專利名稱：鼠婦鎮(zhèn)痛肽的制備的制作方法
鼠婦鎮(zhèn)痛肽的制備
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從鼠婦中分離活性成份。并將本工藝所獲得的物質(zhì)專門用于鎮(zhèn)痛 的治療。背景技術(shù)：
鼠婦又稱"潮蟲"，在南方也叫"西瓜蟲"、"團子蟲"，屬無脊椎動物節(jié) 肢動物門甲殼綱潮蟲亞目。鼠婦的種類較多，它們身體大多呈長卵形，成體長 9一15毫米，背腹扁平十分顯著，呈灰褐色、灰藍色；常能巻曲成團，是草食的 陸棲類群，口器是咀嚼式口器，為甲殼動物中唯一完全適應(yīng)于陸地生活的動物， 從海邊一直到海拔5000米左右的高地都有它們的分布。第一觸角短小，后7對 胸肢變成步足。但它們都需生活在潮濕、溫暖以及有遮蔽的場所，晝伏夜出， 具負趨光性。不像昆蟲和蜘蛛那樣高度適應(yīng)于陸地上生活，在我國大多數(shù)地區(qū) 都有分布，在田間，主要為害黃瓜、西紅柿、油菜等常見的種類有潮蟲科、鼠 婦科、球鼠婦科等代表動物。別名潮濕蟲、潮蟲、地虱婆
來源為平甲蟲科動物平甲蟲Armadillidiumvulgare (Latreil.le)或鼠婦 PorcellioscaberLatreille的干燥蟲體。春、夏、秋三季捕捉，用鐵鍋炒干， 或開水燙死，曬干或焙干。
性味歸經(jīng)酸，溫。
功能主治利咽止痛，破瘀利水。用于慢性氣管炎，術(shù)后疼痛，牙痛，口腔 炎，鵝口瘡，咽喉腫痛，小便不利，閉經(jīng)。用法用量1.5 3分(0.5 1克)，研粉服。摘錄《全國中草藥匯編》
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種從鼠婦中提取鎮(zhèn)痛肽的方法。為實現(xiàn)以上目
的，制備工藝可以概括為以下步驟 (1)總蛋白的提取
取一定量鼠婦，用預(yù)冷的緩沖液沖洗去除雜質(zhì)和其他組織，經(jīng)過壓搾攪拌 后，加入配置好的3 mL裂解液，混勻，在冰面上用超聲粉碎.冰凍高速離心， 一定時間，取上清進行超率(截流率值大于等于5000)為待處理蛋白提取物， 凍存于冰箱中。
(2)蛋白質(zhì)粗制品的獲得
4方法l、不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將 目的蛋白沉淀分級析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再 度溶解而不變性。收集不同條件下沉淀出來的蛋白質(zhì)組分。之后進行鹽析、濃
縮；選擇具有鎮(zhèn)痛作用的組分。
方法2、用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶 解度分級降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下 進行。收集不同條件下沉淀出來的蛋白質(zhì)組分。之后進行復性、濃縮；鎮(zhèn)痛作 用的組分。
(3) 樣品的進一步分離純化
選擇具有鎮(zhèn)痛作用的組分，分別利用進行凝膠層析，收集具有鎮(zhèn)痛功 能的多肽?？梢允占?500 2000Da， 3000 5000 Da。兩組具有鎮(zhèn)痛作用的多 肽。
本工藝所采用的緩沖溶液，是指緩沖范圍包括pH值5 7的一切緩沖溶液， 用量包括樣品量的0. 1倍到1000倍(體積比)， 一般為PBS緩沖液。
工藝所采用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等， 分段鹽析具體方法不限；利用有機溶劑進行沉淀時，所用溶劑主要為可以與水 混溶的溶劑，包括但不限于甲醇，乙醇或丙酮。
濃縮工藝其特征在于使樣品濃度提高，而不使樣品活性受損，包括但不限 于真空低溫凍干、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空干燥等手段。
層析工藝其特征在于使樣品得到分離提純，包括但不限于以下葡聚糖凝膠 層析、離子交換層析、聚乙烯醇層析、聚乙烯酰胺層析、瓊脂層析、瓊脂糖層 析、浮石層析等手段。
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)工藝其特征在于使樣品濃度提高，而不使樣品活性受損，蒸發(fā)溫 度低于IO(TC，旋轉(zhuǎn)速度范圍為0 100000轉(zhuǎn)/分鐘。
低溫凍干工藝其特征在于使樣品濃度提高，而不使樣品活性受損，蒸發(fā)溫
度包括-500°C 50°C，凍干時間包括0 15天。
葡聚糖凝膠層析層析工藝其特征在于使樣品得到分離提純，所用凝膠為 G-75 、 G-25;所用緩沖液為緩沖區(qū)間為Ph5.5 7的緩沖液，常用緩沖液為磷 酸緩沖液。
真空濃縮方法通過真空旋轉(zhuǎn)蒸設(shè)備進行濃縮，控制溫度在10(TC以下。實施實例
總蛋白的提取取300克新鮮鼠婦，用預(yù)冷的1XPBS液沖洗去除雜質(zhì)和其他組織，經(jīng)過壓 搾攪拌后，加入配置好的3 mL裂解液(裂解液7mol/L尿素，2 mol/L硫 脲，5 mL/L IPG buffer (pH 3 10) ， 65 mmol / L DTT, 40 g/L CHAPS， 5 mg/L
蛋白酶抑制劑)，混勻，在冰面上用超聲粉碎.5000轉(zhuǎn)/分鐘，30分鐘，取上清 利用截流率值5000的超濾柱子進行超率，所得蛋白提取物，凍存于冰箱中。 蛋白質(zhì)粗制品的獲得
方法l、以1.0M， 2.0M， 3.0M， 4.0M四個不同濃度的硫酸銨，進行鹽析， 所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀分級析出，收集不同條件下沉淀出來的 蛋白質(zhì)組分。之后進行鹽析、濃縮；收集具有鎮(zhèn)痛作用的組分。
方法2、用與水可混溶的乙醇，加入到提取物中，使乙醇濃度達到40%、 75%、 95%，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度分級降低并析出。收集不同條件下沉淀出來的蛋白 質(zhì)組分。之后進行復性、濃縮鎮(zhèn)痛作用的組分。
樣品的進一步分離純化
選擇具有鎮(zhèn)痛作用的組分，分別利用G-25進行凝膠層析，所用洗脫緩 沖液為0. 01mol/L、 pH 6.2磷酸緩沖液;收集具有鎮(zhèn)痛功能的多肽?？梢允占?1300 2000Da， 3000 5000 Da兩組具有鎮(zhèn)痛作用的多肽。
權(quán)利要求
1、制備工藝包括以下步驟為總蛋白的提取取一定量鼠婦用，用預(yù)冷的洗滌緩沖溶液洗去除雜質(zhì)和其他組織，經(jīng)過壓榨攪拌后，加入配置好的適量裂解液，混勻，在冰面上用超聲粉碎；冰凍離心，一定時間，取上清進行超率(截流率值大于等于5000)為待處理蛋白提取物，凍存于冰箱中；蛋白質(zhì)粗制品的獲得方法1、不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀分級析出；被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性；收集不同條件下沉淀出來的蛋白質(zhì)組分；之后進行鹽析、濃縮；選擇具有鎮(zhèn)痛作用的組分待用；方法2、用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度分級降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進行；收集不同條件下沉淀出來的蛋白質(zhì)組分。之后進行復性、濃縮；鎮(zhèn)痛作用的組分待用；樣品的進一步分離純化選擇具有鎮(zhèn)痛作用的組分，分別利用進行凝膠層析，用層析緩沖液洗脫，收集具有鎮(zhèn)痛功能的多肽；可以收集到1500～2000Da，3000～5000Da；兩組具有鎮(zhèn)痛作用的多肽。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的本工藝所采用的適量的緩沖溶液，包括^fe滌緩沖 液和層析緩沖液，是指緩沖范圍包括pH值5 7的一切緩沖溶液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的本鹽析工藝所采用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸 鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等，分段鹽析具體方法不限。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機溶劑，主要為可以與水混溶的溶劑，包括但 不限于甲醇，乙醇或丙酮。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的濃縮工藝，其特征在于使樣品濃度提高，而不使 樣品活性受損，包括但不限于真空低溫凍干、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空干燥等手段。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的層析工藝，其特征在于使樣品得到分離提純，包 括但不限于以下葡聚糖凝膠層析、離子交換層析、聚乙烯醇層析、聚乙烯酰胺 層析、瓊脂層析、瓊脂糖層析、浮石層析等手段；常用方法為葡聚糖凝膠層析 和離子交換層析。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)工藝，其特征在于使樣品濃度提高，而 不使樣品活性受損，蒸發(fā)溫度低于10(TC，旋轉(zhuǎn)速度范圍為0 100000轉(zhuǎn)/分鐘。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的低溫凍干工藝，其特征在于使樣品濃度提高，而 不使樣品活性受損，蒸發(fā)溫度包括-500°C 50°C，凍干時間包括0 15天。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的葡聚糖凝膠層析層析工藝，其特征在于使樣品得 到分離提純，所用凝膠為G-75 、 G-25。
全文摘要
取一定量鼠婦，用預(yù)冷的緩沖液沖洗去除雜質(zhì)和其他組織，壓榨攪拌后，加入配置好的裂解液混勻，在冰面上用超聲粉碎。冰凍高速離心，一定時間，取上清進行超率(截流率值大于等于5000)為待處理蛋白提取物，凍存于冰箱中。通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀分級析出。收集不同條件下沉淀出來的蛋白質(zhì)組分。之后進行鹽析、濃縮；選擇具有鎮(zhèn)痛作用的組分?；蛘咴诘蜏叵掠门c水可混溶的有機溶劑使多數(shù)蛋白并分級析出。收集不同條件下沉淀出來的蛋白質(zhì)組分。之后進行復性、濃縮；鎮(zhèn)痛作用的組分。選擇具有鎮(zhèn)痛作用的組分，分別利用進行凝膠層析，收集具有鎮(zhèn)痛功能的多肽?？梢允占?500～2000Da，3000～5000Da。兩組具有鎮(zhèn)痛作用的多肽。
文檔編號C07K1/14GK101475624SQ200810000048
公開日2009年7月8日 申請日期2008年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月4日
發(fā)明者張永和, 王茂功 申請人:張永和;王茂功