專利名稱：：用于富集、除去和檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的方法和手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含內(nèi)溶素(endolysin)或另一種細(xì)胞壁溶解酶(lysingenzyme)的無(wú)酶促活性細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域和依照SEQIDNO:l的序列或其衍生物的多肽，以及其制備手段，其中除所述細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，所述多肽不包含內(nèi)溶素或另一種細(xì)胞壁溶解酶的別的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還涉及用于結(jié)合、富集、從樣品中除去、捕獲和/或檢測(cè)細(xì)菌(特別是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)的方法。
背景技術(shù)：
：革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌在環(huán)境中廣泛傳播。它們不僅可在土壤、水、植物材料、糞便等樣品中找到，而且還可在人和動(dòng)物中找到。利斯特氏菌(listeria)、桿菌(bacillus)、梭菌(Clostridium)、葡萄球菌(staphylococcus)、鏈球菌(streptococcus)、腸球菌(enterococcus)、微球菌(micrococcus)或分枝軒菌(mycobacteria)等種類(lèi)的整個(gè)病原體細(xì)菌系列在食物方面以及在人和動(dòng)物的感染疾病的預(yù)防、診斷和治療中有顯著的關(guān)聯(lián)性。蠟狀芽孢桿菌CBa"7/wcew船)群的細(xì)菌代表具有重要的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)學(xué)價(jià)值以及在生物恐怖主義方面具有突出關(guān)聯(lián)性的微生物。這些細(xì)菌在群內(nèi)彼此密切相關(guān)；大量的所述細(xì)菌已經(jīng)被測(cè)序(Rasko等，F(xiàn)EMSMicrobiol.Reviews,2005,29,303-329)。它們?cè)谧匀唤缰袕V泛傳播，而且存在于不同種類(lèi)的食物(大多數(shù)為植物來(lái)源)之中。它們是需氧生存的、活動(dòng)的、桿狀革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。由于其抗逆性內(nèi)生孢子，它們能夠經(jīng)受加工處理食物所使用的不同方法，例如如干燥或加熱。通常，受污染的食物主要是含有淀粉的食物、谷類(lèi)、稻、香料、蔬菜和即食(ready-to-eat)產(chǎn)品。肉類(lèi)可通過(guò)使用受污染的香料而受污染。因?yàn)殒咦幽苄颐庥诎褪蠝缇?，隨后無(wú)限制的增殖是有可能的，所以乳制品經(jīng)常受到污染。蠟狀芽孢桿菌群由6種密切相關(guān)的種組成，除食物病菌蠟狀芽孢桿菌外，還包括極端危險(xiǎn)的人病原體細(xì)菌炭疽芽孢桿菌(S""7/m""決ra"》(其在生物恐怖主義方面具有極大的關(guān)聯(lián)性)、昆蟲(chóng)病原體蘇云金芽孢桿菌(5acz7/w/ran'wg/e"^;s)(通過(guò)基于蘇云金芽孢桿菌的微生物學(xué)殺蟲(chóng)劑而廣泛傳播)、根狀樣蕈狀芽胞桿菌(5acz7/Mmyco^e"以及假真菌樣芽孑包桿菌(6a".〃M/wewt/owjvco/^)和韋氏芽孑包桿菌(6ac贏s冊(cè)/Z^ra嘩/2""e麗》。利斯特氏菌是人和動(dòng)物病原體細(xì)菌，通常存在于食物中，特別是在魚(yú)、肉和乳制品中。利斯特氏菌屬包含6個(gè)不同種，其中有16個(gè)不同的血清型。雖然食物相關(guān)疾病的僅小部分是由利斯特氏菌引起的(在美國(guó)約1%),但是每年幾乎30%的由食物病原體引起的致命疾病是由該病菌引起的。染病者主要是免疫抑制人群，例如老年人、糖尿病患者、癌癥患者和/或AIDS患者。孕婦和尚未出生的孩子占所有的利斯特氏菌病患者病例的25%。目前，葡萄球菌和腸球菌是與感染疾病有關(guān)的最難解決的病原體，因?yàn)樗鼈內(nèi)找嫘纬啥喾N耐藥性病菌(例如MRSA——多耐藥性金黃色葡萄球菌和VRE—一萬(wàn)古霉素耐藥性腸球菌)，導(dǎo)致主要在固定健康護(hù)理方面的顯著發(fā)展，即不良的疾病預(yù)后以及費(fèi)用的激增。潛在的病原體通常以很少的細(xì)胞數(shù)目存在于感染狀態(tài)和食物區(qū)域中，另外還伴隨有干擾性背景菌群。一方面，需要用于有效除去相關(guān)革蘭氏陽(yáng)性病菌的方法，另一方面，需要用于選擇性富集這些病菌的方法，以便例如實(shí)現(xiàn)靈敏4全測(cè)。好檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)是靈敏性、快速、可靠性以及簡(jiǎn)單和劃算的應(yīng)用。開(kāi)始，基本上始終有應(yīng)當(dāng)檢測(cè)的生物體的富集。一般而言，這是以常規(guī)方法在多步過(guò)程中實(shí)現(xiàn)的。初次富集通常用非選擇性或低選擇性液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)生。隨后，發(fā)生選擇性再次富集，接著是通常在選擇性瓊脂上發(fā)生的初次分離。在傳代培養(yǎng)物中再次富集單一菌落，隨后用不同檢測(cè)方法檢測(cè)。這些常規(guī)方法在檢測(cè)出陽(yáng)性病菌之間花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間。利斯特氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)時(shí)間為依照ISO11290-1:1996/FDAM1:2004(E)的超過(guò)4-7天和依照FDA和USDA/FSIS的4-7天。蠟狀芽胞桿菌群的細(xì)菌的富集依照標(biāo)準(zhǔn)方法(USFDA方法，章14;ISO7932:2004)需花費(fèi)1.5至2.5天，隨后的檢測(cè)花費(fèi)2天，在蠟狀芽胞桿菌群內(nèi)再次進(jìn)行的更為詳細(xì)的鑒別花費(fèi)2-3天。在食品工業(yè)中，檢測(cè)時(shí)間對(duì)于一些種類(lèi)的食物的短貨架期和成本密集的(costintensive)存儲(chǔ)是重要的方面，其在已確定樣品沒(méi)有受到污染之前是必須的。此外，若在收到對(duì)照結(jié)果之前提前投遞受污染的商品，則成本密集的產(chǎn)物召回可一貫地遵守。在健康護(hù)理中，長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間也是成問(wèn)題的，因?yàn)橐园沧鳛榕c傳統(tǒng)富集和檢測(cè)方法相比更快的備選，通常使用基于抗體的方法(例如US6,699,679,US2004/0197833，UA2006/0211061，F(xiàn)luit等，1993,ApplEnvironMicrobiol"59,1289-1293,Jung等,2003,JFoodProt.，66，1283-1287，Hawkes等，2004，Biosens.Bioelectron.，19,1021-1028)。糖結(jié)合凝集素作為細(xì)菌表面碳水化合物部分的受體的應(yīng)用也有考慮。然而，這些通常過(guò)于非特異性以致于不能從混合的培養(yǎng)物中選擇某些細(xì)菌，而且往往展現(xiàn)出基于其多聚體結(jié)合性質(zhì)的凝集問(wèn)題。使用基于抗體的方法，細(xì)菌的回收率也是比較差的，比率范圍在5%至25%。除回收率差之外，免疫磁性分離方法(IMS)的別的缺點(diǎn)在于在低污染率的靈敏性不足、與其它細(xì)胞的交叉反應(yīng)和通常關(guān)于抗體包被珠的凝集問(wèn)題。另外，獲得針對(duì)完整細(xì)菌的抗體是比較難的。雖然在純培養(yǎng)物的情況中這些方法是非常有前途的，但是它們?cè)诨旌吓囵B(yǎng)物或復(fù)合基質(zhì)(諸如食物)的情況中顯現(xiàn)出重大的問(wèn)題。作為抗體的備選，來(lái)自噬菌體肽聚糖水解酶的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的應(yīng)用在本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中是已知的(Loessner等,2002，Mol.Microbiol"44，335-349)。EP1147419和WO2004/088321使用CBD以檢測(cè)細(xì)胞，其中CBD結(jié)合至固相，而且一般攜帶標(biāo)志物。EP1399551描述了一種使用噬菌體殼體蛋白質(zhì)或噬菌體尾部蛋白質(zhì)來(lái)選擇性純化革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞片段的方法。在這種情況中，以2步方法結(jié)合細(xì)菌，結(jié)合分子首先結(jié)合靶細(xì)胞，接著該復(fù)合物固定化至固體載體。借助于His標(biāo)簽、生物素或Strep標(biāo)簽來(lái)偶聯(lián)噬菌體尾部蛋白質(zhì)與固體載體的官能化表面，從而發(fā)生固定化。特別是對(duì)于所述2步方法，結(jié)合蛋白-靶細(xì)胞復(fù)合物與官能化載體的高效、快速和非共價(jià)偶聯(lián)具有至關(guān)重要的關(guān)聯(lián)性，特別是在靶細(xì)胞應(yīng)當(dāng)與樣品和固體載體分開(kāi)時(shí)。US5，252,466披露了一種制備包含供體內(nèi)生物素化用的標(biāo)簽并因此易于純化的融合蛋白的方法。在這種情況中，生物素化結(jié)構(gòu)域是例如謝氏丙酸桿菌(/Vo//ow'6ac&廠/wms/zermaw/()l爭(zhēng)歡酵0:ranscarboxylase)的1.3S亞基、番癡生物素蛋白質(zhì)、肺炎克雷伯氏菌(《/e^/e//ap"ewmom'ae)草乙酸脫羧酶(oxalacetatedecarboxylase)的a-亞基或大腸桿菌CEsc/zm'c/^co/z〕生物素歡基載體蛋白，它們與質(zhì)粒的生物素連接酶一起在相同的讀碼框中表達(dá)，因此在體內(nèi)被生物素化。借助于噬菌體展示系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了在蛋白水解方面更穩(wěn)定的最小限度型式的克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的生物素化結(jié)構(gòu)域，其適于純化和檢測(cè)相應(yīng)的融合蛋白(Stolz等，1998，F(xiàn)EBS-Lett.440，213-217)。US5,874,239也要求保護(hù)一種用于融合蛋白生物素化的方法，其提示許多所謂"Avi-標(biāo)簽"的標(biāo)簽，所述標(biāo)簽(長(zhǎng)度為13至50個(gè)氨基酸，優(yōu)選約20個(gè)氨基酸)短于克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的生物素化結(jié)構(gòu)域。如此，本發(fā)明要解決的問(wèn)題在于提供更有效和更具生產(chǎn)性的方法和實(shí)施所述方法的手段來(lái)，以便快速、筒單和高效結(jié)合、富集、除去、捕獲和檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。專利權(quán)利要求書(shū)中限定的主題解決了該問(wèn)題。附圖筒述下列附圖闡明本發(fā)明。圖l:具有JS標(biāo)簽的噬菌體尾部蛋白質(zhì)。圖1A:具有不同標(biāo)簽的P22樣噬菌體尾部蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能性裝配的比較?？寺≡贜端有Strep-標(biāo)簽、Avi-標(biāo)簽和JS-標(biāo)簽的來(lái)自沙門(mén)氏菌(Sa/mo"e〃a)的P22樣噬菌體尾部蛋白質(zhì)，并分別在大腸桿菌HMS174(DE3)和大腸桿菌JM83中表達(dá)。在12。/。SDS凝膠上加載樣品，并用考馬斯(Coomassie)染色。在實(shí)施例l中描述了該實(shí)驗(yàn)。M:標(biāo)志物，P:沉淀；S:上清液；+:經(jīng)誘導(dǎo)的；-:未誘導(dǎo)的；ng:未煮沸的。箭頭分別指示噬菌體尾部蛋白質(zhì)單體和三聚體的位置。圖1B:三種具有JS標(biāo)簽的來(lái)自沙門(mén)氏菌噬菌體的噬菌體尾部蛋白質(zhì)的克隆和表達(dá)。以具有JS標(biāo)簽的融合蛋白克隆三種不同的來(lái)自沙門(mén)氏菌噬菌體的噬菌體尾部蛋白質(zhì)(Tsp),并在大腸桿菌HMS174(DE3)中表達(dá)。在12%SDS凝膠上加載來(lái)自細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(celllysate)的樣品，并用考馬斯染色。第l道標(biāo)志物(自頂部起的分子量118kDa、85kDa、47kDa、36kDa、26kDa、20kDa);第2道沉淀物(P)，未誘導(dǎo)的；第3道上清液(S)，未誘導(dǎo)的；第4-12道(均在誘導(dǎo)后)，第4道Felix樣尾部蛋白質(zhì)(Felix-Tsp，48kDa),P;第5道Felix-Tsp，S,經(jīng)煮沸的；第6道Felix-Tsp,未煮沸的；第7道P22樣尾部蛋白質(zhì)(P22-Tsp,67kDa),P;第8道P22-Tsp,S,經(jīng)煮沸的；第9道P22-Tsp，S,未煮沸的；第10道el5樣尾部蛋白質(zhì)(sl5-Tsp，93kDa)，P;第ll道el5-Tsp,S,經(jīng)煮沸的；第12道sl5-Tsp，S，未煮沸的。箭頭指示噬菌體尾部蛋白質(zhì)單體和SDS耐受的三聚體的預(yù)期位置(在未煮沸的樣品中)。圖1C:分別具有Avi標(biāo)簽和JS標(biāo)簽的來(lái)自彎曲桿菌(campylobacter)噬菌體的尾部蛋白質(zhì)的比較克隆和表達(dá)。在質(zhì)粒pET21d中克隆分別具有N端Avi標(biāo)簽和JS標(biāo)簽(型式5b)的彎曲桿菌噬菌體尾部蛋白質(zhì)(推定為空腸彎曲桿菌(Cam/^/o&cter^w')的尾部纖維蛋白H,登錄號(hào)ZP01067412),并分別在大腸桿菌HMS174(DE3)和大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。在實(shí)施例l中描述了該實(shí)驗(yàn)。描繪了經(jīng)9%考馬斯染色的SDS凝膠，其中含有來(lái)自表達(dá)和溶解度測(cè)試的不同的樣品。P:沉淀物(Pellet);S:上清液；(i)經(jīng)誘導(dǎo)的；-:未煮沸的；M:標(biāo)志物。箭頭分別指示誘導(dǎo)后噬菌體尾部蛋白質(zhì)的單體和三聚體的位置(在未煮沸的樣品中)。圖2:利斯特氏菌CBD在化學(xué)生物素化后變得完全失活。被結(jié)合。在測(cè)試中使用0.5嗎/ml、lpg/ml、2(ig/ml和5pg/ml的蛋白質(zhì)濃度。與NHS-生物素一起溫育O分鐘、20分鐘、60分鐘和120分鐘。Avi-CBD起對(duì)照作用。圖3:l步方法和2步方法的比較圖3A描繪了依照1步方法和2步方法以及ISO方法從卡門(mén)培爾干酪(camembert)中檢測(cè)利斯特氏菌的比較。比較分析時(shí)間依賴性，依照所述時(shí)間依賴性用不同方法在卡門(mén)培爾干酪中可檢測(cè)出很低濃度的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌。用0、2、4、15和46CFU(集落形成單位)污染5份卡門(mén)培爾干酪(每份25g),并在依照l(shuí)步方法、2步方法或ISO(ISO:11290-1:1996FDAM1)方法濃縮4小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)后測(cè)試。對(duì)于1步方法和2步方法，使用Strep-標(biāo)簽-GFP-CBD511—f2作為特異性配體。各從4個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定數(shù)值(0:平板上沒(méi)有菌落，X:<10個(gè)菌落，XX:10-30個(gè)菌落，XXX:>30個(gè)菌落)。圖3B描繪了使用融合蛋白JS-GFP-CBD511_f2在莫澤雷勒干酪(mozzarella)中檢測(cè)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)(菌林EGDe，黑色柱形；和ScottA，陰影柱形)的1步方法和2步方法中的濃度依賴性。實(shí)施例3b中描述了實(shí)驗(yàn)實(shí)施。在每種情況中，描繪了從lml莫澤雷勒干酪樣品中回收多少百分比的總共應(yīng)用的利斯特氏菌相應(yīng)菌林細(xì)胞。各從2個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定數(shù)值。圖4:JS標(biāo)簽與Avi標(biāo)簽的比較圖4A:JS標(biāo)簽和Avi標(biāo)簽構(gòu)建體的細(xì)胞結(jié)合能力的比專交依照2步方法用利斯特氏菌菌抹ScottA測(cè)試不同構(gòu)建體的細(xì)胞結(jié)合能力。使用下列構(gòu)建體JS-GFP_CBD511_f3(圓圈)、JS-CBD511—f3(方框型)和Avi-GFP—CBD511—fi(三角形)。以使用細(xì)胞的百分比給出附著于磁J朱的利斯特氏菌的比例。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次，并測(cè)定平均值。圖4B:Avi-GFP-CBD511—f2和JS-CBD511—f2的比較純化左圖描繪了Avi-GFP-CBD51l一f2純化的考馬斯染色凝膠，右圖描繪了JS-CBD511—f2純化的終產(chǎn)物。在實(shí)施例4b中描述了該實(shí)驗(yàn)。M:標(biāo)志物；L:柱上加載；F:流過(guò)物；W:清洗級(jí)分；3-8:含有Avi-GFP-CBD511—f2的級(jí)分。10、1、0.1ng/ml:JS-CBD511—f2的加載蛋白質(zhì)濃度。指示Avi-GFP-CBD511—f2和JS-CBD511—f2以及BirA條帶位置。圖4C:利斯特氏菌結(jié)合的濃度依賴性分析了在哪個(gè)濃度的特異性結(jié)合蛋白開(kāi)始實(shí)現(xiàn)最大限度細(xì)胞結(jié)合。作為結(jié)合蛋白，以0嗎/ml、0.02)ag/ml、0.1jag/ml、0.5|ig/ml、l|ig/ml、2lig/ml和3iag/ml濃度？1入JS-CBD511_f3。在實(shí)施例4b中描述了該實(shí)驗(yàn)。圖5:BirA的共表達(dá)對(duì)JS-標(biāo)簽CBD結(jié)合功效的影響顯示了結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞(利斯特氏菌ScottA)的比例依賴于特異性結(jié)合蛋白JS5b-CBD511—f2的引入(introduced)量。對(duì)于一部分的蛋白質(zhì)，在別的質(zhì)粒中共表達(dá)所M(三角形)，對(duì)于另一部分，不與5/"發(fā)生共表達(dá)(菱形)。此外，在2個(gè)實(shí)驗(yàn)中額外添加生物素(實(shí)心符號(hào))，而這在2個(gè)實(shí)驗(yàn)中保持未進(jìn)行(空心符號(hào))。圖6:JS-標(biāo)簽-CBD對(duì)鏈霉抗生物素蛋白珠的特異性結(jié)合與His-標(biāo)簽-CBD對(duì)鎳-NTA珠的結(jié)合的比較使用2步方法用兩種不同的CBD(CBDBa和CBD21)將蠟狀芽胞桿菌細(xì)菌或是經(jīng)由6個(gè)His的標(biāo)簽結(jié)合至鎳-NTA磁珠或是經(jīng)由JS標(biāo)簽結(jié)合至鏈霉抗生物素蛋白磁珠。描繪了特異性結(jié)合細(xì)菌與總共的引入細(xì)菌(濃度3xl03CFU/ml)相比的比例。圖7:在不同培養(yǎng)基中細(xì)菌分別與Strep-標(biāo)簽和JS-標(biāo)簽CBD的結(jié)合通過(guò)依照本發(fā)明的方法，分別從不同培養(yǎng)基和PBST緩沖液中濃縮單核10細(xì)胞增生利斯特氏菌EGDe細(xì)胞。在實(shí)施例8中描述了該實(shí)驗(yàn)。圖7A:使用Avi-CBD511—f2(5嗎/ml)來(lái)濃縮利斯特氏菌。圖7B:使用JS-CBD511—f2(5嗎/ml)來(lái)濃縮利斯特氏菌。圖8:在含有生物素的樣品中的細(xì)菌結(jié)合用構(gòu)建體Strep-標(biāo)簽-CBDBa和JS-標(biāo)簽-CBDBa在0.01iiM、O.ljxM和liiM的生物素濃度比較分析特定濃度的蠟狀芽胞桿菌。圖9:在不同條件下的JS-標(biāo)簽CBD的長(zhǎng)期穩(wěn)定性在-20。C至37。C的溫度范圍中溫育JS-CBD511—f3以及鏈霉抗生物素蛋白磁珠，隨后引入含有單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ScottA的細(xì)胞結(jié)合測(cè)試中。圖9A:在磷酸鈉，pH7，2mMEDTA中的溫育。在l天(實(shí)心圓圈)、14天(空心三角形)、60天(實(shí)心三角形)、和126天(叉形記號(hào))后給出在給定濃度的JS-CBD511—f3的結(jié)合利斯特氏菌的比例。圖9B:在咪唑，100mMNaCl，pH7，+30%八8中的溫育。在O天(圓圈)、33天(長(zhǎng)方形)和74天(三角形)后給出在給定濃度的JS-CBD511—f3的結(jié)合利斯特氏菌的比例。圖10:從不同食物中用JS-CBD51l構(gòu)建體捕獲利斯特氏菌圖10A:單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ScottA從牛奶和奶酪中的濃度依賴性除去。使用不同濃度的JS4b-CBD511—f2來(lái)結(jié)合。給出了在相應(yīng)蛋白質(zhì)濃度有多少百分比的引入細(xì)菌被結(jié)合至》茲珠。圖1OB:無(wú)害利斯特氏菌(丄/Wen'a/""ocwa)從薩拉米香腸(Salami)和熏制鮭魚(yú)的除去。圖11:從食物中濃縮利斯特氏菌及隨后用NASBA技術(shù)進(jìn)行的檢測(cè)。通過(guò)使用JS5b-CBD511—f2從薩拉米香腸濃縮利斯特氏菌，所述薩拉米香腸用少量單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ScottA(5CFU/25g)污染，并在LEB-FDA培養(yǎng)基中分別預(yù)溫育17小時(shí)和20小時(shí)后進(jìn)行。在圖11A中，描繪了在用利斯特氏菌特異性引物進(jìn)行的酶反應(yīng)之后出現(xiàn)的熒光信號(hào)。圖11B描繪了用JS5b-CBD511—f2可從樣品中結(jié)合多少百分比的引入細(xì)菌。圖12:從細(xì)菌混合物中特異性結(jié)合蠟狀芽胞桿菌使用特異性JS-標(biāo)簽-CBDBa/人細(xì)菌混合物(蠟狀芽胞桿菌(DSMZ345)、田納西沙門(mén)氏菌(5*a/mo"e//a^朋e;wee)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(ScottA)、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌HMS174(DE3))中濃縮蠟狀芽胞桿菌。以百分比分別給出了與結(jié)合至,茲珠(黑色柱形)或在上清液和清洗級(jí)分中(陰影柱形)的總回收細(xì)胞相比的結(jié)合蠟狀芽胞桿菌細(xì)胞的數(shù)目。一方面，將細(xì)胞在完全培養(yǎng)基(CASO,Merck)上鋪板以同樣維持來(lái)自混合培養(yǎng)物的其他細(xì)月包；另一方面，將細(xì)胞在針對(duì)蠟狀芽胞桿菌的選擇性培養(yǎng)基(PEMBA)上鋪板。作為對(duì)照，進(jìn)行添加磁珠而沒(méi)有結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)。圖13:從食物中濃縮蠟狀芽胞桿菌來(lái)自蠟狀芽胞桿菌群的病原體細(xì)菌的出現(xiàn)是一個(gè)問(wèn)題，特別是對(duì)于預(yù)煮的、高度含有碳水化合物的食物(如即食產(chǎn)品或再次加熱的米飯)。為此，使用預(yù)煮的米飯作為食物樣品，其僅需要在微波爐中加熱2分鐘來(lái)完成蒸煮。將食物樣品用培養(yǎng)基稀釋，均漿化，并摻入102、103或104CFU/ml濃度的蠟狀芽胞桿菌細(xì)胞。使用TSPB培養(yǎng)基作為對(duì)照。圖13A以珠級(jí)分中的(黑色柱形)和上清液中的(陰影柱形)回收細(xì)胞的百分比顯示了結(jié)合細(xì)胞的數(shù)目。胞桿菌菌落可以其花朵形狀和擴(kuò)展生長(zhǎng)來(lái)識(shí)別。比較而言，圖13C描繪了其上鋪有含有細(xì)胞的上清液級(jí)分的PEMBA平板。圖14:借助于CBD21和》茲珠從血液中濃縮蠟狀芽胞桿菌向人血液摻入l(^CFU/ml濃度的蠟狀芽胞桿菌(DSMZ345)。先前向血液樣品中添加種檬酸鹽、EDTA或肝素以抑制血液凝固，并用PBST緩沖液稀釋1:1。JS-標(biāo)簽-CBD21(10pg/ml)(黑色柱形)，不含蛋白質(zhì)的對(duì)照(陰影柱形)。圖15:用JS-標(biāo)簽-CBD3626特異性結(jié)合產(chǎn)氣莢膜梭菌(C/oWnW/"m-0《803626對(duì)梭菌細(xì)菌和對(duì)磁珠的結(jié)合。圖15A例示性描繪了JS-標(biāo)簽-GFP-CBD3626對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞的結(jié)合。圖15B例示性描繪了JS-標(biāo)簽-GFP-CBD3626對(duì)磁珠的結(jié)合。圖16:在細(xì)胞結(jié)合測(cè)試中測(cè)量的依照本發(fā)明的JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體對(duì)不同葡萄球菌菌抹的特異性細(xì)胞結(jié)合。使用依照本發(fā)明的JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體JS-CBDPitti20(灰色柱形)、JS-CBDOpf(白色柱形)和JS-CBDUSA(黑色柱形)。描繪了多少百分比的引入細(xì)胞在細(xì)胞結(jié)合測(cè)試中被特異性結(jié)合。在實(shí)施例20中，描述了該實(shí)驗(yàn)的實(shí)施。給出的數(shù)目是來(lái)自PROFOS菌抹保藏中心的數(shù)目。葡萄球菌菌林分別分離自親林以及DSMZ和ATCC菌抹。圖16A:對(duì)不同金黃色葡萄球菌菌林(在MRSA菌林和非MRSA菌抹中劃分)的細(xì)胞結(jié)合圖16B:對(duì)不同非金黃色葡萄球菌菌林的葡萄球菌細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)合菌林C=肉葡萄球菌(^to//^/ococcmc"r"osm)，D=表皮葡萄5求菌(S鄉(xiāng)/iiy/ococcMs—E=馬胃葡萄球菌(5"to//^/ococcwse《wor謂)，F(xiàn)—溶血葡萄球菌(5Vqp/2少/ococcws/zaemofy"cz^),G=腐生葡萄球菌(iS啤/^/ococc^sa/ra//zWc—，H=松鼠葡萄球菌(S鄉(xiāng)/zj/ococcRSsc/"W)，I=模仿葡萄球菌，J=沃氏葡萄球菌(Sto;/^/ococc"swamer/),K=木糖葡萄球菌圖17:在過(guò)氧化物酶測(cè)試中依照本發(fā)明的JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體對(duì)不同葡萄球菌菌林的特異性細(xì)胞結(jié)合在實(shí)施例21中描述了過(guò)氧化物酶測(cè)試的進(jìn)行和原理。圖17A描繪了JS-標(biāo)簽-構(gòu)建體JS-CBDALE-l(陰影柱形)和JS-CBDLS(溶葡萄球菌素)(白色柱形)對(duì)兩種不同的葡萄球菌菌林的的特異性結(jié)合。還描繪了沒(méi)有添加蛋白質(zhì)的緩沖液對(duì)照(黑色柱形)的背景吸收。在該測(cè)試中使用下列葡萄球菌菌林S459-金黃色葡萄球菌(患者樣品)，S1546-表皮葡萄球菌(DSMZ20044)，S1548-溶血葡萄球菌(DSMZ20228)，S464-金黃色葡萄球菌(患者樣品)，S1501-金黃色葡萄球菌MRSA(患者樣品)，S1502-金黃色葡萄球菌MRSA(患者樣品)，S27溶血葡萄球菌。圖17B描繪了別的葡萄球菌特異性JS-標(biāo)簽構(gòu)建體對(duì)一組葡萄球菌種類(lèi)的特異性結(jié)合以及對(duì)作為非特異性對(duì)照的大腸桿菌菌林的結(jié)合。緩沖液對(duì)照(黑色柱形),JS-CBDALE-1(陰影的),JS-CBDLS(白色的),JS-CBDPitti20(水平條帶的)，JS-CBDOpf(灰色的)，JS-CBDUSA(垂直條帶的)。在該測(cè)試中引入下列細(xì)菌菌林S683-大腸桿菌(ECOR01),S1603-變異鏈球菌(5^印tococc"smwto"力(DSMZ20523)，S464-金黃色葡萄球菌(患者樣品)，S1513-金黃色葡萄球菌(患者樣品)，S1502-金黃色葡萄球菌MRSA(患者樣品)，S1501-金黃色葡萄球菌MRSA(患者樣品)，S27溶血葡萄球菌。圖18:在過(guò)氧化物酶測(cè)試中自腸球菌內(nèi)溶素衍生的依照本發(fā)明的多肽構(gòu)建體的特異性細(xì)胞結(jié)合實(shí)施例22中描述了該測(cè)試的實(shí)施。引入兩種依照本發(fā)明的JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體JS-CBDEF0355(灰色柱形)和JS-CBDEF1293(白色柱形)。還描述了沒(méi)有添加蛋白質(zhì)的緩沖液對(duì)照(黑色柱形)。給出的數(shù)目是來(lái)自PROFOS菌抹保藏中心的菌林?jǐn)?shù)目。其涉及腸球菌和葡萄球菌種類(lèi)的患者分離物以及DSMZ和ATCC菌林的問(wèn)題。圖18A描繪了對(duì)不同糞腸球菌菌林的特異性結(jié)合。圖18B描繪了對(duì)不同屎腸球菌C&7&racoccm/"e"ww)菌林以及對(duì)不同金黃色葡萄球菌菌林的特異性結(jié)合。發(fā)明概述下文描述本發(fā)明。術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌除去"在用于本文時(shí)指從樣品材料中完全或部分除去細(xì)菌。術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌富集，，在用于本文時(shí)指根據(jù)存在于樣品中的初始濃度濃縮細(xì)菌。一般而言，必須實(shí)施富集以使得相應(yīng)的檢測(cè)步驟得到明確的陽(yáng)性結(jié)論或明確的陰性結(jié)論。術(shù)語(yǔ)"捕獲"細(xì)菌指借助于"CBD"特異性結(jié)合來(lái)自樣品的細(xì)菌的能力從樣品中提取和結(jié)合細(xì)菌的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)"樣品材料"或"樣品"在用于本文時(shí)包含其中應(yīng)當(dāng)檢測(cè)出細(xì)菌或應(yīng)當(dāng)從中除去細(xì)菌的所有溶液。合適樣品的例子是水溶液及水和有機(jī)溶劑的混合物、食物、培養(yǎng)基、血液、血產(chǎn)品、血漿、血清、尿、其它體液、診斷性樣品、蛋白質(zhì)溶液、水乙醇混合物、過(guò)程溶液(處理液)(processsolution)諸如用于分析醫(yī)療器械的污染或食品加工中的清洗溶液。此外，還包括其中溶解有非水固體物質(zhì)的溶液，所述非水固體物質(zhì)有待分析或有待分離，例如蛋白質(zhì)、DNA、RNA、糖、鹽類(lèi)、食物、食物-培養(yǎng)基勻漿、藥物、疫苗、環(huán)境樣品、糞便、有機(jī)的和無(wú)機(jī)的化學(xué)品，例如NaCl、MgCl2、嘌呤、嘧啶。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)溶素"在用于本文時(shí)指在其最初的功能中起到在相應(yīng)噬菌體復(fù)制周期末期釋放新噬菌體作用的酶。在自然界中，此類(lèi)內(nèi)溶素可以是例如由噬菌體基因組所編碼的。這些內(nèi)溶素各由至少一個(gè)有酶促活性的結(jié)構(gòu)域和結(jié)合相應(yīng)宿主細(xì)胞細(xì)胞壁的無(wú)酶促活性的結(jié)構(gòu)域組成。另外，內(nèi)溶素必須理解為還包括類(lèi)似組成的自溶素。這些在自然界中是細(xì)菌編碼的，并且也由至少一個(gè)有酶促活性的細(xì)胞壁水解結(jié)構(gòu)域和結(jié)合靶細(xì)菌細(xì)胞壁的無(wú)酶促活性的結(jié)構(gòu)域組成。噬菌體編碼的內(nèi)溶素和細(xì)菌編碼的自溶素通常是彼此同源的(Garcia等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85，914-918),而且來(lái)自細(xì)菌和p藍(lán)菌體編碼序列的模塊(module)是可互換的，甚至可在嵌合物中彼此結(jié)合(Diaz等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.87,8125-8129)。因此，除來(lái)自噬菌體內(nèi)溶素的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，依照本發(fā)明還可使用來(lái)自其它細(xì)胞壁溶解酶(例如自溶素、細(xì)菌素或噬菌體尾部蛋白質(zhì))的相應(yīng)無(wú)酶促活性的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)"CBD"在用于本文時(shí)指分別自內(nèi)溶素或其它細(xì)胞壁溶解酶衍生的，并且負(fù)責(zé)內(nèi)溶素或其它細(xì)胞壁溶解酶對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁特異性結(jié)合的多肽結(jié)構(gòu)域和序列。這些是無(wú)酶促活性的。術(shù)語(yǔ)"依照本發(fā)明的多肽"在用于本文時(shí)指包含內(nèi)溶素或另一種細(xì)胞壁溶解酶的無(wú)酶促活性的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)和依照SEQIDNO:l的序列或其衍生物的多肽，其中除所述細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，所述多肽不包含內(nèi)溶素或另一種細(xì)胞壁溶解酶的別的結(jié)構(gòu)域，特別是不包含內(nèi)溶素的有完全酶促活性的結(jié)構(gòu)域(EAD)。術(shù)語(yǔ)"JS標(biāo)簽"在用于本文時(shí)指包含依照SEQIDNO:l的序列或其衍生物的多肽序列。JS標(biāo)簽衍生自肺炎克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的a-亞基的生物素受體結(jié)構(gòu)域，而且包含共有序列MKM(K是生物素化的)，使得該多肽可由蛋白質(zhì)生物素連接酶在體內(nèi)生物素化。與肺炎克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的完整a-亞基相比，JS標(biāo)簽是截短的。一種可能的最低限度JS標(biāo)簽序列包含與肺炎克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的氨基酸529至594對(duì)應(yīng)的66個(gè)氨基酸(SEQIDNO:2)。術(shù)語(yǔ)"JS標(biāo)簽"還包含依照SEQIDNO:l的序列的衍生物。衍生物在用于本文時(shí)包括與SEQIDNO:l仍有至少80o/。同源性的此類(lèi)序列。SEQIDNO:2-18中描繪了此類(lèi)衍生物的例子。術(shù)語(yǔ)"定向的固定化"在用于本文中時(shí)指CBD經(jīng)由作為特定偶聯(lián)劑的生物素而固定化于合適的表面上，例如經(jīng)由提供有鏈霉抗生物素蛋白或親合素的磁性顆?；蚱渌d體。術(shù)語(yǔ)"表面"或"載體"在用于本文時(shí)包括CBD分子和依照本發(fā)明的多肽分別有可能直接或間接偶聯(lián)或粘附的所有材料，例如玻璃表面、層析材料(諸如瓊脂糖、Sepharose、丙烯酸酯)、塑料表面(諸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚砜、聚曱基丙烯酸曱酯)、過(guò)濾材料或?yàn)V膜(諸如纖維素、乙酸纖維素、硝酸纖維素、PVDF)、由玻璃、膠乳、塑料、金屬、金15屬氧化物制成的磁性或非磁性顆粒。術(shù)語(yǔ)"l步方法"在用于本文時(shí)指其中在添加樣品之前已經(jīng)將特異性結(jié)合蛋白(例如依照本發(fā)明的多肽)固定化至合適的載體或表面(定向的或不定向的)的方法。在將固定化的結(jié)合蛋白與樣品一起溫育后，將細(xì)菌-結(jié)合蛋白-載體復(fù)合物與樣品分開(kāi)，然后任選地，進(jìn)行清洗。術(shù)語(yǔ)"2步方法"在用于本文時(shí)指其中將非固定化的特異性結(jié)合蛋白(例如依照本發(fā)明的多肽)與樣品接觸并一起溫育的方法。隨后將形成的細(xì)菌-結(jié)合蛋白復(fù)合物與合適的載體或表面接觸，使得細(xì)菌-結(jié)合蛋白復(fù)合物經(jīng)由結(jié)合蛋白借助于生物素化的親和標(biāo)簽而結(jié)合至載體或表面。隨后，將細(xì)菌-結(jié)合蛋白-載體復(fù)合物與樣品分開(kāi)，并且任選地，進(jìn)行清洗。如下用多肽或化學(xué)基團(tuán)修飾結(jié)合蛋白，該修飾方式使得它們特異性結(jié)合提供有所述多肽或化學(xué)基團(tuán)的相應(yīng)結(jié)合配偶體的載體或表面。術(shù)語(yǔ)"多肽"在用于本文時(shí)指有至少5個(gè)氨基酸的多肽鏈。術(shù)語(yǔ)"細(xì)菌-多肽復(fù)合物"或"多肽-細(xì)菌復(fù)合物"在用于本文時(shí)指其中存在細(xì)菌和依照本發(fā)明的多肽(依照本發(fā)明的多肽)的復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)"載體-多肽-細(xì)菌復(fù)合物"在用于本文時(shí)指其中存在細(xì)菌、依照本發(fā)明的多肽(依照本發(fā)明的多肽)以及載體(載體材料)的復(fù)合物。本發(fā)明涉及一種多肽，其包含i)內(nèi)溶素或另一種細(xì)胞壁溶解酶的無(wú)酶促活性的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD),和ii)依照SEQIDNO:1的序列或其衍生物，其中除所述細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，所述多肽不包含內(nèi)溶素或另一種細(xì)胞壁溶解酶的別的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明具體涉及一種生物素化的依照本發(fā)明的多肽。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的多肽內(nèi)的內(nèi)溶素或另一種細(xì)胞壁溶解酶的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)具有特異性結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的能力。依照本發(fā)明的多肽適于結(jié)合、富集、從樣品中除去、捕獲和/或檢測(cè)細(xì)菌。因此，本發(fā)明涉及依照本發(fā)明的多肽用于結(jié)合、富集、從樣品中除去、捕獲和/或檢測(cè)細(xì)菌的用途。相應(yīng)，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種用于結(jié)合、富集、除去、捕獲和/或檢測(cè)來(lái)自樣品的細(xì)菌的方法，其包括以下步驟a)使樣品與生物素化的依照本發(fā)明的多肽接觸和/或一起溫育，b)使步驟a)中獲得的多肽-細(xì)菌復(fù)合物與提供有生物素結(jié)合物質(zhì)的載體接觸和/或一起溫育，c)將步驟b)中獲得的載體-多肽-細(xì)菌復(fù)合物與所述樣品分開(kāi)，d)任選地，自載體-多肽-細(xì)菌復(fù)合物清洗非特異性附著的樣品成分，e)任選地，將載體與多肽-細(xì)菌復(fù)合物分開(kāi)，并f)任選地，；險(xiǎn)測(cè)所述細(xì)菌。在依照本發(fā)明的方法中，樣品與相應(yīng)的依照本發(fā)明的多肽一起溫育(步驟a)的持續(xù)時(shí)間或細(xì)菌-多肽復(fù)合物與載體材料一起溫育(步驟b)的持續(xù)時(shí)間分別必須針對(duì)相應(yīng)的樣品進(jìn)行調(diào)整，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，可在數(shù)秒和約24小時(shí)之間變化。依照本發(fā)明的方法的步驟a)(其中官能化的，即生物素化的依照本發(fā)明的多肽結(jié)合至細(xì)菌)一般快于步驟b)(其中將生物素化的多肽-細(xì)菌復(fù)合物固定化于生物素結(jié)合載體上)。適于依照本發(fā)明的方法的步驟a)的溫育時(shí)間具體是約0.1分鐘至約IO分鐘，適于步驟b)的溫育時(shí)間具體是約10分鐘至約60分鐘或者在需要時(shí)還可過(guò)夜。然而在依照本發(fā)明的方法的步驟a)中，其一般是足以充分混合所添加的依照本發(fā)明的多肽和樣品，而在與載體材料一起溫育(步驟b)期間，例如添加載體材料之后，必需在水平位置滾動(dòng)樣品容器以實(shí)現(xiàn)對(duì)載體盡可能有效的結(jié)合。起始材料中細(xì)菌處于非常低的濃度時(shí)，在合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的預(yù)溫育階段是必需的，以便實(shí)現(xiàn)高效富集，因此獲得適用于依照本發(fā)明的方法的樣品。含有固體成分的樣品(諸如食物樣品)可在用于依照本發(fā)明的方法前進(jìn)行勻漿化，并在它們被用于依照本發(fā)明的方法前再次吸收于、溶入合適的溶液中。在依照本發(fā)明的方法中，使用提供有生物素結(jié)合物質(zhì)的載體，即載體是官能化的。生物素結(jié)合物質(zhì)應(yīng)當(dāng)能夠以高親和力結(jié)合生物素。具體地，載體表面上的合適結(jié)合配偶體(即生物素結(jié)合物質(zhì))是例如鏈霉抗生物素蛋白、親合素及其生物素結(jié)合變體，諸如單體親合素、具有部分乙?；被虿糠瞩セ然挠H合素。與疏水表面相比，優(yōu)選親水表面，因?yàn)樗鼈円话愀m于結(jié)合蛋白質(zhì)，而且趨于以更小的程度凝集。通過(guò)將細(xì)菌與樣品的剩余部分分開(kāi)來(lái)富集細(xì)菌。細(xì)菌可在例如以^茲性為基礎(chǔ)的所述方法中、經(jīng)由層析方法、或在分批方法中富集。優(yōu)選^f茲性富集，因?yàn)榕c其它方法相比，該方法是非?？斓?，可以小型化，而且還可以自動(dòng)化。17但是也可使用層析方法或分批方法，特別是若該方法主要不是用于后續(xù)細(xì)菌檢測(cè)，而是瞄準(zhǔn)例如較大量細(xì)菌的分離，并且將繼續(xù)對(duì)這些所分離的細(xì)菌進(jìn)行操作。在以磁性為基礎(chǔ)的富集過(guò)程中，在依照本發(fā)明的方法的步驟b)中將多肽-細(xì)菌復(fù)合物與作為載體的合適磁性顆粒一起溫育。在某些實(shí)施方案中，磁性顆粒可具有的直徑范圍為約0.1)am至約100^im。然而，優(yōu)選直徑在約0.5pm至約5(am之間的更小顆粒，特別優(yōu)選直徑為約0.8jim至約2iim的顆粒，因?yàn)榕c較大的顆粒相比，較小的顆粒以較小速度沉降，因此提供較好的混合物，并且具有相對(duì)較大的表面，以及具有高的回收率。合適磁性顆粒的例子是MagPrep-鏈霉抗生物素蛋白顆粒(Merck)、鏈霉抗生物素蛋白》茲性顆粒(Roche)、鏈霉抗生物素蛋白珠(Dynal)、經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)的石圭珠(MicroCoat)、經(jīng)鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)的聚乙烯醇珠(PA-鏈霉抗生物素蛋白珠，Microcoat)。在依照本發(fā)明的方法的步驟b)之后，通過(guò)應(yīng)用》茲場(chǎng)用》茲性方法將載體-多肽-細(xì)菌復(fù)合物與樣品分開(kāi)。合適的磁力分離器可購(gòu)自例如Ambion、Ademtech、Bilatec、BioLabs、Dynal、Polysciences和Promega等公司。借助于分批方法進(jìn)行的富集過(guò)程中，最初將包含細(xì)菌的樣品與依照本發(fā)明的多肽一起溫育，隨后添加適于結(jié)合高親和力生物素的載體材料，混合，并再次一起溫育。隨后，可從樣品中離心出、沉降出或過(guò)濾出載體-多肽-細(xì)菌復(fù)合物。優(yōu)選經(jīng)由批次方法進(jìn)行的濃縮，特別是在細(xì)菌處于非常低的濃度時(shí)?；蛘?，可通過(guò)在含有生物素結(jié)合柱材料的層析柱上應(yīng)用多肽-細(xì)菌復(fù)合物來(lái)將它們與樣品分開(kāi)，并富集?？扇缦聦⒍嚯?細(xì)菌復(fù)合物與官能化載體分開(kāi)，即通過(guò)置換，例如通過(guò)添加合適量的生物素；或者通過(guò)調(diào)節(jié)條件(其高度地使蛋白質(zhì)變性，諸如約8M鹽酸胍或約pH1.5)和添加生物素酰胺酶，自肽切割生物素。還有可能的是，通過(guò)選擇條件僅將細(xì)菌與生物素化的依照本發(fā)明的多肽分開(kāi)，在所述條件依照本發(fā)明的多肽不再結(jié)合其位于細(xì)菌表面上的受體。因?yàn)楸景l(fā)明可使用依照本發(fā)明的不同多肽，因此必須在個(gè)體情況中測(cè)試準(zhǔn)確的條件。例如，這可通過(guò)引入熒光標(biāo)志物并在熒光顯微:鏡下監(jiān)測(cè)來(lái)實(shí)施，其中先前結(jié)合的細(xì)菌仍發(fā)熒光，因?yàn)樗鼈兊谋砻娓采w有依照本發(fā)明的多肽。然而，一般而言，離子強(qiáng)度向很高或很低的離子強(qiáng)度的變化、pH向很酸或很堿的變化(例如50mM磷酸鈉和pH11,達(dá)5分鐘)、去污劑或化學(xué)變性劑(諸如尿素或鹽酸胍)的添加、或所述可能性的組合適于阻止CBD細(xì)菌結(jié)合，因?yàn)檫@是特異性的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。然而，對(duì)于許多應(yīng)用，例如隨后的鋪板和自所結(jié)合細(xì)菌衍生的菌落的計(jì)數(shù)，磁性顆粒與細(xì)菌的分離是完全沒(méi)有必要的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于檢測(cè)樣品中的細(xì)菌的方法。細(xì)菌的檢測(cè)包括上文所述用于富集的方法步驟之后的別的步驟。根據(jù)應(yīng)當(dāng)檢測(cè)的細(xì)菌種類(lèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉一套技術(shù)，產(chǎn)生期望的結(jié)果。下文提及合適檢測(cè)方法的選擇。例如，細(xì)菌可在復(fù)合物中連同載體和生物素化的依照本發(fā)明的多肽一起檢測(cè)，或者可在經(jīng)由選擇性生長(zhǎng)條件(例如在選擇性培養(yǎng)基平板上鋪板和溫育)自載體材料釋放后檢測(cè)。此外，細(xì)菌檢測(cè)有可能通過(guò)基于核酸的方法進(jìn)行，即檢測(cè)細(xì)菌的核酸，所述基于核酸的方法例如PCR、RT-PCR、PCR-RFLP、rep-PCR指紋法、NASBA、DNA雜交方法(例如對(duì)于某些毒素或其它致病性因子)、多基因座序列分型(multi-locussequencetyping,MLST)和rRNA比較。還可能分別檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞壁及其成分(例如經(jīng)由內(nèi)溶素或抗體的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域或經(jīng)由FTIR),或分別檢測(cè)細(xì)菌成分，例如蛋白質(zhì)經(jīng)由ELISA檢測(cè)或酶經(jīng)由其活性或多位點(diǎn)酶電泳(multi-locusenzymeelectrophoresis,MEE)才全測(cè)。細(xì)菌檢測(cè)還有可能經(jīng)由細(xì)菌中包含的ATP進(jìn)行，例如在經(jīng)由使用細(xì)菌特異性噬菌體進(jìn)行的檢測(cè)的生物發(fā)光測(cè)定法中，例如對(duì)于利斯特氏菌A511-luxA(參見(jiàn)US5,824,468)。細(xì)菌可經(jīng)由另一種偶聯(lián)有標(biāo)志物的特異性CBD在載體-多肽-細(xì)菌復(fù)合物中或在從載體材料中除去后進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。因此，在EP1147419中描述了一組例子。微生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和/或生化檢測(cè)方法的組合的常規(guī)4全測(cè)也是有可能的。細(xì)菌成分(例如蛋白質(zhì))的檢測(cè)優(yōu)選經(jīng)由ELISA或類(lèi)似的技術(shù)(例如VIDAS)進(jìn)行。對(duì)于這些方法的實(shí)施，必需在實(shí)際檢測(cè)之前破壞細(xì)菌。例如，這可用溶胞蛋白質(zhì)諸如溶菌酶或細(xì)菌特異性內(nèi)溶素來(lái)進(jìn)行。溶胞蛋白質(zhì)例如可選自下組(括弧中的參考或是NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)(數(shù)字-字母組合)或是出版物引文):-對(duì)于利斯特氏菌屬Ply511(Q38653)、Ply500(Q37979)、Plyl18(Q37976)、PlyPSA(lXOV—A)、菌抹EGDe的自溶素(NP—466213)，隱對(duì)于炭疽芽孢桿菌PlyL(lYBO一A，B和C)、PlyG(YP_891193)、PlyPH(Yoong等，J.Bac.2006,188,2711-2714)、PlyB(2NW0一A和B)，-對(duì)于蠟狀芽胞桿菌PlyBa(CAA72266)、Ply21(CAA72267)、Plyl2(CAA72264)，-對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌Ply3626(WO03/066845)和來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌菌抹13的溶素(lysines)(BAB81921)和來(lái)自菌林SM101的溶素(YP—699489),-對(duì)于酪丁酸梭菌(C7o血W,0w6wOWc):<E>P1溶素(lysine)(EP1300082)，-對(duì)于腸J求菌屬PlyV12(NP_049942),■對(duì)于鏈球菌屬PlyC(NP—852017)、PlyGBS(AAR99416)、Cpl畫(huà)l(P15057)、Cpl-7(P19385)、Cpl-9(P19386)、來(lái)自噬菌體Dpl的Pal酰胺酶(P19386)、B30內(nèi)溶素(AAN28166)和LytA(CAJ34420),-對(duì)于葡萄球菌屬Twort酰胺酶(CAA69021)、葡萄球菌噬菌體P68酰胺酶(NP—817332)、LysK(O，F(xiàn)laherty等，J.Bac.，2005，187，7161-7164)、OSA2usa溶素(YP—494080)、Phil1酰胺酶(NP—803306)和細(xì)胞壁水解酶(NP—803302)或Phil2內(nèi)溶素(NP—803355)、以及來(lái)自金黃色葡萄球菌的自溶素Atl(BAA04185)、來(lái)自表皮葡萄球菌OStop/^/ococcMep/cfermWs)的AtlE(CAI59555)、來(lái)自頭狀葡萄球菌(&ap/2少/ococcwscfl//to)的ALE-l(BAA13069)以及自金黃色葡萄球菌菌林PS47衍生的肽聚糖水解酶(AAA26662)或來(lái)自模仿葡萄球菌的溶葡萄球菌素(AAB53783)。不同的別的添加劑可支持細(xì)胞溶解，諸如蛋白酶例如蛋白酶K的添加和加熱的應(yīng)用，優(yōu)選在約56。C5分鐘，隨后在約94。C5分鐘，或者諸如添加去污劑，優(yōu)選Triton、SDS、Tween、脫氧膽酸鈉或溶劑，諸如DMSO、異丙醇、乙醇、丁醇、氯仿。依照本發(fā)明的多肽包含分別在內(nèi)溶素和自溶素中所謂CBD的多肽結(jié)構(gòu)域/序列，其中依照本發(fā)明的多肽不再展現(xiàn)出有酶促活性的細(xì)胞壁水解區(qū)。缺乏酶活性對(duì)于功能性地分開(kāi)復(fù)合物中的細(xì)菌與載體是必需的。優(yōu)選地，僅在分開(kāi)之后(若這對(duì)于例如隨后的檢測(cè)反應(yīng)是必需的話)有目的地溶解所結(jié)合的細(xì)菌，因此釋放細(xì)胞內(nèi)容物。因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的多肽除包含細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外不包含內(nèi)溶素的別的結(jié)構(gòu)域，特別是不包含內(nèi)溶素的有酶促活性的結(jié)構(gòu)域(EAD),在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，也不包含內(nèi)溶素的別的序列。然而，在某些條件下，所使用多肽片段的較小的于相應(yīng)的應(yīng)用，即必須檢查何等程度的細(xì)胞水解酶速率可與應(yīng)用的總持續(xù)時(shí)間相符合以使得足夠量的完整細(xì)胞被捕獲。在例如Loessner等(1996,Appl.Environ.Microbiol.62,3057-3060)中描述了在水解測(cè)定法中可如何檢測(cè)CBD的潛在剩余活性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的多肽所示SEQIDNO:l的衍生物。在SEQIDNO:2-18中描述了此類(lèi)衍生物的例子，作為SEQIDNO:l例示性變異的所述例子顯示如下i)與SEQIDNO:l相比在第60位用Asp代替Glu，ii)在C末端添加Val或Val-Asp,和/或iii)在N末端添加M或MVGA。證明上文所述SEQIDNO:l的衍生物對(duì)于在依照本發(fā)明的方法中的應(yīng)用是有益的。1990年Garcia等(1990,Gene,86，81-88)已經(jīng)描述了在負(fù)責(zé)特異性細(xì)胞結(jié)合的C端結(jié)構(gòu)域(CBD)和包括酶促活性中心的N端結(jié)構(gòu)域(EAD)中的內(nèi)溶素模塊組織。CBD的概念在Loessner等，2002,(Mol.Microbiol.,44,335-349)和Loessner,2005，(Curr.Opin.Microbiol,8，480-487)中獲得延伸。大量的CBD已經(jīng)記載于本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)之中。通常，有酶促活性的結(jié)構(gòu)域(EAD)位于N端，而CBD位于C端——但是，也有例外(例如Garcia等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,85,914-918;Loessner,2005,Curr.Op.Microbiol.,8,480-487)。EAD一般是明確限定的，而且可相對(duì)容易地找到并定位，這通過(guò)用序列分析軟件(在本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中是已知的)和具有保守序列基序的相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)(例如CDD(Marchler-Bauer等，2005;NucleicAcidsResearch,33，D192-D196);Pfam(Finn等，2006，NucleicAcidsResearch34,D247-D251)或SMART(Schultz等,1998，Pro"Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864,Letunic等,2006,NucleicAcidsRes34,D257-D260))與其它水解酶(諸如酰胺酶、內(nèi)肽酶、糖香酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、溶菌酶)進(jìn)行序列和同源性比較來(lái)實(shí)現(xiàn)。在內(nèi)溶素CBD部分的鑒定過(guò)程中，找到了許多情況中細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的已知基序，這為提供依照本發(fā)明的多肽的CBD序列提供了合理的指示。在結(jié)合鏈球菌的內(nèi)溶素組中，CBD相對(duì)容易找到，因?yàn)橥ǔ３霈F(xiàn)長(zhǎng)度為約20個(gè)氨基酸的、具有保守芳香殘基的膽堿結(jié)合基序(CW—binding—1，pfam01473)，其通常以多個(gè)重復(fù)發(fā)生(參見(jiàn)Garcia等，1990,Gene，86,81-88)。長(zhǎng)度為約40個(gè)氨基酸的LysM結(jié)構(gòu)域(pfam01476)也可在CBD中部分地被找到。這是一種廣泛分布的具有保守二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽聚糖結(jié)合模塊(Bateman和Bycroft，2000,J.Mol.Biol.，299，1113-1119)。SH3b結(jié)構(gòu)域和SH3—3、SH3—4或SH3—5結(jié)構(gòu)域(smart00287、pfam08239、pfam06347、pfam08460)(分別為真核生物和病毒Scr同源性結(jié)構(gòu)域SH3的原核生物對(duì)應(yīng)物)(Ponting等，1999,J.Mol.Biol.,289，729-745)通常也可作為細(xì)胞結(jié)合基序在CBD中找到(主要在葡萄球菌和腸球菌中)。肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PG—binding—1，pfam01471;PG—binding—2，pfam08823)由3個(gè)螺旋組成，通常也可在EAD的N端找到。然而，時(shí)常找不到CBD部分與其它相關(guān)噬菌體內(nèi)溶素的直接關(guān)系或者也找不到CBD部分與其它碳水化合物結(jié)合蛋白質(zhì)的直接關(guān)系，而且?guī)缀醪豢上薅ㄖ该鰿BD的獨(dú)特序列基序或結(jié)構(gòu)模塊。在此類(lèi)情況中，可經(jīng)由EAD來(lái)確定關(guān)系。作為本發(fā)明多肽的基礎(chǔ)，在該情況中，除從本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的CBD起作用之外，還有內(nèi)溶素中不被EAD占據(jù)的部分起作用。該內(nèi)溶素的剩余部分(即減去EAD的內(nèi)溶素)可直接理解為并用作CBD,只要其展現(xiàn)出細(xì)胞結(jié)合功能。然而，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用較短的片段是有用的(例如因?yàn)樗鼈冋宫F(xiàn)出較高的穩(wěn)定性)，只要它們?nèi)哉宫F(xiàn)出細(xì)胞結(jié)合功能。CBD的功能性測(cè)試是檢測(cè)對(duì)相應(yīng)細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)合。適于該目的的不同例示性測(cè)定法記載于實(shí)施例和附圖中。除有效細(xì)胞結(jié)合之外，還應(yīng)當(dāng)考慮涉及定義發(fā)揮CBD功能的肽部分的別的特征表達(dá)率、溶解度、穩(wěn)定性和簡(jiǎn)單純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可從本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中知曉測(cè)試這些特征的方法。因此，在下文實(shí)施例中還描述了一些例子。例如，依照結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定有目的設(shè)計(jì)的CBD部分的取向，其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、潛在的結(jié)構(gòu)域接頭和3D模型來(lái)評(píng)估。合適的例示性方法i己載于例如下纟且出版物Garnier等，1996，MethodsinEnzymology266,540-553;Miyazaki等，2002,J.Struct.Funct.Genomics,15,37-51;Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.17,3389-3402;Schwede等，2003,NucleicAcidsResearch31,3381-3385.Lund等，CPHmodels2.0:X3MaComputerProgramtoExtract3DModels.CASP5會(huì)議文摘A102,2002?；旧纤凶员绢I(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)知曉的CBD和所有依照上文所述方法自內(nèi)溶素衍生的CBD可用于本發(fā)明的多肽，并用于本發(fā)明的方法。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的多肽的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自下列內(nèi)溶素的和其它細(xì)胞壁溶解酶的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述內(nèi)溶素22和其它細(xì)胞壁溶解酶包括Ply511(Q38653)、Ply500(Q37979)、Ply118(Q37976)、PlyPSA(lXOV—A)、EGDe(NP_466213)、PLyL(1YB0_A,B和C)、PlyG(YP一891193)、PlyPH(Yoong等，J.Bac.2006，188，2711-2714)、PlyB(2NW0—A和B)、PlyBa(CAA72266)、Ply21(CAA72267)、Plyl2(CAA72264),糞腸球菌V5M原噬菌體內(nèi)溶素、Ply3626(WO03/066845)、來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌菌林13(BAB81921)和菌抹SM101(YP—699489)的溶素、①P1溶素(EP1300082)、PlyV12(NP—049942)、PlyC(NP—852017)、PlyGBS(AAR99416)、Cpl-l(P15057)、Cpl隱7(P19385)、Cpl-9(P19386)、Pal酰胺酶(P19386)、Twort酰胺酶(CAA69021)、金黃色葡萄球菌噬菌體PVL酰胺酶(UniProt080064)、P68lys16(NP—817332)、OSA2usa內(nèi)溶素(YP—494080)、Phill(NP—803306)和Phi12內(nèi)溶素(NP—803355)、金黃色葡萄球菌噬菌體Phi11的細(xì)胞壁水解作用(NP—803302)、p盆菌體B30內(nèi)溶素(AAN28166)、噬菌體168內(nèi)溶素(MJLoessner等，JBacteriol,1997May;179(9):2845—2851)、LysK(0、Flaherty等，J.Bac.,2005,187,7161-7164)、模仿葡萄球菌(S.simulans)溶葡萄球菌素(AAB53783)、頭狀葡萄球菌ALE-1內(nèi)肽酶(BAA13069)、噬菌體PhiNIHl.1細(xì)胞壁水解酶(NP—438163)、LytM(AAB62278)、Atl(BAA04185),來(lái)自肺炎鏈球菌的LytA(CAJ34420)、自金黃色葡萄球菌菌林PS47衍生的肽聚糖水解酶(AAA26662)，來(lái)自糞腸球菌的腸溶素A(Q9F8B0)、來(lái)自單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的ami自溶素(Milohanic等；InfectionandImmunity,August2004，p,4401-4409，Vol.72，No.8)、乳桿菌溶素例如噬菌體A2的溶素(AJ251788.2或Q9MCC8)、噬菌體PL-1酰胺酶(Q9MCC6)(均為干酪乳桿菌(丄.cose/)的)等。特別適于結(jié)合利斯特氏菌的是內(nèi)溶素Ply511的片段，特別適于結(jié)合桿菌的是內(nèi)溶素PlyBa、Ply21、和Plyl2的片段，特別適于結(jié)合梭菌的是Ply2636的片段，特別適于結(jié)合葡萄球菌的是OSA2usa內(nèi)溶素的片段、葡萄球菌細(xì)菌素溶葡萄球菌素的片段、溶葡萄球菌素樣(如ALE-1)的片段、葡萄球菌自我分離的(self-isolated)plyOpf、plyPitti20、plyPitti26和同源原噬菌體的類(lèi)似蛋白質(zhì)的片段，特別適于結(jié)合腸球菌的是來(lái)自糞腸球菌V583原噬菌體內(nèi)溶素的片段、以及CBDEF0355和CBDEF129?？稍谝勒毡景l(fā)明的多肽中出現(xiàn)的CBD序列的例子是SEQIDNO:19:CBD21;SEQIDNO:20:CBDBA;SEQIDNO:21:CBDUSA;SEQIDNO:22:Ply511型式1:SEQIDNO:23:Ply511型式2;SEQIDNO:24:Ply511型式3;SEQIDNO:25:Ply3626型式1;SEQIDNO:26:Ply3626型式2;SEQIDNO:27:CBDPitti20;SEQIDNO:28:CBDPitti26;SEQIDNO:29:CBDLS;SEQIDNO:30:CBDALE-1;SEQIDNO:31:CBDOpf;SEQIDNO:32:CBDEF0355;SEQIDNO:33:CBDEF1293。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，除細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，依照本發(fā)明的多肽不包含別的內(nèi)溶素序列。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的多肽由僅一個(gè)CBD和另外的依照SEQIDNO:l的多肽序列或其衍生物組成，任選地，它們由接頭或間隔區(qū)偶聯(lián)。們的預(yù)測(cè)的知識(shí)(例如George和Heringa，2003，ProteinEng.15，871-879;Bae等，2005，Bioinformatics,21,2264-2270)。結(jié)構(gòu)域接頭序列以相對(duì)高比例的親水氨基酸為特征，因?yàn)樗鼈円话憬Y(jié)構(gòu)較少，并且暴露于溶劑，所述結(jié)構(gòu)域接頭序列諸如利斯特氏菌內(nèi)溶素PlyPSA的短接頭序列AAKNPN(SEQIDNO:37)(Kornddrfer等，2006，J.Mol.Biol.,364，678-689)。傳統(tǒng)上也使用聚甘氨酸接頭，然而，它們通常是蛋白酶敏感的。一種特殊的親水性非結(jié)構(gòu)化接頭是富含脯氨酸和蘇氨酸的序列(也以天然接頭存在)，例如來(lái)自腸溶素A(EnterolysinA)的TPTPPNPGPKNFTT(SEQIDNO:36)。富含脯氨酸和蘇氨酸的接頭序列可簡(jiǎn)單地以共有基序(PT)xP或(PT)xT描述，其中x是從l至10的整數(shù)。Croux等(1993,Molec.Microbiol.,9,1019-1025)描述了在N端和C端結(jié)構(gòu)域之間，如此在內(nèi)溶素的EAD和CBD之間的所謂連接區(qū)。這些通常比較短的區(qū)域是天然接頭序列，而且也適于將CBD模塊在借助于用JS標(biāo)簽重組的切割位點(diǎn)下連接至依照本發(fā)明的多肽。在例如SEQIDNO:34-38中描述了特別適于特定接頭的例子。依照本發(fā)明的多肽的序列可由下組序列組成i)選自SEQIDNO:l-18的JS標(biāo)簽序列，ii)選自SEQIDNO:19-33的CBD序列，iii)選自SEQIDNO:34-38的接頭序列，和任選地iv)作為間隔區(qū)的GFP、GST或MBP的序列。在SEQIDNO:39-53中描述了數(shù)個(gè)例示性的依照本發(fā)明的多肽序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及無(wú)酶促活性的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即Ply21的CBD。令人驚訝的是，無(wú)水解活性的CBD21在細(xì)菌結(jié)合中具有如下宿主譜，所述宿主譜除包括幾乎所有的桿菌群細(xì)菌(多粘芽孢桿菌CB.;o/;w;aa)和球形芽孢桿菌(5.^/weWc^)除外)之外，還進(jìn)一步包括來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的重要群體的代表，諸如葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌，甚至利斯特氏菌。因?yàn)镃BD通常展現(xiàn)出相對(duì)小的宿主譜(Loessner2005，Curr.Opin.Microbiol,8，480-487)，所以CBD的這種廣泛宿主特異性特征是很不尋常的。因此，CBD21能夠結(jié)合所有來(lái)自蠟狀芽胞桿菌群的測(cè)試細(xì)菌，另外還能夠解決一般性富集革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的問(wèn)題，特別是那些自其中可找到許多病原體病菌的群體(諸如葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、微球菌、桿菌和利斯特氏菌)衍生的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。因此，另一方面，本發(fā)明涉及包含SEQIDNO:19所示序列的多肽，但是除此細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，其不包含別的內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述多肽不包含內(nèi)溶素的有完全酶促活性的結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選地，包含SEQIDNO:19所示序列的多肽不包含別的內(nèi)溶素序列。由于CBD21的廣泛適用性，本發(fā)明還涉及依照本發(fā)明的CBD21用于結(jié)合、富集、從樣品中除去、捕獲和/或檢測(cè)選自下組屬的細(xì)菌的用途葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、微球菌、桿菌和/或利斯特氏菌(參見(jiàn)表3);所述依照本發(fā)明的CBD21包含依照SEQIDNO:19的序列，但是除此細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，其不包含別的內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域。另外，依照本發(fā)明的多肽中限定合適CBD的多肽部分還可與充當(dāng)間隔區(qū)，同時(shí)任選地充當(dāng)標(biāo)志物的多肽部分連接。因?yàn)镃BD表示來(lái)自較大蛋白質(zhì)(內(nèi)溶素)的區(qū)域，所以它們一般相對(duì)較小，具有約100至300個(gè)氨基酸或者對(duì)于某些細(xì)胞結(jié)合基序甚至更少。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在CBD結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)固定化至載體的基團(tuán)之間引入間隔區(qū)是有用的。這可阻止CBD由于固定化而變性，并阻止其喪失對(duì)細(xì)胞的結(jié)合能力。對(duì)于2步方法中對(duì)多肽-細(xì)菌復(fù)合物的結(jié)合，重要的是，負(fù)責(zé)固定化至表面的基團(tuán)變得更易接近，若它們不與CBD直接偶聯(lián)的話。優(yōu)選地，間隔區(qū)是明確限定的、可表達(dá)良好的穩(wěn)定蛋白質(zhì)模塊，其與其它蛋白質(zhì)和表面盡可能小的相互作用(例如GFP(綠色熒光蛋白)、MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)、GST(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶))。特別合適的例子是GFP及其變體。因?yàn)镚FP是高度熒光性的，其作為標(biāo)志物也是合適的。為此，例如可在方法過(guò)程中監(jiān)測(cè)依照本發(fā)明的多肽。在功能性測(cè)試即結(jié)合測(cè)試中，CBD的結(jié)合和依照本發(fā)明的多肽對(duì)細(xì)菌的結(jié)合以及對(duì)載體的結(jié)合可容易地檢出。別的修飾也可充當(dāng)標(biāo)志物，如例如EP1147419中所提出的。為了使CBD成為依照本發(fā)明的多肽，CBD必需存在有融合蛋白內(nèi)的所謂JS標(biāo)簽的標(biāo)簽。生物素與其結(jié)合配偶體鏈霉抗生物素蛋白或親合素(1(T"M;Gonzales等，1997,J.Biol.Chem.,272，11288-11294)之間的非常強(qiáng)的鍵對(duì)于上文所述2步方法的運(yùn)轉(zhuǎn)是有益的，從本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)知曉所述2步方法甚至比已知的l步方法更好(例如EP1147419)。其它也適于將蛋白質(zhì)結(jié)合至官能化表面的標(biāo)簽是例如His標(biāo)簽或Strep標(biāo)簽(His-標(biāo)簽10^-l(rSM;Nieba等，1997,Anal.Biochem.，252，217-228;Strep標(biāo)簽，約10-6]\4，Voss和Skerra，1997，ProteinEng.，10，975-982)。細(xì)菌-多肽復(fù)合物與載體的結(jié)合在2步方法中更高效，所述2步方法影響結(jié)合時(shí)間，并導(dǎo)致在困難條件(例如在食物樣品中)下細(xì)菌丟失的可能性降低，以及導(dǎo)致靈敏性升高。在可能的生物素化偶聯(lián)基團(tuán)的選擇中，證明JS標(biāo)簽是更優(yōu)選的。一方面，化學(xué)生物素化沒(méi)有導(dǎo)致在某個(gè)位置結(jié)合蛋白的官能性想要的限定生物素化，通過(guò)在這些限定的生物素化，CBD定向固定化至載體將是有可能的。另一方面，由此蛋白質(zhì)通常是失活的。這特別可應(yīng)用于相對(duì)較少的CBD蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。證明Avi標(biāo)簽(大體代表最低限度序列，其中所述最低限度序列仍將在體內(nèi)在融合蛋白中被生物素化)也沒(méi)有JS標(biāo)簽合適，因?yàn)楸仨氁敫叩牡鞍踪|(zhì)量以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌與^茲珠的有效結(jié)合。與Avi標(biāo)簽相比，US5,252,466中提出的用于與蛋白質(zhì)融合的生物素化結(jié)構(gòu)域相對(duì)較大。如此，例如肺炎克雷伯氏菌草乙酸脫J^酶的生物素化結(jié)構(gòu)域包含595個(gè)氨基酸，這對(duì)于表達(dá)產(chǎn)率是不利的，而且大的融合蛋白相對(duì)而言是蛋白酶敏感的，因此是相對(duì)不穩(wěn)定的(whichisdisadvantageousconcerning26boththeexpressionyieldandinsofarthatthelargefosionportionisrelativelyproteasesensitiveandthereforerelativelyunstable)。證實(shí)JS標(biāo)簽及其衍生物為與CBD結(jié)合以便結(jié)合、富集、除去、捕獲和檢測(cè)樣品中的細(xì)菌的非常好的生物素化標(biāo)簽。這些是來(lái)自肺炎克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的a亞基的、包含供體內(nèi)生物素化用的共有基序(MKM)的區(qū)段及其衍生物。與完全生物素化結(jié)構(gòu)域相比，所述多肽變得對(duì)例如蛋白水解更穩(wěn)定，而且作為親和標(biāo)簽更易于在例如克隆、表達(dá)和純化中操作。JS標(biāo)簽的最低限度序列的長(zhǎng)度為66個(gè)氨基酸，這些氨基酸對(duì)應(yīng)于加有作為起始的甲硫氨酸的肺炎克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的氨基酸529至594。特別合適的是SEQIDNO:l陽(yáng)18所示的序列。在Cronan(1990,J.Biol.Chem.,265，10327隱10333)中強(qiáng)調(diào)位于MKM基序N端的富含保守脯氨酸和丙氨酸的區(qū)域應(yīng)當(dāng)在生物素連接酶進(jìn)行的溶素生物素化方面發(fā)揮重要的結(jié)構(gòu)功能。肺炎克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的a亞基的該區(qū)域甚至特別形成有長(zhǎng)度為22個(gè)氨基酸的P和A區(qū)域。然而，已經(jīng)證明該區(qū)域?qū)τ谠谒鱿到y(tǒng)中的生物素化不是必需的，因?yàn)樯衔乃鲎畹拖薅刃蛄胁话搮^(qū)域，但是非常高效地被生物素化。已經(jīng)證明，向肺炎克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的氨基酸529至594添加很短的肽(MVGA)可提供非常好的N端起始序列(參見(jiàn)SEQIDNO:8-10和16-18)。JS標(biāo)簽和CBD(和另外的在中間引入的間隔區(qū)模塊)之間的融合既可在CBD的N端實(shí)施又可在CBD的C端實(shí)施(ThefUsionbetweentheJS-tagandtheCBD，andanadditionalintermediatelyintroducedspacermodule,respectively,canbecarriedoutN-terminallyaswellasC-terminallyoftheCBD)。對(duì)于依照本發(fā)明的多肽，N端融合物是優(yōu)選的，因?yàn)閮?nèi)溶素的CBD部分通常是位于C端，而JS標(biāo)簽(任選地加上間隔區(qū)模塊)可在結(jié)構(gòu)上替換內(nèi)溶素中缺失的EAD。顯而易見(jiàn)的是，這些結(jié)構(gòu)域若在N端使用也能運(yùn)行良好。為此，在Cronan(1990:J.Biol.Chem.,265,10327-10333)中，僅使用具有謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)轉(zhuǎn)羧酶的1.3S亞基的生物素化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白質(zhì)融合物。若沒(méi)有使用間隔區(qū)分子，則可經(jīng)由接頭連接JS標(biāo)簽與CBD(參見(jiàn)上文的實(shí)施方案)，或者也可沒(méi)有接頭，則可引入僅1至3個(gè)氨基酸以獲得用于克隆的限制性切割位點(diǎn)。序列AGAGAGAGS或AGAGAGAGSEL(SEQIDNO:34或35)證明是例示性的合適接頭肽。然而，其它具有已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)接頭序列和相對(duì)非結(jié)構(gòu)化肽的接頭序列(例如富含脯氨酸和蘇氨酸的接頭諸如(PT)3T(PT)3丁(PT)3)也可使用。富含PT的接頭的例子是TPTPPNPGPKNFTT(SEQIDNO:36)。(短的)親水接頭的例子是AAKNPN(SEQIDNO:37)?？稍诒景l(fā)明中使用的接頭的另一個(gè)例子是AGAGAGAEL(SEQIDNO:38)。在依照本發(fā)明的方法中使用的依照本發(fā)明的多肽可以被生物素化，由此其借助于生物素連接酶在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下在體外被生物素化。令人驚訝的是，還證明了與US5,252，466中所述發(fā)明相比，在細(xì)菌細(xì)胞中制備生物素化的依照本發(fā)明的多肽中生物素化的融合蛋白與生物素連接酶(BirA)的共表達(dá)不是必需的，因?yàn)樯锼鼗苍跊](méi)有外部生物素連接酶的情況下進(jìn)行。有趣的是，在完全培養(yǎng)基(諸如LB)中，甚至一次也沒(méi)必要向培養(yǎng)基中添加生物素。在沒(méi)有額外的BirA共表達(dá)的情況中或者甚至在不添加生物素的情況中，JS標(biāo)簽和CBD的融合蛋白在商品化的大腸桿菌表達(dá)菌抹(例如BL21(DE3)、HMS174(DE3)、JM83)中有效地受到生物素化。與US5,525，466中提出的生物素化標(biāo)簽的用途(作為用于較容易地純化蛋白質(zhì)的手段)相比，沒(méi)有必要經(jīng)由針對(duì)生物素的親和柱來(lái)純化本文所述JS標(biāo)簽和CBD的融合物，而是可以常規(guī)方式純化，諸如經(jīng)由陽(yáng)離子或陰離子交換層析、疏水層析、分級(jí)硫酸銨沉淀等進(jìn)行。一方面，這是有益的，因?yàn)獒槍?duì)生物素的相應(yīng)親和材料是很貴的，而且經(jīng)常僅為低容量，例如攜帶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白或Streptactin的層析材料；另一方面，融合蛋白難以自親和材料釋放，因?yàn)樯锼嘏c其結(jié)合配偶體之間的結(jié)合是非常高效的。這導(dǎo)致所述純化方法中的問(wèn)題。如此，靶蛋白質(zhì)從該柱中延遲洗脫("拖尾，，)，而且在洗脫過(guò)程中有可能變性。依照本發(fā)明的構(gòu)建體的穩(wěn)定性在某種程度上取決于所使用的CBD的特定特性。由JS標(biāo)簽、CBD和任選的接頭、間隔區(qū)和標(biāo)志物組成的融合構(gòu)建體以及官能化載體(諸如-茲珠)可在不喪失它們的結(jié)合能力的情況下在較長(zhǎng)的一段時(shí)間里貯存。貯存的溫度范圍有可能在約-20。C至約37。C。優(yōu)選的是在約-20。C至約10。C的溫度貯存。通常，貯存應(yīng)當(dāng)在約中性pH值(pH6-7)實(shí)施，但是若CBD部分容許，pH值高達(dá)10的貯存也是有可能的。適于貯存的緩沖系統(tǒng)是例如100mM磷酸鈉緩沖液，pH6至pH10,2mMEDTA或10mM咪唑，100mMNaCl，pH7。一般而言，穩(wěn)定劑諸如甘油或硫酸銨(例如30%飽和)的添加對(duì)貯存能力有積極的影響。通過(guò)依照本發(fā)明的方法，在依照本發(fā)明的多肽構(gòu)建體的應(yīng)用下，基本上可結(jié)合所有的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(諸如梭菌、桿菌、利斯特氏菌、葡萄球菌、乳桿菌、腸球菌、氣球菌、足球菌、鏈球菌、分枝桿菌、明串珠菌)，因此可進(jìn)行富集、捕獲、固定化，和任選地，進(jìn)行檢測(cè)。如上文所限定的，應(yīng)用方式依賴于所使用樣品的類(lèi)型。特別合適的是富集和檢測(cè)來(lái)自食物樣品的潛在病原體細(xì)菌的方法。然而，該方法也適用于富集和檢測(cè)來(lái)自醫(yī)學(xué)或診斷性樣品的病原體細(xì)菌。此外，其適用于除去或檢測(cè)來(lái)自下述樣品的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在所述樣品中它們不是想要的，例如在藥學(xué)或化妝用制品和過(guò)程溶液中。與常規(guī)富集方法(諸如ISO方法)相比，依照本發(fā)明的方法在富集方面節(jié)省許多時(shí)間。與使用官能化^磁性顆粒以捕獲細(xì)菌-多肽復(fù)合物的^F茲性分離組合時(shí)，可替換復(fù)雜的，而且難以自動(dòng)化的分離方法，例如離心步驟。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼依照本發(fā)明的多肽的核酸以及載體，以及表達(dá)所述核酸和載體的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用本領(lǐng)域情形中已知的規(guī)程來(lái)制備編碼依照本發(fā)明的多肽的合適核酸和載體。依照本發(fā)明的多肽的氨基,列可以衍生自例如基于遺傳密碼的合適核酸序列。任選地，密碼子的優(yōu)化使用在這里視為取決于所選的表達(dá)系統(tǒng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還能夠選擇合適的載體，例如以便確保經(jīng)由上文所述核酸來(lái)表達(dá)依照本發(fā)明的多肽。令人驚訝的是，證明了翻譯多肽序列的JS標(biāo)簽的N端部分中的核酸序列對(duì)于有效表達(dá)是重要的。在維持氨基酸序列的前提下，與富含GC的序列相比，富含AT的序列顯示顯著更高效的表達(dá)。假設(shè)的是，二級(jí)結(jié)構(gòu)元件在轉(zhuǎn)錄RNA開(kāi)端的形成影響翻譯效率。這些富含AT的序列的3種變體(SEQIDNO:54至56)證明為特別適用于JS標(biāo)簽和隨后的CBD之間的融合物(參見(jiàn)表l)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼依照本發(fā)明的多肽中的JS標(biāo)簽的核酸序列部分以選4奪SEQIDNO:54至56的序列開(kāi)始。依照本發(fā)明的方法和依照本發(fā)明的多肽片段分別以如下優(yōu)勢(shì)為特征具有JS標(biāo)簽與內(nèi)溶素的CBD的組合的融合物一般適于快速而有效地結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。CBD和JS標(biāo)簽的融合物非常適于在高效的2步方法中富集細(xì)菌，因?yàn)樽鳛榕悸?lián)基團(tuán)的生物素容許CBD細(xì)菌復(fù)合物非常好的固定化。與CBD和JS標(biāo)簽的融合物組合的2步方法容許載體材料的投入變小，并且主要是特異性結(jié)合蛋白的投入(i叩ut)變小，這在經(jīng)濟(jì)方面是有益29的。該方法中的生物素化是非常高效而精確限定的，使得與其它方法相比可獲得非常高比例的功能性結(jié)合蛋白。與事先固定化在表面上的結(jié)合蛋白(其中經(jīng)常發(fā)生空間問(wèn)題、作為副反應(yīng)的非特異性結(jié)合、和非功能性固定化)相比，細(xì)菌與游離結(jié)合蛋白的結(jié)合也有效地多。依照本發(fā)明的方法還適用于固定化不同的CBD細(xì)菌復(fù)合物與同一種載體。CBD和JS標(biāo)簽的融合物證明為高度穩(wěn)定性的構(gòu)建體，特別是以在溫度高達(dá)約30。C時(shí)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和蛋白酶穩(wěn)定性為特征。JS標(biāo)簽具有適于操作的長(zhǎng)度，因?yàn)橐环矫?，其不是太長(zhǎng)，而另一方面，其足夠長(zhǎng)以使得不再必需間隔區(qū)。用于制備依照本發(fā)明的多肽的依照本發(fā)明的方法甚至在沒(méi)有祝M共表達(dá)的情況中也起作用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種試劑盒，其包含提供有作為功能性基團(tuán)的生物素結(jié)合物質(zhì)(諸如鏈霉抗生物素蛋白或親合素)的載體，還包含至少一種具有融合有JS標(biāo)簽的CBD的依照本發(fā)明的多肽片段的變體，以及富集和任選的檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌必需的緩沖溶液，例如清洗緩沖液、洗脫緩沖液和/或溶胞緩沖液。實(shí)施例下列實(shí)施例闡明本發(fā)明，并且不會(huì)視為對(duì)本發(fā)明的限制。除非另有說(shuō)明，才艮才居例如Sambrook等,1989,Molecularcloning:ALaboratoryManual第2片反,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork戶斤述4吏用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法。實(shí)施例l:具有生物素化標(biāo)簽的噬菌體尾部蛋白質(zhì)的表達(dá)、溶解度和功能性裝配圖l中描繪了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。依照標(biāo)準(zhǔn)方法，在pET21a或pET21d中克隆圖l所示來(lái)自沙門(mén)氏菌或彎曲桿菌噬菌體的噬菌體尾部蛋白質(zhì)，并在給定的表達(dá)菌抹中在IPTG誘導(dǎo)(每種方法lml)后在30。C表達(dá)。3至4小時(shí)后，將細(xì)胞離心(臺(tái)式離心機(jī)，5分鐘，13，000rpm)，并將沉淀物溶解于緩沖液(例如20mMTris，5mMEDTA,pH8)中。使用超聲來(lái)溶解細(xì)胞，并再次離心(20分鐘,13，000rpm，4°C)。取出含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液，并煮沸5分鐘或不進(jìn)行煮沸。在未煮沸的樣品內(nèi)，應(yīng)當(dāng)形成SDS耐受的天然三聚體，其可在4交高分子量處找到。將含有不溶性蛋白質(zhì)的沉淀物重懸于相同體積的緩沖液(例如20mMTris，pH9，50mMNaCl，5mMEDTA)中。將L3mmli樣品緩沖液添加至所有的樣品，并分別在12。/。和9。/。的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上加載樣品，并用考馬斯染色。在所有三個(gè)子實(shí)驗(yàn)中顯示了，利用具有特定生物素化標(biāo)簽噬菌體尾部蛋白質(zhì)不可獲得有效量的功能性蛋白質(zhì)。部分地，表達(dá)率是非常差的，部分地，大部分的蛋白質(zhì)是不可溶的，并且不可能獲得高比例的以SDS耐受的寡聚體形式為特征的天然蛋白質(zhì)。僅對(duì)于P22樣噬菌體尾部蛋白，可在SDS凝膠上檢測(cè)出單體和天然三聚體的條帶。對(duì)于其它兩種蛋白質(zhì)，在Western印跡上僅可檢測(cè)出很弱的單體條帶，使得可確定位置，并可檢驗(yàn)誘導(dǎo)和表達(dá)的基本運(yùn)行。實(shí)施例2:CBD的化學(xué)生物素化各制備lmg/mlCBD511(在PBS中；20mM磷酸鈉pH7.4,120mM氯化鈉)和NHS-生物素(在DMSO中)的儲(chǔ)液。將120^ilNHS-生物素溶液添加至1200jil蛋白質(zhì)溶液并充分混合。立即(O分鐘數(shù)值)取出或在20分鐘、60分鐘或120分鐘后取出300pl的每種樣品，并添加至在水上的30pl1MTris，pH8以停止反應(yīng)。針對(duì)PBS緩沖液透析所有樣品。通過(guò)測(cè)量吸收來(lái)測(cè)定所有樣品的蛋白質(zhì)濃度，并使用HABA測(cè)試來(lái)測(cè)定生物素化的程度。生物素化的程度是每個(gè)CBD分子1.5至2.5個(gè)生物素分子。用菌林單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ScottA進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合測(cè)試，該菌林以l(^CFU/ml的濃度引入500W測(cè)試樣品(緩沖液PBST;20mM磷酸鈉pH7.4，120mM氯化鈉，0.1%Tween20)中。隨后，分別以濃度0.5pg/ml、lng/ml、2昭/ml和5iig/ml添加生物素化的CBD511，并溫育1分鐘。JS標(biāo)簽CBD511起對(duì)照的作用。將MagPrep-鏈霉抗生物素蛋白顆粒(Merck)添加至50jig/ml，并將樣品在室溫在頂置旋轉(zhuǎn)器(overheadrolator)中溫育20分鐘。磁性分離5分鐘后，取出上清液，并用500(ilPBST緩沖液清洗磁性顆粒l次(IO分鐘)。第2次磁性分離之后，將磁性顆粒添加于l個(gè)緩沖液體積中，并在Oxford板上鋪板(未稀釋的和稀釋1:10的)。作為對(duì)照，將第l次和第2次磁性分離后合并的上清液鋪板，并在l夜后計(jì)數(shù)。圖2中描繪了該實(shí)驗(yàn)。可看出的是，通過(guò)化學(xué)生物素化，所有的CBD變得失活，而用通過(guò)JS實(shí)施例3a:用1步方法、2步方法和ISO方法檢測(cè)卡門(mén)培爾干酪(camembert)中的利斯特氏菌在無(wú)菌條件下以25g的分配單位(portionunit)分開(kāi)300g來(lái)自超市的卡門(mén)培爾干酪，并在-80。CI&存在Stomacher袋中。依照規(guī)則ISO:11290-1:1996FDAM1,對(duì)l個(gè)分配(portion)單位分析利斯特氏菌的存在。若沒(méi)有檢測(cè)出利斯特氏菌污染，則在室溫解凍5個(gè)分配單位，并用不同量的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ScottA感染。因此，將過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋1:5，并在37。C溫育至OD600為約l。隨后，在無(wú)菌PBST(20mM磷酸鈉pH7.4,120mM氯化鈉，0.05%Tween)中制備連續(xù)稀釋物。以0、1-10、11-50、50-100和100-500CFU/25g卡門(mén)培爾干酪污染分配單位，并在4。C過(guò)夜貯存。為了精確測(cè)定細(xì)胞^t目，將一式兩份的稀釋物鋪于Oxford瓊脂(ProfosAG)上，將平板在37。C溫育24小時(shí)，并計(jì)數(shù)。在無(wú)菌條件下將225mlFraser!/2培養(yǎng)基(ProfosAG)添加至分配單位，在Stomacher中均漿化l分鐘，并在30。C培育。溫育時(shí)間達(dá)4小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)后，取出lml的每種樣品。1步方法將300pg/ml經(jīng)Strep-標(biāo)簽-CBD511—f2包被的磁性顆粒(DynabeadsEpoxy)添加至lml均漿，并將樣品在室溫在頂置旋轉(zhuǎn)器中溫育20分鐘。2步方法將5嗎Strep-標(biāo)簽-GFP-CBD511—f2融合蛋白添加至lml均漿，并立即混合。隨后將MagPrep-鏈霉抗生物素蛋白顆粒(Merck)添加至50iag/ml，并將樣品在室溫在頂置旋轉(zhuǎn)器中溫育20分鐘。隨后在磁場(chǎng)中在管壁上收集顆粒-利斯特氏菌復(fù)合物，并除去上清液。將顆粒-利斯特氏菌復(fù)合物在頂置旋轉(zhuǎn)器中在lmlPBST(20mM磷酸鈉pH7.4,120mM氯化鈉，0.05%Tween)中清洗3次達(dá)10分鐘，在,茲場(chǎng)中在管壁上收集，并棄去每次的上清液。將顆粒-利斯特氏菌復(fù)合物重懸于10(^1PBST中，并在Oxford瓊脂(ProfosAG)上鋪板。在37。C在24小時(shí)和48小時(shí)后，對(duì)平板計(jì)數(shù)，并以引入細(xì)胞的百分比計(jì)算附著于磁性顆粒的利斯特氏菌的比例。平行地，依照規(guī)則ISO:112卯-l:1996FDAM1，對(duì)受污染的樣品分析利斯特氏菌。因此，在給定的時(shí)間點(diǎn)將100^il添加至10mlFraser培養(yǎng)基(ProfosAG)，在37。C在旋轉(zhuǎn)器中溫育24小時(shí)，隨后在Oxford瓊脂(ProfosAG)上鋪板。一式32四份進(jìn)行所有的樣品。已經(jīng)顯示了，與依照ISO:11290-1:1996的方法(用于檢測(cè)卡門(mén)培爾干酪中較少的利斯特氏菌污染)相比，用1步方法以及2步方法所必需的濃縮時(shí)間顯著更短。對(duì)于富集時(shí)間縮短，2步方法的結(jié)果比1步方法的結(jié)果更好。實(shí)施例3b:從莫澤雷勒干酪(mozzarella)檢測(cè)利斯特氏菌將225mlFDA培養(yǎng)基添加至每塊25g的莫澤雷勒干酪，并將各份額在無(wú)菌條件下在Stomacher袋中勻漿化。將樣品在30。C溫育過(guò)夜。以500CFU/ml的濃度添加利斯特氏菌菌林EGDe(血清型l/2a)和ScottA(血清型4b)。在檢測(cè)利斯特氏菌之前，各用1/10個(gè)體積的PBST對(duì)樣品進(jìn)行緩沖。1步方法將300|ig/ml經(jīng)JS-標(biāo)簽-GFP-CBD511—f3包被的磁性顆粒(DynabeadsM270Epoxy)添加至lml均漿，并將樣品在室溫在頂置旋轉(zhuǎn)器中溫育20分鐘。2步方法將0.5、2、5或10嗎JS-標(biāo)簽-GFP-CBD511—f3融合蛋白添加至lml均漿，并短暫混合。隨后將MagPrep-鏈霉抗生物素蛋白顆粒(Merck)添加至50昭/ml，并將樣品在室溫在頂置旋轉(zhuǎn)器中溫育20分鐘。隨后在磁場(chǎng)中在管壁上收集顆粒-利斯特氏菌復(fù)合物，并除去上清液。將顆粒-利斯特氏菌復(fù)合物在頂置旋轉(zhuǎn)器中在lmlPBST中清洗l次達(dá)10分鐘，在磁場(chǎng)中在管壁上收集，并棄去每份上清液。將顆粒-利斯特氏菌復(fù)合物重懸于100plPBST中，并在Oxford瓊脂(ProfosAG)上鋪板。在37。C在24小時(shí)后，對(duì)平板計(jì)數(shù)，并以使用細(xì)胞的百分比計(jì)算附著于磁性顆粒的利斯特氏菌的比例。所有方法進(jìn)行兩次。已經(jīng)顯示了借助于JS-標(biāo)簽-GFP-CBD511一f3融合蛋白，可從食物中分離利斯特氏菌。對(duì)于莫澤雷勒干酪，這對(duì)菌株EGDe的效果顯著好于對(duì)ScottA的效果。在食物中應(yīng)當(dāng)使用些微較高的蛋白質(zhì)濃度以實(shí)現(xiàn)高結(jié)合效率。實(shí)施例4:JS-標(biāo)簽-CBD的細(xì)胞結(jié)合能力實(shí)施例4a:JS-標(biāo)簽和Avi-標(biāo)簽構(gòu)建體的細(xì)胞結(jié)合能力比較依照2步方法，用利斯特氏菌菌林ScottA測(cè)試不同構(gòu)建體的細(xì)胞結(jié)合能力。使用下列構(gòu)建體JS-GFP_CBD511—f3、JS-CBD511_f3和Avi-Tag-GFP—CBD511—f3。因?yàn)闃?gòu)建體具有不同長(zhǎng)度，所以使用等摩爾量的/ml，并將混合物在室溫在頂置旋轉(zhuǎn)器中溫育20分鐘。隨后在磁場(chǎng)中在管壁上收集顆粒-利斯特氏菌復(fù)合物，并除去上清液。將顆粒-利斯特氏菌復(fù)合物在頂置旋轉(zhuǎn)器中在lmlPBST中清洗1次達(dá)10分鐘，在磁場(chǎng)中在管壁上收集，并棄去每份上清液。將顆粒-利斯特氏菌復(fù)合物重懸于10(VlPBST中，并在Oxford瓊脂(ProfosAG)上鋪板。在37。C在24小時(shí)后，對(duì)平板計(jì)數(shù)，并以引入細(xì)胞的百分比計(jì)算附著于磁性顆粒的利斯特氏菌的比例。所有方法進(jìn)行兩次，并計(jì)算均值。在圖4A中描繪了該實(shí)驗(yàn)?？梢钥闯鯦S-標(biāo)簽構(gòu)建體比Avi-標(biāo)簽構(gòu)建體更好地結(jié)合。這里必須51入顯著較多的蛋白質(zhì)以實(shí)現(xiàn)最大限度的細(xì)胞結(jié)合。實(shí)施例4b:Avi-GFP-CBD511—f2和JS-CBD511—f2的純化在大腸桿菌HMS174中表達(dá)、細(xì)胞收獲、溶胞和硫酸銨沉淀之后，經(jīng)由陽(yáng)離子交換層析來(lái)純化兩種蛋白質(zhì)。共表達(dá)Avi-GFP-CBD511—f2和5/M。實(shí)施例4c:細(xì)胞對(duì)磁性顆粒結(jié)合的濃度依賴已經(jīng)分析哪個(gè)濃度開(kāi)始的特異性結(jié)合蛋白獲得最大P艮度的細(xì)胞結(jié)合。以O(shè)jag/ml、0.02jig/ml、0.1|ag/ml、0.5jig/ml、lpg/ml、2jag/ml和3pg/ml濃度^f吏用作為結(jié)合蛋白的JS-CBD511一f3。以類(lèi)似于實(shí)施例4a的方式進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。在圖4B中描繪了結(jié)果。已經(jīng)顯示，在0.5pg/ml的很低蛋白質(zhì)濃度已經(jīng)實(shí)現(xiàn)基本上100%所有引入細(xì)胞的最大限度細(xì)胞結(jié)合。實(shí)施例5:JS-標(biāo)簽的N端區(qū)域中的核苷酸序列的優(yōu)化雖然已經(jīng)顯示了包含肺炎克雷伯氏菌草乙酸脫羧酶的C端部分的核苷酸序列的JS-標(biāo)簽CBD構(gòu)建體在體內(nèi)被生物素化，但是它們展現(xiàn)非常差的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)率(還可參見(jiàn)表2)。因此，在不改變氨基酸序列的情況下針對(duì)表達(dá)產(chǎn)率優(yōu)化編碼克雷伯氏菌序列的前一些氨基酸的核苦酸序列和我們的細(xì)胞中額外引入的起動(dòng)肽(MVGA)的核苷酸序列。從一整套不同的序列提議中，證明編碼3種不同核苷酸序列的5種變體為是特別適合的。所有變體共同具有的是，與原始序列相比它們是富含AT的，若密碼子的選擇容許這針對(duì)相應(yīng)的氨基酸的話。在表l中匯總了變體(以灰色突出顯示變異)。表l:JS-標(biāo)簽的N端序列區(qū)域的核苷酸變體<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>證明變體JS4a、JS5b、JS5d、JS10a和JS10c為特別適于表達(dá)JS-標(biāo)簽和CBD的融合構(gòu)建體。對(duì)于單一變體之間依賴于所使用CBD部分的表達(dá)有些樣t的差異。然而，基本上所有的都可禎:使用。實(shí)施例6:JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體與祝M的共表達(dá)標(biāo)簽構(gòu)建體是否為必需的。在表達(dá)菌林大腸桿菌BL21(DE3)中在載體Pet21a中表達(dá)構(gòu)建體JS5b-CBD511—f2。若共表達(dá)所M,則額外存在質(zhì)粒pACYC184-BirA。用表達(dá)菌林的過(guò)夜培養(yǎng)物接種新鮮的LB培養(yǎng)基(在2L燒瓶中，總量4L至10L)，在OD6oo為約0.4至0.6用lmMIPTG誘導(dǎo)細(xì)胞，并在4小時(shí)后收獲。誘導(dǎo)期間將50pM生物素額外添加至一部分樣品。每個(gè)構(gòu)建體測(cè)試兩次。收獲后，將細(xì)胞離心，并溶解。通過(guò)分級(jí)硫酸銨沉淀和隨后的陽(yáng)離子交換層析來(lái)實(shí)施純化。在SDS凝膠中證明蛋白質(zhì)的純度。表2:不同JS-標(biāo)簽-CBD熬建體的表達(dá)和純化產(chǎn)率<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>與來(lái)自肺炎克雷伯氏菌的原始序列相比，對(duì)于在核苷酸序列上優(yōu)^f匕的構(gòu)建體JS-5b(參見(jiàn)實(shí)施例5),表達(dá)產(chǎn)率顯著的更好。歷d的共表達(dá)基本上沒(méi)有提高基于引入的細(xì)菌細(xì)胞量的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。在有所n4共表達(dá)的情況中和在沒(méi)有歷M共表達(dá)的情況中用JS-標(biāo)簽構(gòu)建體進(jìn)4于細(xì)胞結(jié)合測(cè)試。在具有利斯特氏菌菌抹ScottA的細(xì)胞結(jié)合測(cè)試中引入JS5b—CBD51l_f2。使用lml具有l(wèi)(^CFU/rnl利斯特氏菌濃度的樣品。作為》茲性顆粒，使用0.05mg/ml濃度的鏈霉抗生物素蛋白-磁性顆粒(Roche)。其它方面依照實(shí)施例3b中所述的2步方法實(shí)施該實(shí)驗(yàn)。分析在有5/d和沒(méi)有說(shuō)h4的情況中以及在添加額外的生物素(50[iM)和不添加額外的生物素的情況中表達(dá)的構(gòu)建體。在圖5中描繪了結(jié)果。實(shí)施例7:細(xì)菌與His-標(biāo)簽-CBD和JS-標(biāo)簽-CBD的結(jié)合的比較自預(yù)培養(yǎng)物新鮮接種蠟狀芽胞桿菌(DSM345),并在30。C在TS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD,為約l。在測(cè)試樣品(lml)中引入3xl()SCFU/ml濃度的細(xì)菌。對(duì)于His-標(biāo)簽構(gòu)建體，緩沖液是鎳緩沖液A(20mM磷酸鈉，500mMNaCl，20mM咪唑，0.1%Tween20,pH7.4);對(duì)于JS-標(biāo)簽構(gòu)建體，緩沖液是PBST。以liag/ml的濃度添加His-標(biāo)簽-CBDBa和JS-標(biāo)簽-CBDBa，以0.12(ig/ml的濃度添加His-標(biāo)簽-CBD21和JS-標(biāo)簽-CBD21，并在室溫溫育5分鐘。隨后，以約8乂106個(gè)顆粒/ml的濃度分別添加Ni-NTA-瓊脂糖珠(Qiagen)和MagPrep-鏈霉抗生物素蛋白珠，滾動(dòng)溫育20分鐘，并用磁力分離器分離5分鐘。用l個(gè)樣品體積的緩沖液清洗磁性顆粒。將含有未結(jié)合細(xì)菌的清洗溶液和上清液以及取出的含有結(jié)合細(xì)菌的磁性顆粒在CASO完全培養(yǎng)基平板上鋪板。在27。C約18小時(shí)后，對(duì)菌落計(jì)數(shù)。各進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)。不含所添加蛋白質(zhì)的方法起對(duì)照作用。在圖6中描繪了該實(shí)驗(yàn)。在給定的條件下用JS-標(biāo)簽構(gòu)建體非常特異性地結(jié)合細(xì)菌，而用His-標(biāo)簽構(gòu)建體，對(duì)于結(jié)合細(xì)胞的產(chǎn)率是完全不足的?；旧蠜](méi)有細(xì)菌對(duì)兩種^F茲性顆粒的非特異性結(jié)合。實(shí)施例8:分別從不同培養(yǎng)基和緩沖液中富集利斯特氏菌分別用Avi-CBD51Lf2和JS-CBD511—f2(各5pg/ml)從不同培養(yǎng)基和PBST緩沖液中富集單核細(xì)胞增生利斯特氏菌EGDe。將利斯特氏菌在TB培養(yǎng)基中溫育至OD6()()為約1，并在給定的培養(yǎng)基或緩沖液中制備其預(yù)稀釋物(predilution)。在測(cè)試中使用1(^CFU/ml濃度的利斯特氏菌。依照2步方法實(shí)施細(xì)胞結(jié)合測(cè)試，其中與50pg/mlMagPrep-鏈霉抗生物素蛋白顆粒(Merck)—起滾動(dòng)溫育20分鐘，并用PBST清洗1次。將結(jié)合的和未結(jié)合的細(xì)胞在Oxford瓊脂上鋪板，并在l晚后計(jì)數(shù)。給出兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)均值。在圖7中描繪了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)施例9:在含有生物素的樣品中細(xì)菌與Strep-標(biāo)簽-CBD和JS-標(biāo)簽-CBD的結(jié)合的比較食物樣品中通常包含生物素。因?yàn)镴S標(biāo)簽以及Strep-標(biāo)簽對(duì)鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合與生物素竟?fàn)?，所以分析哪個(gè)系統(tǒng)在含有生物素的樣品中更為合適，以便特異性富集細(xì)菌。自預(yù)培養(yǎng)物新鮮接種蠟狀芽胞桿菌(DSM345),并在30。C在TS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD,為約1。以lxl(^CFU/ml的濃度將細(xì)菌引入測(cè)試方法(lml)中。作為測(cè)試溶液，使用含有給定生物素濃度(0.01iiM、0.1|iM、lpM)的PBST。以20pg/ml的濃度分別添加JS標(biāo)簽和Strep標(biāo)簽CBDBa,并在室溫與細(xì)菌一起溫育約2分鐘。以50ng/ml的濃度添加鏈霉抗生物素蛋白-PA珠，滾動(dòng)溫育20分鐘，并用磁力分離器分離5分鐘。用l個(gè)樣品體積的緩沖液清洗磁性顆粒。將含有未結(jié)合細(xì)菌的清洗溶液和上清液以及取出的含有結(jié)合細(xì)菌的磁性顆粒在CASO完全培養(yǎng)基平板上鋪板，并在室溫溫育過(guò)夜。在30。C再溫育4小時(shí)后，對(duì)菌落計(jì)數(shù)。各進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)。不含所添加蛋白質(zhì)的樣品起對(duì)照作用。在圖8中描繪了結(jié)果。已經(jīng)顯示了，與較差的結(jié)合Strep-標(biāo)簽系統(tǒng)相比，在含有生物素的樣品中用JS標(biāo)簽系統(tǒng)進(jìn)行的細(xì)胞結(jié)合起顯著更好的作用。在lpM生物素濃度用JS標(biāo)簽仍可檢測(cè)出特異性結(jié)合，而這在相同條件下用Strep標(biāo)簽是不可能的。實(shí)施例10:在不同條件下JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體的長(zhǎng)期穩(wěn)定性將JS-CBD-511—B(約lmg/ml)和鏈霉抗生物素蛋白磁性顆粒(約lmg/ml)的儲(chǔ)液在給定的條件下溫育，并引入含有利斯特氏菌的細(xì)胞結(jié)合測(cè)試中。lml測(cè)試(PBST緩沖液)中的磁性顆粒濃度是5(Hig/ml，蛋白質(zhì)濃度如給定的，而所使用的細(xì)菌數(shù)目是10tFU/ml。實(shí)施例10a:將結(jié)合蛋白和磁珠在-20。C、4°C、RT(約23。C)和37。C在100mM磷酸鈉，pH6-7，2mMEDTA中貯存長(zhǎng)達(dá)126天，并在利斯特氏菌結(jié)合測(cè)試中以給定濃度使用?？煽闯觯瑑H在126天后且主要在37。C溫育的該情況中，結(jié)合功效顯著降低。實(shí)施例10b:將結(jié)合蛋白和磁性顆粒在-20。C、4°C、RT(約23。C)和37。C在加有30。/。硫酸銨的10mM咪唑，pH7，100mMNaCl中貯存長(zhǎng)達(dá)74天，并在利斯特氏菌結(jié)合測(cè)試中以給定濃度使用。可看出，溫育74天后結(jié)合功效在所有的溫度均些微降低，但仍超過(guò)50%。看來(lái)兩種緩沖系統(tǒng)都適于JS-CBD構(gòu)建體和合適的鏈霉抗生物素蛋白磁性顆粒的長(zhǎng)期溫育。在圖9中描繪了結(jié)果。實(shí)施例ll:從不同食物中富集利斯特氏菌在圖10中描繪了該實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例11a:將單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ScottA的過(guò)夜培養(yǎng)物在FDA-Oxoid培養(yǎng)基中以l:5稀釋，并在37。(:培養(yǎng)至006()()為約1。分別將牛奶和均漿化奶酪在PBST中以1:10稀釋，并用l(^CFU/ml濃度的利斯特氏菌接種。以給定的濃度將JS4a-CBD511—f2添加至Eppendorf杯，并與各lml樣品溶液混合。作為磁性顆粒，以50pig/ml的濃度使用鏈霉抗生物素蛋白磁性顆粒(Roche),并將樣品在頂置旋轉(zhuǎn)器中溫育10分鐘。在磁力分離器中將磁性顆粒分離5分鐘，隨后用lmlPBST緩沖液清洗1次，并在lml緩沖液中處理。將100^d未稀釋的和1:10稀釋的珠級(jí)分和合并的上清液(在第l次磁性分離和清洗步驟之后)在Oxford瓊脂上鋪板，并在37。C溫育過(guò)夜。第2天對(duì)利斯特氏菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算多少百分比的所發(fā)現(xiàn)細(xì)菌經(jīng)由JS4a-CBD511—f2結(jié)合至磁珠。已經(jīng)顯示了，在0,2jig/ml特異性結(jié)合蛋白濃度的JS4b-CBD51Lf2已經(jīng)從牛奶以及從奶酪中基本上完全除去引入的利斯特氏菌細(xì)胞。在0.02(ig/ml的很低蛋白38質(zhì)濃度已經(jīng)可除去50%的細(xì)菌。實(shí)施例llb:將各25g熏制鮭魚(yú)和薩拉米香腸均漿化，用LEB-FDA培養(yǎng)基稀釋1:10，并用1(^CFU/ml濃度的無(wú)害利斯特氏菌接種，并在室溫在Stomacher袋中溫育l小時(shí)。將所使用的細(xì)菌稀釋物作為對(duì)照鋪板。取出Stomacher袋中的各lml濾液樣品，并與JS5b-CBD511—f3(l嗎/ml)混合。不向?qū)φ仗砑拥鞍踪|(zhì)。隨后立即添加400jxg/mlPA-鏈霉抗生物素蛋白珠，并在頂置旋轉(zhuǎn)器中溫育20分鐘。將磁性顆粒在磁力分離器中分離5分鐘，隨后用PBST緩沖液清洗l次，并再次在lml緩沖液中處理。將100fil未稀釋的和l:10稀釋的珠級(jí)分和合并的上清液(在第1次》茲性分離和清洗步驟之后)在Oxford瓊脂上鋪板，并在37。C溫育過(guò)夜。第2天對(duì)利斯特氏菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算各有多少百分比的找到細(xì)菌經(jīng)由JS5b-CBD511—f3結(jié)合至磁性顆粒。已經(jīng)顯示了，可從熏制鮭魚(yú)以及薩拉米香腸中結(jié)合超過(guò)卯％的細(xì)菌。實(shí)施例12:用NASBA技術(shù)從食物中檢測(cè)利斯特氏菌將單核細(xì)胞增生利斯特氏菌ScottA的過(guò)夜培養(yǎng)物在LEB-FDA培養(yǎng)基中稀釋1:5，并在37。C培養(yǎng)至OD,為約l。制備其高達(dá)l(^CFU/ml的連續(xù)稀釋物。對(duì)2x60g薩拉米香腸稱重，并用5CFU/25g食物的濃度的利斯特氏菌污染。對(duì)于每塊60g樣品，添加540mlLX培養(yǎng)基(BioMerieux)，將樣品均漿化，并在37。C在Stomacher袋中分別溫育17小時(shí)和20小時(shí)。隨后，在來(lái)自Stomacher袋的上清液的lml樣品中用JS5b-CBD511一f2捕獲細(xì)菌。另外對(duì)上清液進(jìn)行鋪板，并作為對(duì)照計(jì)數(shù)。以l昭/ml的濃度添加結(jié)合蛋白，并與樣品一起溫育l分鐘。隨后，以400ng/ml的濃度添加PA鏈霉抗生物素蛋白磁性顆粒，并在過(guò)夜旋轉(zhuǎn)器中溫育20分鐘。將磁性顆粒在磁力分離器中分離5分鐘，隨后每次用lmlTT緩沖液(50mMTris，pH8.0,0.1%Tween20)清洗3次。將一部分具有結(jié)合細(xì)菌的磁性顆粒在Oxford瓊脂上鋪板，并在溫育15至20小時(shí)后計(jì)數(shù)以獲得結(jié)合功效。在圖(圖11)的部分A中描繪了結(jié)果。引入一部分具有經(jīng)由JS-標(biāo)簽-CBD結(jié)合的利斯特氏菌的磁性顆粒以在NASBA中檢測(cè)。將珠子上的細(xì)胞用5jig/ml在10(V1溶解緩沖液A(21%DMSO，57mMTris，0.4%TritonX100)中的利斯特氏菌特異性內(nèi)溶素在室溫溶解15分鐘。隨后，在磁力分離器中對(duì)磁珠分離5分鐘，并且每個(gè)NASBA反應(yīng)使用14pl溶胞產(chǎn)物。使用已經(jīng)攜帶預(yù)先制備的(precasted)利斯特氏菌特異性引物珠的測(cè)試紙條(各針對(duì)8個(gè)樣品)。對(duì)于每個(gè)樣品，添加5pl用于NASBA的酶溶液，并依照制造商的方案進(jìn)行反應(yīng)。作為NASBA系統(tǒng)，一起使用NuclisensEasyQ分析器(BioMerieux)與相應(yīng)的加熱塊(thermo-block)。以時(shí)間依賴性熒光信號(hào)評(píng)估數(shù)據(jù)。在成功的檢測(cè)反應(yīng)后，在約30分鐘的檢測(cè)時(shí)間之后熒光信號(hào)升高至較高的水平，并保持在那里。每個(gè)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行7個(gè)NASBA反應(yīng)。在圖llb中描繪了NASBA檢測(cè)(在溫育17小時(shí)后)?？煽闯鲈谒?個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)出陽(yáng)性焚光信號(hào)，因此經(jīng)由特異性RNA引物進(jìn)行的利斯特氏菌檢測(cè)已經(jīng)起作用。已經(jīng)顯示了，在所述系統(tǒng)中在食物與5CFU/25g濃度的利斯特氏菌一起溫育17小時(shí)后，已經(jīng)可結(jié)合超過(guò)99%的細(xì)菌并可檢出。檢測(cè)經(jīng)由常規(guī)選擇性平板(參見(jiàn)圖lla)以及經(jīng)由如NASBA的基于核酸的方法(其在捕獲細(xì)菌后僅持續(xù)約2.5小時(shí))(參見(jiàn)圖llb)常規(guī)地運(yùn)行。用熏制鮭魚(yú)、蝦、布里干酪(brie)、火雞肉和豬肉香腸和來(lái)自山羊的奶油奶酪也成功地進(jìn)行相當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。實(shí)施例13:自桿菌內(nèi)溶素衍生的JS-標(biāo)簽-CBD的特異性細(xì)胞結(jié)合對(duì)于所有的細(xì)菌菌抹，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)物。將過(guò)夜培養(yǎng)物在完全培養(yǎng)基(例如CASO、LB、TS、TY)中接種1:20至1:5，并進(jìn)一步培養(yǎng)至0D,為約1。所有桿菌細(xì)菌的生長(zhǎng)溫度是30。C，所有其它菌林的生長(zhǎng)溫度是37。C。自預(yù)培養(yǎng)物制備稀釋系列。在測(cè)試方法(500pl的體積)中，以1()S至1(^CFU的濃度使用細(xì)菌。為了測(cè)定每個(gè)所使用稀釋物的準(zhǔn)確細(xì)胞數(shù)目，將相應(yīng)的對(duì)照鋪板，并計(jì)數(shù)。分別以l(Vg/ml和lpg/ml的濃度各將JS-標(biāo)簽-CBDBa和JS-標(biāo)簽-CBD21添加至測(cè)試方法(緩沖液PBST)，并與細(xì)胞一起溫育約1分鐘。隨后，以50嗎/ml的濃度添加先前用CASO-Tween(0.1%)溶液封閉的MagPrep-鏈霉抗生物素蛋白顆粒(Merck)。將含有細(xì)菌、結(jié)合蛋白和磁性顆粒的樣品在頂置旋轉(zhuǎn)器中在室溫溫育20分鐘。將石茲性顆粒在^F茲力分離器中分離5分鐘，隨后用lmlPBST清洗l次，隨后在緩沖液中重懸。在磁性分離后將各100fil含有結(jié)合細(xì)胞的重懸珠級(jí)分和合并的上清液級(jí)分及清洗溶液鋪板。干燥后，將平板在相應(yīng)的生長(zhǎng)溫度溫育過(guò)夜，在第2天早晨計(jì)數(shù)，并由相應(yīng)的稀釋因子校正。分別給出多少百分比的總結(jié)合細(xì)菌經(jīng)由JS-標(biāo)簽-CBD而特異性結(jié)合至磁性顆粒和多少百分比的總結(jié)合細(xì)菌與樣品分開(kāi)。針對(duì)細(xì)菌對(duì)磁性顆粒的潛在非特異性結(jié)合，不含所添加特異性結(jié)合蛋白的樣品起對(duì)照作用。作為進(jìn)一步的對(duì)照，也進(jìn)行鋪板和計(jì)數(shù)的細(xì)菌預(yù)稀釋物用作預(yù)期細(xì)胞數(shù)目。僅評(píng)估如下實(shí)驗(yàn)，其顯示回收細(xì)胞的總數(shù)范圍為總使用細(xì)胞的80%至120%。每個(gè)測(cè)試進(jìn)行2至4個(gè)實(shí)驗(yàn)。表3中描述了與不同桿菌菌林和其它革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌以及革蘭氏陰性細(xì)菌的相應(yīng)結(jié)合數(shù)據(jù)的概述。表3:在細(xì)胞結(jié)合測(cè)定法中JS-CBDBa和JS-CBD21對(duì)不同細(xì)菌菌林的結(jié)合能力<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>_i_一_;:_^_^_、ProCC:PROFOS培養(yǎng)物中心；結(jié)合00/。墨；<10%:o;10%-30%:+;30%-60%:++;60%-100%:+++如所預(yù)期的，兩種CBD都沒(méi)有顯示對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的結(jié)合。然而，兩者都自蠟狀芽孢桿菌噬菌體分離的CBD的結(jié)合特異性是出乎預(yù)料的完全不同的。已經(jīng)顯示了，CBDBa^"來(lái)自蠟狀芽孢桿菌群的桿菌是非常特異的。除該群之外僅2種鏈球菌菌抹被識(shí)別。然而，CBD21展現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌特別寬的結(jié)合特異性。蠟狀芽孢桿菌群的所有代表都受到結(jié)合，另外還有除球形芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌外的所有別的測(cè)試桿菌。特殊的是，來(lái)自其它科的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌也受到結(jié)合。6種所測(cè)試的科均被識(shí)別，所述測(cè)試的科的特征在于它們展現(xiàn)出高的病原體潛力。因此，CBD21特別適于在病原體細(xì)菌造成問(wèn)題的不同領(lǐng)域中富集、除去和檢測(cè)所述病原體細(xì)菌。與進(jìn)一步測(cè)試的片段(其也衍生自內(nèi)溶素plyB21)相比，本文所述片段(SEQIDNO:19)以提高的穩(wěn)定性和降低的聚集易感性為特征。實(shí)施例14:從細(xì)菌混合物中特異性結(jié)合蠟狀芽孢桿菌在下列細(xì)菌的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)物蠟狀芽孢桿菌(DSM345)、田納西沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(ScottA)、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌HMS174(DE3)。在新鮮培養(yǎng)基中接種過(guò)夜培養(yǎng)物，并分別在37。C和30°C(桿菌)培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD6oo為約l。在該測(cè)試中以約l(^CFU/ml的稀釋使用所述菌株。將相應(yīng)的稀釋物作為對(duì)照鋪板，并計(jì)數(shù)。測(cè)試混合物具有l(wèi)ml,并在PBST(20mM磷酸鈉，120mMNaCl，pH7.4，0.1%Tween20)中進(jìn)行。作為特異性結(jié)合蛋白，以20昭/ml的濃度提供JS-標(biāo)簽-CBDBa。對(duì)于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，僅添加PBST替代蛋白質(zhì)。各添加10^il細(xì)菌預(yù)稀釋物，使得在每種樣品中的細(xì)菌濃度是約l()SCFU/ml。將細(xì)菌與細(xì)胞一起溫育l分鐘。隨后，添加100|ag/mlPA-鏈霉抗生物素蛋白^茲珠(Microcoat)，并將樣品在室溫滾動(dòng)溫育20分鐘。將磁性顆粒在磁力分離器中收集5分鐘，并取出上清液。用lmlPBST將分離的磁性顆粒清洗1次達(dá)5分鐘。合并清洗溶液和上清液。再次用PBST將磁珠補(bǔ)足至lml。將各來(lái)自不同稀釋物的100nl鋪板，一方面在CASO平板(酪蛋白、大豆提取物；完全培養(yǎng)基，Merck)上而另一方面在PEMBA平板44(針對(duì)蠟狀芽孢桿菌的選擇性培養(yǎng)基，含有多粘菌素B、蛋黃、甘露醇)上，并在27。C溫育約18小時(shí)，隨后計(jì)數(shù)。從2個(gè)實(shí)驗(yàn)各測(cè)定2個(gè)均值。回收細(xì)胞的總數(shù)源自于結(jié)合至磁性顆粒的細(xì)胞和分別保留在上清液和清洗溶液中的細(xì)胞的總數(shù)。鋪板的細(xì)胞稀釋物用作對(duì)照。在圖12中描繪了結(jié)果。已經(jīng)顯示了，僅在添加特異性CBD之后才從樣品中富集蠟狀芽孢桿菌，而在不添加蛋白質(zhì)的情況中，細(xì)菌沒(méi)有被結(jié)合至磁性顆粒。還顯示了，僅蠟狀芽孢桿菌經(jīng)由珠子而被結(jié)合，而其它細(xì)菌僅在其上鋪有上清液的CASO平板上生長(zhǎng)。實(shí)施例15:從含有碳7jc化合物的食物中富集蠟樣芽胞桿菌作為食物樣品，使用預(yù)煮的快熟米(expressrice)(上等的長(zhǎng)粒度快熟米，UncleBen、s)。在無(wú)菌條件下將5g預(yù)煮的快熟米及50mlTSPB培養(yǎng)基(含有0.01mg/ml多粘菌素B的TS完全培養(yǎng)基)轉(zhuǎn)移至Stomacher袋中，并均漿化l分鐘。將蠟狀芽孢桿菌(DSMZ345)的過(guò)夜培養(yǎng)物在30。C在TS培養(yǎng)基中溫育。將2ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至10ml新鮮的TSPB培養(yǎng)基中，并溫育，直至達(dá)到OD600=0.8。向990(xl來(lái)自Stomacher袋濾液的食物樣品摻入l(Vl每種不同稀釋度的桿菌預(yù)培養(yǎng)物，使得食物樣品中的桿菌濃度是102、103、或10tFU/ml。將TSPB培養(yǎng)基摻入作為對(duì)照。在室溫溫育5分鐘后，每個(gè)樣品添加10(igJS-標(biāo)簽-CBDBa，并充分混合。對(duì)照樣品沒(méi)有獲得蛋白質(zhì)。在約l分鐘后，添加400嗎鏈霉抗生物素蛋白PA磁珠(Microcoat),并將樣品在室溫滾動(dòng)溫育20分鐘。將磁珠在磁力分離器中收集5分鐘，并取出上清液。用lmlPBST清洗分離的磁性顆粒2次每次5分鐘。合并清洗溶液及上清液。再次用PBST將磁珠補(bǔ)足至lml。將各100(al不同稀釋度的樣品與磁性顆粒及與上清液分別鋪至選擇性PEMBA平板上，隨后在30。C溫育過(guò)夜，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)。各平行鋪于2塊平板。在圖13中描繪了結(jié)果。顯示基本上所有來(lái)自食物樣品以及來(lái)自TSPB培養(yǎng)基的蠟樣芽胞桿菌細(xì)胞選擇性結(jié)合至JS-標(biāo)簽-CBDBa，隨后結(jié)合至磁性顆粒，而在上清液中和在清洗溶液中，幾乎沒(méi)有蠟樣芽胞桿菌細(xì)胞剩余。在不含蛋白質(zhì)的對(duì)照樣品中，桿菌沒(méi)有非特異性結(jié)合至^f茲性顆粒。實(shí)施例16:從血液中富集蠟狀芽孢桿菌在TB培養(yǎng)基中在30。C培養(yǎng)蠟狀芽孢桿菌(DSMZ345)過(guò)夜。將新鮮TB培養(yǎng)基接種I:IO,并培養(yǎng)細(xì)菌至OD6Qo為約l。將各0.5ml檸檬酸鹽、EDTA或肝素血液各與0.5mlPBST混合。血液中的所有添加物起抗凝劑的作用。檸檬酸鹽-血液用血液將0.106M檸檬酸鹽稀釋1:10。EDTA-血液1.2-2mgEDTA/ml血液。肝素血液10-30I.U.肝素/ml血液。將10pl蠟狀芽孢桿菌預(yù)培養(yǎng)物摻入lml緩沖血液樣品，使得細(xì)菌濃度是約l(^CFU/ml。因此，添加5plJS-標(biāo)簽《8021蛋白質(zhì)溶液(211^/1111),并短暫渦旋。對(duì)照沒(méi)有獲得蛋白質(zhì)。隨后，添加40(il磁性顆粒(鏈霉抗生物素蛋白-PA珠，Microcoat,10mg/ml)，并將樣品在室溫滾動(dòng)溫育20分鐘。將磁性顆粒在磁力分離器中分離5分鐘。取出含有未結(jié)合細(xì)菌的上清液，并用lmlPBST清洗珠子l次(5分鐘)。在磁性分離后合并清洗溶液和上清液。將lmlPBST添加至含有JS-標(biāo)簽-CBD和細(xì)菌的結(jié)合復(fù)合物的石茲珠。將各100)all:10稀釋的合并上清液和包含/f茲性顆粒的溶液在選擇性PEMBA平板上鋪板，并溫育約18小時(shí)，并計(jì)數(shù)。各用2個(gè)實(shí)驗(yàn)形成均值。在圖14中描繪了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。已經(jīng)顯示了，借助于JS-標(biāo)簽-CBD21，幾乎所有來(lái)自血液的桿菌都可被除去。在不含蛋白質(zhì)的對(duì)照中已經(jīng)顯示了，僅對(duì)于包含肝素的血液樣品，出現(xiàn)一定百分比(約25%)的對(duì)^磁性顆粒的非特異性結(jié)合。對(duì)于檸檬酸鹽血液和EDTA血液，非特異性結(jié)合的比例是非常低的。實(shí)施例17:用CBD3626的JS-標(biāo)簽構(gòu)建體結(jié)合梭菌基于文獻(xiàn)(Zimmer等，2002，Appl.Environm.Microbiol.，68，5311-5317)中所述產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體03626的內(nèi)溶素Ply3626,用分子生物學(xué)技術(shù)制備具有JS標(biāo)簽的潛在合適的CBD3626的不同變體。因?yàn)殚_(kāi)始時(shí)所有構(gòu)建體的表達(dá)是很差的，所以制備根據(jù)梭菌和大腸桿菌中不同的密碼子應(yīng)用而優(yōu)化的合成基因。證明了用His標(biāo)簽克隆的常規(guī)變體僅具有很差的可溶性；然而，具有JS標(biāo)簽的變體具有較好的可溶性。在表4中匯總了如下變體，其證明為適于穩(wěn)定表達(dá)，并為可溶的，使得它們隨后可被純化，并用于含產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞的功能性結(jié)合測(cè)試。在載體Pet21d中實(shí)施克隆。在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中在共表達(dá)另一個(gè)質(zhì)粒上的&M的情況下在30。C在菌林大腸桿菌HMS174中實(shí)施表達(dá)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>對(duì)于結(jié)合測(cè)試，在厭氧盒中在TYG培養(yǎng)基(胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖)中在45。C培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌的預(yù)培養(yǎng)物過(guò)夜。在室溫在lmlPBST緩沖液中進(jìn)行結(jié)合測(cè)試。以約l(^CFU/ml的濃度提供梭菌細(xì)胞，并以25pg/ml的濃度添加不同的JS-標(biāo)簽-CBD3626構(gòu)建體，混合，并溫育約2分鐘。隨后，以100ng/ml的濃度添加PA-鏈霉抗生物素蛋白珠(Microcoat)，并滾動(dòng)溫育10分鐘。從每個(gè)包含作為標(biāo)志物的GFP的CBD構(gòu)建體中取出樣品，并在熒光顯微鏡下對(duì)結(jié)合進(jìn)行分析。圖15中描繪了結(jié)果。實(shí)施例18:用特異性JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體結(jié)合葡萄球菌將葡萄球菌菌抹的過(guò)夜培養(yǎng)物在BHI培養(yǎng)基中稀釋l:lO，并在30。C溫育至OD綱為約l。將細(xì)胞在培養(yǎng)基中稀釋，并以10tFU/ml的濃度在測(cè)試(測(cè)試方法500pl，PBST緩沖液)中使用。以10嗎/ml的濃度添加特異性結(jié)合蛋白JS5b—CBDUSA,并在室溫與細(xì)胞一起溫育20分鐘。隨后，以200ng/ml的濃度添加PA-鏈霉抗生物素蛋白珠(Microcoat),并在頂置旋轉(zhuǎn)器中溫育45分鐘。將含有結(jié)合細(xì)胞的磁性顆粒在磁性分離器中分離5分鐘，用lml緩沖液清洗l次，并再次重懸于500pl緩沖液中。將磁性顆粒和合并的上清液在CASO平板上鋪板，并在37。C溫育過(guò)夜?？稍?6小時(shí)后對(duì)具有金黃色葡萄球菌和溶血葡萄球菌的平板計(jì)數(shù)，直至24小時(shí)后才對(duì)具有表皮葡萄球菌的平板計(jì)數(shù)。與總共找到的細(xì)菌比較，分析結(jié)合葡萄球菌的比例。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>0/o細(xì)胞結(jié)合<10%:o;10%-25%:+;25%-50%:++;>50%:+++通過(guò)JS5b-CBDUSA構(gòu)建體，可結(jié)合不同的葡萄球菌菌抹，其中金黃色葡萄球菌最好地結(jié)合。實(shí)施例19:在珠-sb-結(jié)合測(cè)試中具有CBD和JS標(biāo)簽的依照本發(fā)明的多肽構(gòu)建體比具有Strep標(biāo)簽和His標(biāo)簽組合(NS-HIS)的CBD顯著更好地結(jié)合葡萄球菌細(xì)胞在細(xì)胞結(jié)合測(cè)試中與實(shí)施例18類(lèi)似地實(shí)施該實(shí)驗(yàn)。與包含用于生物素結(jié)合的Strep標(biāo)簽以及His標(biāo)簽(組合NS-His)的構(gòu)建體相比，使用CBDPitti26細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:28)的依照本發(fā)明的JS-標(biāo)簽多肽構(gòu)建體。CBD構(gòu)建體分別具有在N端的NS-His標(biāo)簽和JS標(biāo)簽(變體5b),接著有接頭序列(AGAGAGAGSEL)和CBDPitti26序列。Pitti26是葡萄球菌噬菌體的自我分離林(self-isolate)。測(cè)試之前才透析多肽構(gòu)建體，使用UV吸收測(cè)量來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并在測(cè)試中以10嗎/ml的濃度使用蛋白質(zhì)。在表6中描述了對(duì)3種不同的葡萄球菌菌林的結(jié)合行為。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>通過(guò)依照本發(fā)明的JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體，可在所有3種葡萄球菌菌林上檢測(cè)出細(xì)胞結(jié)合，即使顯著優(yōu)選表皮葡萄球菌細(xì)胞，而對(duì)于僅針對(duì)表皮葡萄球菌細(xì)胞的具有Strep標(biāo)簽和His標(biāo)簽的構(gòu)建體，在相同條件下僅可實(shí)現(xiàn)很弱的結(jié)合。這顯示了依照本發(fā)明的構(gòu)建體比偶聯(lián)有其它標(biāo)簽的CBD顯著更好地適用于結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞。實(shí)施例20:在細(xì)胞結(jié)合測(cè)試中通過(guò)葡萄球菌特異性JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體檢測(cè)葡萄球菌結(jié)合與實(shí)施例18中所述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類(lèi)似地，在使用3種不同的葡萄球菌特異性JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體的情況下測(cè)試許多不同的葡萄球菌菌抹。不同構(gòu)建體的CBD部分分別衍生自噬菌體OSA2usa-JS-CBDUSA和來(lái)自噬菌體自我分離林的內(nèi)溶素PlyOpf—JS-CBDOpf;和PlyPitti20—JS-CBDPitti20。分別可在SEQIDN021、31、和27下找到多肽序列。在圖16中描繪了該實(shí)5^的結(jié)果。在珠結(jié)合測(cè)試中，依照本發(fā)明的多肽構(gòu)建體JS-CBDUSA、JS-CBDOpf和JS-CBDPitti20特異性結(jié)合許多葡萄球菌菌抹。由此，金黃色葡萄球菌MRSA菌抹與非MRSA菌抹類(lèi)似良好地被結(jié)合(圖16A)。然而，可注意到傾向性地，JS-CBDOpf更好地結(jié)合MRSA菌抹，而JS-CBDUSA更好地結(jié)合非MRSA菌抹。圖16B總結(jié)了3種依照本發(fā)明的葡萄球菌JS-CBD構(gòu)建體對(duì)一組別的葡萄球菌菌抹(其不屬于金黃色葡萄球菌種類(lèi))的結(jié)合。由此，肉葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和馬胃葡萄球菌種類(lèi)的菌林(具有一個(gè)例外)不被特異性結(jié)合，比較而言，表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌、模仿葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌種類(lèi)的菌林被特異性結(jié)合。這顯示了所使用的依照本發(fā)明的JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體適于特異地且高效地結(jié)合大量的人病原體葡萄球菌菌林。實(shí)施例21:借助于過(guò)氧化物酶測(cè)試來(lái)檢測(cè)細(xì)胞與JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體的結(jié)合過(guò)氧化物酶測(cè)試基于如下原理，即測(cè)量信號(hào)4又可在所<吏用的StrepTactin-HRP(,束才艮過(guò)氧化物酶)偶聯(lián)物(IBA,G6ttingen)經(jīng)由StrepTacin部分而結(jié)合至生物素時(shí)才檢出。將此生物素共價(jià)結(jié)合至依照本發(fā)明的多肽構(gòu)建體的生物素化JS標(biāo)簽，接著在實(shí)驗(yàn)方法中所述多肽構(gòu)建體特異性結(jié)合至細(xì)菌細(xì)胞，因此存在于離心步驟中保留的沉淀級(jí)分中。未結(jié)合的JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體會(huì)與相應(yīng)的離心上清液一起棄去，因此不會(huì)給出信號(hào)。在過(guò)氧化物酶測(cè)試中使用前，將依照本發(fā)明的JS-標(biāo)簽-多肽構(gòu)建體針對(duì)TE緩沖液(20mMTris,50mMNaCl，5mMEDTA;pH7.0)透析過(guò)夜，隨后經(jīng)由UV吸收依靠比消光系數(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)在37。C各與600^dPBST—起溫育1小時(shí)來(lái)封閉微量滴定板(深孔)。隨后，分別將各200pl細(xì)菌預(yù)培養(yǎng)物和BHI培養(yǎng)基(作為對(duì)照)移入孔中，并分別添加相應(yīng)量的蛋白質(zhì)溶液(蛋白質(zhì)濃度10iig/ml)和緩沖液(作為對(duì)照)，并在室溫溫育15分鐘。各進(jìn)行三次測(cè)定。溫育后，將平板在臺(tái)式離心機(jī)中在4。C離心10分鐘(3，600rpm)，取出上清液，棄去，并用200^1PBST再次清洗沉淀物。隨后，將沉淀物重懸于200plStrepTactin-HRP偶聯(lián)物溶液(PBST中1:5000稀釋的)中，并在室溫溫育30分鐘。再次離心樣品，用各200nlPBST清洗2次，每次棄去由此獲得的上清液。在第2次清洗步驟之后，將每個(gè)沉淀物在200plABTS反應(yīng)溶液中處理，并且在最大限度30分鐘里經(jīng)由405nm處的吸收(通過(guò)600nm處的背景吸收校正)來(lái)測(cè)量顏色反應(yīng)。ABTS反應(yīng)溶液由如下成分組成18mlMc-Ilvains緩沖液(0.1M檸檬酸、0,2MNa2HP04,pH5.0)加上2ml在水中的1%ABTS(2,2-連氮基-二(3-乙基)苯并遙哇啉-6-石黃酸)(2,2azino-bis(3-ethyl)benzthiazolin6-sulfonacid)力口上100plH2O2(1%溶液)。在圖17中描繪了通過(guò)使用不同的依照本發(fā)明的CBD構(gòu)建體進(jìn)行的過(guò)氧化物酶測(cè)試的結(jié)果。JS-CBDOpf和JS-CBDPitti20是來(lái)自葡萄球菌噬菌體自我分離抹的CBD構(gòu)建體。JS-CBDUSA衍生自噬菌體OSA2usa。構(gòu)建體JS-CBDALE-1和JS-CBDLS中的溶葡萄球菌酶(staphylolyticenzyme)ALE-1和溶葡萄球菌素的CBD部分分別衍生自細(xì)菌菌林頭狀葡萄球菌EPK1和模仿葡萄球菌。然而，合成制備相應(yīng)的基因，并使之適于大腸桿菌密碼子用法以更好地表達(dá)蛋白質(zhì)。如圖17A中所示，JS-CBDALE-1(SEQIDNO:50)和JS-CBDLS(SEQIDNO:49)特異性且以高功效結(jié)合不同的凝固酶陽(yáng)性金黃色葡萄球菌菌株(MRSA和非MRSA)以及凝固酶陰性表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌。兩種JS-標(biāo)簽構(gòu)建體均以大體相似的功效結(jié)合葡萄球菌。圖17B描繪了在過(guò)氧化物酶測(cè)試中依照本發(fā)明的多肽JS-CBDALE-1(SEQIDNo50)、JS畫(huà)CBDLS(SEQIDNo49)、JS-CBDPitti20(SEQIDNo47)、JS-CBDOpf(SEQIDNo51)以及JS-CBDUSA(SEQIDNo46)特異性結(jié)合不同葡萄球菌菌抹諸如金黃色葡萄球菌(MRSA和非MRSA)和溶血葡萄球菌菌抹，而不結(jié)合革蘭氏陰性的大腸桿菌菌抹，而且也不結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性病原體菌林變異鏈球菌。特別強(qiáng)調(diào)的是由多肽構(gòu)建體JS-CBDPitti20產(chǎn)生了強(qiáng)烈細(xì)胞結(jié)合。實(shí)施例22:借助于過(guò)氧化物酶測(cè)試來(lái)檢測(cè)細(xì)胞與腸球菌特異性JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體的結(jié)合如實(shí)施例21中所述的那樣實(shí)施過(guò)氧化物酶測(cè)試。在圖18中描繪了通過(guò)使用不同的依照本發(fā)明的CBD構(gòu)建體進(jìn)行的過(guò)氧化物酶測(cè)試的結(jié)果。中CBD衍生自2種推定的原噬菌體內(nèi)溶素，它們分別可在完全公布的菌抹糞腸球菌V583基因組(登錄號(hào)NC—004668)中在基因座標(biāo)簽EF—0355和EF—1293下找到。然而，合成制備相應(yīng)的基因，并使之適于大腸桿菌密碼子用法以更好地表達(dá)蛋白質(zhì)。這樣獲得CBD，使得從完整的內(nèi)溶素序列中刪除EAD的保守結(jié)構(gòu)域，隨后用序列分析軟件尋找蛋白質(zhì)內(nèi)潛在的結(jié)構(gòu)域接頭。作為JS標(biāo)簽和CBD之間的新接頭，隨后引入序列AGAGAGAGSEL(SEQIDNo.35)。在測(cè)試中使用10pg/mlJS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體。在圖18中描繪了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖18A顯示了在過(guò)氧化物酶測(cè)試中所有測(cè)試的糞腸球菌被特異性結(jié)合，因?yàn)闆](méi)有添力口JS-標(biāo)簽-CBD構(gòu)建體的對(duì)照給出顯著較低的測(cè)量信號(hào)。兩種構(gòu)建體JS-CBDEF0355和JS-CBDEF1293對(duì)大多數(shù)菌林都給出非常相似的結(jié)果。圖18B顯示了測(cè)試的屎腸球菌菌株被特異性結(jié)合，雖然它們部分給出些微較低的吸收信號(hào)。還以良好的功效結(jié)合一種金黃色葡萄球菌菌林，因此對(duì)腸球菌種類(lèi)的結(jié)合不是非常特異性的。然而，從Yoong等(J.Bact.,2004，186，4808-4812)中已經(jīng)知道該行為，其中已經(jīng)顯示了除腸球菌之外，還結(jié)合鏈球菌禾口葡萄球菌。5權(quán)利要求1.一種多肽，其包含i)內(nèi)溶素或另一種細(xì)胞壁溶解酶的無(wú)酶促活性的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和ii)依照SEQIDNO1的序列或其衍生物，其中除所述細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，所述多肽不包含內(nèi)溶素或另一種細(xì)胞壁溶解酶的別的結(jié)構(gòu)域。2.根據(jù)權(quán)利要求l的多肽，其中所述另一種細(xì)胞壁溶解酶選自下組自溶素、細(xì)菌素和噬菌體尾部蛋白質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述SEQIDNO:1的衍生物是SEQIDNO:2-18中的序列之一。4.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽是生物素化的。5.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽的或所述另一種細(xì)胞壁溶解酶的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域展現(xiàn)出結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的能力。6.根據(jù)權(quán)利要求5的多肽，其中所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌選自下組梭菌、桿菌、利斯特氏菌、葡萄球菌、乳桿菌、腸球菌、氣球菌、足球菌、鏈球菌、枝原體和/或明串珠菌。7.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自下組內(nèi)溶素或其它細(xì)胞壁溶解酶的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域Ply511、Ply500、Plyl18、PlyPSA、EGDe、PlyL、PlyG、PlyPH、PlyB、PlyBa、Ply21、Plyl2、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)V583原噬菌體內(nèi)溶素、Ply3626、來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌菌林13和菌林SM101的溶素、OPl溶素、PlyV12、PlyC、PlyGBS、Cpl-l、Cpl-7、Cpl-9、Pal酰胺酶、Twort酰胺酶、金黃色葡萄球菌(S.aureus)噬菌體PVL酰胺酶、P68lysl6、OSA2usa內(nèi)溶素、Phill和Phil2內(nèi)溶素、金黃色葡萄球菌噬菌體Phill的細(xì)胞壁水解作用、噬菌體B30內(nèi)溶素、噬菌體168內(nèi)溶素、LysK、模仿葡萄球菌溶葡萄球菌素、頭狀葡萄球菌ALE-1內(nèi)肽酶、噬菌體PhiNIHl.l細(xì)胞壁水解酶、LytM、Atl,來(lái)自肺炎鏈球菌的LytA、自金黃色葡萄球菌菌林PS47衍生的肽聚糖水解酶，來(lái)自糞腸球菌的腸溶素A、來(lái)自單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的ami自溶素、乳桿菌溶素諸如噬菌體A2的溶素或噬菌體PL-1酰胺酶。8.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其中所述內(nèi)溶素的無(wú)酶促活性的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有/包含依照SEQIDNO:19-33的序列。9.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其在內(nèi)溶素的無(wú)酶促活性的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域和依照SEQIDNO:l的序列或其衍生物之間具有/包含間隔區(qū)(spacer)。10.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的多肽，其顯示由下組序列組成的序列i)選自SEQIDNO:l-18的序列，ii)選自SEQIDNO:19-33的序列,iii)選自SEQIDNO:34-38的序列，和任選地iv)作為間隔區(qū)的GFP、GST或MBP序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10的多肽，其為所示SEQIDNO:39-53的序列之一。12.編碼根據(jù)權(quán)利要求l至ll任一項(xiàng)的多肽的核酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12的核酸，其中編碼SEQIDNO:l或其衍生物的部分序列以選自SEQIDNO:54-56的序列開(kāi)始。14.編碼根據(jù)權(quán)利要求1至1l任一項(xiàng)的多肽的載體。15.根據(jù)權(quán)利要求l至ll任一項(xiàng)的多肽之一用于結(jié)合、富集、從樣品中除去、捕獲和/或檢測(cè)細(xì)菌的用途。16.用于富集、除去、捕獲和/或檢測(cè)來(lái)自樣品的細(xì)菌的方法，其包括以下步驟a)使樣品與生物素化的依照權(quán)利要求l至ll任一項(xiàng)的多肽接觸和/或一起溫育，b)使步驟a)中獲得的所述多肽-細(xì)菌復(fù)合物與提供生物素結(jié)合物質(zhì)的載體接觸和/或一起溫育，c)將步驟b)中獲得的所述載體-多肽-細(xì)菌復(fù)合物與所述樣品分開(kāi)，d)任選地，自所述載體-多肽-細(xì)菌復(fù)合物清洗非特異性附著的樣品成分，e)任選地，將所述載體與所述多肽-細(xì)菌-復(fù)合物分開(kāi)，并f)任選地，4企測(cè)所述細(xì)菌。17.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述生物素結(jié)合物質(zhì)包含親合素或鏈霉抗生物素蛋白。18.19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述方法經(jīng)由磁性、層析或分批方法來(lái)實(shí)施。20.根據(jù)權(quán)利要求17至19任一項(xiàng)的方法，其中步驟f)中的所述檢測(cè)經(jīng)由選擇性生長(zhǎng)條件、基于核酸的方法來(lái)實(shí)施；細(xì)菌細(xì)胞壁及其成分的檢測(cè)，細(xì)菌成分的檢測(cè)經(jīng)由偶聯(lián)有標(biāo)志物的別的特異性細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和/或經(jīng)由微生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和/或生化檢測(cè)方法的組合來(lái)實(shí)施。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述基于核酸的方法選自下組PCR、RT-PCR、PCR-RFLP、rep-PCR指纟丈法、NASBA、DNA雜交方法、多基因座序列分型(MLST)和rRNA比較。22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞壁及其成分的檢測(cè)分別經(jīng)由內(nèi)溶素、抗體的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域或經(jīng)由FTIR來(lái)實(shí)施。23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)菌成分的檢測(cè)經(jīng)由ELISA、酶活性、多位點(diǎn)酶電泳(MEE)或生物發(fā)光測(cè)定法來(lái)實(shí)施。24.—種多肽，其包含SEQIDNO:19或SEQIDN0:31所示序列，但除此細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，所述多肽不包含別的內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域，特別是不包含內(nèi)溶素的有完全酶促活性的結(jié)構(gòu)域。25.包含SEQIDNO:19所示CBD21多肽序列或SEQIDNO:31所示CBDObpf多肽序列的無(wú)酶促活性的多肽用于結(jié)合、富集、從樣品中除去、捕獲和/或檢測(cè)細(xì)菌的用途，其中所述細(xì)菌選自下組葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、微球菌、桿菌和利斯特氏菌。26.用于多肽生物素化的方法，其中在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)包含依照SEQIDNO:l的多肽序列或其衍生物的感興趣多肽，其中沒(méi)有共表達(dá)外源基因(exogene)生物素連接酶。27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中沒(méi)有添加生物素。全文摘要本發(fā)明涉及包含內(nèi)溶素或另一種細(xì)胞壁溶解酶的無(wú)酶促活性細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域和依照SEQIDNO1的序列或其衍生物的多肽，以及其制備手段，其中除所述細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，所述多肽不包含別的內(nèi)溶素結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還涉及用于結(jié)合、富集、從樣品中除去、捕獲和/或檢測(cè)細(xì)菌(特別是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)的方法。文檔編號(hào)C07K19/00GK101636415SQ200780051424公開(kāi)日2010年1月27日申請(qǐng)日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日發(fā)明者安賈·菲利普,斯蒂芬·米勒,邁克爾·許茨,馬丁納·貝辛格申請(qǐng)人:拜奧默里克斯公司