專利名稱：：作為褪黑素受體MT₁和MT₂的亞型選擇性激動劑的異喹諾酮化合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及異喹諾酮衍生物和它們作為治療試劑的用途。特別地，本發(fā)明涉及能夠調節(jié)褪黑素受體的異喹諾酮化合物，以及涉及含有這些化合物的藥物組合物，用于在哺乳動物受試者中治療與褪黑素受體相關的失調或病理學狀況。
背景技術：
：褪黑素(N-乙酰-5-曱氧基色胺)是主要由松果腺合成和分泌的激素，已經(jīng)顯示了調節(jié)哺乳動物晝夜節(jié)律和生殖功能(KennawayandWright,2002;GuerreroandReiter,2002)。^逸黑素是在哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)、血液和周圍組織中廣泛分布的親脂性激素(Vaughanetal.,1978;Rogawskietal.，1979)。它通過與特定的褪黑素受體相互作用來發(fā)揮它的生物學效應。兩種人類褪黑素受體MT,和MT2已經(jīng)被鑒定和克隆，都具有對褪黑素的相似的結合親合力(Reppertetal.,1994，1995)。這些受體是G蛋白偶聯(lián)受體，表明了經(jīng)由G蛋白介導的信號轉導途徑的觸發(fā)機制。G蛋白隨后直接或間接地(經(jīng)由第二信使)調節(jié)各種效應物系統(tǒng)。由于能夠介導褪黑素受體的下游信號轉導途徑的G蛋白的不同類別(Newetal,2003),MT!和MT2可以觸發(fā)許多不同的信號轉導級聯(lián)，引起各種獨特的細胞反應的活化(Witt-Enderbyetal.，2003)。褪黑素受體MT,和MT2在身體內(nèi)的各種各樣的組織中表達。MTt受體在腦內(nèi)下丘腦的視交叉上核(SCN)中、心臟血管以及腦與周圍組織的各種區(qū)域中表達。MT!受體也在正常的和惡性的乳房組織中存在(Dillonetal,2002)。MT2受體更多地定位于和存在于腦內(nèi)的小腦和SCN、視網(wǎng)膜、卵巢、腎和心臟血管中。兩種受體都被認為通過調節(jié)身體的晝夜節(jié)律在介導睡眠/醒來周期方面起作用(Dubocovichetal.，1998)，但是MT!受體被認為調節(jié)睡意，M丁2受體被認為幫助調節(jié)睡眠-醒來周期，MTi受體收縮心臟血管，MT2受體擴張它們(Doolenetal,1998)。此外，MT2受體涉及炎癥性反應。因此，隨著兩種受體在身體內(nèi)許多不同組織中的廣泛分布，褪黑素涉及身體的許多生理過程并不令人驚訝。褪黑素已經(jīng)與許多生理過程的調節(jié)相關聯(lián)(Pandi-Perumaletal,2006)，因而，已經(jīng)用于許多生物學失調的治療。它廣泛地用于時間生物學失調例如季節(jié)性情感障礙(SAD)(Rosenthaletal.,1986)、原發(fā)和繼發(fā)性失眠、以及由失明(Nakagawaetal,,1992)、倒班(Sacketal.,1992)和時差反應(Arendtetal.,1991)引起的睡眠失調。褪黑素還與視網(wǎng)膜醛生理^L能(Dubocovichetal.,1997)、血壓調節(jié)(Doolenetal.,1998)以及免疫系統(tǒng)的調節(jié)(GuerreroandReiter,2002)和炎癥(CuzzocreaandReiter,2002)相關聯(lián)。此外，褪黑素已經(jīng)顯示了具有對抗癌癥和腫瘤生長的強的效果(Reiter，2003;Blasketal,2002)。而且，在許多新近的研究中，已經(jīng)報道了褪黑素抑制多種肺瘤細胞，包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、黑素瘤、前列腺肺瘤和腸胂瘤細月包的生長和增殖(Pandi-Perumaletal.2006)。新近的證據(jù)也表明，褪黑素在精神失調(雙極的、抑郁和憂慮失調、精神分裂癥、癲癇和癲癇發(fā)作)、神經(jīng)變性疾病(Parkinson's病(PD)、阿爾茨海默氏病(AD)、Huntington，s病、肌萎縮性側索硬化、肌肉硬化)中風和神經(jīng)內(nèi)分泌失調(消化性潰瘍、銀屑病)的治療方面可能是有益的。新近的研究提供了實驗證據(jù)，支持了褪黑素作為PD的治療中有希望的治療試劑(Khaldyetal.,2003)。褪黑素還顯示了在人類(Molina-Carballoetal.，1997)和大鼠(Bikjdaoueneetal.,2003)中賦予對抗癲癇的保護效果，這種效果被認為通過提高GABA能神經(jīng)傳遞來發(fā)生(Acuna-Castroviejoetal.，1995)褪黑素還顯示了在Alzheimer，s病人中賦予了有益的效果。新近的報告指出，患有AD的患者展現(xiàn)了降低的褪黑素受體亞型MT2的表達(Savaskanetal.，2005)。向AD患者施用褪黑素已經(jīng)獲得了滿意的結果，包括改善的認知功能、改善的睡眠和疾病發(fā)展速度的顯著降低(Maurizi,2001;Cardinali,2003)。褪黑素也在神經(jīng)保護中起到作用。新近的報告顯示了褪黑素在急性腦缺血性中風后的神經(jīng)保護中的牽涉。對病灶腦缺血的動物模型的研究指出，褪黑素賦予了顯著的神經(jīng)保護效果(Kilicetal.，2005;Leeetal.,2005;Macleodetal.,2005)并發(fā)揮了抗炎癥效果(PeiandCheung,2004),結果表明，褪黑素可能是人中風后神經(jīng)保護藥物的良好候選物(Macleodetal.,2005)。褪黑素的神經(jīng)保護作用被認為通過它的抗氧化和自由基清除活性來發(fā)生(Leeetal.,2005)。盡管褪黑素對多種效應物系統(tǒng)具有調節(jié)效果，但是它在臨床應用中的使用受到它的短的生物學半衰期、不良的口服生物利用率和遍在性作用的限制(Uchikawaetal.,2002)。因此，最近幾年中，已經(jīng)進行了許多工作來鑒定或開發(fā)褪黑素激動劑，其比褪黑素是更加代謝穩(wěn)定的、展現(xiàn)更高的對MTt和MT2受體的親合力，最主要的，顯示了相對一種亞型的對另一種受體亞型的選擇性。合成來源的褪黑素激動劑模擬了褪黑素通過與褪黑素受體MT^和MT2的結合所產(chǎn)生的信號級聯(lián)。它們對于不同褪黑素受體亞型的生理學研究是有無限價值的，幫助描繪褪黑素調節(jié)和觸發(fā)其他效應物系統(tǒng)的方式。由于褪黑素已經(jīng)顯示了通過廣泛地靶向受體來調節(jié)睡眠-醒來周期，展現(xiàn)了褪黑素性質以及對褪黑素受體亞型之一或兩者的高親合力和選擇性的褪黑素激動劑作為治療試劑和研究工具都是有價值的。對于失眠和晝夜節(jié)律相關的失調、以及在如上所述與褪黑素相關的其他失調的治療中，它們是有希望的治療試劑。除了褪黑激素之外，還存在著與褪黑素受體相互作用的幾種其他的已知的褪黑素配體。這些包括2-碘褪黑素和N-乙酰血清素，其與褪黑素一樣，以不同的親合力結合MT,和MT2受體。這些激動劑已經(jīng)用于受體亞型的藥理學評估，但是它們的使用受到了它們?nèi)狈煞N受體亞型之間的選擇性的限制。此外，它們不是有希望的藥物候選物。表現(xiàn)對受體之一的選擇性的褪黑素受體的配體具有更大的藥理學和治療學的價值。因此，最近幾年中，許多不同的科研小組使用了藥物化學來合成展現(xiàn)更大選擇性和更高結合親合力的激動劑。大多數(shù)已知的褪黑素受體配體是基于褪黑素的。引哚結構開發(fā)的。關鍵特征包括5-曱氧基基團(Chongetal.,1993;Moretal.，1998;Sicsicetal.,1997;Sugdenetal.,1995)和3-乙基酰胺鏈(GrolandJansen,1996)。褪黑素上的曱氧基和酰胺基的相對距離和構象是決定配體的效力和功效的一些關鍵因素。附著到酰胺羰基基團上的烷基鏈有長度<3個碳的限制以保持高親合力(Sugdenetal.,1995)。已經(jīng)深入地研究了C2和C6取代的耐受性和特異性(Spadonietal.，1993;Sugdenetal.,1995)。其他褪黑素配體結構采用了各種雜環(huán)的支架，例如基于吲哚的三環(huán)和四環(huán)、1，2-二氬化茚、萘、1,2，3，4-四氫化萘、喹啉、苯并嚼唑、苯并呋喃等等(Zlotos,2005)。在植物中，對抗草食動物和病原體的防御機制涉及生物堿。公開的報導指出了植物中的生物堿賦予神經(jīng)保護活性。它們也被報道具有抗病毒、抗微生物、和免疫調節(jié)活性(Hudson,1990;Huang，1999),以及作為強力的抗肺瘤試劑(Craggetal.,1997;CraggandPhil,1999)。雖然，在本發(fā)明之前，美國申請N0.10/135，247和10/738,964以及PCT申請7>開WO/2005/075431A1和WO/2005/075432Al/^開了一些異唾諾酮書亍生物，但是這些申請人不知道具有褪黑素受體激動劑活性的任何異喹諾酮衍生物。參考文獻Acuna-Castroviejoetal.(1995)Cellprotectiveroleofmelatonininthebrain.Jow""/o/尸/wea//^earc/z16:100-112.Arendt,J.(1991)Melatonininhumans:jetlagandafter.」<iv尸/wea/5:299-302.Bikjdaoueneetal.(2003)Changesinbrainaminoacidsandnitricoxideaftermelatoninadministrationinratswithpentylenetetrazole-inducedseizures.JoMrwa/q/"Pi'Mea/iesearc/z25:54-60.Blask,D.E.，Sauer,L,A.，andDau勿，R.T.(2002)Melatoninasachronobiotic/anticanceragent:cellular,biochemicalandmolecularactionandtherapeuticimplicationsforcircadian-basedcancertherapy.CWrewf7b//cs她血/"a/C7ew/s吵2:113-132.Cardinali,D.P.(2003)ClinicalperspectivesfortheuseofmelatoninasaneuroprotectivechronobioticinAlzheimer'sdisease,iwa/"osc/iVewra/og/czwe2:188-204.Cragg，G,M.,Newman,D丄，Weiss，R.B.(1997)CoralReefs，forests,andthermalvents:theworldwideexplorationofnaturefornovelanticanceragents.iSe/w力a^y0"co/ogy24:156-163.Cragg，G.M.andPhil,D丄(1999)Discoveryanddevelopmentofantineoplasticagentsfromnaturalsources.C朋cer/"vesf17:153-163.Cuzzocrea,S.andReiter，R丄(2002)Pharmacologicalactionsofmelatonininacuteandchronicinflammation.Cwr7b/A/e<iCTzem2:153-165.Dillon,D.C.，Easley，S.E.,Asch,B.B.，Cheney,R.T.，Brydon,L.,Jockers，R.,Winston,J.S.，Hurd，T.，andAsch,H丄.(2002)Differentialexpressionofhigh-affinitymelatoninreceptor(MTl)innormalandmali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發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明的一個方面中，提供了治療、預防或改善哺乳動物中的病理狀況的方法，其中所述病理狀況與褪黑素受體相關，所述方法包括向所述哺乳動物施用治療有效量的式(I)的異喹諾酮衍生物的步驟R4O其中RrR7各自獨立地是氫或取代基。取代基是取代氫原子的原子或原子基團。取代可以通過化學合成領域已知的方法來實現(xiàn)。例如，通過合適的設計，高產(chǎn)量的組合合成能夠產(chǎn)生大的衍生物庫，所述衍生物具有附著到親本化合物的主干的各個位置的各種取代基。然后可以通過希望的褪黑素性質選擇本發(fā)明的異喹諾酮衍生物。對于大的衍生物庫，選擇可以通過高產(chǎn)量的篩選方法來實現(xiàn)。作為治療試劑，式(I)的化合物可以具有下文定義的功能衍生物形式。作為本發(fā)明的另一個方面，提供了一系列異喹諾酮衍生物，其具有褪黑素性質，對褪黑素受體具有高親和力，有或者沒有相對于受體的一種亞型針對另一種亞型的高選擇性。這些異喹諾酮衍生物具有以下的式(II)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(II)其中Rj、R2、R3、Rt和R7獨立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羥基，條件是R!、R2、R3和R之一是X-(CH2)n-R8;Rs是烷基或芳烷基；Re是H或烷基；X是鍵、O、S、SO、S02、CO或NH;n=0-10;Rs是鏈烯基、取代或未取代的芳基、NR9Rk)或OR9;R9是H、取代的或未取代的芳基曱基、或鏈烯基；和R,o是H或烷基。期待的是，普通技術人員將理解的，上述化合物可以以各種可能的外消旋的、對映異構或非立體異構的同分異構體形式制備，可以與礦物質和有機酸形成鹽，也可以形成衍生物例如N-氧化物、前體藥物、生物電子等排體。"前體藥物"是指化合物的無活性形式，由于以短暫的方式使用來改變或消除親本分子中不希望的性質的一種或多種專門化的保護基團的附著而導致無活性，其一旦被施用便在身體內(nèi)部(體內(nèi))被代謝成或轉變成活性化合物。"生物電子等排體"是指由原子或原子的基團與其他的、廣義上類似的原子或原子的基團的交換而產(chǎn)生的化合物。生物電子等排替換的目的是產(chǎn)生具有與親本化合物類似生物學性質的新化合物。生物電子等排替換可以是基于物理化學的或基于拓樸的。從已知化合物(例如在本說明書中公開的那些)制備適合的前體藥物、生物電子等排體、N-氧化物、藥學上可接受的鹽或各種異構體是本領域普通技術人員能力之內(nèi)的。因而，本發(fā)明期待上文公開的化合物的所有適合的異構體形式、鹽和衍生物。在本發(fā)明的上下文中，術語"功能衍生物，，是指來自上文公開的特定化合物的前體藥物、生物電子等排體、N-氧化物、藥學上可接受的鹽或各種異構體，其在一個或多個方面與親本化合物相比是有益的。制備功能衍生物可能是費力的，但是所涉及的技術是本領域公知的。各種高產(chǎn)量化學合成方法是可用的。例如，組合化學已經(jīng)使得化合物庫的快速擴展與各種高效率的生物篩選技術結合。本發(fā)明的另一個方面，提供了合成和鑒定褪黑素受體激動劑的方法，所述褪黑素受體激動劑用作治療試劑用于治療與褪黑素受體相關的多種疾病。所述方法包括步驟(a)設計和合成在不同位置具有各種取代基的式(I)的異會諾酮衍生物，和(b)對異喹諾酮衍生物進行分析來測定與褪黑素受體相關的任何效果或任何褪黑素激動劑活性。在步驟(a)中，異喹諾酮衍生物可以通過常規(guī)的有機合成逐個地獲得，其中設想了在式(I)的一個或多個給定位置處具有取代基的特定衍生物。異喹諾酮衍生物還可以通過利用異喹諾酮結構單元的固相組合合成來獲得。異喹諾酮衍生物的庫可以通過利用IRORI技術的組合合成即時獲得，IRORI技術涉及microkan反應器和無線復頻標簽。在步驟(b)中，如果觀察到褪黑素受體相關的效果，還可以進一步測定針對特定褪黑素受體亞型的效果的特異性。對于理解說明書和解釋權利要求的范圍來說，在整個說明書和權利要求書中，詞語"一"是指"一個(一種)或多個(多種)"。例如，"對一異喹諾酮衍生物進行一分析"與"對一種或多種異喹諾酮衍生物進行一種或多種分析"是相同的。本發(fā)明的另一個方面，還期待的是，式(II)的組合物進一步摻入到藥物組合物中，用于治療或預防哺乳動物中的病理狀況或癥狀，其中可以通過調節(jié)褪黑素受體的活性減輕和預防所述病理狀況或癥狀。本發(fā)明的另一個方面，提供了治療、預防或改善哺乳動物中的病理狀況的方法，其中通過調節(jié)褪黑素受體的活性減輕或預防所述病理狀況，其中所述方法包括向患有病理狀況的所述哺乳動物施用治療有效量的式(I)的化合物。褪黑素受體是MTVMT2、或兩者。另一個方面，提供了為治療或科學研究目的調節(jié)MTi或MT2受體活性的方法，通過體外或體內(nèi)地用式(I)的化合物接觸所述受體。在附屬于并構成本公開內(nèi)容的一部分的權利要求書中，詳細地指出了表征本發(fā)明的各種特征和新穎點。為了更好地理解本發(fā)明、它的操作優(yōu)點、以及通過它的使用獲得的特定目標，應當參考附圖和隨后的說明，其中說明和描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式。附圖1顯示了異會諾酮化合物IS005的劑量反應曲線。附圖2顯示了異會諾酮化合物IS030的劑量反應曲線。附圖3顯示了異會諾酮化合物IS007的劑量反應曲線。附圖4顯示了異查諾酮化合物IS017的劑量反應曲線。附圖5顯示了異會諾酮化合物IS044的劑量反應曲線。附圖6顯示了異喹諾酮化合物IS521的劑量反應曲線。附圖7顯示了異唾諾酮化合物IS528的劑量反應曲線。附圖8呈現(xiàn)了開發(fā)本發(fā)明的新型褪黑素化合物中涉及的步驟。具體實施例方式I.獲得具有褪黑素激動劑活性的異喹諾酮衍生物異會諾酮衍生物可以通過從天然來源例如植物提取它們或通過化學合成來獲得。實際上，在本發(fā)明中利用了天然來源和化學合成兩者。參考附圖8，來自天然產(chǎn)物的生物堿首先在熒光成像平板讀取器(FLIPR)上通過高產(chǎn)量篩選(Ca"動員分析)來篩選針對G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的比活性。使用了與關鍵信號轉導途徑相關的一系列GPCR。異喹諾酮生物堿，一種最常見的生物堿種類，展現(xiàn)了針對褪黑素受體ML和MT2的活性。然后合成基于異會諾酮生物堿的小的化合物庫，針對MT,/MT2受體來篩選。由于這些是初步的篩選，進行單劑量分析(10pM)。對成功地活化MT!/MT2受體的化合物在此進行Ca"動員分析，這次通過使用親本細胞系。在這種情況下，多劑量的新化合物被用于產(chǎn)生完整的劑量反應曲線和測定它們相應的ECso。還對展現(xiàn)了陽性結果(positivehit)的化合物進行一系列其他功能分析來獲得進一步的活性證明。這些包括cAMP和熒光素酶分析。然后對被成功地證實為褪黑素激動劑的所有新的化合物進行第二級的分析來確認作用的機制。這些分析包括(i)放射性配體結合分析來檢查化合物取代褪黑素的能力，褪黑素是V/MT2受體的天然配體；和(ii)ERK分析來測量下游信號轉導途徑的活化。此外，還通過MTT分析來篩選新的化合物的細胞毒性，其測量在暴露于新的異喹諾酮化合物之后的細胞生存力。在下文中進一步提供了制備本發(fā)明的化合物的合成方案和特定實例。<image>imageseeoriginaldocumentpage20</image>在下文的實施例1中舉例說明了方案1。方案2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>在下文的實施例2中舉例說明了方案2:方案3OH〇tR3XHOBBr3OntR2RX0RON-R2N-R2X:Br或IR。R2和R3是本領域普通技術人員認為適合于所述方案的取代基團。優(yōu)選的，RpR2是烷基或取代的烷基基團，R3、R是烷基、取代的烷基、酰基、磺?；鶊F。在下文的實施例3和4中進一步舉例說明了方案3。方案4卜(CH2)n-CI'"CI—(CH2)n-ONalRtOi—(CH2)n—OfON-R221R,和R2是本領域普通技術人員認為適合于所述方案的取代基團。n是2-12。在下文的實施例5中舉例說明了方案4。方案5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>所需產(chǎn)物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>r3y:石典代曱烷，烯丙基溴，芐基溴，4-溴芐基溴，3-曱氧基芐基溴，4-叔丁基在下文的實施例6中舉例說明了方案:步驟l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>向曱胺在THF中的溶液(2.0M,16.8mL，33.7mmol)添加苯基乙烯基亞砜(3mL，22.4mmol)。反應混合物在室溫下攪動18小時。在真空下除去溶劑。產(chǎn)生的殘余物通過柱層析純化來提供產(chǎn)物(2.9g,17.1mmol，76%)。步驟2o在氮氣下，向步驟l的產(chǎn)物(2.9g)、4-羥基-3-曱氧基苯曱酸(3.5g,20.6mmol)和HOBt(2.8g，20.6mmol)在80mL二氯曱烷的溶液中滴加二異丙基碳二亞胺(2.6mL,20.6mmol)。反應混合物在室溫下攪動12小時。在真空下除去溶劑。產(chǎn)生的殘余物通過柱層析純化來提供產(chǎn)物(4.8g，14.4mmol，84%)。iHNMR(400MHz,CDC13)57.64(1H,dd,J=8.4，1.2Hz)，7.56(1H，d，J=1.2Hz)，7.30(5H，m)，6.93(1H，d,J=8.4Hz),4.49(2H，t,J=5.6Hz)，3.92(3H，s)，3.31(2H，t，J=5.6Hz)，2.94(3H，s)。步驟3o步驟2的產(chǎn)物(4.8g,14.4mmol)溶于40mL乙酸酐中。產(chǎn)生的混合物回流下加熱6小時。減壓下除去過量的乙酸酐。產(chǎn)生的殘余物用飽和的碳酸氫鈉處理，用二氯曱烷提取，干燥并濃縮，得到產(chǎn)物(6.1g，100%)，其不進一步純化就用于下一個步驟。iHNMR(400MHz,CDC13)S7.53(1H,m)，7.32(4H，m)，7.01(2H，m)，6.90(1H,m)，6.50(1H，s),3.88(2H，m)，3.81(3H,s)，3.03(3H,s),2.32(3H，s)，2.09(3H，s)。步驟4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>向步驟3的產(chǎn)物(粗產(chǎn)物，6.1g)在70mL曱苯中的溶液中，添加p-曱苯磺酸一水合物(12.2g,64.1mmol)?；旌衔镌诘獨庵屑訜嶂粱亓?。40分鐘之后，減壓下除去溶劑。產(chǎn)生的殘余物用飽和的碳酸氫鈉中和。用二氯曱烷提取混合物幾次，直到水相的TLC不顯示期望的產(chǎn)物。干燥合并的二氯甲烷，然后濃縮和通過柱層析純化，提供呈白色固體的兩種產(chǎn)物。產(chǎn)物l:6-羥基-7-甲氧基-2-曱基-l(2H)-異喹諾酮(2.1g，10.2mmol，71%)toMR(糊MHz，CDC13)57.82(1H，s)，6.99(1H,s)，6.98(1H，d，J=7.2Hz)，6.38(1H,d，J=7.2Hz),3.99(3H,s),3.60(3H,s)。產(chǎn)物2:6-羥基-5-曱氧基-2-曱基-l(2H)-異喹諾酮(80mg,0.39mmol，3%)'HNMR(400MHz,CDC13)S8.15(1H,d，J=8.8Hz),7.15(1H，d，J=8.8Hz),7.08(1H，d，J=7.4Hz),6.66(1H，d,J=7.4Hz),3.91(3H,s)，3.59(3H,s)。從不同地取代的苯曱酸和伯胺開始，根據(jù)實施例l中列出的操作制備具有不同取代型式的以下異喹諾酮化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>買施例2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>向甲胺在THF中的溶液(2.0M，49.3mL,98.5mmol)添加苯基乙烯基亞石風(10mL，65.7mmo1)。反應混合物在室溫下攪動48小時。減壓下濃縮混合物來得到粗產(chǎn)物，其通過柱層析純化來提供產(chǎn)物(8.38g，49.5mmol，75%)。步驟2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>在氮氣下，向步驟l的產(chǎn)物(8.38g，45.7mmo1)、3-羥基-4-曱氧基-苯曱酸(8.46g，50.3腿ol)和HOBt(6.84g，50.3mmol)在150ml二氯曱烷和40mLDMF的混合物中的溶液中滴加二異丙基碳二亞胺(7.9mL,50.3mmol)。在室溫下攪動2天之后，停止反應，減壓下濃縮。殘余物用二氯曱烷處理。濾出白色的脲鹽。濾液用飽和的氯化銨處理，用二氯曱烷萃取，干燥并濃縮，以提供18.83g的粗產(chǎn)物，其不進一步純化就用于下一個步驟。步驟3向在IOOmLDMF中的步驟2的產(chǎn)物(粗產(chǎn)物，18.83g)添加千基溴(8.1mL,68.6mmol)和碳酸鉀(9.5g，68.6mmol)。反應混合物在室溫下攪動17小時。減壓下除去溶劑，產(chǎn)生的殘余物用水處理，用乙酸乙酯萃取(x3)。干燥、過濾和濃縮合并的乙酸乙酯提取物。柱層析純化提供了產(chǎn)物(17.7g，41.8mmo1,兩個步驟91%)。在氮氣中，在0攝氏度下，向步驟3的產(chǎn)物(17.7g)在210mL二氯曱烷的溶液中滴加2，4,6-三曱吡啶(16.6mL,125.4mmol)，隨后滴加TFAA(29.5mL，208.95mmol)。在攪動30分鐘之后，通過緩慢添加180mL10%碳酸鉀來淬滅反應?；旌衔锶缓蠹訙氐绞覝?。分離各層。用二氯曱烷萃取水層(x2)。用10%鹽酸鹽洗滌(x2)合并的二氯曱烷，干燥、過濾并濃縮。產(chǎn)生的殘余物溶于210mL曱苯中。添加p-甲苯磺酸一水合物(39.75g，209.0mmol)。產(chǎn)生的混合物回流下加熱40分鐘。反應冷卻到室溫。添加飽和的碳酸氫鈉直到pH二8。分離各層。用二氯曱烷萃取水層幾次，直到水層的TLC不顯示期望的產(chǎn)物。干燥、過濾和濃縮合并的有機層。通過在硅膠上的柱層析純化提供了兩種主要產(chǎn)物。產(chǎn)物4:5-羥基-6-曱氧基-2-曱基-l(2H)-異喹諾酮(2.5g，10匪ol，24%)'HNMR(400MHz,CDC13)S7.96(1H，d,J=8.8Hz),7.03(1H，d,J=8.8Hz)，6.97(1H,d，J=7.6Hz),6.83(1H，d，J=7.6Hz),3.86步驟4(3H,s)，3.55(3H，s)。產(chǎn)物3:7-羥基-6-曱氧基-2-甲基-l(2H)-異喹諾酮(3.2g,15.6mmol，37%)iHNMR(400MHz，CDC13)S7.78(1H,s)，6.98(1H,d，J=7.4Hz)，6.87(1H,s),6.46(1H，d，J=7.4Hz)，3.98(3H，s),3.60(3H，s)。向5-羥基-6-曱氧基-2-曱基-l(2H)-異會諾酮(實施例2，步驟4的產(chǎn)物4)(40mg，0.20mmol)在3mLDMF種的溶液中，添加千基溴(0.035mL，0.30mmol)和碳酸鉀(55mg，0.40mmol)。反應在室溫下攪動24小時，通過添加水來淬滅。用乙酸乙酯萃取混合物(x3),干燥、過濾并濃縮。通過柱層析純化產(chǎn)生的殘余物，提供了產(chǎn)物(45mg，76%)。iHNMR(400MHz，CDC13)S8.20(1H，d,J=8.8Hz)，7.35-7.47(5H，m)7.14(1H，d,J=8.8Hz)，6.94(1H，d，J=7.0Hz)，6.67(1H，d，J=7.0Hz)，5.07(2H,s)，3.97(3H,s)，3.53(3H，s)。利用合適的中間物(產(chǎn)物l、2、3、4、5、6、7或8)和不同的溴化物(或碘化物)，根據(jù)實施例3中列出的操作制備以下化合物IS007、IS008、IS009、ISOIO、IS013、IS017、IS042、IS044、IS047、IS521、IS523、IS526、IS528、IS527、IS529、IS532和IS098。實施例4OHO在氮氣下，向8-羥基-7-曱氧基-2-曱基-l(2H)-異喹諾酮(產(chǎn)物6，63mg，0.31mmol)在5mL二氯曱烷種的溶液中添加三溴化硼(在二氯甲烷中，實施例3IS005l.OM，3.1mL)。反應在室溫下攪動4小時，然后用曱醇淬滅。減壓下除去溶劑，添加曱醇。添加曱醇隨后除去曱醇的這個操作重復三次，以除去硼殘余物。通過在硅膠上的柱層析純化提供了產(chǎn)物(48.7mg,83%)。'HNMR(400MHz，CD3OD)57.17(1H,d，J=8.2Hz)，7.01(1H，d，J=7.4Hz)，6.89(1H,d，J=8.2Hz),6.51(1H，d，J=7.4Hz)，3.51(3H,s)。實施例5o步驟l使用產(chǎn)物3(實施例2，步驟4，600mg,2.92mmol)和l-氯-2-碘丙烷(0.63mL，5.84mmol)根據(jù)實施例3中列出的操作，制備7-(3-碘代丙氧基)-6-曱氧基-2-曱基-l(2H)-異喹諾酮(830mg，2.95mmol,100%)。ESI-MS282.18(M+1)步驟2向步驟l的產(chǎn)物(830mg,2.95mmol)在29mL曱基乙基酮種的溶液中添加石典化鈉(4.41g,29.5mmo1)。反應在回流下加熱30小時。減壓下除去溶劑，添加水。產(chǎn)生的混合物用二氯曱烷(x3)萃取，干燥、過濾并濃縮。通過在硅膠上的柱層析純化提供了產(chǎn)物(1.01g，92%)。ESI-MS374.09(M+1)。實施例6步驟l將StratospherePL-REM樹脂(50-100目)均勻分布到96IRORImicrokan反應器中。每個microkan反應器含有無線復頻標簽和28-35mg樹脂。將96個microkan反應器分到四個燒瓶中。向每個燒瓶添加40mL干燥的DMF和一種不同的胺(12.7mmoL)。密封燒瓶，microkan反應器在室溫下攪動48h。在除去DMF之后，microkan反應器用DMF(x3)、二氯曱烷(x3)和甲醇(x3)洗滌并在真空下干燥過夜。步驟2將96個microkan反應器分到四個不同的燒瓶中。向每個燒瓶中添加40mLDMF、lmL二異丙基乙胺和一個異喹諾酮結構單元(如方案4中所示制備的)。密封燒瓶，在55。C下攪動48h。停止反應之后，microkan反應器用DMF(x3)、二氯曱烷(x3)和曱醇(x3)洗滌并在真空下干燥過夜。步驟3將96個microkan反應器分到6個不同的燒瓶中。向每個燒瓶中添加20mLDMF。將六種不同的活性囟化物分別添加到六個不同的燒瓶中。燒瓶在室溫下?lián)u動24h之后，停止反應。然后，microkan反應器用DMF(x3)、二氯曱烷(x3)和曱醇(x3),二氯曱烷(x3)洗滌并在真空下干燥過夜。步驟4將得到的96個microkan反應器放入96試管陣列中。向每個試管中添加2.1mL的混合物，所述混合物是IOmL二異丙基乙胺在200mL二氯曱烷中形成的。在室溫下?lián)u動96試管陣列48h，過濾到另一個96試管陣列中。在蒸發(fā)溶劑之后，剩余的殘余物一個接一個地通過短的硅膠柱純化，以獲得最終產(chǎn)物。通過這種4步反應從4種胺、4種異喹諾酮結構單元和6種囟化物可以獲得96種異唾諾酮衍生物的庫。根據(jù)上文公開的方案和實施例，可以獲得具有附著于異喹諾酮主干上的一個或多個位置的各種取代基的異會諾酮衍生物。通過改變起始苯曱酸的取代，可以制備具有不同取代型式的異喹諾酮主干。還可以從異喹諾酮結構單元、不同的胺和卣化物通過利用IRORI技術的固相組合化學作用構建適合的庫。然后篩選這些異喹諾酮衍生物，鑒定具有比專利化合物更大特異性和效力的化合物。以下公開了某些篩選分析方法。II.測定褪黑素激動劑活性的方法一般地，在評估本發(fā)明的化合物的褪黑素活性時進行兩種分析功能分析1.FLIPRCa2+動員分析這項分析通過測量活化的受體的下游事件(在這種情況下為細胞內(nèi)鉤動員)，表明了新的化合物活化MTi和MT2受體的能力。如在表l中指出的，EC50是在nM-nM范圍內(nèi)。作為2-IMT反應(已知的褪黑素激動劑)的百分比的反應也被包括用于比較。2.cAMP分析cAMP分析表明新的化合物活化褪黑素受體的能力。當被活性的激動劑結合時，褪黑素受體啟動事件的級聯(lián)，其引起對細胞中cAMP生成的抑制。表達MTl或MT2受體的細胞用單獨的forskolin(—種刺激cAMP產(chǎn)生的物質)處理或用具有新的異喹諾酮化合物的forskolin處理。表1中顯示的產(chǎn)生的抑制作用百分比是褪黑素受體活化作用的量度。3.CRE-Luc分析熒光素酶報告基因分析提供了測量褪黑素受體活化作用的另一種途徑。表達cAMP應答元件驅動的熒光素酶報告基因(293-pCREluc)以及MT1或MT2受體之一的細胞用單獨的forskolin(刺激cAMP產(chǎn)生以及隨后的熒光素酶基因表達的一種物質)或用具有新的異會諾酮化合物的forskolin處理。由于褪黑素受體活化作用抑制了cAMP產(chǎn)生，熒光素酶表達方面的任何抑制導致酶活性的降低和產(chǎn)生的螢光信號數(shù)量的降低。表l中的數(shù)據(jù)表明，對于大多數(shù)新的異會諾酮化合物，抑制作用是約60-80%。二級分析1.結合分析進行竟爭性配體結合分析來檢查新的異喹諾酮化合物的受體結合特性。該分析測量了新的異喹諾酮化合物結合并替換放射標記的內(nèi)源配體[3司褪黑素的能力。添加提高濃度的新化合物來替換與MT1或MT2受體表達細胞結合的卩H]褪黑素。只要新的化合物結合受體的相同區(qū)域，觀察到的結合放射活性將隨著新化合物濃度提高而降低。如表2中表明的，2-IMT(具有對兩種亞型的相似效價的已知激動劑)替換了結合的卩H]褪黑素的85-95。/。，IC5o<lnM。然而，異喹諾酮化合物都沒有替換結合的褪黑素，表明受體結合處在另一個位點結合分析結果表明，新的化合物不能或僅最低限度地能夠替換結合的卩H]褪黑素，盡管它們對MT,或M丁2受體有高活性。由于異喹諾酮非常不同于主要基于吲哚的已知的褪黑素配體結構，竟爭性結合分析結果表明，異全諾酮的結合特性不同于。引咮。因此，不同于在受體上與內(nèi)源配體褪黑素相同的結合口袋處與MT!或MT2受體的相互作用(正位位點)，它們可能在受體內(nèi)不與褪黑素結合位點重疊的第二變構位點處結合，引起對卩H]褪黑素的不完全替換。變構位點在GPCR中不是罕見的(例如，它們在某些毒蕈堿亞型中存在)，但是早先的報道沒有表明褪黑素受體中存在這樣的位點。2.MTT分析這項分析根據(jù)長期處理下的細胞生存力評估了新的異喹諾酮化合物的細胞毒性效應。存活細胞而不是死細胞能夠將底物轉變?yōu)橛猩a(chǎn)物，其產(chǎn)生更高的光吸收。表2中的數(shù)據(jù)表示為對照細胞(沒有用本發(fā)明處理的細胞)的百分比。低的百分比表明低的細胞生存力(或高的細胞毒性)。3.ERK磷酸化分析這項分析通過測量活化的受體的下游事件(在這種情況下為ERK磷酸化)，表明了新的化合物活化MTt或MT2受體的能力。在蛋白質印跡(westernblot)中檢測和定量磷酸化的ERKl/2的數(shù)量。表2中的數(shù)據(jù)表示為相對于未刺激的對照細胞的刺激倍數(shù)。在下文中更詳細地描述了一些方法1.利用熒光成像平板讀取器(FLIPR)的細胞內(nèi)Ca"動員分析在熒光成像平板讀取器(FLIPR)上進行細胞內(nèi)鈣動員分析來篩選針對兩種褪黑素受體亞型MT!和MT2的異喹諾酮化合物。為了以高產(chǎn)量方式促進篩選過程，采用了具有結合一系列GPCR并活化細胞內(nèi)Ca"的能力的嵌合G蛋白。褪黑素受體亞型(MT,或MT2)在COS-7(猴腎臟成纖維細胞)細胞中與G蛋白嵌合體共同表達。在分析期間，細胞暴露于新的異喹諾酮化合物，測量焚光方面的相應改變。對每種異喹諾酮化合物進行單點和劑量依賴性分析，根據(jù)后者繪制劑量反應曲線，為每種受體亞型確定相應的ECso。特別地，COS-7細胞以20，000個細胞/反應孔的密度播種到設計用于FLIPR分析的96孔平板中，利用具有10%FCS的Opti-MEM,FCS用量為100ja1/反應孔。使用Lipofectamine⑧試劑進行轉染。在每個反應孔中，0.2ng的GPCR和G蛋白cDNA用25jal的Opti-MEM稀釋，0.2|il的Lipofectamine200(f用另外的25HlOpti-MEM稀釋。在混合兩種成分20分鐘之后，將它們添加到合適的反應孔中。在轉染后溫育48小時之后，從每個反應孔中除去50pl的轉染培養(yǎng)基，隨后用100nl的2uMFluo-4、在具有20mMHEPES(N-[2-羥乙基]旅嗓N，-[2-乙烷磺酸];pH7.5)和2.5mM4-(二丙基氨磺酰基)苯曱酸(陰離子交換劑抑制物，新制備的)的含鈣HBSS(Hank，s平衡鹽溶液)中在37。C標記轉染的細胞1小時。制備70jul的3x藥物(本發(fā)明涵蓋的異喹諾酮化合物)并等分到V-孔藥物平板的相應反應孔中。熒光的改變用488nm的激發(fā)波長在FLIPR96中檢測。通過改變FLIPR設備的激光功率和曝光時間(一般分別為0.4W和0.4秒)，將背景熒光調節(jié)到8，000到12，OOO單位的范圍。將50nl的每種激動劑溶液添加到相應的反應孔中，監(jiān)視熒光發(fā)射(510和560nm之間)3分鐘。結果表示為熒光強度單位(FIU)的變化。通過測定每個數(shù)據(jù)集的FIU的最大變化來確定濃度-反應曲線。在GraphPadPrism版本3.03上進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)和EC5G(半有效濃度)值的數(shù)值分析。2.CRE-熒光素酶分析進行熒光素酶分析(一種報告基因分析)，來確定本發(fā)明活化褪黑素受體的能力。在分析之前，HEK(人類胚腎)293細胞用cAMP應答性元件驅動的熒光素酶報告基因(293-pCREluc)和編碼MT!或MT2受體的cDNA穩(wěn)定地轉染。細胞然后暴露于新的異喹諾酮化合物中，之后，添加底物螢光素，測量產(chǎn)生的螢光。在分析之前，于37。C下，在含有5%C02的濕潤大氣中，將人類胚腎(HEK)293細胞(CRL-1573，ATCC)保持在補充有10%胎兒牛血清(FBS)、100單位/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素的最小必需培養(yǎng)基(MEM)中。建立用cAMP應答性元件驅動的熒光素酶報告基因(293-pCREluc)穩(wěn)定轉染的人類胚腎293細胞，并保持在補充有300ug/mlG418硫酸鹽的生長培養(yǎng)基中。對于熒光素酶分析，穩(wěn)定地表達pCRE-熒光素酶的HEK-293細胞以15,000個細胞/反應孔的密度播種到96孔平板中。用均為0.2iul的Plus和lipofectamine試劑，利用Lipofectamine卩11^@試劑進行轉染，每個反應孔有50ng的編碼MTt或MT2受體的cDNA。在37。C下3小時的轉染期之后，將具有20%胎牛血清(FCS)的50julDMEM添加到反應孔中，在24小時的血清饑餓之前將平板在37。C溫育48h。將不同的新型異會諾酮化合物和IOiuMforskolin添加到合適的反應孔中30分鐘，隨后加入普通培養(yǎng)基保持另外6小時。通過用50)il熒光素酶裂解緩沖液替換反應孔中的培養(yǎng)基來收獲細胞。在整個分析中Berthold微量培養(yǎng)板光度計維持在25。C。連接到空的試管的注射器M和連接到藥物試管的注射器P被設置成將25yl的螢光素注射到合適的反應孔中。L6秒延遲時間、之后是1秒測量時間周期被分配給注射器M,而注射器P在熒光素酶底物導入反應孔中之后被測量10秒。結果表示為相對發(fā)光單位(RLU)。在指明時，激動劑誘導的活性被表示為用forskolin獲得的RLU的百分比。3.卩H]環(huán)化AMP分析進行cAMP分析來測量在本發(fā)明存在的情況下在表達褪黑素受體(MT,或MT2)的細胞中第二信使cAMP的水平。當被活性的激動劑結合時，褪黑素受體啟動事件的級聯(lián)，其引起細胞中對cAMP的抑制作用。因而，與對照相比，暴露于本發(fā)明的化合物的細胞中cAMP水平的降低將表明褪黑素受體活化?？梢允褂梅€(wěn)定的CHO(中國倉鼠卵巢)細胞系。表達褪黑素MT2受體和G蛋白嵌合體16z25的穩(wěn)定的轉染子CH0-MTV16z25維持在補充有300lag/mlG418硫酸鹽和200ng/mlZeocin⑧的生長培養(yǎng)基中。對于所述分析，將CHO-MT2/16z25細胞以2x105個/孔的細胞密度播種到12孔細胞培養(yǎng)平板中，并溫育過夜。細胞在具有1%FBS的F12培養(yǎng)基中用卩H]腺噤呤(1juCi/ml)標記額外一天。標記的細胞用具有20mMHEPES、pH7.5的lmlF12培養(yǎng)基洗滌，用單獨的10uMforskolin、或用在具有l(wèi)mM3-異丁基-l-曱基黃嘌呤(磷酸二酯酶抑制物，新制備的)的相同培養(yǎng)基中合適濃度的測試化合物或IOjaM2-IMT處理30分鐘。通過抽吸和向每個反應孔添加具有l(wèi)mMATP的1ml冷卻的5。/。三氯乙酸來停止反應。細胞在4。C裂解至少30分鐘，通過連續(xù)的離子交換層析從其他的標記的腺苷酸核苷酸中分離卩H]cAMP級分。cAMP水平被解釋為卩H]cAMP級分的每分鐘計數(shù)(cpm)與總共標記的核苦酸級分的每分鐘計數(shù)的比率。4.竟爭性結合分析利用放射性配體結合分析測定化合物結合]VT^和/或MT2受體的能力。HEK-293細胞用編碼G16z25以及MT,或MT2之一的cDNA轉染。轉染后48小時，在結合緩沖液(50mMTris-HCl、2mMMgCl2、1mMEDTA、pH7.4)中收獲細胞。100,000個細胞在室溫下與96孔平板(PerkinElmerLifeAndAnalyticalSciences,Inc.,Boston,MA)中總體積IOO|ul中的1nM[3H]褪黑素(比活性83Ci/mmol;GEHealthcare)和合適濃度(0.1nM到ljuM)的未標記的配體儀器溫育2小時。通過在96孔GF/C過濾片上快速過濾通過96孔細胞收集器來終止反應。過濾片用500)LU冰冷的結合緩沖液洗滌，干燥，并密封在具有3.5ml的閃爍液體的聚乙烯袋中，在MicrobetaJet閃爍計數(shù)器中對氚計數(shù)。每個96孔平板包括一系列濃度的已知褪黑素受體激動劑2-碘褪黑素作為標準物。數(shù)據(jù)利用GraphPadPrism3.02通過非線性最小二乘回歸法來分析。5.利用MTT分析的細胞毒性測試細胞以合適的密度播種到100ial生長培養(yǎng)基中的透明的96孔平板中，容許生長過夜。新的異喹諾酮化合物利用新鮮的生長培養(yǎng)基稀釋到希望的濃度，這些稀釋物用于替換每個反應孔中的生長培養(yǎng)基。在溫育24-96h之后，將10jul的MTT標記試劑(Roche)添加到每個反應孔中，細胞在032孵化器中溫育4h。然后將IOOial溶解緩沖液添加到每個反應孔中并溫育過夜，以完全溶解紫色曱潛(formazan)晶體。最后，利用ELISA讀取器測量570nm處樣品的分光光度的吸光度。在每個實驗中每種條件進行三次，結果表示為空白對照土標準差的％。6.ERK磷酸化的4企測一天前在12孔平板中播種至匯合的、表達任一褪黑素受體亞型的HEK29334細胞，用2-碘褪黑素(100nM)或選定的新的異喹諾酮衍生物(1uM)處理5分鐘。通過在冰上抽吸來終止刺激，并通過200jul的lx蛋白凝膠加載緩沖液立即裂解。溶胞產(chǎn)物通過煮沸5分鐘來變性，在室溫下冷卻直到加載。30in1的每種溶胞產(chǎn)物在12%SDS-PAGE上分離并通過電印跡轉移到硝化纖維膜上。轉移的成功通過麗春紅S染色來顯現(xiàn)。所有隨后的溫育在輕柔的攪動下進行(~100行程/分鐘)。膜的不用的區(qū)域通過"Blotto"—一lxTris緩沖鹽水(TBS)中的5%脫脂奶來封閉。針對磷酸化的或總的ERKl/2的初級抗血清在合適的稀釋度(1:4000-1:2000)下在Blotto中與封閉的膜在4。C溫育過夜。膜用新鮮的Blotto洗滌3次各15分鐘，然后與lxTBS中l(wèi):1000稀釋度的二級抗血清(辣根過氧化酶結合的抗兔IgG)在室溫下溫育lh。用過量的lxTBS快速地清洗膜3次，隨后用lxTBS進行歷時10分鐘的4次洗滌。最后，制備基于魯米諾(luminol)的化學發(fā)光底物溶液的預混合物(每8cm^莫，lmL),并覆蓋在經(jīng)洗滌的膜上溫育l分鐘。在移除過量的溶液之后，膜用賽綸外罩覆蓋，在暗室中在X射線底片上產(chǎn)生具有合適曝光量的自動生成的照片。掃描圖像，利用ImageJ1.34來定量條帶強度。數(shù)據(jù)表示為載體處理的或未處理的樣品的反應百分比。實驗進行至少3次，給出平均反應土SEM。III本發(fā)明的異喹諾酮衍生物的褪黑素激動劑活性為了顯示庫中的異壹諾酮化合物的功能活性，將MT!和MT2受體的cDNA轉染到各種細胞系中。然后如上所述利用熒光成像平板讀取器(FLIPR)進行細胞內(nèi)Ca"動員分析。參考式(III)，環(huán)的碳原子位置順時針方向地計數(shù)，羰基的碳原子為Cl,因而R1、R2、R3和R4分別連接到C5、C6、C7和C8。兩個主要的取代的異會諾酮系列，2，5,6-和2，6,7-取代的異喹諾酮主要顯示顯著的受體活化活性，而大多數(shù)的衍生物看起來是MT2特異性的。在位置5、6或7上取代的變化決定了受體亞型選擇性和受體活化效力。2,5，6-和2,6,7-取代的異喹諾酮分別是指在位置C2、C5和C6處具有取代基的異喹諾酮，和在位置C2、C6和C7處具有取代基的異喹諾酮。參看表l，第一系列的化合物在C6位置處含有曱氧基，在C5位置上具有變化的取代基。5-千氧基基團取代產(chǎn)生了化合物IS005,其以nM級親和力結合兩種褪黑素受體(EC5():MT尸5.81nM;MT2=48.5nM)，但對MT,具有稍凝:更高的親和力。然而，IS005看來是部分激動劑，因為與已知的褪黑素激動劑2-碘褪黑素(2-IMT)引發(fā)的反應相比，IS005對于MT,和MT2的活性分別是31%和63%。許多其他的取代基，例如苯基丙基氧基(IS008)、p-溴節(jié)氧基(IS009)和p-曱基千氧基(IS529),與5-節(jié)氧基取代相比，降低了親和力和/或受體活化的效力，這表明烷基鏈的延長在褪黑素受體的配體結合口袋中不是良好耐受的。重要地，這些化合物僅活化MT2，表明5-取代的基團的適應性在兩種受體亞型中是十分不同的。在C5位置，曱氧基對5-節(jié)氧基基團的苯環(huán)的單-或二-間位取代顯著地提高了對MTz的親和力(IS527:單-間，EC50=5.78nM;IS528:二-間，EC50=0.37nM)而不損害它們專有的受體亞型選擇性。IS528和IS527都部分地活化MT2，與2-IMT相比具有~65%的效力。含有5-烯丙氧基取代的另一個高度MT2選擇性的化合物IS007展現(xiàn)了對MT2的3.51nM的ECso。與對于IS528和IS527的發(fā)現(xiàn)結合起來，這表明了在5-取代基的末端的分散的7T電子結構促進了異喹諾酮化合物的MT2選擇性。然后在C6和C7上進行類似的取代，用曱氧基取代任一個。與化合物ISOOl和IS002(分別在C6和C7處具有羥基)相比，在任一位置上的千氧基(C6:IS016和C7:IS003)或苯基丙氧基(C6:IS017和C7:IS013)取代沒有顯著地提高親和力，ECso為lOOnM-lmM。盡管這些取代產(chǎn)生了完全MT2激動劑，具有與2-IMT類似的最大反應，然而它們顯示了對ML的弱的或邊緣的活性。在任一位置上的單-(C6:IS044和C7:IS521)和二-間-甲氧基千氧基(C6:IS042和C7:IS523)取代產(chǎn)生了具有高度MT2選擇性的非常強力的完全激動劑。在這四種衍生物中，與C7取代基相比，C6取代基顯示了對兩種受體亞型的更高的總體親和力(低l-2個數(shù)量級的ECso)。與C7取代基相比，MT!對C6取代基具有更好的耐受性，但是當C6取代基顯示50。/?；罨饔脮r，C7取代基具有非常低的效力(<30%)。在任一位置上的二-間-曱氧基芐氧基取代看起來具有對MT2的稍微更高的最大反應，其幾乎與2-IMT—樣好。反之，與二-間-曱氧基芐氧基取代基相比，在MT,中，單-間-曱氧基苯基氧基取代引發(fā)了高得多的反應。對C5、C6和C7取代基的多樣性的進一步的擴展通過組合化學技術來進行。對每個位置產(chǎn)生約96種衍生物，然后對其進行褪黑素受體活化的單劑量篩選。然而，它們中僅少數(shù)顯示了對兩種受體亞型的弱活化。根據(jù)基于上述發(fā)現(xiàn)對配體選擇性的理解，這不是令人驚訝結果，因為大多數(shù)這些化合物由于在3個關鍵位置上具有大體積的取代基因而是無活性的。在C4、C8和N2上具有取代基的衍生物主要展現(xiàn)對兩種受體亞型的低親和力和/或效力?？偟恼f來，發(fā)現(xiàn)了在異喹諾酮支架的位置C5、C6或C7處的3-曱氧基節(jié)氧基或3,5-二曱氧基千氧基基團對于異喹諾酮衍生物展現(xiàn)強力的褪黑素激動劑活性是關鍵的。具有在C5位置處附著的這種取代基的化合物(IS527,IS528)提供了高效力和高MT2選擇性。附圖1-7顯示了某些代表性的異喹諾酮化合物的劑量反應曲線和它們對于每種受體亞型的ECso:對于異喹諾酮化合物IS005，對MTi和MT2的ECso估計值分別是5.81xl(T9nM和4.85xl(T8nM;對于IS030，對MTi和MT2的EC5o估計值分別是1.04xIO-6nM和3.01xl(T6nM;對于IS007,對MT2的EC5o估計值是3.51xl(T9nM(MT!未測定);對于IS017，對MT2的EC5o估計值是1.08xio'7nM(MT,未測定)；對于IS044，對MT,和MT2的ECso估計值分別是1.20xl(T8nM和3.79xl(r1GnM;對于IS521，對MT!和MT2的EC5。估計值分別是1.86xl(y6nM和1.14xl(T8nM;對于IS528，對MT,和MT2的EC5Q估計值分別是7.14xl(V6nM和3.69xl(T1()nM。表l-3呈現(xiàn)了更多的測試數(shù)據(jù)，表現(xiàn)了本發(fā)明的示例性化合物的褪黑素活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表3:證實新的異全諾酮化合物的褪黑素活性的二級分析<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>:a;IV制造藥物組合物和它們在治療褪黑素受體相關失調方面的用途一旦鑒定了有效的化合物，通過從天然來源例如植物分離所述化合物或通過化學合成，獲得化合物的部分純的或基本上純的制品，可以利用現(xiàn)有的工藝或將來在產(chǎn)業(yè)中開發(fā)的工藝來從部分純的或基本上純的化合物制造各種藥物組合物或制劑。從化合物制造藥物制劑和劑型(包括但不限于，片劑、膠嚢、注射液、糖漿)的具體過程不是本發(fā)明的一部分，制藥工業(yè)的普通技術人員能夠將產(chǎn)業(yè)中建立的一種或多種工藝應用于本發(fā)明的實踐。做為選擇，本領域的普通技術人員可以改進現(xiàn)有的常規(guī)工藝來更好地適合本發(fā)明的化合物。例如，在美國專利局官方網(wǎng)站上提供的專利或專利申請數(shù)據(jù)庫含有涉及從有效的化合物制造藥物制劑和產(chǎn)品的豐富資源。雖然在應用于本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式時描述和指出了本發(fā)明的基礎性的新特征，要理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前提下，本領域技術人員可以對例舉的實施方式的形式和細節(jié)做出各種省略和替代和改變。本發(fā)明不受到上文描述的實施方式的限制，其僅僅作為實例，而可以以各種方式在專利權利要求所限定的保護范圍之內(nèi)變化。權利要求1.一種治療、預防或改善哺乳動物中的病理狀況的方法，其中所述病理狀況與褪黑素受體相關，所述方法包括向所述哺乳動物施用治療有效量的異喹諾酮衍生物的步驟。2.權利要求l的方法，其中所述異喹諾酮衍生物是式(I)的化合物或式(I)的化合物的功能衍生物R4OR1R7(I)其中R!-R7各自獨立地是氫或取代基。3.權利要求2的方法，其中R,、R2、R3、R4和R7獨立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羥基，條件是R,、R2、R3和R7之一是X-(CH2)n-R8;Rs是烷基或芳烷基；R^是H或烷基；X是鍵、O、S、SO、S02、CO或NH;n=0-10;Rs是鏈烯基、取代的或未取代的芳基、NR9R!o或OR9;R9是H、取代的或未取代的芳基甲基，或鏈烯基；和Rn)是H或烷基。4.一種調節(jié)褪黑素受體的活性的方法，包括用足夠數(shù)量的異喹諾酮衍生物與所述受體相互作用以調節(jié)所述受體的步驟。5.權利要求4的方法，其中所述異喹諾酮衍生物是式(I)的化合物或式(I)的化合物的功能衍生物R4OR1R7(I)其中R1-R7各自獨立地是氫或取代基。6.權利要求5的方法，其中Ri、R2、R3、R4和R7獨立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羥基，條件是R。R2、R3和R之一是X-(CH2VR8;Rs是烷基或芳烷基；Re是H或烷基；X是鍵、O、S、SO、S02、CO或NH;n=0-10;Rs是鏈烯基、取代的或未取代的芳基、NR9Rkj或OR9;R9是H、取代的或未取代的芳基曱基，或鏈烯基；和Rw是H或烷基。7.—種化合物，其是式(II)的化合物或是式(II)的化合物的功能衍生<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(II)其中RrR7各自獨立地是氫或取代基。8.權利要求7的化合物，其中R!是X-(C恥-R8;R2、R3、R4、R7獨立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羥基；Rs是烷基或芳烷基；R6是H或烷基；X是鍵、O、S、SO、S02、CO或NH;n=l-10;Rs是鏈烯基、取代的芳基、未取代的芳基、或NR9Rk)、OR9;R9是H、取代的芳基甲基、未取代的芳基甲基、鏈烯基；Rio是H或坑基。9.權利要求7的化合物，其中RAX-(CH2)n-R8;R。R3、R4、R7獨立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羥基；Rs是烷基或芳烷基；Re是H或烷基；X是鍵、O、S、SO、S02、CO或NH;n斗10;Rs是鏈烯基、取代的芳基、未取代的芳基、或NR9Rk)、OR9;R9是H、取代的芳基曱基、未取代的芳基甲基、鏈烯基；Rm是H或烷基。10.權利要求7的化合物，其中R3是X-(CH2)n-R"R,、R2、R4、R7獨立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羥基；Rs是烷基或芳烷基；Re是H或烷基；X是鍵、O、S、SO、S02、CO或NH;n=l-10;Rs是鏈烯基、取代的芳基、未取代的芳基、或NR9Rk)、OR9;R9是H、取代的芳基曱基、未取代的芳基甲基、鏈烯基；R,o是H或烷基。11.權利要求7的化合物，其中R7是X-(CH2)n隱R8;R,、R2、R3、R4獨立地是H、卣素、烷氧基、烷基或羥基；Rs是烷基或芳烷基；R6是H或烷基；X是鍵、O、S、SO、S02、CO或NH;n=l-10;Rs是鏈烯基、取代的芳基、未取代的芳基、或NR9Rw、0R9;R9是H、取代的芳基曱基、未取代的芳基曱基、鏈烯基；Rjo是H或烷基。12.權利要求7的化合物，其選自以下化合物7-曱氧基-6-(3-曱氧基-芐氧基)-2-曱基-2仏異喹啉-l-酮,<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>6-(3,5-二曱氧基-節(jié)氧基)-7-曱氧基-2-曱基-2//-異喹淋-1-酮，<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>6-曱氧基-7-(3-曱氧基-節(jié)氧基)-2-曱基-2//-異喹啉-1-酮,<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>7-(3，5-二曱氧基-芐氧基)-6-曱氧基-2-曱基-2//-異喹淋-1-酮，<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>5-烯丙氧基-6-曱氧基-2-曱基-2//-異*啉-1-酮O5_千氧基_6-曱氧基-2-曱基-27/-異喹啉-1-酮,o5陽(3.5-二曱氧基-芐氧基)-6-曱氧基-2-曱基-2//-異喹啉-1-酮,o6-曱氧基-5-(3-曱氧基-芐氧基)-2-曱基-277-異喹啉-l-酮，和6-曱氧基-5-{2-[(3-曱氧基-千基)-丙基-氨基]-乙氧基}-2-曱基-2//-異喹啉-1-酮。13.—種藥物組合物，包含藥學上可接受的載體和治療有效量的活性成物。14.權利要求13的藥物組合物，其中所述活性成分是權利要求8的化合物或權利要求8的化合物的功能衍生物。15.權利要求13的藥物組合物，其中所述活性成分是權利要求9的化合物或權利要求9的化合物的功能衍生物。16.權利要求13的藥物組合物，其中所述活性成分是權利要求10的化合物或權利要求10的化合物的功能衍生物。17.權利要求13的藥物組合物，其中所述活性成分是權利要求ll的化合物或權利要求11的化合物的功能衍生物。18.權利要求13的藥物組合物，其中所述活性成分是權利要求12的化合物或權利要求12的化合物的功能衍生物。19.權利要求4的方法，其中所述異喹諾酮衍生物通過以下方法來鑒定，所述方法包括步驟(a)在異喹諾酮主干上的位置進行取代來獲得異喹諾酮衍生物和步驟(b)對所述異全諾酮衍生物進行分析來測定與褪黑素受體相關的任何效果或任何褪黑素激動劑活性。全文摘要一種治療、預防或改善哺乳動物中與褪黑素受體相關的病理狀況的方法，通過使用含有作為配體與褪黑素受體相互作用的式(I)的化合物的藥物組合物，R₁、R₂、R₃、R₄和R₇獨立地是H、鹵素、烷氧基、烷基或羥基，條件是R₁、R₂、R₃和R₇之一是X-(CH₂)n-R₈；R₅是烷基或芳烷基；R₆是H或烷基；X是鍵、O、S、SO、SO₂、CO或NH；n＝0-10；R₈是鏈烯基、取代的或未取代的芳基、NR₉R₁₀或OR₉；R₉是H、取代的或未取代的芳基甲基，或鏈烯基；和R₁₀是H或烷基。文檔編號C07D217/24GK101583601SQ200780050054公開日2009年11月18日申請日期2007年1月17日優(yōu)先權日2007年1月17日發(fā)明者何細新,何覺中,大衛(wèi)·查爾斯·紐,龐海泓,王殷厚,胡月青申請人:香港科技大學