專(zhuān)利名稱(chēng)：：抗gdf-8的中和抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
涉及抗生長(zhǎng)分化周子-8(GDF-8)的抗體，具體地，涉及人抗體，以及抗體片段，特別是在體外和/或體內(nèi)抑制GDF-8活性的那些。該
技術(shù)領(lǐng)域：
進(jìn)一步涉及診斷、預(yù)防或治療肌肉或骨退行性障礙，或胰島素代謝失調(diào)。技術(shù)背景生長(zhǎng)分化因子-8(GDF-8)，也稱(chēng)為肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin)，是一種分泌蛋白，還是結(jié)構(gòu)相關(guān)的生長(zhǎng)因子一轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-p(TGF-p)超家族的一員，所有結(jié)構(gòu)相關(guān)的生長(zhǎng)因子都具有生理學(xué)上重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生活性(Kingsley等.(1994)GenesDev.，8:133-146;Hoodless等，(1998)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.,228:235-272)。類(lèi)似于TGF-p，人GDF-8被合成為375個(gè)氨基酸長(zhǎng)的前體蛋白。該前體GDF-8蛋白形成同型二聚體。在加工過(guò)程中，氨基末端前肽在Arg-266處裂解。該裂解前肽，稱(chēng)為"潛在性相關(guān)肽"(LAP),可與上述同型二聚體保持非共價(jià)結(jié)合，因此使該復(fù)合體失活(Miyazono等.(1988)J.Biol.Chem,，263:6407-6415;Wakefield等.(1988)J.Biol.Chem.，263:7646-7654;Brown等.(1990)GrowthFactors,3:35-43;和Thies等.(2001)GrowthFactors,18:251-259)。成熟GDF-8與前肽的復(fù)合體通常稱(chēng)為"小潛在性復(fù)合體"(smalllatentcomplex)(Gentry等.(1990)Biochemistry,29:6851-6857;Derynck等.(1995)Nature,316:701-705;和Massague(1990)Ann.Rev.CellBiol.，12:597-641)。也已知其他蛋白能結(jié)合成熟GDF-8并抑制其生物活性。上述抑制性蛋白包括卵泡抑素和卵泡抑素相關(guān)蛋白(Gamer等.(1999)Dev.Biol.，208:222-232)。來(lái)自于不同物種推斷的氨基酸序列的比對(duì)表明GDF-8在進(jìn)化過(guò)程中高度保守(McPherron等.(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94:12457-12461)。事實(shí)上，人、小鼠、大鼠、豬和雞GDF-8序列的0末端區(qū)域是100%同一的，而在狒狒、牛和綿羊中僅有3個(gè)氨基酸不同。斑馬魚(yú)(zebrafish)GDF-8差異最大；然而與人仍具有88%同一性。該高度保守暗示GDF-8具有重要功能。GDF-8在發(fā)育和成熟的骨骼肌中高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)與肌肉中及骨發(fā)生中關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程的調(diào)節(jié)相關(guān)。例如，GDF-8敲除轉(zhuǎn)基因小鼠耒現(xiàn)為明顯肥大和骨骼肌過(guò)度增生(McPherron等.(1997)Nature,387:83-90)以及改變的骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)(Hamrick等.(2000)Bone，27(3):343-349)。在牛的GDF-8自發(fā)突變中也明顯出現(xiàn)類(lèi)似的骨骼肌質(zhì)量增加(Ashmore等.(1974)Growth,38:501-507;Swatland等.(1994)J.Anim.Sci.，38:752-757;McPherron等.(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94:12457-12461;和Kambadur等.(1997)GenomeRes.，7:910-915)。已有研究指出與HIV感染相關(guān)的肌肉萎縮伴隨著GDF-8表達(dá)的增加(Gonzalez-Cadavid等.(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，95:14938-14943)。GDF-8也與肌肉特異性酶(如，肌酸激酶)的產(chǎn)生和成肌細(xì)胞的增殖相關(guān)(WO00/43781)。除了其生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生特性外，GDF-8被認(rèn)為也與許多其他生理過(guò)程相關(guān)，包括n型糖尿病發(fā)展中葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)，葡萄糖耐量降低，代謝綜合征(如X綜合征)，諸如燒傷或氮失調(diào)的創(chuàng)傷誘導(dǎo)的胰島素抗性和脂肪組織病(如，肥胖癥)(Kim等.(2001)BBRC，281:902-906)。許多人和動(dòng)物病癥與肌肉組織機(jī)能上受損相關(guān)，如，肌肉營(yíng)養(yǎng)不良(包括Duchenne氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良)，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，肌肉萎縮，器官萎縮，虛弱，充血性阻塞性肺，少肌癥(sarcopenia)，惡病質(zhì)和由其他疾病和病癥引發(fā)的肌肉萎縮綜合征。迄今，極少可靠的或有效的療法已被發(fā)展用于治療這些病癥。也有許多病癥與骨質(zhì)損失相關(guān)，包括骨質(zhì)疏松癥癥和骨關(guān)節(jié)炎，特別是在老年人和/或絕經(jīng)后的婦女中，此外，代謝性骨病和骨障礙包括由于長(zhǎng)期糖皮質(zhì)激素治療導(dǎo)致的^f氐骨量，生殖腺早衰，雄激素遏抑，維生素D缺乏，繼發(fā)性甲狀旁腺功能尤進(jìn)癥，營(yíng)養(yǎng)缺乏和神經(jīng)性厭食。當(dāng)前用于這些病癥可行的療法是通過(guò)抑制骨再吸收作用而進(jìn)行的。對(duì)于這些療法而言，促進(jìn)新骨生成的療法將是所需的可選療法，因此，特別地在人中，存在發(fā)展促使肌肉質(zhì)量和/或強(qiáng)度和/或骨密度全面增加的新療法的需要.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供用亍肌肉和/或骨相關(guān)病癥的安全及有效的治療方法。本發(fā)明的另一目的是提供在脊推動(dòng)物中增加肌肉質(zhì)量和/或骨強(qiáng)度和/或密度的方法。本發(fā)明的另一目的是提供在體內(nèi)安全及有效的GDF-8抑制劑，本發(fā)明的另一目的是提供具有高特異性和親和力的結(jié)合GDF-8的人抗體及其片段。因此，提供了用于治療肌肉和骨退行性障礙的方法。該方法也用于正常動(dòng)物中以增加肌肉質(zhì)量和骨密度。也提供了新的人抗GDF-8抗體，稱(chēng)為Myo29，Myo28和Myo22，以及由其衍生的抗體和抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體具有許多用途。首先，所述抗體能夠以高親和力結(jié)合成熟GDF-8。其次，所披露的抗體在體外和體內(nèi)都抑制GDF-8活性，已通過(guò)例如ActRIIB結(jié)合的抑制和凈艮道基因測(cè)定而證實(shí)。最后，所披露的抗體可抑制與骨骼肌質(zhì)量及骨密度負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)的GDF-8活性。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包含Myo29，Myo28或Myo22的Fv片段的Vb和/或V,區(qū)。另外的實(shí)施方案包含一或更多這些Vb和Vl區(qū)的任一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。其他的實(shí)施方案包含Myo29，Myo28或Myo22的VB區(qū)的H3片段.本發(fā)明其他方面提供了含有本發(fā)明抗體或它們抗原結(jié)合片段的組合物，以及它們?cè)谝种苹蛑泻虶DF-8的方法中的用途，包括治療人或動(dòng)物的方法.本發(fā)明的抗體也用于治療或預(yù)防所需增加肌肉組織或骨密度的病癥。例如，本發(fā)明所披露的抗體可用于治療修補(bǔ)損傷的肌肉，如心肌、隔膜等。疾病和病癥的實(shí)例包括諸如肌肉營(yíng)養(yǎng)不良(包括Duchenne氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良)的肌肉和神經(jīng)肌肉障礙；肌萎縮性側(cè)索硬化；肌肉萎縮；器官萎縮；虛弱；腕管綜合征；充血性阻塞性肺?。簧偌“Y；惡病質(zhì)和其他肌肉萎縮綜合征；脂肪組織病(如，肥胖癥)；n型糖尿病；葡萄糖耐量降低；代謝綜合征(如X綜合征)；諸如燒傷或氮失調(diào)的創(chuàng)傷誘導(dǎo)的胰島素抗性；和骨退行性疾病(如，骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏*>癥)。此外，本發(fā)明所披露的抗體可月作在生物樣品中定量或定性檢測(cè)GDF-8或其片段的診斷工具。所檢測(cè)到的GDF-8的存在或數(shù)量與上述所列的一或多種醫(yī)學(xué)疾病相關(guān)。本發(fā)明的另一發(fā)面提供了一種分離的核酸，其包含編碼來(lái)自Myo29，Myo28或Myo22的Fv片段的Vb或Vl區(qū)的序列。也披露了一種分離的核酸，其包含編碼來(lái)自本發(fā)明所披露的任一Va和Vi區(qū)的至少一個(gè)CDR的序列。另一方面提供了包含上述核酸的宿主細(xì)胞。還在本發(fā)明的另一方面提供了產(chǎn)生衍生自Myo29，Myo28或Myo22的Vh或Vl區(qū)的新的Vb和^區(qū)和/或包含上述區(qū)域的全部或部分的功能性抗體的方法。本發(fā)明另外的目的將在下列描述中部分提出，以及部分在該描述中顯而易見(jiàn)，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐可被得知。依靠在附屬權(quán)利要求中特別指出的要素和組合可認(rèn)識(shí)到并獲得本發(fā)明的各種目的、方面和優(yōu)點(diǎn)?？梢岳斫馇笆鲆话忝枋龊碗S后詳細(xì)描述僅是示范性和解釋性的，并不限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍.圖1顯示了生物素化的GDF-8和BMP-ll結(jié)合ActRIIB受體，它們分別具有15ng/ml和40ng/ml的ED5。。圖2顯示了通過(guò)本發(fā)明scFv片段抑制GDF-8和ActRIIB受體結(jié)合。如圖，Myo29，Myo28和Myo22的scFv的105。分別為2.4nM，1.7nM和60nM。圖3A和3B顯示了在ActRIIB結(jié)合測(cè)定中Myo29與10ng/ml生物素標(biāo)記的GDF-8或BMP-ll預(yù)溫育抑制了GDF-8或BMP-ll與ActRIIB的結(jié)合，其具有0.2-0.4nM的ICs。。圖4B和4C描述了pGL3(CAGA)u報(bào)告基因測(cè)定的結(jié)果，其中測(cè)試了Myo29。圖4A顯示了基線(xiàn)條件，即，GDF-8、BMP-ll和活化素誘導(dǎo)的報(bào)告基因活性。圖4B和4C顯示了Myo29以劑量-響應(yīng)方式減少GDF-8活性，其具有15-30ng/ml的IC5。，并以同樣的程度抑制BMP-11的生物活性.圖4D闡明了在該測(cè)定中Myo29并不影響活化素的活性。圖5顯示Myo22，Myo28和Myo29表位作圖的結(jié)果。Myo29的表位定位在成熟GDF-8的氨基酸72到氨基酸88;對(duì)于Myo22，定位在氨基酸1到氨基酸44;對(duì)于Myo28,定位在氨基酸1到氨基酸98。圖6顯示了Myo29表位取代分析的結(jié)果。對(duì)于Myo29結(jié)合GDF-8而言，成熟GDF-8中殘基Lys-78，Pro-81和Asn-83似乎起重要作用。圖7描述了用Myo29和Myo28進(jìn)行免疫沉淀試驗(yàn)的結(jié)果。來(lái)自表達(dá)GDF-8的CH0細(xì)胞的條件培養(yǎng)液用Myo29或Myo28進(jìn)行免疫沉淀，該CH0細(xì)胞用35S-甲硫氨酸/半胱氨酸進(jìn)行放射性標(biāo)記。接著通過(guò)還原條件下的SDS-PAGE分析免疫沉淀。凝膠上的條帶被鑒定為成熟GDF-8，GDF-8前肽和未被加工的GDF-8。圖8描述了C57B6/SCID小鼠接受作為單次靜脈內(nèi)(IV)或腹膜內(nèi)(IP)給藥的1mg/kg劑量的Myo29的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果。Myo29顯示了大約一周的延長(zhǎng)的終末半衰期和約lml/hr/kg的低清除率。在腹膜內(nèi)(IP)注射后吸收率約為77%。圖9顯示了用不同劑量Myo29(60，10和lmg/kg)或載體(PBS)每周一次處理的雄性C57B6/SCID小鼠中四頭肌質(zhì)量的比較結(jié)果。用Myo"在10和60mg/kg劑量水平下處理四周導(dǎo)致肌肉質(zhì)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上分別顯著增加19%和23%。圖IOA和10B顯示了用不同劑量Myo29(10，5，2.5和1mg/kg)或PBS每周一次持續(xù)四周處理的雌性CB17SCID小鼠中腓腸肌和四頭肌質(zhì)量。與對(duì)照載體相比，用Myo29處理的小鼠中肌肉質(zhì)量增加了10-20%。圖11A和11B分別顯示了用不同劑量Myo29(10，5，2.5和1mg/kg)或PBS每周一次持續(xù)十二周處理的雌性CB17SCID小鼠中腓腸肌和四頭肌肌肉質(zhì)量。用Myo29處理的小鼠顯示肌肉質(zhì)量增加了12-28%,圖12顯示了用Myo29(10和5mg/kg)或PBS每周一次持續(xù)十二周處理的雌性CB17SCID小鼠中，通過(guò)握力計(jì)測(cè)定的前肢肌肉強(qiáng)度，用Myo"在5mg/kg和10mg/kg下處理的小鼠中前肢強(qiáng)度分別增加了17%和23%。發(fā)明詳述I.定義在本文中使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"指免疫球蛋白或其部分，并包含任何含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽，與其來(lái)源、由來(lái)物種、生產(chǎn)方法以及特性無(wú)關(guān)。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，術(shù)語(yǔ)"抗體"包括人、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、綿羊和雞抗體'所述術(shù)語(yǔ)包括但不限于多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、非特異性、人源化、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合、突變和CDR移植抗體。對(duì)于本發(fā)明目的而言，除非另有說(shuō)明，其也包括諸如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb的抗體片段，和其他保留抗原結(jié)合功能的抗體片段。例如，可通過(guò)傳統(tǒng)的雜交瘤4支術(shù)(Kohler和Milstein(1975)Nature,256:495-499)，重組DNA技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利笫4，816，567號(hào))或4吏用抗體文庫(kù)的噬菌體展示技術(shù)(Clackson等.(1991)Nature,352:624-628;Marks等.(1991)J.Mol.Biol.，222:58卜597)制備抗體。關(guān)于不同的其他抗體生產(chǎn)技術(shù)，參見(jiàn)Antibodies:ALaboratoryManual,eds.Harlow等.，ColdSpringHarborLaboratory,1988。術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合區(qū)"指抗體分子的一部分，其包含與抗原的部分或全部特異性結(jié)合或互補(bǔ)的區(qū)域，其中抗原較大，抗體僅結(jié)合該抗原的特定部分。"表位"或"抗原決定簇"是抗原分子的一部分，其負(fù)責(zé)與抗體的抗原結(jié)合區(qū)特異性相互作用。一或多個(gè)抗體可變區(qū)可提供一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)(如，所謂的由Vh區(qū)組成的Fd抗體片段).一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)包含一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)(VJ和一個(gè)抗體重鏈可變區(qū)(VB)。術(shù)語(yǔ)"庫(kù)(repertoire)"指遺傳學(xué)上不同的核苷酸集合，如全部或部分衍生自編碼表達(dá)免疫球蛋白的序列的DNA序列。所述序列通過(guò)體內(nèi)重排產(chǎn)生，如對(duì)于H鏈而言，重排V，D和J片段和如對(duì)于L鏈而言，重排V和J片段。可選地，所述序列可通過(guò)體外刺激和響應(yīng)重排發(fā)生而產(chǎn)生自細(xì)胞系?？蛇x地，所述序列的部分或全部可獲得自通過(guò)組合如未重排的V片段與D和J片段，通過(guò)核普酸合成、隨機(jī)誘變和其他披露于美國(guó)專(zhuān)利第5，565，332號(hào)的方法。術(shù)語(yǔ)"特異性相互作用"或"特異性結(jié)合"或類(lèi)似術(shù)語(yǔ)指兩個(gè)分子形成的在生理?xiàng)l件下相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合體，所述術(shù)語(yǔ)也適用于，如特異于特定表位的抗原結(jié)合區(qū)，該表位為許多抗原所攜帶，在這種情況下，帶有抗原結(jié)合區(qū)的抗體可結(jié)合帶有該表位的各種抗原。因此，例如，只要抗體能結(jié)合BMP-ll和GDF-8兩者所帶有的表位，其就可特異性結(jié)合BMP-ll和GDF-8,特異性結(jié)合的特點(diǎn)在于高親和力和低至中容量。非特異性結(jié)合通常具有低親和力和中至高容量。通常，當(dāng)親和常數(shù)K,高于106M-'或優(yōu)選高于108M—'時(shí)，認(rèn)為結(jié)合是特異性的。必要時(shí)，通過(guò)改變結(jié)合條件減少非特異性結(jié)合而基本上不影響特異性結(jié)合。上述條件為本領(lǐng)域所公知，且本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)就可選擇合適的條件。所述條件通常用抗體濃度、溶液離子強(qiáng)度、溫度、供結(jié)合時(shí)間、非相關(guān)分子(如，血清白蛋白、乳酪蛋白)濃度等來(lái)限定。條件的實(shí)例列于實(shí)施例4、7和10中。短語(yǔ)"基本上如……所述"指相應(yīng)的CDR、Vb或Vl區(qū)與本文所述序列的指定區(qū)域是同一的或是高度相似的。例如，上述取代包括從CDR(Hl，H2，H3，Ll，L2或-L3)序列的任意5個(gè)氨基酸中取代1或2個(gè)。術(shù)語(yǔ)"TGF-p超家族"指結(jié)構(gòu)相關(guān)的生長(zhǎng)因子家族。有關(guān)的生長(zhǎng)因子家族為本領(lǐng)域所公知(Kingsley等.(1994)GenesDev.，8:133-146;Hoodless等.(1998)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.,228:235-72)。TGF-p超家族包括骨形成蛋白(BMP)、活化素、抑制素、苗勒氏抑制物質(zhì)、膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和數(shù)量上仍在增加的諸如GDF-8(肌肉生長(zhǎng)抑制素)的生長(zhǎng)分化因子(GDF)。許多上述蛋白在結(jié)構(gòu)上和/或功能上與GDF-8相關(guān)。例如，也稱(chēng)為GDF-11的人BMP-ll在氨基酸水平上與GDF-8具有90%的同一性(Gamer等.(1999)Dev.Biol.208，222-232;Nakshima等.(1999)Mech.Dev.,80:185-189)。術(shù)語(yǔ)"GDF-8"指特定的生長(zhǎng)分化因子-8以及，合適時(shí)，在結(jié)構(gòu)上或功能上與GDF-8相關(guān)的因子，例如，BMP-11和其他屬于TGF-p超家族的因子。該術(shù)語(yǔ)指GDF-8全長(zhǎng)未加工的前體形式，也指翻譯后裂解產(chǎn)生的成熟和前肽形式。該術(shù)語(yǔ)也指GDF-8的任一片段和變體，所成熟GDF-8相關(guān)的生物活i。一人成熟GDF-8氨基酸序列提供于SEQIDNO:49。本發(fā)明涉及的GDF-8來(lái)自所有的脊推動(dòng)物，包括但不限于，人、牛、雞、小鼠、大鼠、豬、綿羊、火雞、狒狒和魚(yú)(關(guān)于序列信息，參見(jiàn)如，McPherron等.(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94:12457-12461)。術(shù)語(yǔ)"成熟GDF-8"指來(lái)自于被裂解的GDF-8前體蛋白的羧基末端區(qū)的蛋白'成熟GDF-8可以單體、同型二聚體或以GDF-8潛在性復(fù)合體的形式存在，基于此情形，成熟GDF-8可在這些不同形式的任一或全部之間建立平衡。在其生物活性形式中，成熟GDF-8也稱(chēng)為"活性GDF-8"。術(shù)語(yǔ)"GDF-8前肽"指來(lái)自于被裂解的GDF-8前體蛋白的氨基末端區(qū)的多肽'GDF-8前肽能與成熟GDF-8上的前肽結(jié)合區(qū)結(jié)合'術(shù)語(yǔ)"GDF-8潛在性復(fù)合體"指在成熟GDF-8同型二聚體和GDF-8前肽之間形成的蛋白復(fù)合體。據(jù)信兩個(gè)GDF-8前肽與同型二聚體中兩分子成熟GDF-8結(jié)合形成失活的四聚復(fù)合體。該潛在性復(fù)合體可包括取代GDF-8前肽的其他GDF抑制劑，或除一種或多種該GDF-8前肽之外的其他GDF抑制劑。術(shù)語(yǔ)"GDF-8活性"指與活性GDF-8蛋白相關(guān)的一種或多種生理學(xué)上生長(zhǎng)調(diào)節(jié)或形態(tài)發(fā)生活性。例如，活性GDF-8是一種骨骼肌質(zhì)量的負(fù)調(diào)節(jié)劑。活性GDF-8也能調(diào)節(jié)肌肉特異性酶(如，肌酸激酶)的產(chǎn)生，刺激成肌細(xì)胞增殖以及調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。在體內(nèi)及體外測(cè)定GDF-8活性方法的實(shí)例列于實(shí)施例2、3、6和13中。術(shù)語(yǔ)"GDF-8抑制劑"包括任何能抑制GDF-8活性、表達(dá)、加工或分泌的試劑。上述抑制劑包括蛋白質(zhì)、抗體、肽、肽模擬物、核酶、反義寡核苷酸、雙鏈RNA和其他能特異性抑制GDF-8的小分子。上述抑制劑被認(rèn)為"抑制"、"中和"或"減少"GDF-8的生物活性。術(shù)語(yǔ)"中和"、"抑制"和它們的同源詞指相對(duì)于在缺乏該相同抑制劑條件下的GDF-8活性，通過(guò)GDF-8抑制劑減少了GDF-8的活性，所述活性減少優(yōu)選至少約10%,20%，30%，40%,50%,60%,70%，80%,90%或更高。術(shù)語(yǔ)"處理"在本文中可與術(shù)語(yǔ)"治療方法"可交換地使用，并指治療性處理及預(yù)防/預(yù)防性措施。那些需要處理的可包括已經(jīng)患特定的醫(yī)學(xué)疾病的個(gè)體和最終患該病癥的那些(即，那些需要預(yù)防性措施的)。術(shù)語(yǔ)"分離的"指基本上不舍有其天然周?chē)橘|(zhì)的分子。例如，分離的蛋白基本上不含有細(xì)胞物質(zhì)或來(lái)自衍生其的細(xì)胞或組織源的其他蛋白，該術(shù)語(yǔ)用于制劑時(shí)，其中分離的蛋白是足夠地純以作為治療組合物給藥，或至少70%-80W(w/w)純，更優(yōu)選地，至少80%-90%(w/w)純，甚至更優(yōu)選地，90-95%純；以及，最優(yōu)選地，至少95%，96%，97%，98%，99%或100%(w/w)純。術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物"指照此分類(lèi)的任何動(dòng)物，包括人、馴養(yǎng)和從事畜牧的動(dòng)物、動(dòng)物園動(dòng)物、從事體育活動(dòng)的動(dòng)物或?qū)櫸?，如狗、馬、貓、綿羊、豬、牛等。術(shù)語(yǔ)"有效劑量"或"有效量"指引起患者癥狀改善或所需生物學(xué)結(jié)果(如，增加骨骼肌質(zhì)量和/或骨密度)的化合物的數(shù)量，上述數(shù)量應(yīng)足夠以減少與骨骼肌質(zhì)量和骨密度負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)的GDF-8活性。以下章節(jié)中描述了測(cè)定有效量的方法。II.抗GDF-8抗體和抗原結(jié)合片段A.人抗體Myo29，Myo28和Myo22本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容提供了新的抗GDF-8抗體及其抗原結(jié)合片段。上述抗體的非限制性例證的實(shí)施方案命名為Myo29，Myo28和Myo22。這些例證的實(shí)施方案以人IgG,抗體的形式提供。本發(fā)明的抗體具有獨(dú)特及有益的特性。首先，這些結(jié)合成熟GDF-8的抗體具有高親和力。其次，本發(fā)明的抗體可在體外和體內(nèi)抑制GDF-8活性，例如通過(guò)ActRIIB結(jié)合抑制和受體基因測(cè)定來(lái)證實(shí)。本發(fā)明的抗體也能特異性結(jié)合和/或抑制BMP-ll的活性，例如，通過(guò)ActRIIB結(jié)合抑制和受體基因測(cè)定來(lái)證實(shí)。最后，本發(fā)明所披露的抗體可抑制與骨骼肌質(zhì)量和骨密度負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)的GDF-8活性在一個(gè)例證的實(shí)施方案中，本發(fā)明所披露的抗體能特異性結(jié)合GDF-8和BMP-11。據(jù)推測(cè)該抗體也可與其他蛋白反應(yīng)，例如，那些屬于TGF-p超家族的，諸如苗勒氏抑制物質(zhì)、膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或除了GDF-8之外的生長(zhǎng)和分^f乜因子.在某一實(shí)施方案中，Myo29與包含與SEQIDNO:49的氨基酸72至88同一的序列的蛋白反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Myo29結(jié)合包含序列Lys-Xaal-Xaa2-Pro-Xaa3-Asn(SEQIDN0:54)的蛋白，其中Xaal，Xaa2和Xaa3分別是任意氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少符合下列條件之一(l)Xaal-Met，(2)Xaa-Ser和(3)Xaa3=Ile;所有的條件彼此互相獨(dú)立，在其他實(shí)施方案中，Myo22識(shí)別成熟GDF-8序列中起始的44個(gè)N末端氨基酸(SEQIDNO:49的氨基酸1-44)中的表位。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的抗體可用于檢測(cè)、測(cè)定和抑制與那些上述規(guī)定所不同的蛋白。一般而言，本發(fā)明的抗體可用于包含與列于SEQIDNO:49的GDF-8成熟形式序列中至少100,80，60，40或20個(gè)連續(xù)氨基酸的任一序列具有至少約70%,80%,90%，95%或更多同一性的序列的任何蛋白。上述蛋白非限制性實(shí)例包括GDF-8序列，其衍生自在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中所述的不同物種。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的比對(duì)算法測(cè)定同一性百分?jǐn)?shù)，例如，Altschul等.(1990)J.Mol.Biol.，215:403-410描述的局部相似性基本查詢(xún)工具(BLAST)，Needleman等.(1970)J.Mol.Biol.，48:444—453描述的算法，或Meyers等.(1988)Comput.Appl.Biosci.，4:11-17描述的算法。B.可變區(qū)也稱(chēng)為免疫球蛋白的完整抗體通常是由每條大約25kDa的兩條輕(L)鏈和每條大約50kDa的兩條重(H)鏈組成的糖基化蛋白四聚體。在抗體中存在兩種類(lèi)型的輕鏈，稱(chēng)為k和K?；谥劓満愣▍^(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分為五種主要類(lèi)型A，D，E，G和M，以及其中一些可進(jìn)一步分為亞型(同種型)，如IgG,，IgG2，IgG3，IgG"IgA,和IgA2。不同類(lèi)型免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象為本領(lǐng)域眾所周知。關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)的綜迷，參見(jiàn)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,eds.Harlow等.，1988。簡(jiǎn)單而言，每條輕鏈都由N-末端可變(V)區(qū)(Vl)和恒定(C)區(qū)(CJ組成。每條重鏈都由N-末端V區(qū)，三或四個(gè)C區(qū)以及鉸鏈區(qū)組成。最接近L的G區(qū)被指定為CH1.l和VL區(qū)包括四個(gè)稱(chēng)為骨架區(qū)的相對(duì)保守的序列區(qū)域(FRl，F(xiàn)R2,FR3和FR4),其形成三個(gè)超變序列區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)，CDRs)的支架。CDR包含最多的負(fù)責(zé)與抗原特異性相互作用的殘基。CDR是指CDR1，CDR2和CDR3。因此，重鏈上的CDR組件稱(chēng)為Hl，H2和H3，這時(shí)輕鏈上的CDR組件稱(chēng)為L(zhǎng)l，L2和L3。在抗體結(jié)合位點(diǎn)中CDR3是分子多樣性最大的來(lái)源。例如，H3可短至兩個(gè)氨基酸殘基或長(zhǎng)于26個(gè)殘基。最小的抗原結(jié)合片段是Fv，其由L和L區(qū)組成，F(xiàn)ab片段(抗原結(jié)合片段)由V廣CJ和\厶-「區(qū)通過(guò)在恒定區(qū)之間的二硫鍵共價(jià)連接組成。當(dāng)在宿主細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，為克服Fv中VB和l區(qū)非共價(jià)連接導(dǎo)致的解離趨向，可構(gòu)建通常稱(chēng)作為單鏈(sc)Fv片段(scFv)，其中在Vh的C-末端與Vj^的N-末端之間或在Vl的C-末端與l的N-末端之間存在柔性的和足夠長(zhǎng)的多肽接頭。最常用的接頭是具有15個(gè)殘基(Gl^Ser)3的肽，但其他接頭也為本領(lǐng)域所公知，通過(guò)編碼不同區(qū)域的多胚系基因的使用以及多種體細(xì)胞事件形成了抗體多樣性。體細(xì)胞事件包括可變基因片段與多樣性(D)和連接(J)基因片段重排產(chǎn)生完整的VB區(qū)以及可變和連接基因片段重排產(chǎn)生的完整l區(qū)。其自身的重排過(guò)程是不精確的，導(dǎo)致在V(D)J連接處缺失或添加氨基酸。在發(fā)育的B細(xì)胞中這些多樣性機(jī)制出現(xiàn)在抗原暴露前。在抗原刺激后，在B細(xì)胞中表達(dá)抗體的基因經(jīng)歷了體細(xì)胞突變?；诠烙?jì)的胚系基因片段的數(shù)目，這些片段的隨機(jī)重排，以及隨機(jī)VB-l配對(duì)，可產(chǎn)生1.6xl()7個(gè)不同的抗體(FundamentalI咖unology，第3版，ed.Paul,RavenPress,NewYork,NY,1993)。當(dāng)考慮到其他有助于抗體多樣性的加工(如體細(xì)胞突變)時(shí)，預(yù)計(jì)能有超過(guò)lxl(T個(gè)不同抗體產(chǎn)生(ImmunoglobulinGenes,第2版.，eds.Jonio等.，AcademicPress,SanDiego，CA，1995)。因?yàn)樵S多加工與抗體多樣性產(chǎn)生相關(guān)，所以獨(dú)立得到的具有相同抗原特異性的單克隆抗體不太可能具有同樣的氨基酸序列。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了新的衍生自人免疫球蛋白基因文庫(kù)的CDRs。帶有本發(fā)明CDR的結(jié)構(gòu)通常是抗體重鏈或輕鏈序列或它們的實(shí)質(zhì)部分，其中CDR位于相應(yīng)于天然存在的Vb和l的CDR的位置。可通過(guò)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDepartmentofHealthandHumanServices,eds.Kabat等.，1991中所描述的方法來(lái)測(cè)定免疫球蛋白可變區(qū)的結(jié)構(gòu)和位置。本發(fā)明所披露的抗體、它們的scFV片段、Vb和Vl區(qū)和CDR的DNA和氨基酸UA)序列列于序列表中并在表l中列舉。為了方便起見(jiàn)，Vb和l區(qū)中每個(gè)CDR的位置列于表2中.鑒定了在Myo29，Myo28和Myo"中除了L和l區(qū)之外的重鏈和輕鏈序列。表l:ScFv,VH和Vl區(qū)及CMs的DNA和氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2:scFv中的CDR位置<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本發(fā)明披露了可進(jìn)一步包含抗體恒定區(qū)或其部分的抗體。例如，l區(qū)的c-末端可附著在抗體輕鏈恒定區(qū)末端上，該輕鏈恒定區(qū)包括人CK或a鏈，優(yōu)選a鏈。同樣地，基于Va區(qū)的特異性抗原結(jié)合片段的c-末端可附著在免疫球蛋白重鏈的全部或部分的末端上，該免疫球蛋白重鏈衍生自任一同種型抗體，如IgG，IgA，IgE和IgM，以及該同種型的任一亞型，特別是IgGi和IgG4。在例證的實(shí)施方案中，抗體包含人IgGa的重鏈和輕鏈C-末端片段.輕鏈入的C-末端片段的DNA和氨基酸序列分別列于SEQIDNO:50和SEQIDNO:51中。Igd重鏈C-末端片段的DM和氨基酸序列分別列于SEQIDNO:52和SEQIDNO:53中，本發(fā)明的某些實(shí)施方案包含Myo29，Myo28或Myo22的Fv片段的Vh和/或Vl區(qū)。另外的實(shí)施方案包舍一個(gè)或多個(gè)這些VH和VL區(qū)任一的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。一個(gè)實(shí)施方案包含Myo29，Myo28或Myo22的VH區(qū)的一個(gè)H3片段。在某些實(shí)施方隸中，本發(fā)明的Vh和l區(qū)是胚系的，即使用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)改造這些區(qū)的骨架區(qū)(FR)以與人胚系基因產(chǎn)物的連續(xù)氨基酸序列相匹配。在另一個(gè)實(shí)施方案中，骨架序列仍保留與胚系的差異。C.修飾的抗體及其片段本發(fā)明另一方面提供了一種用于獲得特異于GDF-8的抗體結(jié)合區(qū)的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明的抗體不限于表1中所陳列的Vh和Vl的特定序列，但也包括這些仍保留抗原結(jié)合活性序列的變體。這種變體可衍生自使用本領(lǐng)域公知4支術(shù)提供的序列。在FR或CDR中可進(jìn)行氨基酸取代、缺失或添加。雖然在骨架區(qū)中的改變通常意在改善抗體穩(wěn)定性和減少免疫原性，但是在CDR中的改變通常意在增加抗體對(duì)其目標(biāo)妁親和力。上述親和力增加的改變通常是通過(guò)以經(jīng)驗(yàn)為主的改變CDR區(qū)和測(cè)試抗體來(lái)確定。上述改變可才艮據(jù)描述于AntibodyEngineering,第2版，ed.Borrebaeck，OxfordUniversityPress,1995中的方法來(lái)進(jìn)行，制備是本文所述的VB區(qū)的氨基酸序列變體的VB區(qū)的方法包含在本發(fā)明所披露的Vb區(qū)氛基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，任選地將這樣提供的L區(qū)與一種或多種Vl區(qū)組合，并測(cè)試Va區(qū)或VH/VL組合或組合物與GDF-8的特異性結(jié)合，任選地，測(cè)試上述抗原結(jié)合區(qū)中和GDF-8活性的能力。l區(qū)可具有基本上如本文所述的氨基酸序列。一種類(lèi)似的方法可應(yīng)用于本文所披露的^區(qū)的一種或多種序列變體與一種或多種Vb區(qū)的結(jié)合。本發(fā)明另一方面提供了一種制備與GDF-8特異性反應(yīng)的抗原結(jié)合片段的方法。該方法包括(a)提供編碼Vb區(qū)核酸的起始庠，該Vh區(qū)包括要被取代的CDR3或缺失CDR3編碼區(qū)；(b)將該庫(kù)與編碼基本上如本文中所迷的VBCDR3(即，H3)氨基酸序列的供體核酸結(jié)合，使得該供體核酸插入該庫(kù)的CDR3區(qū)中，以致提供了一種編碼VB區(qū)核酸的產(chǎn)物庫(kù)；(c)表達(dá)該產(chǎn)物庫(kù)的核酸；(d)篩選特異于GDF-8的特異性抗原結(jié)合片段；和(e)收集該特異性抗原結(jié)合片段或編碼其的核酸。此外，一種類(lèi)似的方法可用于將本發(fā)明的VlCDR3(即，L3)與編碼Vl區(qū)核酸的庫(kù)結(jié)合，該Vl區(qū)包括要被取代的CDR3或缺失CDR3編碼區(qū)。使用重組DNA技術(shù)，可將編碼本發(fā)明CDR(如，CDR3)的序列導(dǎo)入缺失CDR(如，CDR3)的可變區(qū)庫(kù)中。例如，Marks等.(Bio/Technology(1992)10:779-783)描述了產(chǎn)生抗體可變區(qū)庫(kù)的方法，其中定向于或鄰近可變區(qū)5'末端的通用引物被用于通用引物與人Vb基因的第三骨架區(qū)的連接，以提供缺失CDR3的Vh可交區(qū)庠。該庫(kù)可與特定抗體的CDR3結(jié)合。使用類(lèi)似技術(shù)，本發(fā)明CM3衍生序列可與缺失CDR3的Vb或Vi區(qū)的庫(kù)混合，并且該混合的完整Vb或Vl區(qū)可與同源l或VB區(qū)結(jié)合以提供本發(fā)明的特異性抗原結(jié)合片段。接著，該庫(kù)在諸如W092/01047的噬菌體展示系統(tǒng)的適合的宿主系統(tǒng)中展示，使得可篩選合適的抗原結(jié)合片段。類(lèi)似的混合或組合4支術(shù)也披露于Ste咖er(Nature(1994)370:389-391)中，其描述了與P-內(nèi)酰胺酶基因相關(guān)的技術(shù)，但據(jù)觀察，該方法可用于抗體的制備。另一種可選方法是使用隨機(jī)誘變一或多種選定的L和/或^基因以產(chǎn)生在整個(gè)可變區(qū)范圍中的突變，來(lái)產(chǎn)生帶有本發(fā)明CDR衍生序列的新的Vb或I區(qū).該才支術(shù)描述于Gram等.(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89:3576-3580)中，其使用了易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。另一種可使用的方法是直接誘變Vb或^基因的cdr區(qū)。該技術(shù)披露于Barbas等.(Pro"Nat.Acad.Sci.U,S.A.(1994)91:3809-3813)和Schier等.(J.Mol.Biol.(1996)263:551-567)中。同樣地，一或多個(gè)，或所有三個(gè)CDR可移植入Vh或1區(qū)的庠中，接著篩選特異于GDF-8的特異性結(jié)合配體或結(jié)合片段。免疫球蛋白可變區(qū)的主要部分至少包含CDR區(qū)以及任選地，它們之間的骨架區(qū)，該骨架區(qū)來(lái)自如在本文中所迷的scFv片段。該部分也包括至少約50%的FR1和FR4任一或全部，該50W是FR1C-末端的50%和FR4N-末端的50%。在該可變區(qū)N-末端或C-末端添加的殘基可以是通常與天然存在的可變區(qū)不相關(guān)的那些。例如，通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明的特異性抗原結(jié)合片段的結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致編>%接頭的N-或C-末端殘基導(dǎo)入，該接頭的導(dǎo)入有利于克隆或其他操作步驟。其他操作步驟包括在本發(fā)明可變區(qū)與其他蛋白序列包括免疫球蛋白重鏈、其他可變區(qū)(如，在雙體產(chǎn)生中)或如下更詳細(xì)討論的蛋白標(biāo)記的連接處導(dǎo)入接頭。盡管在實(shí)施例中說(shuō)明的實(shí)施方案包含VB和l區(qū)的"匹配"對(duì)，本發(fā)明也包含含有單一可變區(qū)的結(jié)合片段，該單一可變區(qū)衍生自任一VB或Vl區(qū)序列，特別是Vh區(qū)。就任一單鏈特異性結(jié)合區(qū)而言，這些區(qū)可用于篩選能結(jié)合GDF-8的可形成雙區(qū)特異性抗原結(jié)合區(qū)的互補(bǔ)區(qū)?？赏ㄟ^(guò)使用在W092/01047中披露的稱(chēng)為分級(jí)雙重組合法的噬菌體展示篩選方法進(jìn)行篩選，在該方法中含有任一H或L鏈克隆的單獨(dú)克隆被用于感染編碼其他鏈(L或H)的克隆的完整文庫(kù)，以及篩選所產(chǎn)生的雙鏈特異性抗原結(jié)合區(qū)，與諸如那些在參考文獻(xiàn)中描述的噬菌體展示技術(shù)是一致的。該技術(shù)也披露于Marks等.，同上?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)方法將抗體與放射'性核素、藥物、大分子或其他試劑連接或?qū)⑵溆糜诋a(chǎn)生包含一或多個(gè)本發(fā)明的CDR的融合蛋白。在含有VH-Vl封的抗體融合蛋白中這些鏈(通常為Vb)之一和其他蛋白被合成為單一的多肽鏈。在不同于抗體的這些產(chǎn)物類(lèi)型中，通常具有額外的功能元件；小分子的活性部分，或綴合的或融合的大分子的主要分子結(jié)構(gòu)特征。除了上述氨基酸序列改變之外，抗體也可被糖基化、聚乙二醇化或連接上白蛋白或非蛋白質(zhì)聚合物。例如，本發(fā)明所披露的抗體可連接多種非蛋白質(zhì)聚合物之一，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，這些方法列于美國(guó)專(zhuān)利第4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4，791，192或4，179，337號(hào)中.例如，通過(guò)共價(jià)連接聚合物化學(xué)修飾抗體可增加它們的循環(huán)半衰期。聚合物的實(shí)例和方法以及它們所修飾的肽也示于美國(guó)專(zhuān)利第4,766,106;4,179,337;4，495，285和4，609，546號(hào)中。在其他實(shí)施方案中，可修飾抗體以具有改變的糖基化類(lèi)型(即，改變?cè)嫉幕蛱烊坏奶腔?lèi)型)，在本文中使用的"改變"意指一或多個(gè)碳水化合物部分缺失、和/或添加一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)到原始抗體上。通過(guò)改變氨基酸序列以包含糖基化位點(diǎn)共有序列來(lái)實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明所披露的抗體上添加糖基化位點(diǎn)是本領(lǐng)域眾所周知的。其他增加抗體上碳水化合物部分?jǐn)?shù)量的方法是通過(guò)化學(xué)或酶偶聯(lián)糖普到抗體的氨基酸殘基上。這些方法描述于W087/05330中，以及于Aplin和Wriston(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.，22:259-306中?？赏ㄟ^(guò)在Hakimuddin等.(1987)Arch.Biochem.Biophys.，259:52;和Edge等.(1981)Anal.Biochem.，118:131和Thotakura等.(1987)Meth.ENZYMOL.，138:350中所描述的化學(xué)或酶方法來(lái)實(shí)現(xiàn)除去抗體上出現(xiàn)的任一碳水化合物部分。本發(fā)明的抗體也可標(biāo)記有可檢測(cè)的或功能性標(biāo)記。可檢測(cè)的標(biāo)記包括諸如1311或"Tc的放射性標(biāo)記，使用本領(lǐng)域公知的常規(guī)化學(xué)反應(yīng)可將其連接在本發(fā)明的抗體上。也包括諸如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的酶標(biāo)記。還包括諸如生物素的化學(xué)部分，其通過(guò)與諸如標(biāo)記的抗生物素蛋白的特定相關(guān)的可檢測(cè)部分結(jié)合而被檢測(cè)。其中CDR序列與列于SEQIDNO:n中，其中n為2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，31,32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47或48的那些僅具有非實(shí)質(zhì)性差異的抗體也包括在本發(fā)明的范圍中.非實(shí)質(zhì)性差異包括較少的氨基酸改變，這樣的取代即在CDR序列的任意5個(gè)氨基酸中取代1或2個(gè)氨基酸。通常，氨基酸為具有相似電荷、疏水性或立體化學(xué)特性的相關(guān)氨基酸所取代。這樣的取代應(yīng)為本領(lǐng)域的公知常識(shí)。不像200810003929.4說(shuō)明書(shū)第17/76頁(yè)在CDR中，在結(jié)構(gòu)骨架區(qū)(FR)中可進(jìn)行更實(shí)質(zhì)性的改變而不會(huì)對(duì)抗體結(jié)合特性產(chǎn)生不利影響。FR的iL變，包括但不限于，人源化非人源骨架區(qū)或工程化某些對(duì)抗原接觸或?qū)Ψ€(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)起重要作用的骨架區(qū)殘基，如改變恒定區(qū)的類(lèi)型或亞型，該改變可改變諸如Fc受體結(jié)合的效應(yīng)子作用的特定氨基酸殘基(Lund等.(1991)J.I咖un.H7:2657-2662和Morgan等.(1995)Immunology86:319-324)，或改變恒定區(qū)所衍生自的物種。抗體在重鏈的CB2區(qū)中可具有突變以減少或改變效應(yīng)子作用，如，F(xiàn)c受體結(jié)合和補(bǔ)體激活。例如，抗體可具有諸如在美國(guó)專(zhuān)利第5，624，821和5，648，260號(hào)中所描述的那些突變。例如，在Igd或IgG,重鏈中，上逸突變可在SEQIDNO:53的氨基酸殘基117和120上產(chǎn)生，這些殘基代表了IgdFc的一部分(這些殘基相應(yīng)于Igd或IgG:全長(zhǎng)序列中氨基酸234和237)?？贵w也可具有突變以穩(wěn)定免疫球蛋白兩條重鏈之間的二硫鍵，如披露于Angal等.(1993)Mol.Immunol.30:105-108中的在IgG4絞鏈區(qū)中的突變。D.核酸、克隆和表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明還提供了一種分離的編碼本發(fā)明抗體或結(jié)合片段的核酸。根據(jù)本
發(fā)明內(nèi)容的核酸可包含DNA或RNA，并且可以是全合成或部分合成的。除非上下文另有要求，本文中所提及的核苷酸序列包含具有特定序列的DNA分子，以及包含其中U取代了T的具有特定序列的RNA分子。本發(fā)明的核酸包含如本文中所列出的本發(fā)明的CDR或Vb或l區(qū)的編碼序列。本發(fā)明也提供了以質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體，其包含至少一種上述本發(fā)明的核酸。本發(fā)明也提供了一種宿主細(xì)胞，其包含一或多種上述構(gòu)建體。在本文中提供的編碼任一CDR(Hl，H2，H3，Ll，L2或L3)、Vb或L區(qū)、或特異性抗原結(jié)合片段的核酸作為本發(fā)明的一方面，也提供了一種生產(chǎn)編碼產(chǎn)物的方法。該方法包括編碼核酸的表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)在合適的條件下培養(yǎng)含有核酸的重組宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)表達(dá).接著，使用任意合適的技術(shù)分離和/或純化通過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的、或l區(qū)、或特異性抗原結(jié)合片段，然后在適當(dāng)時(shí)使用?？商峁┓蛛x的和/或純化的根據(jù)本
發(fā)明內(nèi)容的特異性抗原結(jié)合片段、Vb和/或^區(qū)、以及編碼核酸分子和載體，如從它們的天然污染物中分離和/或純化，以基本上純或均一的形式提供，或就核酸而言，除編碼具有所需功能多肽的序列外，不含有或基本上不含有其他來(lái)源的核酸或基因。在多種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是眾所周知的，合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母及桿狀病毒系統(tǒng)。在本領(lǐng)域中可獲得用于表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NS0小鼠黑色素瘤細(xì)胞和許多其他細(xì)胞。常用的細(xì)菌宿主是大腸桿菌。關(guān)于適合產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，參見(jiàn)GeneExpressionSystems,eds.Fernandez等.，AcademicPress,1999。任何與本發(fā)明相容的細(xì)胞可月于產(chǎn)生本發(fā)明所披露的抗體。可選擇或構(gòu)建設(shè)合適的載體，該載體含有合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和其他合適的序列。載體可以是質(zhì)粒或病毒，如合適的噬菌體或噬菌粒。為了解詳情，參見(jiàn)例如,MolecularCloning:aLaboratoryManual:第2版.，Sambrook等.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989。例如，在制備核酸構(gòu)建體、i秀變、測(cè)序、DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)、以及分析蛋白中，用于處理核酸的許多公知的技術(shù)和方案詳細(xì)描述于CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2版.，Ausubel等.eds.,JohnWiley&Sons,1992。因此，本發(fā)明另一方面提供了一種包含本文所披露的核酸的宿主細(xì)胞。還在另一方面提供了一種包括將上述核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。所述導(dǎo)入可使用任何可獲得的技術(shù)。對(duì)于真核細(xì)胞而言，合適的技術(shù)包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-Dextran)、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，如牛痘，或?qū)τ诶ハx(chóng)細(xì)胞而言，桿狀病毒。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞而言，合適的技術(shù)可包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染.在導(dǎo)入后可接著促使或允許核酸的表達(dá)，如，通過(guò)在適合于表達(dá)該基因的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。E.生物保藏編碼非胚系scFv的Myo29，Myo28或Myo22的噬菌粒載體pCANTAB6單獨(dú)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物于2002年10月2日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心UTCC)，保藏號(hào)分別為PTA-4741,PTA-4740和PTA-4739,保藏單位的地址是108O1UniversityBlvd，Manassas,VA20110，U.S.A。II.治療疾病的方法和其它用途本發(fā)明的抗體可用于預(yù)防、診斷或治療人或動(dòng)物中不同的醫(yī)學(xué)疾病。該抗體可用于抑制或減少一或多種與GDF-8或相關(guān)蛋白有關(guān)的活性。最優(yōu)選地，相對(duì)于GDF-8不與抗體結(jié)合的情況，該抗體抑制或減少一或多種GDF-8的活性。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于不結(jié)合一或多種本發(fā)明所披露抗體的成熟GDF-8蛋白活性，當(dāng)結(jié)合一或多種本發(fā)明所披露抗體時(shí)，GDF-8活性被抑制至少50%,優(yōu)選至少60，62，64，66，68，70，72，72，76，78，80，82，84，86或88%,更優(yōu)選至少90，91，92，93或94%,以及甚至更優(yōu)選至少95%到100%,在pGL3(CAGA)12報(bào)告基因測(cè)試(RGA)或ActRIIB受體測(cè)試中可測(cè)定對(duì)GDF-8活性的抑制，報(bào)告基因測(cè)試描述于Thies等.(GrowthFactors(2001)18:251-259)中以及闡述于實(shí)施例2和9中，受體測(cè)試闡述于實(shí)施例3和6中'由本發(fā)明抗體診斷、治療或預(yù)防的醫(yī)學(xué)疾病是肌肉或神經(jīng)肌肉障礙；諸如肥胖癥的脂肪組織障礙；n型糖尿??；葡萄糖耐量降低；代謝綜合征(如X綜合征);諸如燒傷或氮失調(diào)的創(chuàng)傷誘導(dǎo)的胰島素抗性；或諸如骨質(zhì)疏松癥的骨退行性疾病。其他由本發(fā)明所披露的抗體診斷、治療或預(yù)防的醫(yī)學(xué)疾病是與骨質(zhì)丟失相關(guān)的疾病，包括骨質(zhì)疏松癥，特別是在老年人和/或絕經(jīng)后的婦女中，#泉質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏木>癥，骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎，和骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的骨折。其他作為目標(biāo)的代謝性骨病和骨障礙包括由于長(zhǎng)期糖皮質(zhì)激素治療導(dǎo)致的低骨量，生殖腺早衰，雄激素遏抑，維生素D缺乏，繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，營(yíng)養(yǎng)缺乏和神經(jīng)性厭食。本發(fā)明抗體優(yōu)選用于預(yù)防、診斷或治療哺乳動(dòng)物中，特別是在人類(lèi)中的上述醫(yī)學(xué)疾病。本發(fā)明的抗體或抗體組合物以治療有效量的形式給予。一般而言，治療有效量可隨著患者的年齡、身體狀況和性別，以及所患有的醫(yī)學(xué)疾病的嚴(yán)重程度而改變.劑量可決定于醫(yī)師，如需要，可調(diào)整以與所觀察到的療效相適應(yīng)。上述化合物的毒性和療效可通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)或試驗(yàn)動(dòng)物中執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法來(lái)測(cè)定，如，測(cè)定LDso(試驗(yàn)對(duì)象50'/i致死劑量)和EDs。(試驗(yàn)對(duì)象50%有效劑量)。治療指數(shù)指毒性和療效之間的劑量比，可表示為L(zhǎng)D5。/ED5。優(yōu)選具有大的治療指數(shù)的抗體。獲得自細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可用于計(jì)算在人體中使用的劑量范圍。上述化合物的劑量?jī)?yōu)選處于循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，包括具有很少毒性或無(wú)毒性的ED5。。在該范圍內(nèi)劑量基于所采用的劑型和給藥途徑可改變。對(duì)于本發(fā)明所使用的任何抗體而言，治療有效劑量可最初從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中確定。在動(dòng)物模型中可計(jì)算劑量以獲得循環(huán)血漿濃度范圍，包括在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中測(cè)定的IC5。(即達(dá)到癥狀的半最大抑制的受試抗體濃度)。例如，通過(guò)高效液相色譜可測(cè)定血漿水平。通過(guò)合適的生物測(cè)定可檢測(cè)任何特定劑量的效果。合適的生物測(cè)定的實(shí)例包括DNA復(fù)制測(cè)定、基于轉(zhuǎn)錄的測(cè)定、GDF-8蛋白/受體結(jié)合測(cè)定、肌酸激酶測(cè)定、基于前脂肪細(xì)胞分4匕的測(cè)定、基于脂肪細(xì)胞中葡萄糖攝取的測(cè)定，和免疫測(cè)定.一般而言，試用組合物使得抗體或它們結(jié)合片段以ljig/kg-150mg/kg、ljig/kg-100mg/kg、ljig/kg-50mg/kg、ljig/kg-20mg/kg、1(ig/kg-10mg/kg、1[ig/kg-lmg/kg、10jig/kg-lmg/kg、10jig/kg-100(ig/kg、100jig/kg-lmg/kg、以及500jig/kg-1mg/kg的劑量給予。優(yōu)選地，抗體以快速濃注劑形式給予，以達(dá)到服藥后最大時(shí)間長(zhǎng)度內(nèi)抗體循環(huán)水平最大化的目的。在以快速濃注劑給藥后也可采用連續(xù)輸注。用本發(fā)明所披露的抗體治療、診斷或預(yù)防上述醫(yī)學(xué)疾病的方法中也可使用TGF-p超家族中其他蛋白。許多這些蛋白在結(jié)構(gòu)上與GDF-8相關(guān)，如BMP-ll。因此，另外的實(shí)施方案提供了治療上述疾病的方法，該方法通過(guò)單獨(dú)給予患者能抑制BMP-ll或活化素的抗體或與諸如抗GDF-8中和抗體的其他TGF-p抑制劑聯(lián)合給予。本發(fā)明的抗體也可用于治療與BMP-11相關(guān)或由其介導(dǎo)的疾病或病癥，參見(jiàn)，如美國(guó)專(zhuān)利第5，639，638和6，437，111號(hào)。本發(fā)明的抗體也用于在體內(nèi)或體外檢測(cè)屬于諸如BMP-ll和GDF-8的TGF-p超家族蛋白的存在.通過(guò)把這些蛋白的存在或水平與醫(yī)學(xué)疾病相聯(lián)系，本領(lǐng)域技術(shù)人員可診斷湘關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病。所述的醫(yī)學(xué)疾病可通過(guò)上述本發(fā)明所披露的抗體來(lái)診斷.上述檢測(cè)方法在本領(lǐng)域眾所周知，包括ELISA、放射性免疫測(cè)定、免疫印跡、蛋白質(zhì)印跡、免疫焚光檢驗(yàn)法、免疫沉淀法和其他類(lèi)似的技術(shù)?？贵w可進(jìn)一步以包括一或多種這些技術(shù)的診斷試劑盒形式提供來(lái)檢測(cè)蛋白(如，GDF-8)。該試劑盒可含有其他組分、包裝、說(shuō)明書(shū)或其他有助于檢測(cè)蛋白和使用該試劑盒的物質(zhì)。如果抗體意在診斷目的，可能需要對(duì)其進(jìn)行修飾，例如，用配體(如生物素)或可檢測(cè)的標(biāo)記基團(tuán)(如熒光基團(tuán)、放射性同位素或酶)修飾。若有要求，該抗體(無(wú)論是多克隆的還是單克隆的)可使用常規(guī)技術(shù)標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、放射性原子、高電子密度試劑、酶和含有特異性結(jié)合配體的配體。通常可檢測(cè)酶的活性。例如，可通過(guò)用分光光度計(jì)定量檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶將四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)化為藍(lán)色素的能力。其他合適的標(biāo)記可包括生物素和抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素、IgG和蛋白A，以及本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對(duì)。其他修飾或可能進(jìn)行的修飾為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所顯而易見(jiàn)，且被認(rèn)為與本發(fā)明的范圍等同。還在本發(fā)明另一方面提供了一種鑒定用于治療肌肉和骨疾病的治療劑的方法。合適的篩選方法，如基于ELISA的鑒定法，為本領(lǐng)域所公知。在上述篩選方法中，通過(guò)將本發(fā)明的抗體與諸如GDF-8、BMP-11、活化素的配體結(jié)合形成第一結(jié)合混合物；并測(cè)定第一結(jié)合混合物(M。)中配體和抗體之間的結(jié)合量。通過(guò)將抗體、配體和要被篩選的化合物或試劑結(jié)合形成第二結(jié)合混合物，并測(cè)定笫二結(jié)合混合物(MJ中配體和抗體之間的結(jié)合量。接著比較第一和笫二結(jié)合混合物的結(jié)合量，例如，通過(guò)計(jì)算MJM。比值，如果與所觀察到的第一結(jié)合混合物比較，在第二結(jié)合混合物中結(jié)合減少了，那么認(rèn)為該化合物或試劑能抑制GDF-8活性。結(jié)合混合物的配方和最優(yōu)化為本領(lǐng)城所顯而易見(jiàn)的，上述結(jié)合混合物也可含有所需用于增強(qiáng)或優(yōu)化結(jié)合的緩沖液和鹽類(lèi)，以及在本發(fā)明的篩選方法中可包括額外的對(duì)照試驗(yàn).若發(fā)現(xiàn)化合物能減少抗體-配體結(jié)合至少約10%(即，M,/M。〈0.9)，優(yōu)選地大于約30%,則該化合物可得到鑒定，接著，如果需要，在諸如ActRIIB結(jié)合測(cè)定(實(shí)施例2)和其他基于細(xì)胞以及描述于實(shí)施例13、15和16中的體內(nèi)測(cè)定的其他鑒定法中再次篩選具有抑制GDF-8活性的化合物。III.藥物組合物及給藥方法本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所披露抗體的組合物。上述組合物可適于制藥用途及給患者施用。該組合物通常包含一或多種本發(fā)明的抗體和藥學(xué)上可接受的賦形劑。本文中4吏用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的賦形劑"包括與藥物施用相容的溶劑、分散劑、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等的任一或全部。使用上述介質(zhì)和試劑作為藥學(xué)上活性物質(zhì)為本領(lǐng)域眾所周知。該組合物也含有其他能提供補(bǔ)充、額外或增強(qiáng)的治療功能的活性化合物。該藥物組合物也可與指導(dǎo)施用的說(shuō)明書(shū)一起包含于容器、包裝或分配器中。本發(fā)明的藥物組合物可配制與其所需的給藥途徑相容。實(shí)現(xiàn)給藥的方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知，也有可能獲得可局部或經(jīng)口給藥或能通過(guò)粘膜傳遞的組合物，例如，該給藥方式可以是靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或經(jīng)皮給藥。用于皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液通常包括一或多種下列組分諸如注射用水的無(wú)菌稀釋劑、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；諸如爺醇或尼泊金甲酯的抗細(xì)菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉的抗氧化劑；諸如乙二胺四乙酸的螯合劑；諸如醋酸鹽、擰檬酸鹽或磷酸鹽的緩沖液；和諸如氯化鈉或葡萄糖的用于調(diào)節(jié)張力的試劑?？捎弥T如鹽酸或氫氧化鈉的酸或堿調(diào)節(jié)pH。上述制劑可包裝在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量管形瓶中。適于注射的藥物組合物包括無(wú)菌含水溶液或分散液以及用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥而言，合適的栽體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorTMEL(BASF，Parsippany,NJ)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有情況下，組合物應(yīng)為無(wú)菌并且其流動(dòng)性應(yīng)當(dāng)達(dá)到容易注射的程度。在生產(chǎn)和儲(chǔ)存的條件下它必須是穩(wěn)定的，并且必須防止諸如細(xì)菌和真菌的微生物的污染作用。所述載體可以是溶劑或分散劑，例如含有水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如，可通過(guò)包被諸如卵磷脂的包衣劑、保持分散液所需的粒度以及通過(guò)使用表面活性劑保持合適的流動(dòng)性.可通過(guò)各種抗細(xì)菌刑和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、減柳汞等實(shí)現(xiàn)抑制微生物的作用。在很多場(chǎng)合中，優(yōu)選在所述組合物中包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露糖醇、山梨醇的多元醇和氯化鈉?？赏ㄟ^(guò)在組合物中加入延長(zhǎng)吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和凝膠，延長(zhǎng)可注射組合物的吸收時(shí)間。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用栽體。它們可裝在凝膠膠嚢中或壓成片劑。為了達(dá)到口服治療給藥的目的，所述抗體可與賦形劑混合并以片劑或膠嚢形式使用。藥學(xué)上相容的接合劑和/或佐劑材料可添加作為所述組合物的一部分。所述片劑、丸劑、膠嚢等能包含以下成分中的任意一種或包含具有湘似性質(zhì)的化合物諸如微晶纖維素的粘合劑，黃蓍膠或明膠；諸如淀粉或乳糖的賦形劑；諸如藻酸、PrimogelTM或玉米淀粉的分散劑；諸如硬脂酸鎂或SterotesTM的潤(rùn)滑劑；諸如膠狀二氧化硅的滑動(dòng)劑；諸如蔗糖或糖精的甜味劑；或諸如薄荷、水楊酸甲酯或檸檬香劑的香p木劑。為了通過(guò)吸入給藥，抗體以氣溶膠噴霧形式從壓力容器或分液器或噴霧器中遞送，所述壓力容器或分液器包括合適的推進(jìn)劑，例如，諸如二氧化碳的氣體。也可通過(guò)粘膜或經(jīng)皮方式全身給藥。例如，在抗體包含F(xiàn)c部分的情況下，組合物可經(jīng)FcRn受體介導(dǎo)途徑(美國(guó)專(zhuān)利第6，030，613號(hào))通過(guò)黏膜(如，腸、口腔或肺)傳遞。例如，通過(guò)使用錠劑、鼻腔噴霧劑、吸入器或栓劑可實(shí)現(xiàn)經(jīng)粘膜給藥。為達(dá)到經(jīng)皮給藥的目的，活性化合物可配制為本領(lǐng)域的軟膏劑、油膏劑、凝膠或霜?jiǎng)?。為達(dá)到經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥目的，在該制劑中^f吏用適合穿透屏障的滲透劑。所述滲透劑為本領(lǐng)域所普遍公知，并包括，例如去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物本發(fā)明所披露的抗體可與載體一起制備，所述栽體能保護(hù)該化合物免于從體內(nèi)快速清除，諸如控制釋放制劑，包括植入和微膠嚢化遞送系統(tǒng)?？墒褂每缮锝到獾?、生物相容的聚合物，諸如亞乙基乙烯乙酸酯、聚酐、聚甘油酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸。制備上述試劑的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。含有于此所披露的抗體的脂質(zhì)體懸浮液也可用作為藥學(xué)上可接受載體。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如美國(guó)專(zhuān)利第4，522,811號(hào)所述的，可制備這些脂質(zhì)體懸浮液。為了便于給藥以及劑量的一致性，以劑量單位形式配制口服或腸胃外組合物是有利的.本文所用的劑量單位指適合作為要被治療患者的單位劑量的、在物理上獨(dú)立的單位；每個(gè)單位含有預(yù)定數(shù)量的活性化合物，它是計(jì)算出能與必需的藥物載體一起產(chǎn)生所需療效的用量。有關(guān)本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)定，是由活性化合物的特性和要獲得的特定療效，以及本領(lǐng)域中在將上迷活性化合物用于治療個(gè)體所固有的局限性而決定的，并且直接取決于這些因素。下列實(shí)施例提供了本發(fā)明的例證性實(shí)施方案而不以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到許多其他實(shí)施方案也包含于本發(fā)明的范圍中。在本申請(qǐng)全文中所有引用的參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利以及公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此引用作為參考。具體實(shí)施方式實(shí)施例實(shí)施例1:GDF-8的純化將來(lái)自選定的表達(dá)重組人GDF-8蛋白(成熟GDF-8和GDF-8前肽)細(xì)胞系的條件培養(yǎng)液酸化至pH6.5，然后先上80x50mmP0R0ST"HQ陰離子交換柱，再上80x50mmP0ROSTMSP陽(yáng)離子交換柱(PerSeptiveBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。流出液調(diào)至pH5.0,然后上75x20mmPOROSTMSP陽(yáng)離子交換柱(PerSeptiveBiosystems)并用NaCl梯度洗脫。收集由SDS-PAGE證實(shí)的含有GDF-8潛在性復(fù)合體的級(jí)分，用三氟乙酸(TFA)酸化至pH2-3,然后加入200ml0.1%TFA以減低粘度。接著，將該收集級(jí)分上250x21.2mmC5柱(Phenomenex,Torrance,CA)，在該柱前有60x21.2mm的保護(hù)柱(Phenomenex)，并用TFA/乙腈梯度洗脫以將成熟GDF-8與GDF-8前肽分離。含有成熟GDF-8的所收集級(jí)分通過(guò)凍干法濃縮以除去乙腈并添加20ml0.1%TFA,然后，將該樣品上加熱至60oC的250x10mmCs柱(Phenomenex)以便于分離。重復(fù)該步驟直至不再得到更多的分離物。接著收集含有成熟GDF-8的級(jí)分，并加入40%乙腈，然后上600x21.2BioSepTMS-3000體積排阻柱(Phenomenex)，在該柱前有60x21.2的保護(hù)柱。收集含有純化的成熟GDF-8級(jí)分并濃縮用于隨后的試驗(yàn)中。在SDS-PAGE中，純化的成熟GDF-8作為一條寬帶在非還原條件下移動(dòng)至25kDa處并在還原條件下移動(dòng)至13kDa處，鼠GDF-8相似的SDS-PAGE圖譜已報(bào)道于McPherron等.(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1997)94:12457-12461)中，并反映出成熟蛋白的二聚體特性。以類(lèi)似的方法將活性成熟BMP-11二聚體從來(lái)自表達(dá)重組人BMP-ll細(xì)胞系的條件培養(yǎng)液中純化。將活性成熟BMP-ll從來(lái)自表達(dá)重組人GDF-8前肽/成熟BMP-ll嵌合蛋白細(xì)胞系的條件培養(yǎng)液中純化。在50mMTrispH8.0，lMNaCl中的該條件培養(yǎng)液以lml/min的速度加載于10mlTALONTM柱上(Clonetech，PaloAlto，CA)。結(jié)合的蛋白用50mMTrispH8.0,1MNaCl，500mM咪唑洗脫。含有GDF-8前肽/BMP-11潛在性復(fù)合體的收集級(jí)分用10%TFA酸化至pH為3。接著，將該收集級(jí)分上250x4.6mmJupiterC4柱(Phenomenex，Torrance,CA),將該柱子加熱至60°C以為更好地分離成熟BMP-ll和GDF-8前肽，并用TFA/乙腈梯度洗脫。含有成熟BMP-ll的收集級(jí)分遍過(guò)凍干法濃縮。在SDS-PAGE中，純化的成熟BMP-11在非還原條件下移動(dòng)至25kDa處并在還原條件下移動(dòng)至12kDa處，實(shí)施例2:純化的重組人GDF-8的生物活性為闡明GDF-8的活性，使用表達(dá)焚光素酶的報(bào)告載體pGL3(CAGA)u開(kāi)發(fā)報(bào)告基因測(cè)定法(RGA)。先前報(bào)道CAGA序列是位于TGF-JJ誘導(dǎo)基周PA1-1啟動(dòng)子中的TGF-p響應(yīng)序列(Denner等.(1998)EMBOJ.，17:3091-3100)。用堿性熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3(Promega，Madison,WI)制備含有12CAGA盒的報(bào)告載體。將來(lái)自腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(-35/+10)的TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)插入BgIII與HindIII位點(diǎn)之間。含有12個(gè)CAGA盒AGCCAGACA重復(fù)的寡核苷酸退火并克隆入Xhol位點(diǎn)。用FuGENETM6轉(zhuǎn)染試劑(BoehringerManheim，Germany)將pGL3(CAGA)12瞬間轉(zhuǎn)染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系A(chǔ)204(ATCCHTB-82)。在轉(zhuǎn)染后，在48孔培養(yǎng)板上細(xì)胞在補(bǔ)充有2mM谷氨酰胺、100U/ml鏈霉素、100jig/ml青霉素和10%胎牛血清的McCoy's5A培養(yǎng)液中培養(yǎng)16小時(shí)。接著，細(xì)胞于37。C在含有谷氨酰胺、鏈霉素、青霉素和1mg/ml牛血清白蛋白的McCoy's5A培養(yǎng)液中用或不用10ng/mlGDF-8處理6小時(shí)。使用焚光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)定量測(cè)定受試細(xì)胞中的熒光素圖4A顯示了GDF-8最多活化報(bào)告構(gòu)建體10倍，具有10ng/ml的ED50,表明純化的重組GDF-8具有生物活性。BMP-ll和活化素具有類(lèi)似的生物反應(yīng)。實(shí)施例3:在ActRIIB結(jié)合測(cè)定中純化的GDF-8的結(jié)合特性在冰上以20摩爾EZ-Link碌基-NHS-生物素(Pierce，Rockford，Illinois,Cat.No.21217)對(duì)1摩爾GDF-8復(fù)合體的比率生物素化GDF-8潛在性復(fù)合體2小時(shí)。使用0.5%TFA降低pH值以終止反應(yīng)，并將該復(fù)合體上"Jupiter250x4-6mm層析柱(Phenomenex)以使成熟GDF-8與GDF-8前肽分離。收集TFA/CH3CN梯度洗脫的生物素化成熟GDF-8級(jí)分，將該級(jí)分濃縮并4吏用MicroBCATM蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce,Rockford，IL，Cat.No.23235)定量。生物素化成熟BMP-11以上述同樣的方式制備自BMP-ll潛在性復(fù)合體。在96孔平底測(cè)定培養(yǎng)板(Costar，NY，Cat.No.3590)上包被重組ActRIIB-Fc嵌合體(R&DSystems,Minneapolis,MN，Cat.No.339-RB/CF),于4。C在1jig/ml0.2M碳酸鈉緩沖液中反應(yīng)過(guò)夜。然后，用1mg/ml牛血清白蛋白封閉培養(yǎng)板，接著根據(jù)下列ELISA方案進(jìn)行洗滌100jil不同濃度的生物素化GDF-8或BMP-ll的等分試樣加入到封閉的ELISA培養(yǎng)板上，溫育1小時(shí)，洗滌，以及通過(guò)抗生物素蛋白鏈菌素一辣根過(guò)氧化物酶(SA-HRP，BDPharMingen,SanDiegoCA，Cat.No.13047E)再接著添加TMB(KPL，Gaithersburg，MD，Cat.No.50-76-04)來(lái)檢測(cè)GDF-8或BMP-11的結(jié)合量，比色法用MolecularDevices酵標(biāo)儀在450nm下進(jìn)行。如圖l所示，結(jié)合ActRIIB,推定的GDF-8II型受體，的生物素化GDF-8和BMP-ll分別具有15和40ng/ml的ED5。，表明對(duì)于GDF-8和BMPll，在體外結(jié)合測(cè)定中ActRIIB結(jié)合測(cè)定是敏感的.實(shí)施例4:通過(guò)GDF-8cFv嗟菌體文庫(kù)淘選分離Myo22使用作為所述的1.38xl0"文庫(kù)(Vaughan等.(1996)NatureBiotech.，14:309-314)發(fā)展版本的scFv噬菌體文庫(kù)篩選特異于GDF-8的抗體。可溶的GDF-8蛋白(10jig/ml，在50mM,pH9.6的碳酸鈉緩沖液中)包被于微量培養(yǎng)板的孔上，于4。C反應(yīng)過(guò)夜.用PBS洗滌孔，并于37°C在MPBS(含3%Marvel脫脂奶粉的PBS)中封閉2小時(shí)。在1001的3%MPBS中的純化的噬菌體(10"轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu))加入封閉的孔中并在室溫下溫育1小時(shí)。先用PBST(含0.1%v/vTweenTM20)洗孔10次，再用PBS洗孑L10次。用100jil100mM三乙胺在室溫下洗脫結(jié)合的噬菌體顆粒IO分鐘，然后馬上用50jillMpH7.4Tris-HCl中和。用洗脫的噬菌體感染10ml指數(shù)式生長(zhǎng)大腸桿菌TG1。感染的細(xì)胞在2TY肉湯培養(yǎng)基中于37°C固定培養(yǎng)30分鐘，接著于37。C通風(fēng)30分鐘后，然后在2TYAG培養(yǎng)板上劃線(xiàn)接種并于30°C溫育過(guò)夜。從培養(yǎng)板中挖出的克隆置于10ml2TY肉湯培養(yǎng)基中并添加15%甘油，儲(chǔ)存于-70。C。用輔助噬菌體重感染來(lái)自第一輪淘選育種的甘油儲(chǔ)用培養(yǎng)物，并對(duì)之拯救以提供用于第二輪淘選的scFv抗體表達(dá)噬菌體顆粒，用這種方法總共進(jìn)《于三輪淘選。實(shí)施例5:從scFv文庫(kù)中淘選Myo2g和Myo29使用生物素化GDF-8蛋白(bioGDF-8)篩選可溶供選物。BioGDF-8使用濃度為1fig/ml。使用實(shí)施例4所述的scFv文庫(kù)。純化的scFv噬菌體(1012tu)在100jil3%MPBS中封閉30分鐘，然后加入生物素化抗原并在室溫下溫育1小時(shí)。喧菌體/抗原添加到50jilDynalTMM280抗生物素蛋白鏈菌素磁珠中，該磁珠已于37。C在1ml3%MPBS中封閉1小時(shí)并在室溫下再溫育15分鐘。使用磁性網(wǎng)架(magneticrack)捕獲磁珠并在含有0.1%(v/v)TweenTM20的1ml3%MPBS中洗滌四次，然后在PBS中洗滌三次。在最后一次PBS洗滌后，磁珠懸浮于100piPBS中并用于感染5ml指數(shù)式生長(zhǎng)的大腸桿菌TG-1細(xì)胞。細(xì)胞和噬菌體于37。C溫育1小時(shí)(30分鐘固定，30分鐘以250轉(zhuǎn)/分搖動(dòng))，接著在2TYAG培養(yǎng)板上鋪開(kāi)，培養(yǎng)板于30°C溫育過(guò)夜，第二天可見(jiàn)克隆。從培養(yǎng)板上刮下克隆產(chǎn)物并按如上所述拯救噬菌體。按如上所述進(jìn)行第二輪可溶性供選物的篩選。實(shí)施例6:ActRIIB受體抑制測(cè)定和篩選在含有100jil2TYAG的96孔培養(yǎng)板中挑選如實(shí)施例4和5所述獲得的克隆產(chǎn)物。通過(guò)在指數(shù)式生長(zhǎng)的培養(yǎng)物上清液中添加lmMIPTG誘導(dǎo)scFv產(chǎn)生，并于30。C溫育過(guò)衣。基本上如實(shí)施例3所述，篩選具有抑制MoGDF-8結(jié)合ActRIIB食fe力的含有scFv培養(yǎng)物上清液的粗提物。對(duì)該測(cè)定進(jìn)行輕微改良，其中在時(shí)間分辨熒光測(cè)定法(TRF)中使用銪標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素并使用DELFIATM試劑盒(PerkinElmerLifeSciences,Boston,MA)檢承JbioGDF-8的結(jié)合。挑選與不相關(guān)克隆比較顯示了更強(qiáng)押制結(jié)合信號(hào)的陽(yáng)性克隆并測(cè)定以確證活性。在上述抑制測(cè)定中測(cè)試純化的scFv，該scFv通過(guò)受體抑制篩選鑒定來(lái)自陽(yáng)性克隆。scFv濃度滴定法用于確定克隆效價(jià)，在該測(cè)定中效價(jià)通過(guò)ICs。值測(cè)定。圖2顯示了試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)在這些試驗(yàn)中測(cè)定時(shí)，Myo29，Myo28和Myo22的scFv，sICs。分別為2.4nM、1.7nM和60nM。因此，逸些抗體是GDF-8活性的有效抑制劑。實(shí)施例7:通過(guò)噬菌體ELISA鑒定特異性為測(cè)定抗體的特異性，對(duì)于來(lái)自ActRIIB篩選的抗GDF-8陽(yáng)性克隆和不相關(guān)蛋白進(jìn)行噬菌體ELISA。單獨(dú)含有噬菌粒的大腸桿菌克隆在每孔含有100fil2TYAG培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中溫育。添加M13K07輔助噬菌體進(jìn)行冪為10的指數(shù)式生長(zhǎng)培養(yǎng)物的重復(fù)感染(moi),并且培養(yǎng)板在于37°C溫育超過(guò)l小時(shí)。培養(yǎng)板在臺(tái)式離心機(jī)中以2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。除去上清液并將細(xì)胞沉淀再懸浮于100jil2TYAK中，然后于30°C搖動(dòng)溫育過(guò)夜。第二天，培養(yǎng)板以2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將每個(gè)孔的100nl含有噬菌體的上清液轉(zhuǎn)移入新鮮的96孔培養(yǎng)板中。在進(jìn)行ELISA前，噬菌體樣品在室溫下在終濃度為3%MPBS中封閉l小時(shí)'ljig/ml的GDF-8或不相關(guān)蛋白在96孔微量培養(yǎng)板上于4°C包被過(guò)夜.包被后，從孔中除去溶液，接著培養(yǎng)板在室溫下在3%MPBS中封閉l小時(shí).用PBS沖洗培養(yǎng)板，然后在每個(gè)孔中添加50W的預(yù)封閉的噬菌體。培養(yǎng)板在室溫下溫育1小時(shí)，然后用3次更換的PBST洗滌，接著用3次更換的PBS洗滌。在每個(gè)孔中，加入50jU1:5000抗-M13-HRP綴合物(Pharmacia)稀釋液，并將培養(yǎng)板在室溫下溫育1小時(shí)。每塊培養(yǎng)板先用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，在每個(gè)孔中加入50jil的TMB底物并溫育直至顯色。添加25jtl0.5MH2S04停止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀測(cè)讀450nm處吸收率以測(cè)定所產(chǎn)生的信號(hào).證實(shí)了與GDF-8的特異性結(jié)合.實(shí)施例8:scFv測(cè)序、轉(zhuǎn)化為IgG以及胚系化(Gernlining)在2TYAG培養(yǎng)板上劃線(xiàn)接種中和scFv的大腸桿菌克隆，并于30°C溫育過(guò)夜。通過(guò)使用pCANTAB6栽體序列寡核苷酸擴(kuò)增來(lái)自scFv克隆的l和Vl區(qū)，對(duì)來(lái)自這些培養(yǎng)板的三份相同的克隆進(jìn)行測(cè)序。scFv片段的DNA序列用于制備Myo29，Myo28和Myo22IgG's，這些DNA序列分別為SEQIDNO:13，SEQIDNO:7和SEQIDNO:1。使用PCR及特異性克隆引物壙增來(lái)自scFv克隆的重鏈和輕鏈V區(qū)。用合適的限制性?xún)?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物并將其亞克隆入含有人IgG,重鏈恒定區(qū)(對(duì)于l區(qū))或含有合適的人入輕鏈恒定區(qū)(對(duì)于l區(qū))的載體?？赏ㄟ^(guò)對(duì)來(lái)自分離的大腸軒菌克隆的質(zhì)粒DNA測(cè)序來(lái)檢驗(yàn)質(zhì)粒中V區(qū)的錯(cuò)誤插入。質(zhì)粒通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備自大腸桿菌培養(yǎng)物，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將重鏈和輕鏈構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染入COS細(xì)胞中。使用蛋白A瓊月旨糖凝股(Sepharose)(Pharmacia,Peapack，NJ)純化分泌的IgG并將緩沖液交換為PBS。使用scFv克隆的測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)鑒定對(duì)于每個(gè)克隆的重鏈和輕鏈而言最接近的胚系序列。合適的突變通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)定向誘變技術(shù)以及適當(dāng)?shù)耐蛔円锏玫街苽洹Ｍㄟ^(guò)測(cè)序分析確證scFv序列的突變。對(duì)于Myo28和Myo29而言，其胚系scFv以及Vb和Vl區(qū)序列分別列于SEQIDNO:19和SEQIDNO:25。實(shí)施例9:抗體的生物活性圖3A顯示了Myo29與生物素化的GDF-8預(yù)溫育，如實(shí)施例3所述，在ActRIIB結(jié)合測(cè)定中Myo29在10jig/ml下抑制GDF-8與ActRIIB的結(jié)合，具有0.2-0.4nM的IC5。類(lèi)似地在圖3B中，Myo29抑制生物素化BMP-ll與ActRIIB結(jié)合，并具有相同的IC5。.在體外生物測(cè)定中Myo29也阻斷GDF-8活性。作為實(shí)例，當(dāng)GDF-8與Myo29在室溫下預(yù)溫育1小時(shí)時(shí)，在基本上如實(shí)施例2所迷進(jìn)行的RGA測(cè)定中GDF-8生物活性減少了'圖4C顯示了在Myo29存在以及對(duì)GDF-8的ED"20ng/ml的條件下，pGL3(CAGA)12報(bào)告活性的誘導(dǎo)。Myo29減少GDF-8誘導(dǎo)是以劑量-響應(yīng)的方式，具有15-30ng/ml(0.1-0.2nM)的IC5。。Myo29也能以同樣程度抑制BMP-ll的生物活性(圖4B)。相反，在該測(cè)定中活^!素并不受Myo29影響(圖4D)，推測(cè)是由于在GDF-8和活化素之間與GDF-8和BMP-ll相比同源性相對(duì)較低的緣故。在RGA和ActRIIB結(jié)合測(cè)定中也測(cè)試了Myo22和Myo28。這兩個(gè)抗體都阻斷GDF-8和BMP-11活性。例如對(duì)于Myo28，其ICs。為0.2-0.35nM,實(shí)施例10:Myo22，Myo28和Myo29表位作圖為定位抗體的確切表位，代表列于SEQIDNO:49的成熟GDF-8完整序列的48個(gè)重疊的13殘基肽使用斑點(diǎn)合成技術(shù)(Molina等.(1996)PeptideResearch,9:151-155;Frank等.(1992)Tetrahedron,48:9217-9232)在纖維素紙上直接合成。肽之間的重疊部分具有l(wèi)l個(gè)氨基酸。在該陣列中，絲氨酸殘基取代了半胱氨酸殘基以減少由于半胱氨酸存在而引發(fā)的新增的化學(xué)反應(yīng)。纖維素膜用聚乙二醇修飾，F(xiàn)moc-保護(hù)的氨基酸購(gòu)自Abimed(Ugenfeld，Germany),通過(guò)偶聯(lián)P-丙氨酸間隔分子將該陣列固定在纖維素膜上，并使用如前所述的標(biāo)準(zhǔn)DIC(二異丙基碳二亞胺)/HOBt(羥基笨并三唑)偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)來(lái)合成肽(Molina等.(1996)PeptideResearch,9:151-155;Frank等.(1992)Tetrahedron,48:9217-9232)。使用AbimedASP222機(jī)器人點(diǎn)樣活化的氨基酸，手工進(jìn)行洗滌和脫保護(hù)步驟，并在最后一個(gè)合成循環(huán)后將肽N-末端乙酰化。在肽合成后，纖維素膜先在甲醇中洗滌10分鐘，再在阻斷劑(TBST(含有0.1%(v/v)TweenTM20)和1%(w/v)酪蛋白的Tris-緩沖鹽)中洗滌10分鐘。然后，將膜與2.5jig/ml的抗GDF-8抗體在阻斷劑中輕微搖動(dòng)溫育1小時(shí)。在用阻斷劑洗滌3次，每次10分鐘后，膜與HRP-標(biāo)記的二抗(在阻斷劑中含量為0.25jig/ml)溫育30分鐘。然后，膜先用阻斷劑洗滌3次，每次10分鐘，再用TBST洗滌2次，每次10分鐘，使用SuperSignalTMWest試劑(Pierce)和數(shù)碼相機(jī)(Alpha訓(xùn)otechFluoromager)使結(jié)合抗體可見(jiàn)。圖5顯示了結(jié)果。具體地，從圖5中可見(jiàn)，Myo29識(shí)別的表位定位于成熟GDF-8的氨基酸72與88之間。另一方面，Myo22識(shí)別成熟GDF-8序列起始的44個(gè)N末端氨基酸(SEQIDN0:49的氨基酸1-44)中的表位。最后，Myo28識(shí)別的表位包含了位于成熟GDF-8起始的98個(gè)N-末端氨基酸中的殘基，為進(jìn)一步鑒定Myo29識(shí)別的表位，使用點(diǎn)合成進(jìn)行缺失與取代分析。在取代分析中，肽的每個(gè)殘基用除了半胱氨酸外20個(gè)天然氨基酸單獨(dú)取代。如上所述進(jìn)行合成反應(yīng)及結(jié)合測(cè)定。結(jié)果示于圖6，在第一行中，起始兩列和最后三列代表野生型肽對(duì)照物。結(jié)果證明了當(dāng)Lys-78，Pro-81和Asn-83分別單獨(dú)突變?yōu)槠渌被釙r(shí)，Myo29與肽的結(jié)合親和力明顯降4氐。因此，Myo29識(shí)別包含Lys-Xaal-Xaa2-Pro-Xaa3-Asn(SEQIDN0:54)的序列，其中Xaal，Xaa2和Xaa3分別是任意氨基酸，或Xaal=Met，Xaa2=Ser以及Xaa3-Ile，彼此互相獨(dú)立。實(shí)施例11:GDF-8的免疫沉淀反應(yīng)為評(píng)估Myo29和Myo28與成熟GDF-8及GDF-8復(fù)合體的結(jié)合，進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)研究。表達(dá)GDF-8的CH0細(xì)胞用"S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸標(biāo)記。來(lái)自這些細(xì)胞的含有GDF-8蛋白(成熟GDF-8和潛在性復(fù)合體)的100fil條件培養(yǎng)液與20jig/mlMyo29或Myo28于4。C溫育1小時(shí)。加入蛋白A-SepharoseTM并于4°C溫育過(guò)夜'收集免疫沉淀物，再懸浮于還原樣品緩沖液中并用SDS-PAGE分析。固定凝膠，并用放射自顯影增強(qiáng)劑溶液增強(qiáng)，千燥，以及進(jìn)行放射自顯影，圖7顯示了Myo29和Myo28都能免疫沉淀成熟GDF-8、GDF-8潛在性復(fù)合體和未加工的GDF-8。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定，這兩個(gè)抗體在非還原條件下都能結(jié)合GDF-8二聚體。實(shí)施例12:藥物代謝動(dòng)力學(xué)在以1mg/kg劑量的單次靜脈內(nèi)(IV)或腹膜內(nèi)(IP)給藥后，在C57B6/SCID小鼠中評(píng)估Myo29的藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)。給予該動(dòng)物上列劑量的未標(biāo)記的和^I-標(biāo)記的Myo29混合物，并基于血清中mI放射性強(qiáng)度以測(cè)定血清濃度以及該注射劑量的特異性活性.圖8顯示了對(duì)于靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用Myo29而言，血清濃度對(duì)時(shí)間所作的圖。Myo29顯示了大約一周的延長(zhǎng)的終末半衰期和約lml/hr/kg的低清除率。分布的初期容量(initialvolume)約為83ml/kg。分布的表觀容量(apparenvolume)約為227ml/kg。在注射后約6小時(shí)，Myo29達(dá)到峰值濃度。在腹膜內(nèi)注射后吸收率約為77%。實(shí)施例13:Myo29對(duì)肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度的體內(nèi)效應(yīng)為確定Myo29是否在體內(nèi)阻斷GDF-8活性，在成年SCID小鼠中測(cè)試Myo29。SCID小鼠具有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷，并因此在注射諸如Myo29的人抗體后無(wú)法產(chǎn)生免疫反應(yīng).在用Myo29處理的小鼠中，GDF-8活性用肌肉質(zhì)量作為指示。稱(chēng)重雄性C57B6SCID八周大小的小鼠，并根據(jù)體重均勻地分為8組。將處于PBS緩沖液中的Myo29以不同劑量(60,10和lmg/kg)每周一次注射入小鼠腹膜內(nèi)。在第一周給予兩倍劑量。栽體(PBS)處理的或未處理的小鼠用作為對(duì)照。該處理持續(xù)四周。肌肉質(zhì)量通過(guò)在處理后解剖并稱(chēng)重腓腸肌和四頭肌來(lái)評(píng)估。在處理四周后，在所有用Myo29處理的組中肌肉質(zhì)量增加了10-23%，用更高劑量處理的組能達(dá)到顯著性水平(圖9，p<0.01),在另一個(gè)實(shí)例中，雌性CB17SCID小鼠用Myo29每周一次以不同劑量(10，5，2.5和1mgAg)處理4或12周。再者，用Myo29處理4周可引起用h腸肌和四頭肌重量增加10%-20%(圖10A和10B)。更長(zhǎng)時(shí)間的處理(12周)則引起肌肉質(zhì)量更多的增加(12%-28%)，在所有用Myo29處理的組中均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性水平(圖11A和11B).為確定增加的肌肉質(zhì)量是否導(dǎo)致更強(qiáng)壯的肌肉，用握力計(jì)測(cè)定前肢肌肉強(qiáng)度(1027csx型，ColumbusInstruments,Columbus,0H)。處理12周后，與載體對(duì)照相比，用5mg/kg或10mg/kgMyo29處理的小鼠中前肢強(qiáng)度分別提高了17%和23%"<0.01，圖12)。該研究結(jié)果證明了Myo29在體內(nèi)抑制GDF-8活性并導(dǎo)致肌肉質(zhì)量和肌肉強(qiáng)度顯著增加》實(shí)施例14:治療代謝失調(diào)注入抑制性抗體的GDF-8抑制劑可用于治療代謝失調(diào)，如n型糖尿病、葡萄糖耐量降低、代謝綜合征(如X綜合征)、創(chuàng)傷誘導(dǎo)的胰島素抗性(如燒傷或氮失調(diào))和脂肪^a織病(如，肥胖癥)。本發(fā)明的抗GDF-8抗體可用于治療疾病發(fā)作或具有確定的代謝病的患者。使用已公認(rèn)的肥胖癥、胰烏素抗性和n型糖尿病鼠動(dòng)物模型來(lái)確證抗GDF-8抗體用于治療代謝失調(diào)，如n型糖尿病和/或肥胖癥的療效，該動(dòng)物模型包括ob/ob,db/db和攜帶致死黃色突變的品系。也可通過(guò)給予包括C"BL/6J的某些品系的小鼠高脂肪或高卡路里飲食以誘發(fā)胰烏素抗性.類(lèi)似于人，這些嚙齒動(dòng)物發(fā)展為胰島素抗性、高胰烏素血癥、異常脂血癥、以及葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的劣化所引發(fā)的高血糖癥?？苫谘逯衅咸烟?、胰島素和脂質(zhì)的測(cè)定結(jié)果來(lái)評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)胰島素耐量測(cè)試和葡萄糖耐量測(cè)試來(lái)確定改善胰島素敏感度的手段。更多的敏感度技術(shù)可包括使用血糖正常的一高胰島素血癥夾子(clamp)來(lái)評(píng)估甘油酯對(duì)照和胰鳥(niǎo)素敏感度的改善。此外，該夾子(clamp)技術(shù)可允許定量評(píng)估葡萄糖主要分布組織(肌肉、脂肪和肝臟)在改善的甘油酯對(duì)照試驗(yàn)中所起的作用。在一研究中，用諸如Myo29(腹膜內(nèi)注射)的抗GDF-8抗體或載體處理1周至6個(gè)月。該處理方案可不同，可進(jìn)行不同劑量和治療用藥法(如，每日一次、每周一次或每周兩次注射)的測(cè)試。與安慰劑處理的小鼠相比，可預(yù)計(jì)到用抗GDF-8抗體處理的小鼠具有更多的葡萄糖攝取、增加的糖酵解和糖原合成、更低的游離脂肪酸和血清甘油三酯?？笹DF-8抑制性抗體也用于預(yù)防疾病和/或用于減少疾病的嚴(yán)重程度和/或癥狀?？深A(yù)期抗GDF-8抗體可以皮下注射方式給予，經(jīng)常地每天一次和偶爾地每月一次。治療持續(xù)時(shí)間從一個(gè)月到幾年。為測(cè)試在人體中抗GDF-8的臨床療效，鑒定患有或處于n型糖尿病危險(xiǎn)中的受試者并隨機(jī)分入治療紐.治療組包括安慰劑組和給予抗體(不同劑量)的一到三組。預(yù)期在一個(gè)月到三年后評(píng)估個(gè)體葡萄糖代謝的改變?？深A(yù)期接受治療的個(gè)體將具有改善的癥狀?？贵w作為單一活性化合物給藥或與其他化合物或組合物聯(lián)合給藥。當(dāng)作為單一活性化合物給藥或與其他化合物或混合物聯(lián)合給藥時(shí)，取決于癥狀的嚴(yán)重程度和疾病的進(jìn)展，劑量?jī)?yōu)選從約1jig/kg-20mg/kg,選擇用于臨床治療的合適的有效劑量范圍如下ljig/kg-20mg/kg、lfig/kg-10mg/kg、ljig/kg-l邁g/kg、10^g/kg-lmg/kg、10jig/kg-100pg/kg、100jig/kg-lmg/kg以及500fig/kg-lmg/kg。治療用藥法和結(jié)果的實(shí)例概述于表3中。表3:臨床病例的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>根據(jù)本說(shuō)明書(shū)中所引用參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)可最徹底地理解本說(shuō)明書(shū)，所有參考文獻(xiàn)的全文在此引用作為參考。說(shuō)明書(shū)中的實(shí)施方案提供了本發(fā)明實(shí)施方案的例證而不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到許多其他實(shí)施方案包括在本發(fā)明的權(quán)利要求中，且意在于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例僅被認(rèn)為是例證的，下列權(quán)利要求表明了本發(fā)明的真正范圍和精神.序列表〈110>WyethCambridgeAntibodyTechnology<120〉抗GDF-8的中和抗體及其用途〈130〉8702.020-304<160〉54〈170〉Patentln3.1版〈210〉1〈211〉786〈212〉DNA〈213〉人〈400〉1gaggtgcagctgttggagtctgggggaggctcctgtgcagcctctggattcacctttagcccagggaaggggctggagtgggtctcagctgcagactccgtgaagggccggttcaccatcctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacccctgtactggtggaagctgctacgacaccaccgtctcgagtggaggcggcggttcaggccagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtcctgcactgggagcagctccaacatcgggttggtacagcctggggggtccctgagactc'60agctatgccatgagctgggtccgccaggct120attagtggtagtggtggtagcacatactac180tccagagacaattccaagaacacgctgtat240acggccgtgtattactgtgagagaatgggg300cttggcaactggggccggggcaccctggtc360ggaggtggctctggcggtggcggaagtgca420tctggggccccagggcagagggtcaccatc480gcaggttatgatgtacactggtaccagcaa540cttccaggcgcggcccccaaactcctcatccctgaccgattctctgtctccaagtctggccagcctgccgatgagggtgtttattactgcaaggtgttcggccaagggaccaagctgacccatc3caggggtaatggcaatcggccctcaggggtc600tactcagcctccctggccatcactgggctg660cagtcctatgacagcagtctgagtggttcg720gtcctaggtgcggccgcacatcatcatcac780786〈210〉2〈211〉262〈212〉PRT<213>人<400〉2GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095GluArgMetGlyProCysThrGlyGlySerCysTyrAspThrLeuGly100105110AsnTrpGlyArgGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGly115120125SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAlaGinSerValLeu130135140ThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGinArgValThrlie145150155160SerCysThrGlySerSerSerAsnlieGlyAlaGlyTyrAspValHis165170175TrpTyrGinGinLeuProGlyAlaAlaProLysLeuLeulieArgGly180185190AsnGlyAsnArgProSerGlyValProAspArgPheSerValSerLys195200205SerGlyTyrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGinProAlaAsp210215220GluGlyValTyrTyrCysGinSerTyrAspSerSerLeuSerGlySer225230235240LysValPheGlyGinGlyThrLysLeuThrValLeuGlyAlaAlaAla245250255HisHisHisHisHisHis260〈210〉3〈211〉372〈212〉腿〈213〉人〈400〉3gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactac180gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgagagaatgggg300ccctgtactggtggaagctgctacgacacccttggcaactggggccggggcaccctggtc360accgtctcgagt372〈210〉4〈211〉124〈212〉PRT〈213〉人〈400〉4GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095GluArgMetGlyProCysThrGlyGlySerCysTyrAspThrLeuGly100105110AsnTrpGlyArgGlyThrLeuValThrValSerSer115120〈210>5<211〉336〈212〉DNA<213〉人〈400〉5cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatc60tcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtaccagcaa120cttccaggcgcggcccccaaactcctcatcaggggtaatggcaatcggccctcaggggtc180cctgaccgattctctgtctccaagtctggctactcagcctccctggccatcactgggctg240cagcctgccgatgagggtgtttattactgccagtcctatgacagcagtctgagtggttcg300aaggtgttcggccaagggaccaagctgaccgtccta〈210〉6〈211〉112<212>PRT〈213〉人<400>6GinSerValLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin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ProlieAsnMetLeuTyrPheAsnGlyLysGluGinlielieTyrGly859095LyslieProAlaMetValValAspArgCysGlyCysSer100105〈210〉50〈211〉320<212〉DNA〈213〉人〈400〉50gtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaag60ccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtgg120cctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaac180aaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagt240cccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtgg300cccctacagaatgttcatag320〈210〉51〈211〉106〈212〉PRT〈213〉人〈400〉51GlyGinProLysAlaAlaProSerValThrLeuPheProProSerSer151015GluGluLeuGinAlaAsnLysAlaThrLeuValCysLeulieSerAsp202530PheTyrProGlyAlaValThrValAlaTrpLysAlaAspSerSerPro354045ValLysAlaGlyValGluThrThrThrProSerLysGinSerAsnAsn505560LysTyrAlaAlaSerSerTyrLeuSerLeuThrProGluGinTrpLys65707580SerHisArgSerTyrSerCysGinValThrHisGluGlySerThrVal859095GluLysThrValAlaProThrGluCysSer100105〈210〉52〈211〉992〈212〉DNA〈213〉人<400〉52cctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg60gcacagcggcpctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgt120ggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcag180gactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacct240acatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagccca300aatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggac360cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctg420aggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggt480acgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca540gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagg600agtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca660aagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggaga720tgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcg780ccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgc840tggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggc900agcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc960agaagagcctctccctgtccccgggtaaatga992〈210〉53〈211〉330〈212〉PRT〈213〉人〈400〉53AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys151015SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSer505560LeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGinThr65707580TyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys859095LysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys100105110ProAlaProGluLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro115120125LysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys130135140ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp145150155160TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu165170175GluGinTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu180185190HisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTy:rLysCysLysValSerAsn195200205LysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGly210215220GinProArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu225230235240MetThrLysAsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr245250255ProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsn260265270AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe275280285LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsn290295300ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr305310315320GinLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys325330〈210〉54〈211〉6〈212〉PRT〈213〉任意〈220〉〈221〉MISC一FEATURE〈222〉(2).(3)〈223〉任意氨基酸〈220〉〈221〉MISC一FEATURE<222〉(5)..(5)〈223〉任意氨基酸〈400〉54LysXaaXaaProXaaAsn151權(quán)利要求1.一種分離的抗體或抗體片段，其包含選自SEQIDNO8、SEQIDNO20，或包含SEQIDNO8、SEQIDNO20的片段；以及其中所述抗體或抗體片段能與GDF-8或BMP-11特異性結(jié)合。2.權(quán)利要求l的抗體，所述抗體包含SEQIDNO:n的氨基酸序列，其中n為lO、12、22、24、37、38、39、40、41或42。3.權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體能與包含列于SEQIDNO:54的氨基酸序列的蛋白特異性結(jié)合。4.權(quán)利要求3的抗體，其中SEQIDNO:54具有下述至少一種特征(a)SEQIDNO:54的第二個(gè)氨基酸是甲硫氨酸；(b)SEQIDNO:54的第三個(gè)氨基酸是絲氨酸；和(c)SEQIDNO:54的第五個(gè)氨基酸是異亮氨酸。5.權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體是人抗體。6.權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體是IgG!或IgG4。7.權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體的氨基酸序列被修飾以減少或改變效應(yīng)子功能。8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述抗體還含有SEQIDNO:53的氨基酸序列，所述氨基酸序列在相應(yīng)于SEQIDNO:53的氨基酸117或氨基酸120處的殘基被修飾。9.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是IgGu或IgG&。10.—種藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求l的抗體。11.一種分離的編碼權(quán)利要求l抗體的核酸。12.—種表達(dá)載體，所述載體包含權(quán)利要求ll的核酸。13.—種宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求12的載體。14.權(quán)利要求ll的核酸，其中所述核酸包含SEQIDN0:n的核苷酸序列，其中n為7、9、11、19、21或23。15.—種制備與GDF-8特異性反應(yīng)的抗體的方法，所述方法包括(a)提供編碼可變區(qū)核酸的起始庫(kù)，該可變區(qū)包括要被取代的CDR3或缺失CDR3編碼區(qū)；(b)將該庫(kù)與編碼如SEQIDN0:n中所述的氨基酸序列的供體核酸結(jié)合，其中n是從37-42的整數(shù)，使得該供體核酸插入該庫(kù)的CDR3區(qū)中，以致提供了一種編碼可變區(qū)的核酸的產(chǎn)物庫(kù)；(c)表達(dá)該產(chǎn)物庫(kù)的核酸；(d)篩選特異于GDF-8的特異性抗原結(jié)合片段；和(e)收集該特異性抗原結(jié)合片段或編碼該結(jié)合片段的核酸。16.—種通過(guò)權(quán)利要求15的方法產(chǎn)生的抗體。17.—種用于鑒定GDF-8抑制劑的方法，所述方法包括(a)制備包含權(quán)利要求l的抗體和GDF-8的第一結(jié)合混合物；(b)測(cè)定第一混合物中抗體與GDF-8之間的結(jié)合量；(c)制備包含抗體、GDF-8、受試化合物的第二結(jié)合混合物；和(d)測(cè)定第二混合物中抗體與GDF-8之間的結(jié)合量，18.權(quán)利要求l的抗體在制備增加肌肉強(qiáng)度或質(zhì)量的藥物中的用途。19.權(quán)利要求l-9中任一項(xiàng)的抗體在制備用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中至少一種肌肉、骨或葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài)疾病的藥物中的用途.20.權(quán)利要求19的用途，其中所述哺乳動(dòng)物是人。21.權(quán)利要求19的用途，其中所述疾病是神經(jīng)肌肉障礙。22.權(quán)利要求19的用途，其中所述疾病是肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、Duchenne氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、肌肉萎縮、器官萎縮、腕管綜合征、充血性阻塞性肺病，少肌癥，惡病質(zhì)、肌肉萎縮綜合征或肌萎縮性側(cè)索硬化。23.權(quán)利要求19的用途，其中所述疾病是肥胖癥或脂肪組織病。24.權(quán)利要求19的用途，其中所述疾病是X綜合征、葡萄糖耐量降低、創(chuàng)傷誘導(dǎo)的胰島素抗性或n型糖尿病。25.權(quán)利要求l-9中任一項(xiàng)的抗體在制備用于哺乳動(dòng)物中(a)修復(fù)肌肉損傷，(b)增加肌肉質(zhì)量或強(qiáng)度，和(c)增加葡萄糖耐量當(dāng)中至少之一的藥物中的用途。26.權(quán)利要求25的用途，其中所述(a)的損傷的肌肉是心肌或(b)隔膜。27.權(quán)利要求19-26任一的用途，其中所述抗體以有效劑量給予哺乳動(dòng)物，所述有效劑量選自lng/kg-150mg/kg、lpg/kg-100mg/kg、ljig/fcg-50mg/kg、lpg/kg-20mg/kg、lpg/kg-10mg/kg、ljig/kg-lmg/kg、10jig/kg-lmg/kg、10jig/kg-100pg/kg、100jig/kg-lmg/kg以及500fig/kg-lmg/kg。全文摘要本發(fā)明涉及抗GDF-8的中和抗體及其用途。本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容提供了新的抗生長(zhǎng)分化因子-8(GDF-8)的抗體，具體地，提供了人抗體，以及抗體片段，包括在體外和/或體內(nèi)抑制GDF-8活性的那些。本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容也提供了用于診斷、預(yù)防或治療肌肉或骨退行性障礙，或胰島素代謝失調(diào)的方法。文檔編號(hào)C07K16/00GK101230102SQ200810003929公開(kāi)日2008年7月30日申請(qǐng)日期2003年10月22日優(yōu)先權(quán)日2002年10月22日發(fā)明者A·菲爾德,C·拉塞爾,G·M·維爾德曼,K·格羅夫-布里奇斯,M·V·達(dá)維斯,N·M·沃爾夫曼,V·瓦爾格-阿徹,宋克寧申請(qǐng)人:惠氏公司;劍橋抗體科技有限公司