01(660mg，1.85mmol)、四丁基氫氧化銨(0.5mL)、碘化鈉(55mg)在CHCl3(5mL)和NaOH(1M；5mL)中的強(qiáng)烈攪拌的混合物中，室溫下攪拌過(guò)夜。分離有機(jī)層，用氯仿萃取水層2次(每次5mL)。用水(5mL)、鹽水(5mL)清洗合并的有機(jī)層，用Na2SO4干燥。真空下蒸發(fā)溶劑，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫狀的N3-(2-硝基芐基)-5’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷dT.02(562mg，58％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.98(dd，1H，J＝7.2，1.2Hz，Ph-H)，7.60(d，1H，J＝1.2Hz，H-6)，7.49(dt，1H，J＝7.6，1.2Hz，Ph-H)，7.36(dt，1H，J＝8.1，1.4Hz，Ph-H)，7.16(dd，1H，J＝7.8，1.1Hz，Ph-H)，6.31(dd，1H，J＝8.2，5.7Hz，H-1’)，5.50(d，1H，J＝16.2Hz，PhCH2)，5.44(d，1H，J＝16.2Hz，PhCH2)，4.40(m，1H，H-4’)，3.97(q，1H，J＝2.4Hz，H-3’)，3.82(dq，2H，J＝11.4，2.4Hz，H-5’a和H-5’b)，2.98(s，1H，3’-OH)，2.29(m，1H，H-2’a)，2.05(m，1H，H-2’b)，1.93(d，3H，J＝1.2Hz，5-Me)，0.90(s，9H，(CH3)3CSi)，0.09(s，3H，(CH3)Si)，0.08(s，3H，(CH3)Si). N3-(2-硝基芐基)-胸苷(dT.03) 將n-Bu4NF溶液(1.0M，在THF中，1.125mL，1.125mmol)逐滴加入到化合物dT.02(369mg，0.75mmol)在THF(3.75mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌45分鐘，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N3-(2-硝基芐基)-胸苷dT.03(225mg，80％)。
1H NMR(CDCl3)δ8.01(dd，1H，J＝8.2，1.3Hz，Ph-H)，7.51(m，2H，H-6和Ph-H)，7.40(m，1H，Ph-H)，7.21(dd，1H，J＝7.8，0.9Hz，Ph-H)，6.21(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，5.49(dd，2H，PhCH2)，4.53(m，1H，H-4’)， 3.97(m，1H，H-3’)，3.78(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.30(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.94(s，3H，5-CH3). N3-(2-硝基芐基)-胸苷-5’-三磷酸(WW1p050) 在0℃下將POCl3(30μL，0.33mmol)加入到化合物dT.03(38mg，0.11mmol)和質(zhì)子海綿體(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，攪拌6小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在無(wú)水DMF(1mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，將三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)加入到所述溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將所得殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在240分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯N3-(2-硝基芐基)-胸苷-5’-三磷酸WW1p050(38mg，56％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.15(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.82(s，1H，H-6)，7.64(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.54(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.24(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，6.35(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，5.47(s，2H，Ph-CH2)，4.64(m，1H，H-4’)，4.25(m，3H，H-3’，H-5’a和H-5’b)，2.40(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.98(s，3H，5-CH3)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-6.12(d，J＝15.6Hz)，-11.21(d，J＝15.4Hz)，-19.565(d，J＝15.6Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H20N3O16P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為637.9954，實(shí)測(cè)質(zhì)量為637.9802。
5-(2-硝基芐氧基甲基)-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(VL3p03085)的合成
方案.5-(2-硝基芐氧基甲基)-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、無(wú)水DMF，室溫，過(guò)夜，90％；(ii)NBS，過(guò)氧化苯甲酰，CCl4、回流，1小時(shí)，44％；(iii)2-硝基芐醇，110-115℃，10分鐘，35％；(iv)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO、0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)，22％。
3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(dT.04) 將TBSCl(9.96g，66.05mmol)在DMF(11mL)中的溶液逐滴加入到胸苷(5.00g，20.64mmol)和咪唑(9.0g，132.1mmol)在無(wú)水DMF(11mL)中的溶液中，并將混合物在N2氣氛和室溫下攪拌過(guò)夜。用水(100mL)稀釋混合物后，過(guò)濾所形成的沉淀并溶解在乙醚(125mL)中。所述醚溶液用水清洗2次(每次25mL)，用鹽水清洗1次(25mL)，利用Na2SO4干燥，減壓濃縮成臘狀固體，以己烷/乙醚(10∶1)重結(jié)晶，得到3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷dT.04(10.64g，90％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.51(br s，1H，H-3)，7.48(d，1H，J＝1.2Hz，H-6)，6.34(dd，1H，J＝5.8和8.0Hz，H-1’)，4.41(m，1H，H-3’)，3.93(m，2H，H-4’)，3.87(dd，1H，J＝2.6和11.4Hz，H-5’a)，3.76(dd，1H，J＝2.6和11.4Hz，H-5’b)，2.17(m，1H，H-2’a)，2.01(m，1H，H-2’b)，1.92(d，3H，J＝1.2Hz，CH3)，0.93(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(s，6H，(CH3)2Si). 5-溴甲基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧尿苷(dT.05) 將化合物dT.04(4.63g，9.83mmol)、N-溴代琥珀酰亞胺(3.68g，20.68mmol)和過(guò)氧化苯甲酰(0.10g，75％水溶液)在CCl4(100mL)中的溶液回流1小時(shí)。過(guò)濾混合物，在真空下濃縮濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到5-溴甲基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧尿苷dT.05(2.40g，44％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.16(br s，1H，H-3)，7.89(s，1H，H-6)，6.30(dd，1H，J＝5.8和7.7Hz，H-1’)，4.41(m，1H，H-3’)，4.29(d，1H，J＝10.6Hz，CH2Br)，4.23(d，1H，J＝10.6Hz，CH2Br)，3.98(m，2H，H-4’)，3.89(dd，1H，J＝2.6和11.4Hz，H-5’b)，3.78(dd，1H，J＝2.6和11.4，Hz，H-5’a)，2.30(m，1H，H-2’a)，2.01(m，1H，H-2’b)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.15(s，6H，(CH3)2Si)，0.09(s，6H，(CH3)2Si). 5-(2-硝基芐氧基甲基)-2’-脫氧尿苷(dT.06) 在N2氣氛下，于110-115℃下加熱化合物dT.05(238mg，0.43mmol)和2-硝基芐醇(331mg，2.17mmol)10分鐘。將混合物冷卻至室溫，溶解在乙酸乙酯中，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到5-(2-硝基芐氧基甲基)-2’-脫氧尿苷dT.06(60mg，35％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.41(br s，1H，與D2O可交換，NH)，8.05(d，J＝8.0Hz，1H，Ph-H)，7.96(s，1H，H-6)，7.78(m，2H，Ph-H)，7.56(m，1H，Ph-H)，6.17(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.25(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.00(t，1H，J＝5.0Hz，與D2O可交換，5’-OH)，4.48(s，2H，CH2)，4.24(m，1H，H-3’)，4.23(s，2H，CH2)，3.79(m，1H，H-4’)，3.57(m，2H，H-5’)，2.11(m，2H，H-2’)； 13C NMR(100MHz，MeOH-d4)δ163.38(C)，147.18(C)，139.53(CH)，134.80(C)，133.81(C)，132.87(CH)，128.53(CH)，127.63(CH)，123.75(CH)，110.24(C)，87.16(CH)，82.83(CH)，70.41(CH)，68.26(CH2)，64.73(CH2)，61.05(CH2)，39.58(CH2)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H20N3O8[M+H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為394.1250，實(shí)測(cè)質(zhì)量為394.1286。
5-(2-硝基芐氧基甲基)-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(VL3p03085) 在0℃下將POCl3(22μL，0.24mmol)加入到化合物dT.06(48mg，0.12mmol)和質(zhì)子海綿體(39mg，0.18mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，攪拌2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(285mg，0.6mmol)和三正丁胺(120μL)在無(wú)水DMF(1.2mL)中的溶液。攪拌2分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的5-(2-硝基芐氧基甲基)-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸VL3p03085(16mg，22％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.01(d，J＝8.0Hz，1H，Ph-H)，7.78(s，1H，H-6)，7.65(m，2H，Ph-H)，7.52(m，1H，Ph-H)，6.26(t，J＝6.8Hz，1H，H-1’)，4.93(m，2H，CH2)，4.57(m，1H，H-3’)，4.41(s，2H，CH2)，4.21(m，3H，H-4’和H-5’)，2.34(m，2H，H-2’)； 31P NMR(162Hz，D2O)δ-5.58(d，J＝18.5Hz)，-10.91(d，J＝18.5Hz)，-20.80(br)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H21N3O17P3[M-H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為632.0084，實(shí)測(cè)質(zhì)量為631.9779。
5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p043)的合成
方案.5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(2-硝基苯基)乙醇(1.25g，7.50mmol)，110-115℃，10分鐘，8％；(ii)POCl3，質(zhì)子海綿體，(MeO)3PO，0℃，3小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)，55％。
5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷(dT.07) 在N2氣氛下，于110-115℃下加熱化合物dT.05(0.81g，1.5mmol)和1-(2-硝基苯基)乙醇(1.25g，7.50mmol)10分鐘。將混合物冷卻至室溫，溶解在乙酸乙酯中，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dT.07(48mg，8％，1∶1的非對(duì)映體混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36和11.35(2br s，1H，與D2O可交換，NH)，7.95(m，1H，Ph-H)，7.87(m，1H，Ph-H)，7.76(m，2H，H-6和Ph-H)，7.54(m，1H，Ph-H)，6.14(m，1H，H-1’)，5.25(d，1H，與D2O可交換，3’-OH，5.00(m，2H，其中1H與D2O可交換，5’-OH和CH)，4.24(m，1H，H-3’)，3.96(m，2H，CH2)，3.78(m，1H，H-4’)，3.57(m，2H，H-5’)，2.08(m，2H，H-2’)，1.43(d，J＝6.3Hz，3H，CH3)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C18H22N3O8[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為408.1407，實(shí)測(cè)質(zhì)量為408.1446。
5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p043) 在0℃下將POCl3(15μL，0.17mmol)加入到化合物dT.07(34mg，0.08mmol)和質(zhì)子海綿體(27mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，攪拌3小時(shí)。加入三-正丁胺焦磷酸鹽(197mg，0.4mmol)和三正丁胺(100μL)在無(wú)水DMF(0.8mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸WW2p043(32mg，55％，1∶1的非映應(yīng)體混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，D2O)δ7.93(m，1H，Ph-H)，7.71-7.61(m，3H，H-6和Ph-H)，7.49(m，1H，Ph-H)，6.18和6.12(2t，J＝6.6Hz，1H，H-1’)，5.13(m，1H，CH)，4.53(m，1H，H-3’)，4.39(m，1H，H-4’)，4.20(m，4H，CH2和H-5’)，2.28(m，2H，H-2’)，1.54(d，3H，J＝6.3Hz，CH3)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-7.98(br)，-12.64(br)，-23.33(br)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C18H24N3O17P3Na[M+Na]+而言，計(jì)算質(zhì)量為670.0216，實(shí)測(cè)質(zhì)量為670.0176。
6-JOE標(biāo)記的5-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p075)的合成
方案.6-JOE標(biāo)記的5-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)4-碘-2-硝基芐醇，不含水，110-115℃，10分鐘，10％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、無(wú)水DMF，4小時(shí)，50％；(iii)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO，0℃，4小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)；31％；(iv)6-JOE-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3緩沖液(pH 9.2)，1小時(shí)。
5-(4-碘-2-硝基芐氧基甲基)-2’-脫氧尿苷(dT.08) 在N2氣氛下，于110-115℃下加熱化合物dT.05(0.59g，1.06mmol)和4-碘-2-硝基芐醇(1.09g，3.9mmol)10分鐘。將混合物冷卻至室溫，溶解在乙酸乙酯中，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到低熔點(diǎn)固體的5-(4-碘-2-硝基芐氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dT.08(52mg，10％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.42(s，1H，與D2O可交換，N-H)，8.34(d，1H，J＝1.7Hz，Ph-H)，8.09(dd，1H，J＝1.7和8.2Hz，Ph-H)，7.96(s，1H，H-6)，7.56(d，1H，J＝8.2，Ph-H)，6.16(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.25(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.02(t，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.77(s，2H，CH2)，4.20(m，1H，H-3’)，4.22(s，2H，CH2)，3.79(m，1H，H-4’)，3.57(m，2H，H-5’)，2.11(m，2H，H-2’). 5-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐氧基甲基]-2’-脫氧尿苷(dT.09) 室溫下將化合物dT.08(51mg，0.1mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(45mg，0.3mmol)、四(三苯基膦)-鈀(0)(12mg，0.01mmol)、CuI(4mg，0.02mmol)和Et3N(28μL，0.2mmol)在無(wú)水DMF(1.2mL)中的溶液攪拌4小時(shí)。在真空下濃縮混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的5-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dT.09(27mg，50％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.44(s，1H，與D2O可交換，N3-H)，10.44(1H，與D2O可交換，N-H(COCF3))，8.06(s，1H，Ph-H)，7.97(s，1H，H-6)，7.79(s，2H，Ph-H)，6.16(t，J＝6.8Hz，1H，H-1’)，5.25(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.02(t，1H，與D2O可交換，5’OH)，4.83(s，2H，Ph-CH2)，4.30(s，2H，CH2)，4.23(m，3H，CH2和H-3’)，3.79(m，1H，H-4’a)，3.57(m，2H，H-5’)， 2.10(m，2H，H-2’a和H-2’b)； ES+MS(ESI)543[M+H]+；ES-MS(ESI)541[M+H]+ 5-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(dT.10) 在0℃下將POCl3(8μL，88μmol)加入到化合物dT.09(24mg，44μmol)和質(zhì)子海綿體(14mg，66μmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，攪拌2小時(shí)。再加入POCl3(8μL，88μmol)，再攪拌2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(104mg，0.22mmol)和三正丁胺(50μL)在無(wú)水DMF(0.5mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在0℃下逐滴加入濃氫氧化銨(5mL，27％)。室溫下再攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將所得殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯dT.10(10mg，31％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.10(d，J＝5.1Hz，1H，Ph-H)，7.75(m，2H，H-6和Ph-H)，7.65(m，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.27(t，J＝6.8Hz，1H，H-1’)，4.95(m，2H，CH2)，4.58(m，1H，H-3’)，4.43(s，2H，CH2)，4.22(m，3H，H-4’和H-5’)，3.64(s，2H，CH2)，2.33(m，2H，H-2’)； 31P NMR(162Hz，D2O)δ-6.51(d，J＝15.0Hz)，-11.56(d，J＝15.6Hz)，-19.82(t，J＝15.0Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C20H23N4O17P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為707.0169，實(shí)測(cè)質(zhì)量為707.0321。
6-JOE標(biāo)記的5-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p075) 將6-JOE-SE(1.25mg，2μmol)在無(wú)水DMSO(50μL)中的溶液加入到三磷酸酯dT.10(1.4μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH9.2；0.5mL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化反應(yīng)，得到6-JOE標(biāo)記的三磷酸酯WW2p075。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨酯(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-38％B 40分鐘，然后38-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行洗脫。利用6-JOE染料的消光系數(shù)(即在520nm下的75,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW2p075的濃度。
6-JOE標(biāo)記的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p113)的合成
方案.6-JOE標(biāo)記的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)Boc2O、DMAP、無(wú)水DMF，室溫，16小時(shí)，78％；(ii)NBS、過(guò)氧化苯甲酰、CCl4，回流，1小時(shí)，43％；(iii)1-(4-碘-2-硝基苯基)乙醇，不含水，95℃，50分鐘，13％；(iv)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、無(wú)水DMF，4小時(shí)，76％；(v)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO，0℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)；31％；(vi)6-JOE-SE，0.1MNa2CO3/NaHCO3緩沖液(pH 9.2)，1小時(shí)。
N3-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷(dT.11) 將二碳酸二叔丁酯(2.47g，11.34mmol)在DMF(9mL)中的溶液逐滴加入到化合物dT.04(2.43g，5.15mmol)和DMAP(1.39g，11.34mmol)在無(wú)水DMF(45mL)中的溶液中。在N2氣氛和室溫下攪拌混合物16小時(shí)。在真空下濃縮混合物，將晶體殘留物溶解在CH2Cl2(80mL)中，利用飽和NH4Cl溶液(10mL)清洗，用Na2SO4干燥，在真空下濃縮。通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色固體的N3-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-胸苷dT.11(2.30g，78％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.50(d，1H，J＝1.1Hz，H-6)，6.34(dd，1H，J＝5.8和7.9Hz，H-1’)，4.42(m，1H，H-3’)，3.95(m，2H，H-4’)，3.87(dd，1H，J＝2.5和11.4Hz，H-5’a)，3.76(dd，1H，J＝2.5和11.4Hz，H-5’b)，2.17(m，1H，H-2’a)，2.01(m，1H，H-2’b)，1.92(d，3H，J＝1.2Hz，CH3)，1.60(s，9H，(CH3)3COCON)，0.93(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(s，6H，(CH3)2Si). N3-叔丁氧羰基-5-溴甲基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧尿苷(dT.12) 將化合物dT.11(570mg，1.00mmol)、N-溴代琥珀酰亞胺(0.37g，2.10mmol)和過(guò)氧化苯甲酰(10mg，75％水溶液)在CCl4(10mL)中的溶液回流1小時(shí)。過(guò)濾混合物，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的N3-叔丁氧羰基-5-溴甲基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧尿苷dT.12(281mg，43％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.89(s，1H，H-6)，6.27(dd，1H，J＝5.7和7.7Hz，H-1’)，4.39(m，1H，H-3’)，4.27(d，1H，J＝10.6Hz，CH2Br)，4.20(d，1H，J＝10.6Hz，CH2Br)，3.98(m，2H，H-4’)，3.89(dd，1H，J＝2.5 and 11.4，Hz，H-5’b)，3.78(dd，1H，J＝2.6和11.4Hz，H-5’a)，2.30(m，1H，H-2’a)，2.04(m，1H，H-2’b)，1.61(s，9H，(CH3)3COCON)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.14(s，6H，(CH3)2Si)，0.07(s，6H，(CH3)2Si)； 13C NMR(100MHz，CDCl3)δ159.21(C)，147.99(C)，147.32(C)，138.46(CH)，111.30(C)，88.34(CH)，87.22(C)，86.00(CH)，72.28(CH)，63.04(CH2)，41.93(CH2)，27.42(CH3)，25.99(CH3)，25.71(CH3)，25.65(CH3)，24.91(CH2)，18.47(C)，17.97(C)，-3.58(CH3)，-4.65(CH3)，-4.86(CH3)，-5.32(CH3). 5-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷(dT.13) 在N2氣氛下，于95-97℃下加熱化合物dT.12(323mg，0.50mmol)和1-(4-碘-2-硝基苯基)乙醇(293mg，2.23mmol)50分鐘。將混合物冷卻至室溫，溶解在乙酸乙酯中，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的5-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dT.13(34mg，13％，1∶1的非映體混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ8.26(t，1H，J＝1.7Hz，H-6)，8.05(dd，1H，J＝1.6，8.3Hz，Ph-H)，8.02(d，1H，J＝10.6Hz，Ph-H)，7.60(dd，1H，J＝1.1，8.3Hz，Ph-H)，6.26(m，1H，H-1’)，5.03(m，1H，PhCH)，4.41(m，1H，H-3’)，4.10(m，2H，CH2)，3.94(m，1H，H-4’)，3.80(m，1H，H-5’a)，3.74(m，1H，H-5’b)，2.30(m，1H，H-2’a)，2.20(m，1H，H-2’b)，1.50(m，3H，CH3). 5-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷(dT.14) 在室溫下將化合物dT.13(52mg，0.1mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(44mg，0.29mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(12mg，0.01mmol)、CuI(4mg，0.02mmol)，和Et3N(27μL，0.2mmol)在無(wú)水DMF(1.5mL)中的溶液攪拌4小時(shí)。在真空下濃縮混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的5-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷dT.14(41mg，76％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36，11.35(2s，1H，與D2O可交換，NH)，10.11(t，1H，J＝5.6Hz，與D2O可交換，NH)，7.98(s，1H，H-6)，7.88(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，7.78(m，2H，Ph-H)，6.14(t，J＝7.0Hz，1H，H-1’)，5.25(m，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.01(m，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.98(m，1H，PhCH)，4.33(m，2H，CH2)，4.24(m，1H，H-3’)，4.00(m，1H，H-5’a)，3.94(m，1H，H-5’b)，3.78(m，1H，H-4’)，3.57(m，2H，CH2)，2.08(m，2H，H-2’a H-2’b)，1.41(d，J＝8.1Hz，3H，CH3)； ES+MS(ESI)579[M+Na]+. 5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(dT.15) 在0℃下將POCl3(10μL，0.11mmol)加入到化合物dT.14(30mg，0.054mmol)和質(zhì)子海綿體(17mg，0.08mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，攪拌2小時(shí)。再加入POCl3(2.5μL，0.03mmol)，再攪拌1小時(shí)。加入雙-三-正丁胺焦磷酸鹽(128mg，0.27mmol)和三正丁胺(60μL)在無(wú)水DMF(0.54mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在0℃下逐滴加入濃氫氧化銨(5mL，27％)。室溫下再攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯dT.15(16mg，40％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，D2O)δ8.01(m，1H，Ph-H)，7.74-7.55(m，3H，H-6和Ph-H)，6.18和6.12(2t，J＝6.4Hz，1H，H-1’)，5.11(m，1H，PhCH)，4.53(m，1H，H-3’)，4.37(m，1H，H-4’)，4.20(m，4H，CH2和H-5’)，3.65(s，2H，CH2)，2.35(m，1H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b)，1.54(d，3H，J＝6.4Hz，CH3)； 非對(duì)映體的31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.87(d，J＝19.8Hz)，-11.18和-11.30(2d，J＝19.4Hz)，-21.62(t，J＝19.6Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C21H27N4O17P3Na[M+Na]+而言，計(jì)算質(zhì)量為723.0482，實(shí)測(cè)質(zhì)量為723.0497。
6-JOE標(biāo)記的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p113) 將6-JOE-SE(0.75mg，1.2μmol)在無(wú)水DMSO(30μL)中的溶液加入到三磷酸酯dT.15(0.56μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；200μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化反應(yīng)得到6-JOE標(biāo)記的三磷酸酯WW2p113。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行洗脫。利用6-JOE染料的消光系數(shù)(即在520nm下的75,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW2p113的濃度。
5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p148)的合成
方案.5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(2-硝基苯基)-2-甲基丙醇，100-110℃，35分鐘，14％；(ii)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO，0℃，3小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)。
5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷(dT.16) 在N2氣氛下，于100-110℃下加熱化合物dT.12(0.316g，0.486mmol)和1-(2-硝基苯基)-2-甲基丙醇(0.706g，3.62mmol)35分鐘。將混合物冷卻至室溫，溶解在乙酸乙酯中，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dT.16(30mg，14％，1∶1的非映體混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.33和11.34(2brs，1H，與D2O可交換，NH)，7.95(m，1H，Ph-H)，7.83(m，1H，Ph-H)，7.72(m，1H，Ph-H)，7.68(m，1H，H-6)，7.54(m，1H，Ph-H)，6.14(m，1H，H-1’)，5.26(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.97(m，1H，1H 與D2O可交換，5’-OH)，4.66(m，1H，CH)，4.22(m，1H，H-3’)，3.98(m，2H，CH2)，3.78(m，1H，H-4’)，3.55(m，2H，H-5’)，2.08(m，2H，H-2’)，1.72(m，1H，CH)，0.85(m，3H，CH3)，0.80(m，3H，CH3)； 非對(duì)映體的13C NMR(100MHz，CDCl3)δ165.04(C)，152.20/151.09(C)，141.19/141.04(CH)，139.28(C)，138.05(C)，134.08(CH)，130.57/130.51(CH)，129.60(CH)，125.25/125.19(CH)，112.62/112.43(C)，89.12(CH)/86.64(CH)，82.72/82.40(CH)，72.45(CH)，65.78/65.61(CH2)，63.01(CH2)，41.50/41.45(CH2)，36.21(CH)，26.68(CH)，19.85/19.80(CH3)，18.20/18.14(CH3)； 5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p148) 在0℃下將POCl3(13μL，0.17mmol)加入到化合物dT.16(30mg，0.07mmol)和質(zhì)子海綿體(30mg，0.14mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，攪拌3小時(shí)。加入三-正丁胺焦磷酸鹽(166mg，0.35mmol)和三正丁胺(70μL)在無(wú)水DMF(0.7mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在240分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速純化部分溶液。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的5-[1-(2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸WW2p148(非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，D2O)δ7.93(m，1H，Ph-H)，7.74-7.64(m，3H，H-6和Ph-H)，7.52(m，1H，Ph-H)，6.19和6.13(2t，J＝6.6Hz，1H，H-1’)，4.55(m，1H，H-3’)，4.40(m，1H，H-4’)，4.21(m，4H，CH2和H-5’)，2.38-2.22(m，2H，H-2’)，1.99(m，1H，CH)，1.01(m，3H，CH3)，0.78(m，3H，CH3). 非對(duì)映體的31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.26(d，J＝20.1Hz)，-10.66和-10.72(2d，J＝19.6Hz)，-21.17(t，J＝19.6Hz). ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C20H27N3O17P3[M-H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為674.0553，實(shí)測(cè)質(zhì)量為674.0470。
6-JOE標(biāo)記的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p150)
方案.6-JOE標(biāo)記的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-甲基丙醇，不含水，108℃，45分鐘，18％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、無(wú)水DMF，4.5小時(shí)，99％；(iii)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO，0℃，3小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1MHNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)；(iv)6-JOE-SE，0.1MNa2CO3/NaHCO3緩沖液(pH 9.2)，1小時(shí)。
5-[1-(4-碘-2-硝基苯基-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷(dT.17) 在N2氣氛和108℃下加熱化合物dT.12(400mg，0.615mmol)和1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-甲基乙醇(800mg，2.49mmol)45分鐘。將混合物冷卻至室溫，溶解在乙酸乙酯中，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的5-[1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dT.17(64mg，18％，1∶1的非映體混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ8.22(m，1H，H-6)，8.02(m，2H，Ph-H)，7.49(m，1H，Ph-H)，6.22(m，1H，H-1’)，4.69(m，1H，CH)，4.41(m，1H，H-3’)，4.10(m，2H，CH2)，3.92(m，1H，H-4’)，3.75(m，2H，H-5’a)，2.17(m，1H，H-2’a)，2.15(m，1H，H-2’b)，1.90(m，1H，CH)，0.92(m，3H，CH3)，0.85(m，3H，CH3)； 非對(duì)映體的13C NMR(100MHz，CDCl3)δ165.11(C)，152.16/151.18(C)，143.12(CH)，141.44/141.32(CH)，137.91/137.88(C)，133.83/133.77(CH)，132.37/132.33(CH)，130.80/129.67(C)，112.40/112.24(C)，92.75(C)，89.12(CH)/86.90(CH)，82.43/82.18(CH)，72.39/72.37(CH)，65.83/65.70(CH2)，62.96(CH2)，41.56/41.49(CH2)，36.01(CH)，27.83/26.37(CH)，19.82/19.78(CH3)，17.91/17.88(CH3)； 5-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷(dT.18) 在室溫下將化合物dT.17(60mg，0.107mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(48.5mg，0.321mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(12.4mg，0.01mmol)、CuI(4mg，0.02mmol)和Et3N(30μL，0.214mmol)在無(wú)水DMF(1.5mL)中的溶液攪拌4.5小時(shí)。在真空下濃縮混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的5-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷dT.18(62mg，99％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36，11.35(2s，1H，與D2O可交換，N3-H)，10.11(t，1H，J＝5.3Hz，與D2O可交換，NHTFA)，7.99(m，1H，H-6)，7.86(m，1H，Ph-H)，7.75(m，1H，Ph-H)，7.65(m，1H，Ph-H)，6.12(m，1H，H-1’)，5.26(m，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.97(m，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.62(m，1H，CH)，4.31(m，2H，CH2)，4.30(m，1H，H-3’)，3.98(m，2H，CH2)，3.78(m，1H，H-4’)，3.55(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.08(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.77(m，1H，CH)，0.82(m，6H，2CH3)； 5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(dT.19) 在0℃下將POCl3(8μL，0.09mmol)加入到化合物dT.18(34mg，0.06mmol)和質(zhì)子海綿體(26mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.3mL)中的溶液中，攪拌2小時(shí)。再加入POCl3(4μL，0.045mmol)，再攪拌1小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(142mg，0.3mmol)和三正丁胺(60μL)在無(wú)水DMF(0.6mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在0℃下逐滴加入濃氫氧化銨(5mL，27％)。室溫下再攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在240分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速純化部分溶液。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯dT.19(非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，D2O)δ8.06和8.04(2s，1H，Ph-H)，7.78(m，1H，Ph-H)，7.69-7.59(m，2H，H-6和Ph-H)，6.13(m，1H，H-1’)，4.55(m，1H，H-3’)，4.46和4.34(2d，2H，CH2)，4.20(m，3H，H-4’和H-5’)，3.87和3.83(2s，2H，CH2)，2.40-2.20(m，2H，H-2’)，1.99(m，1H，CH)，1.02(m，3H，CH3)，0.79(m，3H，CH3)； 非對(duì)映體的31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.15(d，J＝19.8Hz)，-10.48和-10.54(2d，J＝19.6Hz)，-21.0(m)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C23H30N4O17P3[M-H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為727.0819，實(shí)測(cè)質(zhì)量為727.0828。
6-JOE標(biāo)記的5-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW2p150) 將6-JOE-SE(0.75mg，1.2μmol)在無(wú)水DMSO(30μL)中的溶液加入到三磷酸酯WW2p145(0.47μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；0.3mL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化反應(yīng)，得到6-JOE標(biāo)記的三磷酸酯WW2p150。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-JOE染料的消光系數(shù)(即在520nm下的75,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW2p150的濃度。
6-JOE標(biāo)記的5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW3p024)的合成
方案.6-JOE標(biāo)記的5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸的合成。(i)(S或R)-1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-甲基丙醇，不含水，108℃，45分鐘，20％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、無(wú)水DMF，4.5小時(shí)，81％；(iii)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO，0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，2小時(shí)；(iv)6-JOE-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3緩沖液(pH 9.2)，1小時(shí)。
5-[(R或S)-1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷(dT.20) 在N2氣氛和108℃下，加熱化合物dT.12(143mg，0.22mmol)和對(duì)映體純(S或R)-1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-甲基乙醇(282mg，0.88mmol，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)45分鐘。將混合物冷卻至室溫，溶解在乙酸乙酯中，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的5-[(R或S)-1-(4-碘-2-硝基苯基)-2-(甲基)丙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dT.20(25mg，20％，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。
1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ8.22(d，1H，J＝1.8Hz，H-6)，8.01(m，2H，Ph-H)，7.50(d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，6.25(t，1H，J＝7.2Hz，H-1’)，4.69(d，1H，J＝5.8Hz，PhCH)，4.41(m，1H，H-3’)，4.10(m，2H，CH2)，3.92(m，1H，H-4’)，3.75(m，2H，H-5’a)，2.17(m，1H，H-2’a)，2.15(m，1H，H-2’b)，1.90(m，1H，CH)，0.92(m，3H，CH3)，0.85(m，3H，CH3)； 5-{(R或S)-1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷(dT.21) 室溫下將化合物dT.20(24mg，0.043mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(28mg，0.186mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(7.2mg，0.006mmol)、CuI(2.4mg，0.012mmol)和Et3N(17μL，0.124mmol)在無(wú)水DMF(1.5mL)中的溶液攪拌4.5小時(shí)。在真空下濃縮混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的5-{(R或S)-1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷dT.21(19.8mg，81％，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。
1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ8.01(br s，1H，H-6)，7.95(d，1H，J＝1.2Hz，Ph-H)，7.72(m，2H，Ph-H)，6.25(t，1H，J＝6.7Hz，H-1’)，4.74(d，1H，J＝5.8Hz，PhCH)，4.38(m，1H，H-3’)，4.34(s，2H，CH2)，4.05(m，2H，CH2)，3.55，3.93(m，1H，H-4’)，3.77(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.15(m，2H，H-2’a和H-2’b)，1.90(m，1H，CH)，0.92(m，6H，2×CH3)； 5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(dT.22) 在0℃下將POCl3(6μL，0.06mmol)加入到化合物dT.21(18mg，0.03mmol)和質(zhì)子海綿體(13mg，0.06mmol)在磷酸三甲酯(0.3mL)中的溶液中，攪拌2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(73mg，0.15mmol)和三正丁胺(30μL)在無(wú)水DMF(0.3mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；5mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(5mL)中，過(guò)濾，通過(guò)Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化反應(yīng)純化部分溶液，得到5-{(R或S)-1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。然后利用濃氫氧化銨(27％；0.5mL)在室溫下處理所純化的三磷酸酯2小時(shí)，得到5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(dT.22，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.01(s，1H，Ph-H)，7.76(d，1H，J＝6.9Hz，Ph-H)，7.62(m，2H，H-6和Ph-H)，6.17(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.55(m，1H，H-3’)，4.39和4.29(2d，2H，J＝6.4Hz，CH2)，4.17(m，3H，H-4’和H-5’)，3.74(s，2H，CH2)，2.28(m，2H，H-2’)，2.00(m，1H，CH)，0.79(m，3H，CH3)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.40(d，J＝19.4Hz)，-10.75(d，J＝19.4Hz)，-21.23(t，J＝19.4Hz). 6-JOE標(biāo)記的5-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]-2-(甲基)丙氧基甲基}-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸(WW3p024) 將6-JOE-SE(0.625mg，1μmol)在無(wú)水DMSO(25μL)中的溶液加入到三磷酸酯dT.22(0.31μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH9.2；180μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化反應(yīng)，得到6-JOE標(biāo)記的三磷酸酯WW3p024。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-JOE染料的消光系數(shù)(即在520nm下的75,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW3p024的濃度。
實(shí)施例3dC化合物 N4-(2-硝基芐基)-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p044)的合成
方案.N4-(2-硝基芐基)-2’-脫氧胞苷三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、無(wú)水DMF，室溫，過(guò)夜，84％；(ii)Boc2O、DMAP、Et3N、CH2Cl2，室溫，過(guò)夜，56％；(iii)2-硝基芐基溴，NaH、無(wú)水DMF，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝?，過(guò)夜，37％；(iv)SiO2，真空，70-80℃，48小時(shí)，79％；(v)n-Bu4NF、THF，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?小時(shí)，59％；(vi)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO，0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分鐘；1MHNEt3HCO3，1小時(shí)，52％。
3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷(dC.01) 在N2氣氛和室溫下將2’-脫氧胞苷dC(2.85g，12.54mmol)、咪唑(6.49g，95.31mmol)和TBSCl(7.18g，47.65mmol)加入到無(wú)水DMF(27mL)中并攪拌過(guò)夜。加入甲醇(20mL)，攪拌混合物30分鐘，然后在真空下濃縮。然后加入乙酸乙酯(60mL)和水(60mL)。分離有機(jī)層，用水清洗2次(20mL)，用乙酸乙酯(20mL)萃取合并的水層。利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷dC.01(4.79g，84％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.95(d，1H，J＝7.4Hz，H-6)，6.26(t，1H，J＝5.6Hz，H-1’)，5.69(d，1H，J＝7.4Hz，H-5)，4.37(m，1H，H-3’)，3.90(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.76(m，1H，H-5’b)，2.40(m，1H，H-2’a)，2.08(m，1H，H-2’b)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.87(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.05(s，6H，(CH3)2Si). N4-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷(dC.02) 在氮?dú)鈿夥障?，將二碳酸二叔丁?0.34g，1.58mmol)在無(wú)水CH2Cl2(3mL)中的溶液緩慢加入到化合物dC.01(0.5g，1.10mmol)、Et3N(0.15mL，1.10mmol)和DMAP(0.13g，1.10mmol)在無(wú)水CH2Cl2(5mL)中的溶液中。室溫下攪拌混合物過(guò)夜，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫狀的N4-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷dC.02(0.34g，56％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.30(d，1H，J＝7.4Hz H-6)，7.47(bs，1H，NH)，7.14(d，1H，J＝7.4Hz，H-5)，6.25(t，1H，J＝5.6Hz，H-1’)，4.38(m，1H，H-3’)，3.95(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.78(m，1H，H-5’)，2.50(m，1H，H-2’a)，2.10(m，1H，H-2’b)，1.51(s，9H，(CH3)3CO)，0.93(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.06(s，6H，(CH3)2Si). N4-叔丁氧羰基-N4-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷(dC.03) 0℃下將NaH(32mg，1.26mmol，干燥的)加入到化合物dC.02(540mg，0.97mmol)在無(wú)水DMF(6mL)中的溶液中，并在氮?dú)鈿夥障聰嚢?0分鐘。逐滴加入2-硝基芐基溴(313mg，1.45mmol)在無(wú)水DMF(1.5mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝夭嚢柽^(guò)夜。加入乙酸乙酯(60mL)后，利用飽和NH4Cl溶液(40mL)清洗混合物3次，用乙酸乙酯(40mL)萃取合并的水層。利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N4-叔丁氧羰基-N4-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷dC.03(250mg，37％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.29(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，8.05(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.53(t，1H，J＝7.5Hz，Ph-H)，7.38(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.28(m，2H，Ph-H和H-5)，6.26(t，1H，J＝5.6Hz，H-1’)，5.60(q，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-3’)，3.96(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.80(m，1H，H-5’b)，2.51(m，1H，H-2’a)，2.15(m，1H，H-2’b)，1.28(s，9H，(CH3)3CO)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(s，9H，(CH3)3CSi)，0.14(s，6H，(CH3)2Si)，0.07(s，6H，(CH3)2Si). N4-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷(dC.04) 將硅膠60(2.5g，100-200目，通過(guò)在減壓下加熱至50-60℃24小時(shí)活化)加入到化合物dC.03(250mg，0.36mmol)在CH2Cl2(5mL)中的溶液中，將混合物在真空下蒸干。減壓下將殘留物加熱至60-70℃48小時(shí)，利用甲醇(30mL)清洗3次，利用布氏漏斗過(guò)濾。在真空下濃縮合并的濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N4-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷dC.04(0.185g，79％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.02(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.92(d，1H，J＝7.2Hz，H-6)，7.79(d，1H，J＝7.5Hz，Ph-H)，7.57(t，1H，J＝7.3Hz，Ph-H)，7.41(t，1H，J＝7.5Hz，Ph-H)，6.38(bs，1H，NH)，6.26(t，1H，J＝5.2Hz，H-1’)，5.68(d，1H，J＝7.2Hz，H-5)，4.92(m，2H，Ph-CH2)，4.36(m，1H，H-3’)，3.88(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.75(m，1H，H-5’b)，2.39(m，1H，H-2’a)，2.07(m，1H，H-2’b)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.87(s，9H，(CH3)3CSi)，0.09(s，6H，(CH3)2Si)，0.05(s，6H，(CH3)2Si). N4-(2-硝基芐基)-2’-脫氧胞苷(dC.05) 在氮?dú)鈿夥障掠?℃下將n-NBu4F(190mg，0.73mmol)在THF(1.4mL)中的溶液逐滴加入到化合物dC.04(170mg，0.29mmol)在THF(3.4mL)中的溶液中。攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N4-(2-硝基芐基)-2’-脫氧胞苷dC.05(62mg，59％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.23(t，1H，與D2O可交換，NH)，8.07(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.83(d，1H，J＝7.4Hz，H-6)，7.74(t，1H，J＝7.5Hz，Ph-H)，7.54(m，2H，Ph-H)，6.13(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.91(d，1H，J＝7.4Hz，H-5)，5.19(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.97(t，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.78(m，2H，Ph-CH2)，4.19(m，1H，H-3’)，3.76(m，1H，H-4’)，3.55(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.09(m，1H，H-2’a)，1.93(m，1H，H-2’b)； 13C NMR(100MHz，CD3OD)δ165.71，158.51，149.70，141.75，135.09，134.73，131.30，129.43，125.94，96.75，88.83，87.57，72.03，62.78，42.71，42.00. N4-(2-硝基芐基)-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p044) 在0℃下將POCl3(17μL，0.2mmol)加入到化合物dC.05(36mg，0.1mmol)和質(zhì)子海綿體(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并攪拌2小時(shí)。再加入POCl3(9μL，0.1mmol)，再攪拌1小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在無(wú)水DMF(1mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在0℃下逐滴加入濃氫氧化銨(5mL，27％)。室溫下再攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯WW2p044(34mg，52％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.12(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.83(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，7.69(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.60(d，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.53(t，1H，J＝8.0和7.6Hz，Ph-H)，6.29(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，6.15(d，1H，J＝7.6Hz，H-5)，4.85(bs，2H，Ph-CH2)，4.58(m，1H，H-3’)，4.21(m，3H，H-4’，H-5’a和H-5’b)，2.38(m，1H，H-2’a)，2.28(m，1H，H-2’b)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.61(d，J＝15.9Hz)，-10.60(d，J＝15.4Hz)，-19.26(br)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C16H21N4O15P3Na[M+Na]+而言，計(jì)算質(zhì)量為625.0114，實(shí)測(cè)質(zhì)量為624.9993。
N4-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸和染料標(biāo)記(WW2p080)的合成

方案.6-TAMRA標(biāo)記的N4-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸的合成。(i)4-碘-2-硝基芐基溴、n-Bu4NBr、CH2Cl2、1MNaOH，室溫，4小時(shí)，45％；(ii)N-炔丙基三氟乙酰胺、PdCl2(PPh3)2、CuI、Et3N、THF，回流，3小時(shí)，82％；(iii)SiO2，真空，70-80℃，48小時(shí)，81％；(iv)n-Bu4NF、THF，0℃，2小時(shí)，然后室溫過(guò)夜，39％；(v)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO，0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)，39％；(vi)6-TAMRA-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3緩沖液(pH 9.2)，1小時(shí)。
N4-叔丁氧羰基-N4-(4-碘-2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷(dC.06) 將4-碘-2-硝基芐基溴(461mg，1.35mmol)在CH2Cl2(4mL)中的溶液逐滴加入到化合物dC.02(250mg，0.45mmol)和n-Bu4NBr(145mg，0.45mmol)在CH2Cl2(4mL)和NaOH(1M；4.5mL)中的混合物中。室溫下強(qiáng)烈攪拌反應(yīng)4小時(shí)。分離有機(jī)層，利用CH2Cl2萃取水層2次(每次4mL)。利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N4-叔丁氧羰基-N4-(4-碘-2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷dC.06(167mg，45％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.37(d，1H，J＝1.8Hz，Ph-H)，8.30(d，1H，J＝7.5Hz，H-6)，7.82(dd，1H，J＝1.8Hz和8.3Hz，Ph-H)，7.26(d，1H，J＝7.5Hz，H-5)，6.99(d，1H，J＝8.4Hz，Ph-H)，6.24(dd，1H，J＝63和5.0Hz，H-1’)，5.52(q，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-3’)，3.96(m，2H，，H-4’和H-5’a)，3.80(m，1H，H-5’b)，2.51(m，1H，H-2’a)，2.14(m，1H，H-2’b)，1.34(s，9H，(CH3)3CO)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.14(s，3H，(CH3)Si)，0.13(s，3H，(CH3)Si)，0.08(s，3H，(CH3)Si)，0.07(s，3H，(CH3)Si). N4-叔丁氧羰基-N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷(dC.07) 在氮?dú)鈿夥障?，將雙(三苯基膦)二氯化鈀(II)(41mg，0.058mmol)在無(wú)水THF(3mL)中的溶液快速加入到化合物dC.06(315mg，0.39mmol)、CuI(15mg，0.078mmol)、Et3N(0.73mL，5.2mmol)和N-炔丙基三氟乙酰胺(82mg，0.54mmol)在無(wú)水THF(7mL)中的混合物中。將反應(yīng)混合物回流2小時(shí)，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N4-叔丁氧羰基-N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷dC.07(268mg，82％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.33(d，1H，J＝7.7Hz，H-6)，8.03(d，1H，J＝1.5Hz，Ph-H)，7.61(bs，1H，NH)，7.50(dd，1H，J＝1.5Hz和8.2Hz，Ph-H)，7.32(d，1H，J＝7.7Hz，H-5)，7.18(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.24(t，1H，J＝6.0Hz，H-1’)，5.56(q，2H，PhCH2)，4.42(m，1H，H-3’)，4.35(d，2H，CH2)，3.97(m，2H，H-5’a和H-4’)，3.80(m，1H，H-5’b)，2.50(m，1H，H-2’a)，2.05(m，1H，H-2’b)，1.31(s，9H，(CH3)3CO)，0.96(s，9H，(CH3)3CSi)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.15(s，3H，(CH3)Si)，0.14(s，3H，(CH3)Si)，0.07(s，6H，(CH3)2Si). N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷(dC.08) 將硅膠60(3.1g，100-200目，通過(guò)在減壓下加熱至50-60℃24小時(shí)活化)加入到化合物dC.07(305mg，0.36mmol)在CH2Cl2(4mL)的溶液中，將混合物在真空下蒸干。減壓下將殘留物加熱至60-70℃24小時(shí)，利用甲醇(30mL)清洗3次，利用布氏漏斗過(guò)濾。在真空下濃縮合并的濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷dC.08(219mg，81％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.25(bs，1H，N-H)，7.94(d，1H，J＝7.4Hz，H-6)，7.84(s，1H，Ph-H)，7.62(d，1H，J＝7.7Hz，Ph-H)，7.41(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，6.25(m，2H，N-H和H-1’)，5.67(d，1H，J＝7.3Hz，H-5’)，4.83(m，2H，Ph-CH2)，4.38(m，2H，CH2和H-3’)，3.90(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.75(m，1H，H-5’b)，2.36(m，1H，H-2’a)，2.05(m，1H，H-2’b)，0.90(s，9H，(CH3)3CSi)，0.87(s，9H，(CH3)3CSi)，0.08(s，6H，(CH3)2Si)，0.05(s，6H，(CH3)2Si). N4-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧胞苷(dC.09) 在氮?dú)鈿夥蘸?℃下將n-Bu4NF(94mg，0.36mmol)在THF(2.5mL)中的溶液逐滴加入到化合物dC.08(200mg，0.27mmol)在THF(1mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2小時(shí)，然后在室溫下過(guò)夜，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧胞苷dC.09(54mg，39％)。
1H NMR(400MHz，(DMSO-d6)δ10.12(t，1H，N-H)，8.26(t，1H，N-H)，8.08(s，1H，Ph-H)，7.84(d，1H，J＝7.5Hz，H-6)，7.78(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，7.50(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，6.13(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.91(d，1H，J＝7.4Hz，H-5)，5.20(d，1H，3’-OH)，5.10(t，1H，5’-OH)，4.77(d，2H，Ph-CH2)，4.35(m，1H，H-3’)，4.31(m，2H，CH2)，3.80(m，1H，H-4’)，3.55(m，2H，H-5’)，2.10(m，1H，H-2’a)，1.92(m，1H，H-2’b). N4-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸(dC.10) 在0℃下將POCl3(18μL，0.2mmol)加入到化合物dC.09(49mg，0.1mmol)和質(zhì)子海綿體(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并攪拌2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在無(wú)水DMF(1mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在0℃下逐滴加入濃氫氧化銨(5mL，27％)。室溫下再攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯dC.10(28mg，39％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.22(s，1H，Ph-H)，7.88(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，7.74(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.59(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.33(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，6.18(d，1H，J＝7.6Hz，H-5)，4.61(m，1H，H-3’)，4.24(m，3H，H-4’，H-5’)，3.63(s，2H，CH2)，2.42(m，1H，H-2’a)，2.29(m，1H，H-2’b)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.88(d，J＝15.6Hz)，-10.69(d，J＝15.6Hz)，-19.25(t，J＝15.6Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C19H22N5O15P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為676.0223，實(shí)測(cè)質(zhì)量為676.0563。
6-TAMRA標(biāo)記的N4-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p080) 將6-TAMRA-SE(0.75mg，1.4μmol)在無(wú)水DMSO(30μL)中的溶液加入到三磷酸酯dC.10(1.6μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH9.2；0.3mL)中的溶液中，并在室溫下孵育30分鐘。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化反應(yīng)，得到6-TAMRA標(biāo)記的三磷酸酯WW2p080。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-TAMRA染料的消光系數(shù)(即在555nm下的65,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW2p080的濃度。
N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p115)的合成
方案.N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、DMF，室溫，3小時(shí)，92％；(ii)TPSCl、DMAP、CH2Cl2，室溫，88％；(iii)1-(2-硝基苯基)乙胺dC.13c、DMF，90℃，1.5小時(shí)，39％；(iv)n-Bu4NF、THF，0℃，2小時(shí)，然后室溫，1小時(shí)，90％；(v)POCl3，質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO，0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)。
3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧尿苷(dC.11) 在氮?dú)鈿夥障掠?℃下將2’-脫氧尿苷dU(2.5g，10.95mmol)，TBSCl(7.26g，48.2mmol)和咪唑(6.56g，96.4mmol)在無(wú)水DMF(25mL)中的混合物攪拌2小時(shí)，然后在1小時(shí)內(nèi)溫?zé)嶂潦覝亍Ｔ谡婵障聺饪s反應(yīng)混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧尿苷dC.11(4.62g，92％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.48(s，1H，NH)，7.80(d，1H，J＝8.1Hz，H-6)，6.19(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.59(d，1H，J＝8.1Hz，H-5)，4.31(m，1H，H-3’)，3.81(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.65(m，1H，H-5’b)，2.21(m，1H，H-2’a)，1.97(m，1H，H-2’b)，0.81(s，9H，(CH3)3CSi)，0.79(s，9H，(CH3)3CSi)，0.00(s，6H，(CH3)2Si)，-0.02(2s，各3H，(CH3)2Si). O4-(2，4，6-三異丙基苯磺酰基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧尿苷(dC.12) 在氮?dú)鈿夥障聦?，4，6-三異丙基苯磺酰氯(660mg，2.19mmol)加入到化合物dC.11(500mg，1.09mmol)、DMAP(6.7mg，催化量)和Et3N(0.62mL，4.38mmol)在無(wú)水CH2Cl2(6mL)中的溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的O4-(2，4，6-三異丙基苯磺酰基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧尿苷dC.12(690mg，88％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.46(d，1H，J＝7.3Hz，H-6)，7.20(s，2H，Ph-H)，6.08(dd，1H，J＝4.3Hz，H-1’)，6.01(d，1H，J＝7.3Hz，H-5)，4.33(m，1H，H-3’)，4.25(m，2H，CH)，3.94(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.76(m，1H，H-5’b)，2.91(m，1H，CH)，2.48(m，1H，H-2’a)，2.12(m，1H，H-2’b)，1.31(d，6H，CH3)，1.26(dd，12H，CH3)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.86(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10和0.09(2s，6H，(CH3)2Si)，0.04(s，6H，(CH3)2Si). N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧胞苷(dC.13) 將化合物dC.12(410mg，0.56mmol)和1-(2-硝基苯基)乙胺dC.13c(470mg，2.82mmol)在無(wú)水DMF(3mL)中的溶液加熱至90℃1.5小時(shí)，然后在真空下濃縮。將殘留物溶解在CH2Cl2(50mL)中，利用飽和NH4Cl溶液(30mL)、水(30mL)清洗，利用飽和NaHCO3溶液(30mL)清洗。利用Na2SO4干燥有機(jī)層，過(guò)濾，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧尿苷dC.13(130mg，39％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.97(m，1H，Ph-H)，7.89(d，1H，J＝7.1Hz，H-6)，7.65(m，2H，Ph-H，7.41(m，1H，Ph-H)，6.19(m，1H，H-1’)，5.91(m，1H，H-5)，5.37(m，1H，Ph-CH)，4.34(m，1H，H-3’)，3.86(m，2H，H-4’和H-5’a)，3.72(m，1H，H-5’b)，2.05(m，1H，H-2’a)，1.83(m，1H，H-2’b)，1.59(bs，3H，CH3)，0.86(s，12H，(CH3)3CSi)，0.03(s，12H，(CH3)2Si). N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧胞苷(dC.14) 在0℃下將n-Bu4NF(142mg，0.54mmol)在THF(3mL)中的溶液加入到化合物dC.13(130mg，0.22mmol)在THF(2mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2小時(shí)，然后在室溫下攪拌1小時(shí)，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色粉末的N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧胞苷dC.14(80mg，90％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.95(m，2H，Ph-H和H-5)，7.65(m，2H，Ph-H)，7.45(m，1H，Ph-H)，6.22(m，1H，H-1’)，5.97(m，1H，H-5)，5.74(m，1H，Ph-CH)，4.34(m，1H，H-3’)，3.93(m，1H，H-4’)，3.75(m，2H，H-5’)，2.32(m，1H，H-2’a)，2.09(m，1H，H-2’b)，1.59(m，3H，CH3). N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸(WW2p115) 在0℃下將POCl3(14μL，0.15mmol)加入到化合物dC.14(28mg，0.08mmol)和質(zhì)子海綿體(23mg，0.11mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并攪拌2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(180mg，0.38mmol)和三正丁胺(80μL)在無(wú)水DMF(0.8mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯WW2p115(24mg，47％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，D2O)δ7.98(m，1H，Ph-H)，7.80(m，1H，H-6)，7.66(m，2H，Ph-H)，7.49(m，1H，Ph-H)，6.24(m，1H，H-1’)，6.11(m，1H，H-5)，5.60(m，1H，Ph-CH)，4.55(m，1H，H-3’)，4.19(m，3H，H-4’和H-5’)，2.35(m，1H，H-2’a)，2.24(m，1H，H-2’b)，1.59(d，3H，J＝6.7Hz，CH3)； 非對(duì)映體的31P NMR(162MHz，D2O)δ-6.00(d，J＝14.1Hz)，-10.82(d，J＝15.6Hz)，-19.36(t，J＝15.9Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H23N4O15P3Na[M+Na]+而言，計(jì)算質(zhì)量為639.0271，實(shí)測(cè)質(zhì)量為639.0332。
1-(2-硝基苯基)乙胺(dC.13c)的合成
dC.13c的方案.1-(2-硝基苯基)乙胺的合成。(i)NaBH4、MeOH、二噁烷，室溫，1小時(shí)，92％；(ii)鄰苯二甲酰亞胺、DIAD、Ph3P、THF，0℃，3小時(shí)，99％；(iii)NH2NH2、CH3CH2OH，回流，1小時(shí)，80％。
1-(2-硝基苯基)乙醇(dC.13a) 將NaBH4(3.24g，85.60mmol)緩慢加入到2’-硝基苯乙酮NAP(3.74g，22.65mmol)在甲醇(34mL)和二噁烷(22mL)混合物中的溶液中。室溫下攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，然后用乙酸乙酯(100mL)稀釋?zhuān)盟?25mL)清洗。利用Na2SO4干燥有機(jī)層，過(guò)濾，在真空下濃縮，得到白色粉末的1-(2-硝基苯基)乙醇dC.13a(3.49g，92％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.89(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，7.83(d，1H，J＝7.4Hz，Ph-H)，7.65(t，1H，J＝7.4Hz，Ph-H)，7.42(t，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，5.41(q，1H，J＝6.0Hz，Ph-CH)，2.48(s，1H，OH)，1.57(d，3H，J＝6.4Hz，CH3). N-[1-(2-硝基苯基)乙基]鄰苯二甲酰亞胺(dC.13b) 將鄰苯二甲酰亞胺(660mg，4.5mmol)加入到化合物dC.13a(750mg，4.5mmol)和Ph3P(1.41g，5.4mmol)在THF(12mL)中的溶液中。將混懸液冷卻至0℃并攪拌10分鐘，然后逐滴加入偶氮二甲酸二異丙酯(1.1mL，5.4mmol)。在0℃攪拌3小時(shí)后，在真空下濃縮反應(yīng)混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到褐色油狀的N-[1-(2-硝基苯基)乙基]鄰苯二甲酰亞胺dC.13b(1.33g，99％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.93(d，1H.J＝7.9Hz，Ph-H)，7.81(m，3H，Ph-H)，7.71(m，2H，Ph-H)，7.61(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.44(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，6.08(q，1H，J＝7.2Hz，Ph-CH)，1.97(d，3H，J＝7.2Hz，CH3). 1-(2-硝基苯基)乙胺(dC.13c) 將化合物dC.13b(1.33g，4.5mmol)溶解在加熱至50℃的乙醇(21mL)中，然后冷卻至室溫。加入肼(0.55mL，11.22mmol)，將反應(yīng)混合物回流1小時(shí)，然后用冰進(jìn)行冷卻。加入乙醚(40mL)以沉淀所述化合物，通過(guò)過(guò)濾分離所述化合物，用乙醚清洗2次(每次40mL)。用水清洗合并的濾液2次(每次40mL)，然后用鹽水(40mL)清洗。利用Na2SO4干燥有機(jī)層，在真空下濃縮，得到褐色油狀的1-(4-碘-2-硝基苯基)乙胺dC.13c(600mg，80％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.78(m，2H.Ph-H)，7.61(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.37(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，4.59(q，1H，J＝6.4Hz，Ph-CH)，1.45(d，3H，J＝6.4Hz，CH3). N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸(WW2p152和WW3p026)的合成
方案.N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、DMF，室溫，60小時(shí)，95％；(ii)TPSCl、Et3N、DMAP、CH2Cl2，室溫，過(guò)夜，80％；(iii)1-(2-硝基苯基)乙胺、DMF，90℃，45分鐘；n-Bu4NF、THF、0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?小時(shí)，對(duì)于非對(duì)映體而言為60％；(iv)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO、0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)。
2’，3’，5’-O-三-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷(C.1) 在氮?dú)鈿夥蘸?℃下將TBSCl(995mg，6.6mmol)加入到尿苷(244mg，1mmol)和咪唑(898mg，13.2mmol)在無(wú)水DMF(5mL)中的溶液中。將混合物溫?zé)嶂潦覝?，攪?0小時(shí)。加入乙酸乙酯(30mL)，用飽和NH4Cl溶液清洗混合物2次(每次20mL)，用水(20mL)清洗，利用Na2SO4干燥，濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的2’，3’，5’-O-三-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷C.1(558mg，95％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.79(s，1H，NH)，8.03(d，1H，J＝8.2Hz，H-6)，5.87(d，1H，J＝3.5Hz，H-1’)，5.68(d，1H，J＝8.2Hz，H-5)，4.08(m，3H，H-2’，H-3’和H-4’)，3.99(d，1H，J＝11.6Hz，H-5’a)，3.77(d，1H，J＝11.6Hz，H-5’b)，0.95(s，9H，(CH3)3CSi)，0.91和0.90(2s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(5s，18H，(CH3)2Si). O4-(2，4，6-三異丙基苯磺酰基)-2’，3’，5’-O-三-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷(C.2) 在氮?dú)鈿夥障聦?，4，6-三異丙基苯磺酰氯(557mg，1.84mmol)加入到化合物C.1(540mg，0.92mmol)、DMAP(12mg，催化量)和Et3N(0.5mL，3.68mmol)在無(wú)水CH2Cl2(10mL)中的溶液中。室溫下攪拌混合物過(guò)夜，加入CH2Cl2(20mL)，利用飽和NH4Cl溶液(15mL)清洗，利用Na2SO4干燥，濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色泡沫狀的O4-(2，4，6-三異丙基苯磺?；?-2’，3’，5’-O-三-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷C.2(629mg，80％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.62(d，1H，J＝7.3Hz，H-6)，7.20(s，2H，Ph-H)，5.99(d，1H，J＝7.3Hz，H-5)，5.68(d，1H，J＝1.0Hz，H-1’)，4.23(m，2H，CH)，4.09(m，3H，H-2’，H-3’和H-4’)，4.00(m，1H，H-5’a)，3.78(1H，d，J＝11.8Hz，H-5’b)，2.90(m，1H，CH)，1.31(d，6H，CH3)，1.26(dd，12H，CH3)，0.94(s，9H，(CH3)3CSi)，0.88(2s，18H，(CH3)3CSi)，0.17-0.05(6s，18H，(CH3)2Si). N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷(單一非對(duì)映體C.3ds1和C.3ds2) 將化合物C.2(476mg，0.56mmol)和1-(2-硝基苯基)乙胺dC.13c(498mg，3mmol)在無(wú)水DMF(4mL)中的溶液在90℃下加熱45分鐘。加入乙酸乙酯(40mL)，將混合物用飽和NH4Cl溶液(20mL)和水(20mL)清洗，利用Na2SO4干燥，濃縮。通過(guò)硅膠柱色譜分離兩種非對(duì)映體，得到N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’，3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷單一非對(duì)映體ds1(快速洗脫，290mg)和ds2(緩慢洗脫，203mg)。兩種非對(duì)映體均不需進(jìn)一步純化而直接用在下一步中。
N4-[(R或S)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷(單一非對(duì)映體C.3ds1) 在0℃下將n-Bu4NF(235mg，0.9mmol)在THF(3mL)中的溶液加入到N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’，3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷單一非對(duì)映體ds1(264mg)在THF(4mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝夭嚢?小時(shí)。加入硅膠60(1g)，將混合物在真空下蒸干。通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫狀的N4-[(R或S)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷單一非對(duì)映體C.3ds1(65mg，兩步大約為30％，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.39(d，1H，與D2O可交換，NH)，7.92(dd，1H，J＝1.1和8.1Hz，Ph-H)，7.82(d，1H，J＝7.5Hz，H-6)，7.70(dt，1H，J＝1.1和7.5Hz，Ph-H)，7.64(dd，1H，J＝1.2和7.5Hz，Ph-H)，7.49(dt，1H，J＝1.3和7.5Hz，Ph-H)，1H，Ph-H)，5.80(d，1H，J＝7.5Hz，H-5)，5.65(d，1H，J＝3.4Hz，H-1’)，5.50(m，1H，Ph-CH)，5.30(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.02(t，1H，D2O與D2O可交換，5’-OH)，4.96(d，1H，與D2O可交換，2’-OH)，3.90(m，2H，H-2’和H-3’)，3.78(m，1H，H-4’)，3.59(m，1H，H-5’a)，3.50(m，1H，H-5’b)，1.48(d，3H，J＝6.9Hz，CH3). N4-[(S或R)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷(單一非對(duì)映體C.3ds2) 在0℃下將n-Bu4NF(167mg，0.64mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到N4-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’，3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷單一非對(duì)映體ds2(188mg)在THF(3mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝夭嚢?小時(shí)。加入硅膠60(1g)，將混合物在真空下蒸干。通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫狀的N4-[(S或R)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷單一非對(duì)映體C.3ds2(67mg，兩步大約為30％，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.38(d，1H，與D2O可交換，NH)，7.92(dd，1H，J＝1.1和8.1Hz，Ph-H)，7.80(d，1H，J＝7.5Hz，H-6)，7.72(dt，1H，J＝1.0和7.5Hz，Ph-H)，7.63(dd，1H，J＝1.1和7.5Hz，Ph-H)，7.49(dt，1H，J＝1.3和7.5Hz，Ph-H)，5.79(d，1H，J＝7.5Hz，H-5)，5.68(d，1H，J＝4.0Hz，H-1’)，5.51(m，1H，Ph-CH)，5.20(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.01(t，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.93(d，1H，與D2O可交換，2’-OH)，3.87(m，2H，H-2’和H-3’)，3.78(m，1H，H-4’)，3.59(m，1H，H-5’a)，3.50(m，1H，H-5’a)，1.49(d，3H，J＝6.9Hz，CH3). N4-[(R或S)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸單一非對(duì)映體(WW3p026) 將POCl3(14μL，0.15mmol)加入到化合物C.3ds1(29mg，0.074mmol)和質(zhì)子海綿體(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并攪拌2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(175mg，0.37mmol)和三正丁胺(74μL)在無(wú)水DMF(0.74mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化部分溶液，得到N4-[(R或S)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸單一非對(duì)映體WW3p026(絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.0(d，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，7.92(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，7.70(m，2H，Ph-H)，7.50(t，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.14(d，1H，J＝7.6Hz，H-5)，5.92(d，1H，J＝4.1Hz，H-1’)，5.61(q，1H，J＝6.8Hz，Ph-CH)，4.33-4.21(m，3H，H-2’，H-3’和H-4’)，4.01(m，2H，H-5’)，1.60(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)； N4-[(S或R)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸單一非對(duì)映體(WW2p152) 在0℃下將POCl3(11μL，0.12mmol)加入到化合物C.3ds2(31mg，0.08mmol)和質(zhì)子海綿體(26mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并攪拌2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(190mg，0.4mmol)和三正丁胺(80μL)在無(wú)水DMF(0.8mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在240分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的N4-[(S或R)-1-(2-硝基苯基)乙基]-胞苷-5’-三磷酸單一非對(duì)映體WW2p152(26mg，47％，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ7.99(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.82(d，1H，J＝7.6Hz，H-6)，7.68(m，2H，Ph-H)，7.50(t，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，6.12(d，1H，J＝7.5Hz，H-5)，5.91(d，1H，J＝4.4Hz，H-1’)，5.60(q，1H，J＝6.8Hz，Ph-CH)，4.26(m，5H，H-2’，H-3’，H-4’和H-5’)，1.60(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.18(d，J＝19.8Hz)，-10.46(d，J＝19.1Hz)，-20.98(t，J＝19.6Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H21N4O16P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為653.0063，實(shí)測(cè)質(zhì)量為652.9975。
5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸(WW3p###)的合成
方案.5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧胞苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、DMF，室溫，24小時(shí)，42％；(ii)TPSCl、DMAP、Et3N、CH2Cl2，室溫，48小時(shí)，56％；(iii)NH3、1，4-二噁烷，80℃，2小時(shí)，56％；(iv)n-Bu4NF、THF、室溫；(v)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO、0℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)。
3’，5’-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷(dC.15) 將TBSCl(114mg，0.76mmol)在無(wú)水DMF(0.5mL)中的溶液加入到化合物dT.07(97mg，0.24mmol)和咪唑(103mg，1.52mmol)在無(wú)水DMF(1mL)中的溶液中。在氮?dú)鈿夥蘸褪覝叵聰嚢杌旌衔?4小時(shí)，然后在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到3’，5’-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dC.15(64mg，42％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.39和9.33(2br s，1H，NH)，7.92(m，2H，Ph-H)，7.70(m，2H，H-6和Ph-H)，7.42(m，1H，Ph-H)，6.29(m，1H，H-1’)，5.11(m，1H，Ph-CH)，4.41(m，1H，H-3’)，4.04(m，2H，CH2)，3.96(m，1H，H-4’)，3.80(m，2H，H-5’)，2.38(m，1H，H-2’a)，2.04(m，1H，H-2’b)，1.55(m，3H，CH3)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，12H，(CH3)2Si)； 非對(duì)映體的13C NMR(100MHz，CDCl3)δ162.89/162.76(C)，150.15(C)，148.40(C)，139.21/139.17(C)，138.94/138.68(CH)，133.86/133.76(CH)，128.22/128.19(CH)，128.17/128.07(CH)，124.23(CH)，111.30/111.22(C)，87.97/87.94(CH)，85.43/85.37(CH)，73.46/73.43(CH)，72.34/72.28(CH)，63.92/63.77(CH2)，63.07(CH2)，41.27/41.17(CH2)，25.97/25.93(CH3)，23.69/23.57(CH3)，18.43/18.41(C)，-4.64/-4.82(CH3)，-5.37/-5.40(CH3). ES+MS(ESI)658[M+Na]+； O4-(2，4，6-三異丙基苯磺?；?-3’，5’-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷(dC.16) 將2，4，6-三異丙基苯磺酰氯(61mg，0.20mmol)的溶液加入到化合物dC.15(64mg，0.10mmol)和DMAP(6mg，0.05mmol)在無(wú)水CH2Cl2(3mL)中的溶液中，然后加入Et3N(63μL，0.45mmol)。在氮?dú)鈿夥蘸褪覝叵聰嚢杌旌衔?8小時(shí)，然后在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到O4-(2，4，6-三異丙基苯磺酰基)-3’，5’-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dC.16(50mg，56％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.33和8.28(2s，1H，Ph-H)，7.90(m，3H，Ph-H)，7.67(m，2H，H-6和Ph-H)，7.44(m，1H，Ph-H)，6.27(m，1H，H-1’)，5.11(m，1H，Ph-CH)，4.40(m，1H，H-3’)，4.06(m，2H，CH2)，3.97(m，1H，H-4’)，3.79(m，2H，H-5’)，2.38(m，1H，H-2’a)，2.04(m，1H，H-2’b)，1.54(m，3H，CH3)，1.60(m，3H，CH)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.80(m，18H，CH3)，0.09(s，12H，(CH3)2Si)； 3’，5’-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷(dC.17) 將NH3(1mL，0.5M，在二噁烷中)的溶液加入到化合物dC.16(48mg，0.05mmol)在無(wú)水1，4-二噁烷(1mL)中的溶液中。在80℃下攪拌混合物2小時(shí)，然后在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-5-[1-(2-硝基苯基)乙氧基甲基]-2’-脫氧尿苷dC.18(25mg，58％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
實(shí)施例4dG化合物 N2-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW2p067)的合成
方案.N2-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、無(wú)水DMF，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀^(guò)夜，96％；(ii)AC2O，無(wú)水吡啶，室溫，100℃，72％；(iii)Boc2O、Et3N、DMAP、CH2Cl2，回流，2小時(shí)，54％；(iv)K2CO3、MeOH，95％；(v)2-硝基芐基溴、NaH、DMF，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?小時(shí)，91％；(vi)SiO2，真空，70-80℃，48小時(shí)，97％；(vii)n-Bu4NF、THF，0℃，1小時(shí)，然后室溫，2小時(shí)，83％；(viii)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)，62％。
3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.01) 在0℃和氮?dú)鈿夥障聦?’-脫氧鳥(niǎo)苷dG(0.89g，3.30mmol)、咪唑(2.0g，29.32mmol)和TBSCl(2.34g，15.55mmol)加入到無(wú)水DMF(8mL)中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪拌過(guò)夜。然后在真空下濃縮混合物，利用CHCl3(8mL)和MeOH(8mL)的混合物處理，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到白色粉末狀的3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.01(1.57g，96％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.60(br s，1H，H-1)，7.88(s，1H，H-8)，6.47(br s，2H，NH2)，6.10(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，4.48(m，1H，H-3’)，3.80(m，1H，H-4’)，3.70(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.64(m，1H，H-2’a)，2.18(m，1H，H-2’b)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.86(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.03(s，6H，(CH3)2Si). N2-乙?；?3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.02) 室溫下將乙酸酐(1.22mL，12.92mmol)緩慢加入到化合物dG.01(0.51g，1.03mmol)在無(wú)水吡啶(10mL)中的溶液中并在100℃下攪拌3小時(shí)。在真空下濃縮反應(yīng)，利用無(wú)水乙醇(15mL)共蒸發(fā)3次，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到白色泡沫狀的N2-乙?；?3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.02(0.34g，56％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.03(s，1H，NH)，11.70(s.1H，NH)，8.20(s，1H，H-8)，6.19(t，1H，J＝6.2Hz，H-1’)，4.51(m，1H，H-3’)，3.84(m，1H，H-4’)，3.68(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.71(m，1H，H-2’a)，2.17(m，1H，H-2’b)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.86(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.04(s，6H，(CH3)2Si). N1，N2-雙-叔丁氧羰基-N2-乙?；?3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.03) 在氮?dú)鈿夥障聦⒍妓岫宥□?8.75g，40mmol)在無(wú)水CH2Cl2(27mL)中的溶液加入到化合物dG.02(1.85g，3.44mmol)、Et3N(12.17mL，15.48mmol)和DMAP(1.72g，14.10mmol)在無(wú)水CH2Cl2(20mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物回流2小時(shí)，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到白色泡沫狀的N1，N2-雙-叔丁氧羰基-N2-乙?；?3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.03(1.37g，54％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H，H-8)，6.43(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.59(m，1H，H-3’)，3.99(m，1H，H-4’)，3.87(m，1H，H-5’a)，3.87(m，1H，H-5’b)，2.60(a，3H，CH3CO)，2.52(m，1H，H-2’a)，2.41(m，1H，H-2’b)，1.71(s，9H，(CH3)3CO)，1.36(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，9H，(CH3)3CSi)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.09(s，6H，(CH3)2Si). N1，N2-雙-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.04) 室溫下利用K2CO3(1.23g.8.90mmol)在MeOH(20.5mL)中處理化合物dG.03(1.31g，1.78mmol)30分鐘。將反應(yīng)在真空下濃縮，溶解在乙酸乙酯(50mL)中，用水清洗兩次(10mL)。利用Na2SO4干燥有機(jī)層，在真空下濃縮，得到白色泡沫狀的N1，N2-雙-叔丁氧羰基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.04(1.18g，95％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.82(bs，1H，N-H)，8.24(s，1H，H-8)，6.27(t，1H，J＝6.6Hz，H-1’)，4.71(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.79(m，1H，H-5’a)，3.73(m，1H，H-5’b)，2.95(m，1H，H-2’a)，2.30(m，1H，H-2’b)，1.66(s，9H，(CH3)3CO)，1.48(s，9H，(CH3)3CO)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.83(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(2s，6H，(CH3)2Si)，-0.01(2s，6H，(CH3)2Si). N1，N2-雙-叔丁氧羰基-N2-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.05) 在0℃下將NaH(22mg，0.93mmol，干燥的)加入到化合物dG.04(500mg，0.72mmol)在無(wú)水DMF(6mL)中的溶液中，在氮?dú)鈿夥障聰嚢?0分鐘。逐滴加入2-硝基芐基溴(202mg.0.94mmol)在無(wú)水DMF(3mL)中的溶液。在0℃下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在真空下濃縮。加入乙酸乙酯(50mL)，將混合物用飽和NH4Cl溶液清洗2次(20mL)。利用乙酸乙酯(20mL)萃取合并的水層，利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到白色粉末狀的N1，N2-雙-叔丁氧羰基-N2-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.05(543mg，91％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.12(s，1H，H-8)，8.06(m，1H，Ph-H)，7.68(m，1H，Ph-H)，7.56(m，1H，Ph-H)，7.38(m，1H，Ph-H)，6.41(6，J＝6.2Hz，1H，H-2’)，5.49(s，2H，Ph-CH2)，4.56(m，1H，H-3’)，4.00(m，1H，H-4’)，3.80(m，2H，H-5’)，2.52(m，1H，H-2’a)，2.39(m，1H，H-2’b)，1.54(s，9H，(CH3)3CO)，1.45(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，12H，(CH3)2Si). N2-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.06) 將硅膠60(4.5g，100-200目，通過(guò)在減壓下加熱至50-60℃24小時(shí)活化)加入到化合物dG.05(450mg，0.54mmol)在CH2Cl2(5mL)的溶液中，將混合物在真空下蒸干。減壓下將殘留物加熱至60-70℃48小時(shí)，利用甲醇清洗3次(50mL)，利用布氏漏斗過(guò)濾。在真空下濃縮合并的濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到白色泡沫狀的N2-(2-硝基芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.06(333mg，97％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.85(s，1H，N-H)，8.05(m，1H，Ph-H)，7.85(s，1H，H-8)，7.69(m，1H，Ph-H)，7.62(m，1H，Ph-H)，7.54(m，1H，Ph-H)，7.10(t，1H，N-H)，6.07(t，1H，J＝，H-1’)，4.78(m，2H，Ph-CH2)，4.40(m，1H，H-3’)，3.79(m，1H，H-4’)，3.62(m，2H，H-5’)，2.60(m，1H，H-2’a)，2.15(m，1H，H-2’b)，0.86(s，9H，(CH3)3CSi)，0.85(s，9H，(CH3)3CSi)，0.06(s，6H，(CH3)2Si)，0.01(s，6H，(CH3)2Si). N2-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.07) 在0℃下將n-Bu4NF(393mg，1.5mmol)在THF(6mL)中的溶液逐滴加入到化合物dG.06(313mg，0.5mmol)在THF(12mL)中的溶液中。在0℃下攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，然后在室溫下攪拌2小時(shí)。在真空下濃縮反應(yīng)，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到黃色泡沫狀的N2-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.07(165mg，83％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.82(s，1H，與D2O可交換，N-H)，8.06(m，1H，Ph-H)，7.90(s，1H，H-8)，7.72(m，1H，Ph-H)，7.64(m，1H，Ph-H)，7.55(m，1H，Ph-H)，7.06(t，1H，與D2O可交換，N-H)，6.08(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.23(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.80(t，3H，其中1H與D2O可交換，5’-OH and Ph-CH2)，4.25(m，1H，H-3’)，3.77(m，1H，H-4’)，3.42(m，2H，H-5’)，2.45(m，1H，H-2’a)，2.12(m，1H，H-2’b). N2-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW2p067) 將POCl3(17μL，0.18mmol)逐滴加入到化合物dG.07(50mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(205mg，0.6mmol)和三正丁胺(120μL)在無(wú)水DMF(1.2mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的N2-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸WW2p067(52mg，62％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.08(d，1H，Ph-H)，8.04(s，1H，H-8)，7.68(m，2H，Ph-H)，7.51(t，1H，Ph-H)，6.27(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，4.63(m，1H，H-3’)，4.21(m，1H，H-4’)，4.10(m，2H，H-5’)，2.66(m，1H，H-2’a)，2.41(m，1H，H-2’b)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-6.48(d，J＝15.7Hz)，-11.40(d，J＝15.2Hz)，-19.94(br)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H19N6O15P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為663.0019，實(shí)測(cè)質(zhì)量為663.0143。
O6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW2p077)的合成
方案.O6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸的合成。(i)2-均三甲苯-磺酰氯、Et3N、DMAP、無(wú)水CH2Cl2、HMPA，室溫，過(guò)夜，98％；(ii)2-硝基芐醇、DABCO、DBU，分子篩，無(wú)水1，2-DME，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?4小時(shí)，77％；(iii)n-Bu4NF、THF，室溫，1.5小時(shí)，94％；(iv)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)，35％。
O6-(2-均三甲苯磺?；?-3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.08) 將2-均三甲苯磺酰氯(510mg，2.34mmol)、Et3N(0.56mL，4.0mmol)和DMAP(27mg，0.197mmol)加入到化合物dG.01(500mg，1.0mmol)在六甲基磷酰三胺(1.5mL)和無(wú)水CH2Cl2(7mL)混合物中的溶液中。在室溫下攪拌反應(yīng)過(guò)夜，然后用乙醚(25mL)稀釋。將所述乙醚溶液用飽和NaHCO3清洗2次(每次10mL)，然后用鹽水(10mL)清洗。利用Na2SO4干燥有機(jī)層，在真空下濃縮得到半固體，將所述半固體溶解在乙醚(2mL)中，用己烷(40mL)逐漸稀釋。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀，得到 O6-(2-均三甲苯磺?；?-3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.08(737mg，98％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.98(s，1H，H-8)，6.98(s，2H，Ph-H)，6.28(t，1H，J＝6.5Hz，H-1’)，4.84(br s，2H，NH2)，4.57(m，1H，H-3’)，3.97(m，1H，H-4’)，3.78(dd，1H，J＝2.9和11.0Hz，H-5’a)，3.75(dd，1H，J＝2.9和11.0Hz，H-5’b)，2.75(s，6H，CH3)，2.53(m，1H，H-2’a)，2.34(m，1H，H-2’b)，2.31(s，3H，CH3)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.90(s，9H，(CH3)3CSi)，0.09(s，6H，(CH3)2Si)，0.06(s，6H，(CH3)2Si). O6-(2-硝基芐基)-3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.09) 在0℃下將DABCO(139mg，1.24mmol)和2-硝基芐醇(474mg，3.10mmol)加入到化合物dG.08(420mg，0.62mmol)和

分子篩(200mg)在無(wú)水1，2-DME(6.2mL)中的溶液中。將混合物溫?zé)嶂潦覝?，攪?0分鐘。加入DBU(139μL，0.93mmol)，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。加入乙酸乙酯(100mL)，用水(20mL)和鹽水(20mL)清洗有機(jī)層，利用Na2SO4干燥，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到O6-(2-硝基芐基)-3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.09(300mg，77％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.09(dd，1H，J＝1.1和8.2Hz，Ph-H)，7.94(s，1H，H-8)，7.86(d，1H，J＝7.7Hz，Ph-H)，7.60(dt，1H，J＝1.1和7.7Hz，Ph-H)，7.45(dt，1H，J＝1.0和8.2Hz，Ph-H)，6.32(t，1H，J＝6.5Hz，H-1’)，5.94(s，2H，NH2)，4.89(s，2H，PhCH2)，4.59(m，1H，H-3’)，3.98(m，1H，H-4’)，3.81(dd，1H，J＝2.9和11.0Hz，H-5’a)，3.75(dd，1H，J＝2.9和11.0Hz，H-5’b)，2.58(m，1H，H-2’a)，2.37(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(s，6H，(CH3)2Si). O6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.10) 在室溫下將n-Bu4NF(252mg，0.80mmol)在THF(4mL)中的溶液加入到化合物dG.09(200mg，0.32mmol)在THF(4mL)中的溶液中。攪拌混合物1.5小時(shí)，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠色譜純化得到O6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.10(119mg，94％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.16(dd，1H，J＝1.0和8.2，Hz，Ph-H)，8.13(s，1H，H-8)，7.79(m，2H，Ph-H)，7.63(m，1H，Ph-H)，6.49(br s，2H，與D2O可交換，NH2)，6.22(dd，1H，J＝6.1和7.7Hz，H-1’)，5.87(s，2H，PhCH2)，5.28(br，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.99(br，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.35(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.55(m，1H，H-5’b)，3.52(m，1H，H-5’a)，2.58(m，1H，H-2’a)，2.23(m，1H，H-2’b). O6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW2p077) 將POCl3(14μL，0.18mmol)逐滴加入到化合物dG.10(43mg，0.1mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中并保持在零下20-30℃2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在無(wú)水DMF(1.0mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的O6-(2-硝基芐基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸WW2p077(24mg，35％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.21(s，1H，H-8)，8.13(d，J＝8.2Hz，1H，Ph-H)，7.83(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，7.74(t，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，7.51(t，J＝7.8Hz，1H，Ph-H)，6.35(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.86(s，2H，Ph-CH2)，4.28(m，1H，H-4’)，4.23(m，2H，H-5’)，2.82(m，1H，H-2’a)，2.57(m，1H，H-2’b)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-6.48(br)，-10.96(br)，-21.83(br)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H19N6O15P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為663.0019，實(shí)測(cè)質(zhì)量為663.0228。
6-ROX標(biāo)記的O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW2p121)的合成
方案.6-ROX標(biāo)記的O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸的合成。(i)4-碘-2-硝基芐醇、DABCO、DBU、

分子篩，無(wú)水1，2-DME，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?4小時(shí)，77％；(ii)n-Bu4NF、THF，室溫，1.5小時(shí)，62％；(iii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(O)、CuI、Et3N、無(wú)水DMF，4小時(shí)，42％；(iv)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO、0℃，1小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)；(v)6-ROX-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3緩沖液(pH 9.2)，1小時(shí)。
O6-(4-碘-2-硝基芐基)-3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.11) 在0℃下將DABCO(90mg，0.80mmol)和4-碘-2-硝基芐醇(555mg，2.00mmol)加入到化合物dG.08(270mg，0.40mmol)和

分子篩(129mg)在無(wú)水1，2-DME(4mL)中的溶液中。將混合物升至室溫并攪拌30分鐘。加入DBU(91μL，0.60mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。加入乙酸乙酯(70mL)，用水(10mL)和鹽水(10mL)清洗有機(jī)溶液，利用Na2SO4干燥，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠色譜純化得到O6-(4-碘-2-硝基芐基)-3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脫氧鳥(niǎo)苷dG.11(233mg，77％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.40(d，1H，J＝1.7Hz，Ph-H)，7.94(s，1H，H-8)，7.86(dd，1H，J＝1.7和8.3Hz，Ph-H)，7.60(d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，6.31(t，1H，J＝6.5Hz，H-1’)，5.86(s，2H，NH2)，4.87(s，2H，PhCH2)，4.59(m，1H，H-3’)，3.98(m，2H，H-4’)，3.82(dd，AB，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’a)，3.75(dd，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’b)，2.57(m，1H，H-2’a)，2.37(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(s，6H，(CH3)2Si). O6-(4-碘-2-硝基芐基)-2-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.12) 室溫下將n-Bu4NF(291mg，0.924mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到化合物dG.11(233mg，0.31mmol)在THF(4mL)中的溶液中。攪拌混合物1.5小時(shí)，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠色譜純化得到O6-(4-碘-2-硝基芐基)-2-脫氧鳥(niǎo)苷dG.12(101mg，62％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.43(d，1H，J＝1.8Hz，Ph-H)，8.16(dd，1H，J＝1.8和8.2Hz，Ph-H)，8.13(s，1H，H-8)，7.52(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.48(br s，2H，與D2O可交換，NH2)，6.22(dd，1H，J＝6.2和7.7Hz，H-1’)，5.79(s，2H，PhCH2)，5.27(d，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.97(t，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.35(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.52(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.58(m，1H，H-2’a)，2.22(m，1H，H-2’b). O6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.13) 室溫下將化合物dG.12(95mg，0.18mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(82mg，0.53mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(21mg，0.018mmol)、CuI(7mg，0.036mmol)和Et3N(51μL，0.36mmol)在無(wú)水DMF(1.4mL)中的溶液攪拌4小時(shí)。加入CH2Cl2(1mL)、甲醇(1mL)和NaHCO3(84mg，1mmol)，攪拌混合物20分鐘，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜和制備HPLC純化，得到O6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.13(42mg，42％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.11(br 1H，NH)，8.16(d，1H，J＝1.7Hz，Ph-H)，8.13(s，1H，H-8)，7.86(dd，1H，J＝1.7和8.2Hz，Ph-H)，7.75(d，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.50(br s，2H，與D2O可交換，NH2)，6.22(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.87(s，2H，PhCH2)，5.27(d，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.97(t，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.35(m，1H，H-3’)，4.33(s，2H，CH2)，3.82(m，2H，H-4’)，3.55(m，1H，H-5’b)，3.51(m，1H，H-5’a)，2.58(m，1H，H-2’a)，2.23(m，1H，H-2’b). O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(dG.14) 將化合物dG.13(33mg，0.06mmol)和質(zhì)子海綿體(26mg，0.12mmol)在無(wú)水吡啶(3mL)中蒸發(fā)3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.3mL)中。加入POCl3(8μL，0.09mmol)，在0℃攪拌混合物1小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(142mg，0.3mmol)和三正丁胺(60μL)在無(wú)水DMF(0.6mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在0℃下逐滴加入濃氫氧化銨(5mL，27％)。在室溫下再攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化得到O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸dG.14。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.28(s，H-8)，8.26(s，1H，Ph-H)，7.80(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.63(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.38(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.88(br s，2H，Ph-CH2)，4.29(m，3H，H-4’，H-5’)，3.67(s，2H，CH2)，2.80(m，1H，H-2’a)，2.56(m，1H，H-2’b)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.85(d，J＝19.4Hz)，-10.98(d，J＝19.4Hz)，-21.78(t，J＝19.4Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C20H24N7O15P3Na[M+Na]+而言，計(jì)算質(zhì)量為718.0441，實(shí)測(cè)質(zhì)量為718.0600。
6-ROX標(biāo)記的O6-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基芐基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW2p121) 將6-ROX-SE(0.3mg，0.47μmol)在無(wú)水DMSO(12μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.14(0.36μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；0.6mL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化反應(yīng)，得到6-ROX標(biāo)記的三磷酸酯WW2p121。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-ROX染料的消光系數(shù)(即在575nm下的82,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW2p121的濃度。
O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW2p143)的合成
方案.O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(2-硝基苯基)乙醇、PPh3、DIAD、無(wú)水THF，室溫，6小時(shí)，74％；(ii)n-Bu4NF、THF，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?小時(shí)，64％；(iii)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO、0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，60℃，3小時(shí)。
O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙?；?3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.15) 將化合物dG.02(108mg，0.2mmol)、1-(2-硝基苯基)乙醇(33mg，0.23mmol)和PPh3(79mg，0.3mmol)在無(wú)水THF(2mL)中的溶液利用偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD，59μL，0.3mmol)處理，并在室溫下攪拌6小時(shí)。將混合物用CH2Cl2(20mL)進(jìn)行稀釋?zhuān)蔑柡蚇H4Cl溶液(10mL)清洗1次，利用Na2SO4干燥，濃縮，通過(guò)硅膠色譜純化得到黃色泡沫狀的O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.15(102mg，74％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.13和8.12(2s，1H，H-8).7.89(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.83(m，1H，Ph-H)，7.74(br s.，1H，NH)，7.57(t，1H，J＝7.2Hz，Ph-H)，7.40(t，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.69(m，1H，PhCH)，6.36(t，1H，J＝6.3Hz，H-1’)，4.56(m，1H，H-3’)，3.98(m，1H，H-4’)，3.82(m，1H，H-5’a)，3.76(m，1H，H-5’b)，2.50(m，1H，H-2’a)，2.41(m，4H，H-2’b和CH3CO)，1.88(2d，J＝6.5Hz，CH3)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.10(s，6H，(CH3)2Si)，0.09(s，6H，(CH3)2Si). O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙酰基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.16) 在0℃下將n-Bu4NF(95mg，0.36mmol)在THF(2mL)中的溶液加入到化合物dG.15(100mg，0.15mmol)在THF(5mL)中的溶液中。將混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪?小時(shí)。加入硅膠(500mg，60-200目)，真空蒸發(fā)混合物。通過(guò)硅膠色譜純化殘留物，得到O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙?；?2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.16(43mg，64％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.19和10.18(2s，1H，與D2O可交換，NH)，8.43(2s，1H，H-8)，8.04(d，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.79-7.74(m，2H，Ph-H)，7.56(t，1H，J＝8.1Hz，Ph-H)，6.84(m，1H，PhCH)，6.26(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，5.29(2d，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.88(m，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.39(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.56(m，1H，H-5’b)，3.51(m，1H，H-5’a)，2.56(m，1H，H-2’a)，2.23(m，1H，H-2’b)，2.12(s，3H，CH3CO)，1.79(2d，J＝6.4Hz，CH3)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C20H21N6O7[M-H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為457.1472，實(shí)測(cè)質(zhì)量為457.1392。
O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW2p143) 將化合物dG.16(25mg，0.055mmol)和質(zhì)子海綿體(23mg，0.11mmol)在無(wú)水吡啶(2mL)中蒸發(fā)3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.3mL)中。加入POCl3(8μL，0.08mmol)，在0℃攪拌混合物2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(130mg，0.28mmol)和三正丁胺(55μL)在無(wú)水DMF(0.55mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化部分溶液，得到O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-N2-乙?；?2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 40分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。然后在60℃下利用濃氫氧化銨(2mL，27％)處理所純化的三磷酸酯3小時(shí)。如上所述利用反相HPLC進(jìn)行純化，得到O6-[1-(2-硝基苯基)乙基]-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸WW2p143(非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，D2O)8.26和8.25(2s，1H，H-8)，8.02(d，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.88(d，1H，J＝7.8Hz，Ph-H)，7.72(t，1H，J＝7.6Hz，Ph-H)，7.53(t，1H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.71(m，1H，PhCH)，6.34(t，1H，J＝6.8Hz，H-1’)，4.25-4.16(m，3H，H-4’和H-5’)，2.80(m，1H，H-2’a)，2.51(m，1H，H-2’b)，1.86(d，1H，J＝6.4Hz，CH3)； 非對(duì)映體的31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.18(d，J＝20.4Hz)，-10.25(d，J＝19.3Hz)，-21.07(t，J＝19.8Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C18H22N6O15P3[M-H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為655.0356，實(shí)測(cè)質(zhì)量為655.0430。
6-ROX標(biāo)記的O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW3p008)的合成
方案.6-ROX標(biāo)記的O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸的合成。(i)1-(4-碘-2-硝基苯基)乙醇、PPh3、DIAD、無(wú)水THF，室溫，過(guò)夜，76％；(ii)n-Bu4NF、THF，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?小時(shí)，52％；(iii)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4、CuI、Et3N、無(wú)水DMF，4小時(shí)，96％；(iv)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO、0℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，60℃，6小時(shí)；(v)6-ROX-SE，0.1M Na2CO3/NaHCO3緩沖液(pH 9.2)，1小時(shí)。
O6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-N2-乙?；?3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.17) 利用偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD，79μL，0.4mmol)處理化合物dG.02(146mg，0.27mmol)、1-(4-碘-2-硝基苯基)乙醇(79mg，0.27mmol)和PPh3(106mg，0.4mmol)在無(wú)水THF(2mL)中的溶液，在室溫下攪拌過(guò)夜。將混合物用CH2Cl2(20mL)進(jìn)行稀釋?zhuān)蔑柡蚇H4Cl溶液(10mL)清洗1次，利用Na2SO4干燥，濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到黃色泡沫狀的 O6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-N2-乙?；?3’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.17(168mg，76％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.20(s，1H，Ph-H)，8.13和8.12(2s，1H，H-8)，7.87(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.73(br s，1H，NH)，7.55(d，1H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.62(m，1H，PhCH)，6.35(t，1H，J＝6.5Hz，H-1’)，4.56(m，1H，H-3’)，3.98(m，1H，H-4’)，3.82(m，1H，H-5’a)，3.77(m，1H，H-5’b)，2.50(m，1H，H-2’a)，2.41(m，4H，H-2’b和CH3CO)，1.85(d，J＝6.4Hz，CH3)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si). O6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-N2-乙?；?2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.18) 在0℃下將n-Bu4NF(125mg，0.48mmol)在THF(1.5mL)中的溶液加入到化合物dG.17(155mg，0.19mmol)在THF(2mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪?小時(shí)。加入硅膠60(1g，60-200目)，真空蒸發(fā)混合物至干。通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫狀的O6-[1-(4-碘-2-硝基苯基)乙基]-N2-乙?；?2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.18(58mg，52％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.21和10.20(2s，1H，與D2O可交換，NH)，8.43(2s，1H，H-8)，8.34(2s，Ph-H)，8.08(2d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，7.54(2d，1H，J＝8.3Hz，Ph-H)，6.75(m，1H，PhCH)，6.27(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.30(m，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.89(m，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.39(m，1H，H-3’)，3.82(m，1H，H-4’)，3.56(m，1H，H-5’b)，3.50(m，1H，H-5’a)，2.60(m ，1H，H-2’a)，2.22(m，1H，H-2’b)，2.12(s，3H，CH3CO)，1.75(2d，J＝6.4Hz，CH3). O6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-N2-乙?；?2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dG.19) 室溫下將化合物dG.18(58mg，0.1mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(45mg，0.3mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(11.5mg，0.01mmol)、碘化銅(I)(3.8mg，0.02mmol)和三乙胺(27μL，0.19mmol)的溶液攪拌4小時(shí)。加入甲醇(1mL)、CH2Cl2(1mL)和碳酸氫鈉(80mg，0.95mmol)，再攪拌混合物半小時(shí)，然后在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化得到O6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-N2-乙?；?2’-脫氧鳥(niǎo)苷dG.19(58mg，96％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.21和10.20(2s.1H，與D2O可交換，NH)，10.08(br，1H，NHCOCF3)，8.43(2s，1H，H-8)，8.06(s，1H，Ph-H)，7.77(m，2H，Ph-H)，6.78(m，1H，PhCH)，6.28(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.29(2d，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.89(t，1H，與D2O可交換，3’-OH)，4.39(m，1H，H-3’)，4.29(d，2H，CH2)，3.82(m，2H，H-4’)，3.50(m，1H，H-5’a)，3.44(m，1H，H-5’b)，2.67(m，1H，H-2’a)，2.23(m，1H，H-2’b)，2.11(s，3H，CH3)，1.78(d，3H，J＝6.4Hz，CH3)； O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(dG.20) 將化合物dG.19(44mg，0.07mmol)和質(zhì)子海綿體(30mg，0.14mmol)在無(wú)水吡啶(3mL)中蒸發(fā)3次，并溶解在磷酸三甲酯(0.5mL)中。加入POCl3(10μL，0.11mmol)，在0℃攪拌混合物3小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(166mg，0.35mmol)和三正丁胺(70μL)在無(wú)水DMF(0.7mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH7.5；10mL)。將反應(yīng)在室溫下攪拌1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC純化部分溶液，得到O6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-N2-乙?；?2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。然后在60℃下利用濃氫氧化銨(2mL，27％)處理所純化的三磷酸酯6小時(shí)，得到O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸dG.20(非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，D2O)8.21和8.20(2s，1H，H-8)，7.85和7.75(2s，1H，Ph-H)，7.64(m，1H，Ph-H)，7.45(m，1H，Ph-H)，6.53(m，1H，PhCH)，6.28(m，1H，H-1’)，4.23-4.12(m，3H，H-4’和H-5’)，3.97(s，2H，CH2)，2.70(m，1H，H-2’a)，2.50(m，1H，H-2’b)，1.74(m，1H，CH3)； 非對(duì)映體的31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.53(d，J＝20.1Hz)，-10.50(d，J＝19.3Hz)，-21.29(t，J＝19.8Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C21H25N7O15P3[M-H]-而言，計(jì)算質(zhì)量為708.0622，實(shí)測(cè)質(zhì)量為708.0609。
6-ROX標(biāo)記的O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW3p008) 將6-ROX-SE(3mg，4.7μmol)在無(wú)水DMSO(120μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.20(1.45μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH9.2；0.3mL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到6-ROX標(biāo)記的三磷酸酯WW3p008。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-ROX染料的消光系數(shù)(即在575nm下的82,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW3p008的濃度。
O6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸的兩種非對(duì)映體(dG.20dS1和dG.20dS2)的分離 利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC進(jìn)行dG.20的兩種非對(duì)映體的分離，以得到O6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸dG.20ds1(單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)和O6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸dG.20ds2(單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-25％B 70分鐘，然后25-50％B 30分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。

6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體O6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW3p037)的合成
方案.6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體O6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸的合成。(i)6-ROX-SE，0.1MNaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小時(shí)。
6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體O6-{(R或S)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW3p037) 將6-ROX-SE(1.5mg，2.38μmol)在無(wú)水DMSO(120μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.20ds1(0.67μmol，單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；150μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體三磷酸酯WW3p037。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 20分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-ROX染料的消光系數(shù)(即在575nm下的82,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW3p037的濃度。
6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體O6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW3p039)的合成
方案.6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體O6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸的合成。(i)6-ROX-SE，0.1MNaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小時(shí)。
6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體O6-{(S或R)-1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)-2-硝基苯基]乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW3p039)的合成 將6-ROX-SE(2.5mg，3.96μmol)在無(wú)水DMSO(200μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.20ds2(0.97μmol，單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；150μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體三磷酸酯WW3p039。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 20分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-ROX染料的消光系數(shù)(即在575nm下的82,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW3p039的濃度。
6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體O6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基-己?；?氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW3p041)的合成
方案.6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體O6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸的合成。(i)6-N-(三氟乙?；?氨基己酸N-琥珀酰亞胺酯，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)；(ii)6-ROX-SE，0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小時(shí)。
O6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(單一非對(duì)映體dG.21ds1) 將6-N-(三氟乙?；?氨基己酸N-琥珀酰亞胺酯(1.0mg，3.08μmol)在無(wú)水DMSO(20μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.20ds1(0.89μmol，單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；200μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。加入濃氫氧化銨(25％水溶液，0.5mL)，將混合物在室溫下再孵育1小時(shí)。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到三磷酸酯dG.21ds1(單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 10分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。
6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體O6-{(R或S)-1-{4-[3-(6-氨基己酰基)氨基-1-丙炔基]-2-硝基苯基}乙基}-2’-脫氧鳥(niǎo)苷-5’-三磷酸(WW3p041)的合成 將6-ROX-SE(1.5mg，2.34μmol)在無(wú)水DMSO(120μL)中的溶液加入到三磷酸酯dG.21ds1(0.59μmol，單一非對(duì)映體，絕對(duì)構(gòu)型未測(cè)定)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；200μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin Elmer OD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到6-ROX標(biāo)記的單一非對(duì)映體三磷酸酯WW3p041。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-50％B 20分鐘，然后50-90％B 20分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行HPLC純化。利用6-ROX染料的消光系數(shù)(即在575nm下的82,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW3p041的濃度。
實(shí)施例5-聚合酶終點(diǎn)(PEP)檢測(cè) 已有多個(gè)小組使用了定性的基于Sanger的檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)相對(duì)于天然核苷酸類(lèi)似物而言的終止核苷酸類(lèi)似物的相對(duì)引入效率。盡管有用，但是在不存在天然核苷酸的情形下利用這些檢測(cè)來(lái)測(cè)試修飾的核苷酸類(lèi)似物是不可行的。這兩個(gè)局限性導(dǎo)致了定量聚合酶終點(diǎn)(PEP)檢測(cè)，其以高通量方式用于篩選對(duì)抗多種充分表征的可商購(gòu)聚合酶的多種修飾核苷酸。然后可將利用特定DNA聚合酶對(duì)先導(dǎo)化合物的鑒別優(yōu)選用于進(jìn)一步的動(dòng)力學(xué)研究中。所述PEP檢測(cè)是按聚合酶濃度相對(duì)引物/模板復(fù)合物過(guò)量而設(shè)計(jì)的(即在滴定開(kāi)始時(shí)該復(fù)合物完全與聚合酶相結(jié)合)，從而限制與核苷酸結(jié)合和核苷酸基(nucleotyl)偶聯(lián)的反應(yīng)步驟。然后在合適的濃度范圍內(nèi)(通常3個(gè)數(shù)量級(jí))滴定所預(yù)期核苷酸的限量以通過(guò)凝膠電泳觀察染料標(biāo)記的引物的延伸。由半對(duì)數(shù)圖測(cè)定終點(diǎn)濃度，在所述半對(duì)數(shù)圖中，底物和產(chǎn)物的摩爾數(shù)相同，稱(chēng)為IC50(即50％時(shí)的引入濃度)值。
對(duì)于本研究中評(píng)價(jià)的所有聚合酶而言，將40nM的寡聚模板(5’-TACGGAGCA-G

ACTGGCCGTCGTTTTACA，探詢(xún)堿基(interrogation base)被加粗和下劃線(xiàn))與5nM BODIPY-FL標(biāo)記的引物(5′-TTGTAAAACGACGGCCAGT)在1×ThermoPol緩沖液(20mMTris-HCl，pH 8.8；10mM(NH4)2SO4；10mM KCl；2mM MgSO4；0.1％Triton X-100，New England BioLabs)中于80℃下退火30秒，于57℃退火30秒，然后冷卻至4℃。然后通過(guò)加入DNA聚合酶、核苷酸類(lèi)似物和ThermoPol緩沖液將所述引物/模板復(fù)合物稀釋一倍(即其最終濃度為2.5nM/10μL體積)。這清楚地表明核苷酸滴定的IC50值下限為1.25nM(即[引物]＝[引物+1])。將聚合酶反應(yīng)在其合適的溫度下孵育10分鐘，然后冷卻至4℃，利用10μL終止溶液(98％去離子甲酰胺；10mMNa2EDTA，pH 8.0；25mg/mL藍(lán)色葡聚糖，MW 2,000,000)淬滅。將終止的反應(yīng)加熱至90℃30秒，然后置于冰上。利用AB型377DNA測(cè)序儀在10％Long Ranger(Cambrex)聚丙烯酰胺凝膠上分析延伸產(chǎn)物，以產(chǎn)物形成與化合物濃度的線(xiàn)性對(duì)數(shù)圖顯示定量數(shù)據(jù)。針對(duì)每種DNA聚合酶/核苷酸類(lèi)似物組合一式三份進(jìn)行PEP測(cè)試以計(jì)算其IC50值±1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
首先通過(guò)利用2’-脫氧腺苷三磷酸(dATP，濃度范圍從0.1nM至100nM)進(jìn)行滴定來(lái)測(cè)定8種可商購(gòu)的3’-外切核酸酶缺陷(3’-exo-)DNA聚合酶的活性單位數(shù)，目的是達(dá)到1.25nM的PEP IC50限度(數(shù)據(jù)未顯示)。一般而言，就該限度而言，除了Taq、Therminator和Therminator II以外，增加單位數(shù)將降低dATP的IC50值。對(duì)于這些酶而言，dATP的IC50值隨著酶濃度的增加而增加，未對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究，推測(cè)是由于增加酶濃度與磷酸解的直接關(guān)系而引起的。就這些情形而言，用于隨后的PEP試驗(yàn)的單位數(shù)是給出dATP的最低IC50值的那些活性單位。
修飾核苷酸的滴定 然后使用8種DNA聚合酶(單位活性前面定義過(guò))在0.1nM至100nM、1nM至1μM、10nM至10μM或100nM至100μM的濃度范圍內(nèi)利用PEP試驗(yàn)滴定WW1p129和ddATP(見(jiàn)表1)。始終在低光照條件下處理對(duì)紫外線(xiàn)敏感的化合物，以將向dATP的轉(zhuǎn)化降到最低。這些數(shù)據(jù)表明，除了TaqFS以外，在所有情形下WW1p129的引入效率比ddATP更高(即較小的IC50值)。
表1對(duì)利用8種不同DNA聚合酶進(jìn)行的針對(duì)WW1p129的PEP試驗(yàn)結(jié)果的總結(jié)
還利用Bst聚合酶和Therminator DNA聚合酶并利用多種光可斷裂的終止核苷酸進(jìn)行了PEP試驗(yàn)(表2)，表明所述化合物被有效地引入。表2中的數(shù)據(jù)表明本發(fā)明化合物是非常好的底物。
表2Bst和Therminator聚合酶的IC50值的比較 標(biāo)記的核苷酸和核苷 實(shí)施例1dA化合物 N6-芐基-2’-脫氧腺苷三磷酸(WW2p062)的合成
方案.N6-芐基-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸的合成。(i)NaH、DMF、溴芐，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?6％；(ii)SiO2，真空，70-80℃，95％；(iii)n-Bu4NF、THF，99％；(iv)POCl3、(MeO)3PO、零下20-30℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF；1M HNEt3HC O3，32％。
N6-叔丁氧羰基-N6-芐基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.n1) 在0℃下將NaH(18mg，0.75mmol，干燥)加入到化合物dA.07(400mg，0.58mmol)在無(wú)水DMF(5mL)中的溶液中，攪拌30分鐘。逐滴加入溴芐(149mg.0.87mmol)在無(wú)水DMF(2.5mL)中的溶液。將混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪?小時(shí)。在真空下除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯(60mL)中，利用飽和NH4Cl溶液清洗2次(每次40mL)，用水(40mL)清洗1次。利用乙酸乙酯(10mL)萃取合并的水層，利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到粘性油狀的 N6-叔丁氧羰基-N6-芐基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.n1(398mg，86％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.72(s，1H，H-8)，8.32(s，1H，H-2)，7.39(m，2H，Ph-H)，7.25(m，2H，Ph-H)，7.18(m，1H，Ph-H)，6.49(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.28(s，2H，Ph-CH2)，4.62(m，1H，H-3’)，4.01(m，1H，H-4’)，3.85(dd，1H，J＝4.4和11.2Hz，H-5’a)，3.77(dd，1H，J＝3.4和11.2Hz，H-5’b)，2.61(m，1H，H-2’a)，2.43(m，1H，H-2’b)，1.65(s，9H，(CH3)3CO)，0.96(s，18H，(CH3)3CSi)，0.08(2s，12H，(CH3)2Si). N6-芐基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.n2) 將硅膠60(3.76g，100-200目，通過(guò)在減壓下加熱至70-80℃24小時(shí)而活化)加入到化合物dA.n1(376mg，0.56mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液中，將混合物在真空下蒸干。減壓下將殘留物加熱至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次30mL)，利用布氏漏斗過(guò)濾。在真空下濃縮合并的濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到黃色泡沫狀的N6-芐基-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.n2(305mg，95％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.41(s，1H，H-8)，8.07(s，1H，H-2)，7.38(m，2H，Ph-H)，7.33(m，2H，Ph-H)，7.28(m，1H，Ph-H)，6.45(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，6.12(br s，1H，6-NH)，4.87(br s，2H，Ph-CH2)，4.62(m，1H，H-3’)，4.01(m，1H，H-4’)，3.87(dd，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’a)，3.77(dd，1H，J＝3.2和11.2Hz，H-5’b)，2.64(m，1H，H-2’a)，2.44(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-). N6-芐基-2’-脫氧腺苷(dA.n3) 0℃下將n-Bu4NF(335mg，1.28mmol)在THF(2.5mL)中的溶液加入到化合物dA.n2(292mg，0.51mmol)在THF(6mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝兀瑪嚢?小時(shí)。加入硅膠60(1g)。將混合物在真空下蒸干。通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫狀的N6-芐基-2’-脫氧腺苷dA.n3(173mg，99％)。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.30(s，1H，H-8)，8.25(s，1H，H-2)，7.36(m，2H，Ph-H)，7.31(m，2H，Ph-H)，7.24(m，1H，Ph-H)，6.42(dd，1H，J＝6.0和7.9Hz，H-1’)，4.81(br s，2H，Ph-CH2)，4.57(m，1H，H-3’)，4.06(m，1H，H-4’)，3.83(m，1H，J＝2.9和12.3Hz，H-5’a)，3.73(dd，1H，J＝3.3和12.3Hz，H-5’b)，2.79(m，1H，H-2’a)，2.40(m，1H，H-2’b). N6-芐基-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p062) 將POCl3(22μL，0.24mmol)加入到化合物dA.10a(42mg，0.12mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(285mg，0.6mmol)和三正丁胺(120μL)在無(wú)水DMF(1.2mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后凍干。將殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用QSepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的N6-芐基-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸WW2p062(24mg，32％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.43(s，1H，H-8)，8.20(s，1H，H-2)，7.39-7.30(m，5H，Ph-H)，6.50(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.85(s，2H，Ph-CH2)，4.31(s，1H，H-4’)，4.22(m，2H，H-5’a和H-5’b)，2.82(m，1H，H-2’a)，2.62(m，1H，H-2’b)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.72(d，J＝15.9Hz)，-10.78(d，J＝15.4Hz)，-19.16(t，J＝14.9Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C17H20N5O12P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為602.0219，實(shí)測(cè)質(zhì)量為602.0363。
6-FAM標(biāo)記的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)芐基)-2’-脫氧腺苷三磷酸(WW2p085)的合成
方案.6-FAM標(biāo)記的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)芐基)-2’-脫氧腺苷三磷酸的合成。(i)NaH、DMF、4-碘芐基溴，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?9％；(ii)SiO2，真空，70-80℃，99％；(iii)n-Bu4NF、THF、98％；(iv)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、無(wú)水DMF，4.5h，94％；(v)POCl3、質(zhì)子海綿體、(MeO)3PO，零下20-30℃，2小時(shí)；(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF，5分鐘；1M HNEt3HCO3，1小時(shí)；NH4OH，1小時(shí)；84％；(vi)6-FAM-SE、0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2。
N6-叔丁氧羰基-N6-(4-碘芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.n4) 0℃下將NaH(23mg，0.94mmol，干燥)加入到化合物dA.07(500mg，0.72mmol)在無(wú)水DMF(6.5mL)中的溶液中，攪拌30分鐘。逐滴加入4-碘芐基溴(322mg.1.08mmol)在無(wú)水DMF(2.5mL)中的溶液。將混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪?小時(shí)。在真空下除去DMF，將殘留物溶解在乙酸乙酯(60mL)中，利用飽和NH4Cl溶液清洗2次(每次40mL)，利用水(40mL)清洗1次。利用乙酸乙酯(10mL)萃取合并的水層，利用Na2SO4干燥合并的有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到粘性油狀的N6-叔丁氧羰基-N6-(4-碘芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.n4(565mg，99％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.71(s，1H，H-8)，8.33(s，1H，H-2)，7.58(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.17(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.49(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.20(s，2H，Ph-CH2)，4.62(m，1H，H-3’)，4.02(m，1H，H-3’)，3.86(dd，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’a)，3.78(dd，1H，J＝3.2和11.2Hz，H-5’b)，2.63(m，1H，H-2’a)，2.45(m，1H，H-2’b)，1.42(s，9H，(CH3)3CO)，0.92(s，18H，(CH3)3CSi)，0.08(2s，12H，(CH3)2Si-). N6-(4-碘芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.n5) 將硅膠60(6.00g，100-200目，通過(guò)在減壓下加熱至70-80℃24小時(shí)而活化)加入到化合物dA.n4(565mg，0.71mmol)在CH2Cl2(20mL)的溶液中，將混合物在真空下蒸干。減壓下將殘留物加熱至70-80℃2天，利用甲醇清洗3次(每次30mL)，利用布氏漏斗過(guò)濾。在真空下濃縮合并的濾液，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到黃色泡沫狀的N6-(4-碘芐基)-3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.n5(489mg，99％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.38(s，1H，H-8)，8.06(s，1H，H-2)，7.63(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.11(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.45(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，6.34(t，1H，6-NH)，4.81(br s，2H，Ph-CH2)，4.61(m，1H，H-3’)，4.00(m，1H，H-4’)，3.85(dd，1H，J＝4.2和11.2Hz，H-5’a)，3.76(dd，1H，J＝3.2和11.2Hz，H-5’b)，2.64(m，1H，H-2’a)，2.44(m，1H，H-2’b)，0.91(s，18H，(CH3)3CSi)，0.09(2s，12H，(CH3)2Si-). N6-(4-碘芐基)-2’-脫氧腺苷(dA.n 6) 0℃下將n-Bu4NF(282mg，1.08mmol)在THF(1.0mL)中的溶液加入到化合物dA.n5(300mg，0.43mmol)在THF(1.2mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪?小時(shí)。加入硅膠60(1g)，將混合物在真空下蒸干。通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到白色泡沫狀的N6-(4-碘芐基)-2’-脫氧腺苷dA.n6(266mg，98％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.48(br s，1H，與D2O可交換，6-NH)，8.40(s，1H，H-8)，8.27(s，1H，H-2)，7.68(d，2H，J＝8.0Hz，Ph-H)，7.17(d，2H，J＝8.0Hz，Ph-H)，6.39(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，5.34(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.22(t，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.68(br s，2H，Ph-CH2)，4.44(m，1H，H-4’)，3.91(m，1H，H-3’)，3.64(m，1H，H-5’a)，3.55(m，1H，H-5’b)，2.76(m，1H，H-2’a)，2.31(m，1H，H-2’b). N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)芐基]-2’-脫氧腺苷(dA.n 7) 室溫下攪拌化合物dA.n6(266mg，0.57mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(260mg，1.72mmol)、CuI(22mg，0.11mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)(65mg，0.06mmol)和Et3N(160μL，1.14mmol)在無(wú)水DMF(2.1mL)中的溶液4.5小時(shí)。在真空下濃縮混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的 N6-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)芐基]-2’-脫氧腺苷dA.n7(268mg，94％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(br m，1H，與D2O可交換，NH)，8.46(brm，1H，與D2O可交換，NH)，8.37(s，1H，H-8)，8.19(s，1H，H-2)，7.37(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.32(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.35(dd，1H，J＝6.4和7.5Hz，H-1’)，5.31(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.19(t，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.70(br s，2H，Ph-CH2)，4.41(m，1H，H-3’)，4.26(d，2H，J＝4.3Hz，CH2)3.88(m，1H，H-4’)，3.61(m，1H，H-5’a)，3.53(m，1H，H-5’b)，2.73(m，1H，H-2’a)，2.25(m，1H，H-2’b). N6-[4-(3-氨基-1-丙基)芐基]-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(dA.n8) 將POCl3(16μL，0.17mmol)加入到化合物dA.n7(56mg，0.11mmol)和質(zhì)子海綿體(37mg，0.17mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(261mg，0.55mmol)和三正丁胺(110μL)在無(wú)水DMF(1.1mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在0℃下逐滴加入濃氫氧化銨(10mL，27％)。室溫下再攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將所得殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯dA.n8(63mg，84％)。
1H NMR(400MHz，D2O)δ8.41(s，1H，H-8)，8.19(s，1H，H-2)，7.38-7.26(m，4H，Ph-H)，6.47(dd，1H，J＝5.5和6.6Hz，H-1’)，4.30(s，1H，H-4’)，4.21(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.63(s，2H，CH2)，2.79(m，1H，H-2’a)，2.60(m，1H，H-2’b). 31P NMR(162MHz，D2O)δ-5.80(d，J＝20.1Hz)，-10.94(d，J＝19.3Hz)，-21.59(t，J＝19.3Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C20H23N6O12P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為655.0485，實(shí)測(cè)質(zhì)量為655.0758。
6-FAM 標(biāo)記的N6-(4-(3-氨基-1-丙基)芐基)-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p085) 將6-FAM-SE(3.5mg，7.35μmol)在無(wú)水DMSO(70μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.18a(3.5μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH 9.2；600μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到6-FAM標(biāo)記的三磷酸酯WW2p085。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-20％B 20分鐘，然后20-90％B 20分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行洗脫。利用6-FAM染料的消光系數(shù)(即在494nm下的68,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW2p085的濃度。
ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C41H36N6O18P3[M+H]+而言，計(jì)算質(zhì)量為993.1299，實(shí)測(cè)質(zhì)量為993.1520。
6-FAM標(biāo)記的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷三磷酸(WW2p093)的合成
方案.6-FAM標(biāo)記的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷三磷酸的合成。(i)TBSCl、咪唑、無(wú)水DMF，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?2小時(shí)，83％；(ii)2-均三甲苯磺酰氯、Et3N、DMAP、無(wú)水CH2Cl2，室溫，1.5小時(shí)，20％；(iii)1-(4-碘苯基)乙胺、分子篩、無(wú)水1，4-二噁烷，50℃，18小時(shí)，88％；(iv)n-Bu4NF、THF，0℃，然后逐漸溫?zé)嶂潦覝兀?3％；(v)N-炔丙基三氟乙酰胺、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、無(wú)水DMF，4.5小時(shí)，86％；(vi)POCl3、(MeO)3PO，零下20-30℃；(n-Bu3NH)2H2P2O7，n-Bu3N，DMF；1M HNEt3HCO3，86％；(vii)6-FAM-SE、0.1M NaHCO3/Na2CO3，pH 9.2，1小時(shí)。
3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧肌苷(dA.n9)1 在氮?dú)鈿夥蘸?℃下將TBSCl(1.91g，12.67mmol)的溶液加入到2’-脫氧肌苷(1.00g，3.96mmol)和咪唑(1.73g，25.34mmol)在無(wú)水DMF(3mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪?2小時(shí)。然后將混合物在真空下濃縮，溶解在CH2Cl2(100mL)中，用水(50mL)清洗2次，利用Na2SO4干燥，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠色譜純化，得到白色粉末的3’，5’-O-雙-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧肌苷dA.n9(1.58g，83％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.37(br s，1H，與D2O可交換，NH)，8.25(s，1H，H-8)，8.04(d，1H，J＝3.6Hz，H-2)，6.29(t，1H，J＝6.6Hz，H-1’)，4.59(m，1H，H-3’)，3.84(m，1H，H-4’)，3.74(m，1H，H-5’a)，3.66(m，1H，H-5’b)，2.76(m，1H，H-2’a)，2.30(m，1H，H-2’b)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.85(s，9H，(CH3)3CSi)，0.11(s，6H，(CH3)2Si)，0.02(2s，6H，(CH3)2Si). 1確切步驟可見(jiàn)于Kiselyov，A.S.；Steinbrecher，T.；Harvey，R.G.(1995)″Synthesis of the Fjord-region cis-and trans-Amino TriolDerivatives of the carcinogenic Hydrocarbon Benzo[g]chrysene andUtilization for the Synthesis of a Deoxyadenosine Adduct Linked to theN6-Amino Group″J.Org.Chem.，606129-6134。
O6-(2-均三甲苯磺?；?-3’，5’-雙-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷(dA.n10)1 將2-均三甲苯磺酰氯(0.70g，2.12mmol)、Et3N(0.42mL，3.07mmol)和DMAP(16mg，0.13mmol)加入到化合物dA.n9(1.02g，2.12mmol)在無(wú)水CH2Cl2(15mL)中的溶液中。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物1.5小時(shí)，然后用乙醚(50mL)稀釋。將所述醚溶液用飽和NaHCO3清洗2次(每次25mL)，然后用鹽水(25mL)清洗，利用Na2SO4干燥有機(jī)層，在真空下濃縮，通過(guò)硅膠色譜純化，得到O6-(2-均三甲苯磺?；?-3’，5’-雙-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷dA.n10(279mg，20％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.55(s，1H，H-8)，8.38(s，1H，H-2)，6.99(s，2H，Ph-H)，6.48(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，4.61(m，1H，H-3’)，4.03(m，1H，H-4’)，3.85(m，1H，H-5’a)，3.76(m，1H，H-5’b)，2.77(s，6H，CH3)，2.61(m，1H，H-2’a)，2.43(m，1H，H-2’b)，2.32(s，3H，CH3)，0.91(s，9H，(CH3)3CSi)，0.89(s，9H，(CH3)3CSi)，0.09(s，6H，(CH3)2Si)，0.08(2s，6H，(CH3)2Si). N6-[1-(4-碘苯基)乙基]-3’，5’-雙-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷(dA.n11) 在氮?dú)鈿夥蘸褪覝叵聦?-(4-碘苯基)乙胺(312mg，1.26mmol)在無(wú)水1，4-二噁烷(1mL)中的溶液加入到化合物dA.n10(279mg，0.42mmol)在含有分子篩(

8-12目，0.75g)的無(wú)水1，4-二噁烷(2mL)中的溶液中。然后在50℃攪拌混合物18小時(shí)。真空下除去溶劑，通過(guò)硅膠柱色譜純化粗產(chǎn)物，得到白色泡沫狀的N6-[1-(4-碘苯基)乙基]-3’，5’-雙-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2’-脫氧腺苷dA.n11(263mg，88％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.32(s，1H，H-8)，8.08(s，1H，H-2)，7.61(m，2H，Ph-H)，7.15(m，2H，Ph-H)，6.42(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，6.20(br m，1H，NH)，5.50(br s，1H，Ph-CH)，4.59(m，1H，H-3’)，3.99(m，1H，H-4’)，3.85(m，1H，H-5’a)，3.77(m，1H，H-5’b)，2.60(m，1H，H-2’a)，2.42(m，1H，H-2’b)，1.59(d，3H，J＝7.0Hz，CH3)，0.90(s，18H，(CH3)3CSi)，0.08(s，12H，(CH3)2Si)； 非對(duì)映體的13C NMR(100MHz，MeOH-d4)δ153.78(C)，151.94(CH)，143.78/143.71(C)，138.36(CH)，137.57(CH)，128.17/128.16(CH)，119.99(C)，92.41(C)，87.81/87.79(CH)，84.28(CH)，71.78/71.74(CH)，62.72/62.68(CH2)，49.40(br，CH)，41.31(CH2)，25.96(CH3)，25.75(CH3)，22.64(CH3)，18.41(C)，17.99(C)，-4.66(CH3)，-4.82(CH3)，-5.39(CH3)，-5.48(CH3). N6-[1-(4-碘苯基)乙基]-2’-脫氧腺苷(dA.n12) 在0℃下將n-Bu4NF(409mg，1.30mmol)在THF(3mL)中的溶液加入到化合物dA.n11(263mg，0.37mmol)在THF(5mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物逐漸溫?zé)嶂潦覝?，攪?0分鐘，然后在真空下濃縮至干。通過(guò)硅膠柱色譜純化殘留物，得到N6-[1-(4-碘苯基)乙基]-2’-脫氧腺苷dA.n12(164mg，93％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.35(s，1H，H-8)，8.32(br s，1H，與D2O可交換，NH)，8.13(s，1H，H-2)，7.62(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.22(d，2H，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.32(m，1H，H-1’)，5.41(br，1H，Ph-CH)，5.31(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.19(m，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.35(m，1H，H-4’)，3.85(m，1H，H-4’)，3.58(m，1H，H-5’a)，3.48(m，1H，H-5’b)，2.68(m，1H，H-2’a)，2.22(m，1H，H-2’b)，1.49(d，3H，J＝7.0Hz，CH3). N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷(dA.n13) 在室溫下將化合物dA.n12(70mg，0.145mmol)、N-炔丙基三氟乙酰胺(66mg，0.44mmol)、CuI(5.5mg，0.03mmol)、四(三苯基膦)鈀(0)17mg，0.015mmol)和Et3N(41μL，0.29mmol)在無(wú)水DMF(2.2mL)中的溶液攪拌5.5小時(shí)。在真空下濃縮混合物，通過(guò)硅膠柱色譜純化，得到臘狀固體的N6-{1-[4-(3-三氟乙酰胺基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷dA.n13(63mg，86％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(t，1H，J＝5.4Hz，與D2O可交換，NH)，8.36(s，1H，H-8)，8.34(br s，1H，與D2O可交換，NH)，8.15(s，1H，H-2)，7.43(d，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，7.36(d，2H，2H，J＝8.2Hz，Ph-H)，6.33(dd，1H，J＝6.4和7.5，Hz，H-1’)，5.49(br，1H，Ph-CH)，5.30(d，1H，與D2O可交換，3’-OH)，5.10(m，1H，與D2O可交換，5’-OH)，4.39(m，1H，H-3’)，4.25(d，2H，J＝5.4Hz，CH2)，3.87(m，1H，H-3’)，3.59(m，1H，H-5’a)，3.51(m，1H，H-5’b)，2.72(m，1H，H-2’a)，2.24(m，1H，H-2’b)，1.52(d，3H，J＝7.0Hz，CH3)； N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(dA.n14) 將POCl3(14μL，0.15mmol)加入到化合物dA.n14(51mg，0.1mmol)和質(zhì)子海綿體(32mg，0.15mmol)在磷酸三甲酯(0.5mL)中的溶液中，并保持在零下20-30℃2小時(shí)。加入雙-三正丁胺焦磷酸鹽(237mg，0.5mmol)和三正丁胺(100μL)在無(wú)水DMF(1.0mL)中的溶液。攪拌5分鐘后，加入三乙胺碳酸氫鹽緩沖液(1M，pH 7.5；10mL)。室溫下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在0℃下逐滴加入濃氫氧化銨(10mL，27％)。室溫下再攪拌混合物1小時(shí)，然后凍干。將所得殘留物溶解在水(10mL)中，過(guò)濾，通過(guò)陰離子交換色譜利用Q Sepharose FF柱(2.5×20cm)以NH4HCO3線(xiàn)性梯度(在300分鐘內(nèi)從50mM至500mM)和4.5mL/分鐘的流速進(jìn)行純化。合并含有三磷酸酯的級(jí)分并冷凍干燥，得到白色蓬松固體的三磷酸酯dA.n14(60mg，86％，非對(duì)映體的1∶1混合物)。
非對(duì)映體的1H NMR(400MHz，D2O)δ8.41(s，1H，H-8)，8.14(2s，1H，H-2)，7.38(m，4H，Ph-H)，6.46(m，1H，H-1’)，5.32(br，1H，Ph-CH)，4.30(s，1H，H-3’)，4.20(m，2H，H-5’a和H-5’b)，3.61(s，2H，CH2)，2.78(m，1H，H-2’a)，2.59(m，1H，H-2’b)，1.60(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)； 31P NMR(162MHz，D2O)δ-6.02(d，J＝19.4Hz)，-11.19(d，J＝19.4Hz)，-21.77(t，J＝19.4Hz)； ToF-MS(ESI)對(duì)于分子離子C21H25N6O12P3Na[M-2H+Na]-而言，計(jì)算質(zhì)量為669.0641，實(shí)測(cè)質(zhì)量為669.0960。
6-FAM標(biāo)記的N6-{1-[4-(3-氨基-1-丙炔基)苯基]乙基}-2’-脫氧腺苷-5’-三磷酸(WW2p093) 將6-FAM-SE(3.5mg，7.4μmol)在無(wú)水DMSO(70μL)中的溶液加入到三磷酸酯dA.n14(4.1μmol)在Na2CO3/NaHCO3緩沖液(0.1M，pH9.2；600μL)中的溶液中，并在室溫下孵育1小時(shí)。利用Perkin ElmerOD-300C18柱(4.6×250mm)通過(guò)反相HPLC將反應(yīng)純化，得到6-FAM標(biāo)記的三磷酸酯WW2p093。流動(dòng)相A，在水中的100mM乙酸三乙銨(TEAA)(pH 7.0)；B，在水/CH3CN(30∶70)中的100mM TEAA。利用5-20％B 20分鐘，然后20-90％B 20分鐘的線(xiàn)性梯度進(jìn)行洗脫。利用6-FAM染料的消光系數(shù)(即在494nm下的68,000)通過(guò)吸收光譜估計(jì)WW2p093的濃度。
本文所參考的所有專(zhuān)利和專(zhuān)利出版物在此通過(guò)引用并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在理解前述說(shuō)明書(shū)的基礎(chǔ)上作出某些改動(dòng)和改進(jìn)。應(yīng)當(dāng)理解，為了簡(jiǎn)明和可讀性的目的已刪除了所有這些改動(dòng)和改進(jìn)，但是所有這些改動(dòng)和改進(jìn)仍完全落在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.下式的化合物
其中R1是H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，
R2是H或OH，
所述堿基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤或其天然衍生物，
所述可斷裂的終止部分是賦予所述化合物以聚合酶終止性能的基團(tuán)，
所述連接物是雙官能團(tuán)，以及
所述染料是熒光團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所述可斷裂的終止部分通過(guò)選自以下的鍵與所述堿基相連接芐胺、芐醚、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基甲酸2-(鄰硝基苯基)乙酯以及碳酸2-(鄰硝基苯基)乙酯。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中所述化合物選自式I-VII所代表的化合物、式I-VII所代表化合物的可藥用鹽或酯，以及式I-VII所代表化合物和其可藥用鹽或酯的對(duì)映體、外消旋混合物或立體異構(gòu)體
或
其中R1＝H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，
R2＝H或OH，
R3和R4各自獨(dú)立地選自H、C1-C12直鏈或支鏈烷基、C2-C12直鏈或支鏈烯基或多烯基、C2-C12直鏈或支鏈炔基或多炔基、以及芳香性基團(tuán)例如苯基、萘基或吡啶環(huán)，
前提是R3和R4中至少一個(gè)是H，
R5、R6、R7和R8各自獨(dú)立地選自H、OCH3、NO2、CN、鹵化物、C1-C12直鏈或支鏈烷基、C2-C12直鏈或支鏈烯基或多烯基、C2-C12直鏈或支鏈炔基或多炔基、以及芳香性基團(tuán)例如苯基、萘基或吡啶環(huán)，和/或下述一般結(jié)構(gòu)的連接基團(tuán)
其中X＝CH2、CH＝CH、C≡C、O、S或NH，
Y＝CH2、O或NH，
n＝0-12的整數(shù)，
m＝0-12的整數(shù)，以及
染料＝熒光團(tuán)。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中R3和R4獨(dú)立地選自-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、異丙基、叔丁基、苯基、2-硝基苯基和2，6-二硝基苯基。
5.權(quán)利要求3的化合物，其中R3和R4中至少一個(gè)選自烷基和芳香基，所述烷基或芳香性基團(tuán)中任選地含有至少一個(gè)雜原子，并且其中所述芳香性基團(tuán)可任選地是芳基或者是多環(huán)基團(tuán)。
6.權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)的化合物，其中R5、R6、R7和R8中至少一個(gè)選自芳基和多環(huán)基團(tuán)的芳香基。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的化合物，其中所述熒光團(tuán)選自BODIPY、熒光素、羅丹明、香豆素、呫噸、花青、芘、酞菁、藻膽蛋白、alexa、squarene染料、產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移染料的組合以及其衍生物。
8.權(quán)利要求3的化合物，其中所述化合物選自
9.一種靶核酸的測(cè)序方法，所述方法包括下述步驟
(i)將引物連接到固體表面上；
(ii)將靶核酸與所述連接到固體表面上的引物進(jìn)行雜交；
(iii)加入權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的一種或多種化合物，其中如果存在一種以上類(lèi)型的堿基，則每種堿基任選地與不同熒光團(tuán)相連接；
(iv)將聚合酶添加入到所述雜交的引物/靶核酸復(fù)合物中以通過(guò)聚合酶催化反應(yīng)將步驟(iii)的化合物引入到生長(zhǎng)中的引物核酸鏈中，其中所引入的步驟(iii)的化合物以約70％至約100％的效率終止所述聚合酶反應(yīng)；
(v)任選地清洗所述固體表面以除去未引入的成分；
(vi)檢測(cè)所引入的熒光團(tuán)以鑒定所引入的步驟(iii)的化合物，其中所述檢測(cè)任選地利用用于熒光染料成像的脈沖多線(xiàn)激發(fā)檢測(cè)器進(jìn)行；
(vii)任選地加入一種或多種化合物以給未延伸引物永久性加帽；
(viii)將所述固體表面暴露于光源以除去光可斷裂的終止部分，得到含有天然成分的延伸的引物核酸；
(ix)任選地清洗所述固體表面以除去所述斷裂的光可斷裂終止部分；
(x)重復(fù)步驟(iii)至(ix)1次或多次以鑒定所述靶核酸中的多個(gè)堿基。
10.權(quán)利要求9的方法，其中步驟(iv)的至少一種化合物的引入效率為所述聚合酶反應(yīng)中含相同堿基的天然底物的引入效率的約70％至約100％。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述引入效率為約85％至約100％。
12.權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合酶選自逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶和DNA聚合酶。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述聚合酶選自Taq DNA聚合酶、Klenow(-exo-)DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent(-exo-)DNA聚合酶、Pfu(-exo-)DNA聚合酶以及DeepVent(exo-)DNA聚合酶。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述聚合酶是選自以下的修飾的聚合酶Taq FS DNA聚合酶、ThermoSequenase DNA聚合酶、ThermoSequenase II DNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶、Therminator II DNA聚合酶以及Vent(-exo-)A488L DNA聚合酶。
15.權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(viii)中通過(guò)暴露于光源除去約85％至約100％的光可斷裂的終止部分。
16.權(quán)利要求9至15中任一項(xiàng)的方法，其中在根據(jù)步驟(iv)引入至少一種化合物之后以約90％至約100％的效率終止所述引物核酸鏈的生長(zhǎng)。
17.一種將核酸分子中的非天然成分轉(zhuǎn)化成天然成分的方法，所述方法包括以下步驟
(i)將權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的化合物引入核酸中；以及
(ii)將所得核酸暴露于光源以除去所述核酸中光可斷裂的終止部分。
18.一種終止核酸合成的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷置于聚合酶的環(huán)境中以及將所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷引入到核酸分子中的步驟。
19.權(quán)利要求18的方法，其中引入所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷時(shí)DNA合成的終止效率為約90％至約100％。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷的引入效率為含有與所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷相同的堿基的天然核苷酸或核苷的引入效率的約70％至約100％。
21.一種進(jìn)行Sanger或Sanger型測(cè)序的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的化合物加入到Sanger或Sanger型測(cè)序反應(yīng)中。
22.一種進(jìn)行焦磷酸測(cè)序或焦磷酸測(cè)序型測(cè)序的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的化合物加入到焦磷酸測(cè)序或焦磷酸測(cè)序型測(cè)序反應(yīng)中。
23.下式的化合物
其中R1是H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，
R2是H或OH，
所述堿基是胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤或其天然衍生物，
所述不可斷裂的終止部分是賦予所述化合物以聚合酶終止性能的基團(tuán)，
所述連接物是雙官能團(tuán)，以及
所述染料是熒光團(tuán)。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中所述不可斷裂的終止部分通過(guò)選自以下的鍵與所述堿基相連接芐胺、芐醚、氨基甲酸酯、碳酸酯、氨基甲酸2-(鄰硝基苯基)乙酯以及碳酸2-(鄰硝基苯基)乙酯。
25.權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物選自式I-VII所代表的化合物、式I-VII所代表化合物的可藥用鹽或酯，以及式I-VII所代表化合物和其可藥用鹽或酯的對(duì)映體、外消旋混合物或立體異構(gòu)體
其中R1＝H、單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，
R2是H或OH，
R3和R4各自獨(dú)立地選自H、C1-C12直鏈或支鏈烷基、C2-C12直鏈或支鏈烯基或多烯基、C2-C12直鏈或支鏈炔基或多炔基、以及芳香性基團(tuán)例如苯基、萘基或吡啶環(huán)，
R5、R6和R7各自獨(dú)立地選自H、OCH3、NO2、CN、鹵化物、C1-C12直鏈或支鏈烷基、C2-C12直鏈或支鏈烯基或多烯基、C2-C12直鏈或支鏈炔基或多炔基、以及芳香性基團(tuán)例如苯基、萘基或吡啶環(huán)，和/或下述一般結(jié)構(gòu)的連接基團(tuán)
其中X＝CH2、CH＝CH、C≡C、O、S或NH，
Y＝CH2、O或NH，
n＝0-12的整數(shù)，
m＝0-12的整數(shù)，并且染料＝熒光團(tuán)，以及
R8和R9如上述針對(duì)R5、R6和R7的定義，前提是R8和R9不是NO2。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中R3和R4中的至少一個(gè)選自-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、異丙基、叔丁基和苯基。
27.權(quán)利要求25的化合物，其中R3和R4中的至少一個(gè)選自烷基和芳香性基團(tuán)，所述烷基或芳香性基團(tuán)中任選地含有至少一個(gè)雜原子，并且其中所述芳香性基團(tuán)可任選地是芳基或者是多環(huán)基團(tuán)。
28.權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)的化合物，其中R5、R6、R7和R8中至少一個(gè)選自芳基和多環(huán)基團(tuán)的芳香性基團(tuán)。
29.權(quán)利要求23至28中任一項(xiàng)的化合物，其中所述熒光團(tuán)選自BODIPY、熒光素、羅丹明、香豆素、呫噸、花青、芘、酞菁、藻膽蛋白、alexa、squarene染料、產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移染料的組合以及其衍生物。
30.權(quán)利要求25的化合物，其中所述化合物選自
31.一種測(cè)定靶核酸序列的方法，所述方法包括下述步驟
(i)將靶核酸加入到Sanger或Sanger型測(cè)序反應(yīng)中；
(ii)向所述測(cè)序反應(yīng)中加入權(quán)利要求23至30中任一項(xiàng)的一種或多種化合物，其中如果存在一種以上類(lèi)型的堿基，則每種堿基任選地與不同熒光團(tuán)相連接；
(iii)加入互補(bǔ)引物和聚合酶；
(iv)進(jìn)行聚合酶催化反應(yīng)以將步驟(ii)的至少一種化合物引入到生長(zhǎng)中的核酸鏈中，以及
(v)分析測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果，其中步驟(i)-(iii)可以任意順序進(jìn)行。
32.權(quán)利要求31的方法，其中在根據(jù)步驟(iv)引入至少一種化合物后以約90％至約100％的效率終止核酸鏈的生長(zhǎng)。
33.權(quán)利要求31的方法，其中步驟(iv)的至少一種化合物的引入效率為聚合酶反應(yīng)中含相同堿基的天然底物的引入效率的約70％至約100％。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述引入效率為約85％至約100％。
35.權(quán)利要求31至34中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合酶選自逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶和DNA聚合酶。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述聚合酶選自Taq DNA聚合酶、Klenow(exo-)DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent(-exo-)DNA聚合酶、Pfu(exo-)DNA聚合酶以及DeepVent(exo-)DNA聚合酶。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述聚合酶是選自以下的修飾的聚合酶TaqFS DNA聚合酶、ThermoSequenase DNA聚合酶、ThermoSequenase II DNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶、Therminator II DNA聚合酶以及Vent(exo-)A488L DNA聚合酶。
38.一種將非天然成分引入到核酸中的方法，所述方法包括以下步驟
(i)將靶核酸加入到反應(yīng)中；
(ii)將權(quán)利要求23至30中任一項(xiàng)的一種或多種化合物加入到所述反應(yīng)中，其中如果存在一種以上類(lèi)型的堿基，則每種堿基任選地與不同熒光團(tuán)相連接；
(iii)將聚合酶加入到所述反應(yīng)中；以及
(iv)進(jìn)行聚合酶催化反應(yīng)以將步驟(ii)的至少一種化合物引入到生長(zhǎng)中的核酸鏈中，其中步驟(i)-(iii)可以任意順序進(jìn)行。
39.權(quán)利要求38的方法，其還包括分析用于引入步驟(ii)的至少一種化合物的聚合酶反應(yīng)的結(jié)果的步驟。
40.權(quán)利要求38至39中任一項(xiàng)的方法，其中在根據(jù)步驟(iv)引入至少一種化合物后以約90％至約100％的效率終止鏈的生長(zhǎng)。
41.權(quán)利要求38至40中任一項(xiàng)的方法，其中根據(jù)步驟(iv)引入至少一種化合物的效率為聚合酶反應(yīng)中含相同堿基的天然底物的引入效率的約70％至約100％。
42.一種終止核酸合成的方法，所述方法包括將權(quán)利要求23至30中任一項(xiàng)的3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷置于聚合酶環(huán)境中并將所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷引入到核酸中的步驟。
43.權(quán)利要求42的方法，其中引入所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷時(shí)的終止效率為約90％至約100％。
44.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述3’-OH未保護(hù)的核苷酸或核苷的引入效率為含相同堿基的天然核苷酸或核苷的引入效率的約70％至約100％。
45.一種進(jìn)行Sanger或Sanger型測(cè)序的方法，所述方法包括將權(quán)利要求23至30中任一項(xiàng)的化合物加入到Sanger或Sanger型測(cè)序反應(yīng)中。
46.一種進(jìn)行微測(cè)序或微測(cè)序型測(cè)序的方法，所述方法包括將權(quán)利要求23至30中任一項(xiàng)的化合物加入到微測(cè)序或微測(cè)序型測(cè)序反應(yīng)中。
全文摘要
本發(fā)明提供了可用在DNA測(cè)序技術(shù)和其它類(lèi)型的DNA分析中的本文所述的新的核苷酸、核苷及其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有未保護(hù)的3’-OH的核苷酸或核苷在核堿基上被衍生成包括通過(guò)連接物與不可斷裂的終止基團(tuán)連接的熒光染料。所述不可斷裂的熒光基團(tuán)被設(shè)計(jì)成終止DNA合成，使得可以平行模式對(duì)DNA寡聚體進(jìn)行有效測(cè)序。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有未保護(hù)的3’-OH的核苷酸或核苷在核堿基上被衍生成包括通過(guò)連接物與光可斷裂的終止基團(tuán)連接的熒光染料。所述光可斷裂的熒光基團(tuán)被設(shè)計(jì)成終止DNA合成以及被斷裂，使得可以平行模式對(duì)DNA寡聚體進(jìn)行有效測(cè)序。
文檔編號(hào)C07H21/04GK101636406SQ200780049437
公開(kāi)日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月5日
發(fā)明者弗拉迪斯拉夫·A·利托什, 布賴(lài)恩·P·斯圖皮, 邁克爾·L·梅茨克, 吳衛(wèi)東 申請(qǐng)人:激光基因公司