專利名稱：嵌合體動物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嵌合體非人動物，其制備方法及使用方法。若使用本發(fā)明的嵌合體非人動物，則可以在動物體內(nèi)保持，表達1Mb(百萬堿基對)以上的巨大DNA片段，這在目前尚不能做到。因此，利用本發(fā)明可做到 ·可制作保持、表達編碼生物活性物質(zhì)基因的全長，如人抗體基因全長的動物。從該動物得到的生物活性物質(zhì)具有醫(yī)藥品的利用價值。
·可對動物中的人巨大基因(組織相容性抗原、肌營養(yǎng)不良白蛋白等)進行功能分析。
·可用于制備人顯性遺傳性疾病和染色體異常癥的動物模型。

背景技術(shù)：
在動物中表達外來基因的技術(shù)，即轉(zhuǎn)基因動物的制作技術(shù)，不僅有利于獲得有關(guān)基因在生物體內(nèi)功能的信息，而且可用于檢測調(diào)控基因表達的DNA序列(例，Magram等，自然，315338，1985)，建立人類疾病的動物模型(山村等，疾病小鼠模型手冊，中山書店，1994)，家畜的繁殖(例，Muller等，Experientia，47923，1991)，以及利用它生產(chǎn)有用的物質(zhì)(例，Velander等，美國國家科學院院刊，8912003，1992)。目前為止應用最多的是以小鼠作為轉(zhuǎn)基因的對象。作為實驗動物，已對小鼠進行了全面研究，且已建立了胚胎操作技術(shù)，所以小鼠是最適宜的哺乳動物。
已知外源基因轉(zhuǎn)移到小鼠的方法大致有兩種。1種是將DNA注入受精卵的原核(Gordon等，美國國家科學院院刊，777380，1980)，另一種是將DNA轉(zhuǎn)移到全能胚胎干細胞(以下稱作ES細胞)，制作嵌合體小鼠的方法(Takahashi等，發(fā)育，102259，1988)。在后者的嵌合體小鼠中，僅僅在提供ES細胞的細胞和組織中保留轉(zhuǎn)移基因，而在經(jīng)ES細胞分化的生殖細胞而獲得的后代所有細胞和組織中均保留轉(zhuǎn)移基因。目前應用該技術(shù)已制備了大量的轉(zhuǎn)基因小鼠。
但是，由于目前可轉(zhuǎn)移DNA的大小受到限制，也大大限制了該技術(shù)的應用范圍。這種限制依賴于可以被克隆的DNA的大小，目前為止轉(zhuǎn)移最大DNA片段的1例是將大約670kb的DNA片段克隆到酵母人工染色體(YAC)中(Jakobovits等，自然，365255，1993)。該實驗是將含有YAC的酵母與ES細胞融合而進行的。YAC中可克隆大約2Mb的外源DNA(Den Dunnen等，人類分子基因，119，1992)，但由于在出芽酵母細胞中，同源DNA序列間重組的發(fā)生率高，所以以完整形式保持具有很多重復序列的人的DNA片段是很困難的。事實上，在含有人基因組DNA的YAC文庫中大約發(fā)生20～40％的重組(Green等，基因組，11584，1991)。
另外償試的一個方法是，在顯微鏡下切斷由人的培養(yǎng)細胞而得到的中期染色體，然后將片段(估計10Mb以上)注入小鼠受精卵中(Richa等，科學，245175，1989)。在所得到的小鼠中能檢測到人特異的DNA序列(Alu序列)，但不能證實有人基因的表達。此外，這里所應用的制備染色體的方法中，將染色體固定于載玻片時，由于使用了醋酸甲醇，不可避免地DNA出現(xiàn)小片段，所注入的DNA以完整形式存在的可能性很小。
無論如何，目前為止尚無將1Mb以上的外源連續(xù)DNA轉(zhuǎn)移到小鼠進行表達的報道。
已知那些希望轉(zhuǎn)移到小鼠、有益的且吸引人的人類基因，如抗體(例Cook等，Natune Genetics，7162，1994)、T細胞受體(Hood等，冷泉港分析生物學研討會，Vol.LVIII，339，1993)、組織相容性抗原(Carrol等，美國國家科學院院刊，848535，1987)、肌營養(yǎng)不良蛋白(DenDunnen等，同前)，其編碼區(qū)域的大小至少為1Mb。由于人類抗體是很重要的醫(yī)藥品，所以人們期望能夠制作保持、表達人免疫球蛋白重鏈(～1.5Mb，Cook等，同前)、輕人類分子遺傳學鏈κ(～3Mb，Zachau，基因，135167，1993)、輕鏈λ(～1.5Mb，F(xiàn)rippiat等，4983，1995)基因全長的小鼠，但目前該領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)尚無法完成(Nikkei Biotec，1993，7.5.)。
人類顯性遺傳疾病、引起先天異常的染色體異常癥(唐氏綜合征等)的許多誘因基因尚不能克隆，只能利用染色體上大致位置的信息。例如，對中期染色體進行吉姆薩染色所得到的G帶，通常在數(shù)Mb～10Mb大小。由此可發(fā)現(xiàn)某些誘因基因存在于特定的G帶上，而將這些異常表型轉(zhuǎn)移到小鼠的時候，有必要將誘因基因周圍的染色體片段(數(shù)Mb以上)進行轉(zhuǎn)移，這也是目前的技術(shù)達不到的。
因此，希望能開發(fā)一種能將長度超過1Mb限制的外源DNA導入到小鼠中并使其表達的技術(shù)。
應用目前的技術(shù)，可以將超過上述界限的DNA轉(zhuǎn)移到動物的培養(yǎng)細胞中。這主要以染色體(人染色體的大小為50～300Mb)為介質(zhì)進行。有一些關(guān)于將染色體移入細胞的方法的報道(例，McBride等，美國國家科學院院刊，701258，1973)，其中微細胞法是只將1條所選染色體進行轉(zhuǎn)移的最佳方法(Koi等，日本癌癥研究雜志，80413，1989)。叫做微細胞的構(gòu)造體是用核膜和質(zhì)膜包裹一至數(shù)條染色體。經(jīng)抑制某種細胞中紡綞體形成的抑制劑誘導形成微細胞，分離它，與受體細胞融合，可轉(zhuǎn)移少數(shù)(大多數(shù)為1條)染色體。用這種方法所得到的，只含有1條人類染色體的單染色體雜交細胞的文庫，可用于已知基因的作圖，說明未知抑癌基因、細胞老化基因所存在的染色體(例，Saxon等，EMBO J.，53461，1986)。此外，還可用γ-射線照射微細胞，將所得染色體片段的一部分進行轉(zhuǎn)移(Koi等，科學(Science)，260361，1993)。如上所述，微細胞法是將1Mb以上的DNA轉(zhuǎn)移到動物培養(yǎng)細胞中的一種適宜的方法。
隨著ES細胞這一能穩(wěn)定保持全能性細胞的發(fā)現(xiàn)(Evans等，自然(Nature)，292154，1981)，從培養(yǎng)細胞到能制備小鼠的愿望成為現(xiàn)實?？梢詫⑼庠椿?、各種突變及目的基因重組造成的突變基因均可轉(zhuǎn)移到ES細胞，可在小鼠水平進行大范圍的基因修飾(例，Mansour等，自然(Nature)，336348，1988)。導入巨大DNA的意思是以前面所講的克隆到Y(jié)AC載體中的可能的外源DNA片段的大小為界限的。目前將較長的DNA導入培養(yǎng)細胞的染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)還不能用于小鼠的基因轉(zhuǎn)移，相信這是難以完成的(村松等，轉(zhuǎn)基因生物學，講談社Scientific，p143-，1989)。
理由如下。
將人的染色體轉(zhuǎn)移到正常核型的受體細胞ES細胞是轉(zhuǎn)移染色體異常。至今人們認為如果發(fā)生顯微鏡下可識別的染色體水平的基因異常，通常對小鼠的胚胎發(fā)生是致死性的(Gropp等，實驗動物雜志(實驗動物學，228253，1983)；相沢慎一，生物技術(shù)手冊系列8，基因打靶，羊土社，1995)。
·我們所能得到的人染色體通常是有限增殖的正常纖維母細胞、或是癌細胞等分化的體細胞，將這樣來源于體細胞的染色體轉(zhuǎn)移到未分化的ES細胞的時候，會引起ES細胞的分化(Muller等，自然(Nature)，311438，1984)或老化(Sugawara，科學(Science)，247707，1990)。
·將體細胞來源的染色體轉(zhuǎn)移到初期胚胎中，在胚胎的發(fā)育過程中能否起到與來源于生殖細胞的染色體一樣的功能、確保各種組織、細胞中特異基因的表達，關(guān)于這一問題所進行的研究很少。二者最大的差異之一是關(guān)于染色體DNA的甲基化狀態(tài)。甲基化伴隨細胞的分化而有所不同，這表明甲基化對于組織特異性基因的表達起到主要作用(Ceder，細胞，533，1988)。例如，有這樣的報道，在活化抗體基因?qū)λM行的基本的位點特異性DNA重組反應中，將甲基化的底物轉(zhuǎn)移到B細胞，若復制后也保持甲基化狀態(tài)，就阻礙重組反應(Hsieh等，EMBO.J.，11315，1992)。此外，與生物體內(nèi)相比所建立的細胞株中，容易發(fā)生從頭甲基化(Antequera等，細胞，62503，1990)?；谀壳暗难芯浚荒芎唵蔚卦O想，纖維母細胞、人-鼠雜交細胞中高度甲基化的抗體基因在小鼠的B細胞中正常表達。
必需注意的是這里有III mensee等的兩個相關(guān)報道(美國國家科學院院刊，751914，1978；美國國家科學院院刊，76879，1979)。一個是人的肉瘤細胞與小鼠EC細胞融合，另一個是大鼠的肝癌細胞與小鼠EC細胞融合，用得到的融合株制作嵌合體小鼠。這些報道中，對實驗結(jié)果指出了許多問題，其可靠性低(野口等，小鼠畸胎瘤，理工學社，5版，1987)。此外，盡管人們期望能早日探討清楚，但是報道發(fā)表后的17年至今沒有成功重復這些實驗的報道。因此我們認為根據(jù)這些報道，在小鼠體內(nèi)保持外源染色體，并表達該染色體上的基因是不可能的。
在目前的狀況下，將染色體片段那樣的巨大DNA轉(zhuǎn)移到小鼠等動物體內(nèi)并使之表達是很困難的，實際上，自上面III mensee等的報道以來沒有對此問題進行研究。
因此，本發(fā)明的目的是提供嵌合體非人動物及其后代，以及其制作方法，其中該動物保持外源染色體或其片段，并能表達該染色體或其片段上的基因。
另外，本發(fā)明的目的是提供來源于上述嵌合體非人動物及其后代的組織和細胞。
本發(fā)明的另一目的是提供雜交瘤，該雜交瘤是上述嵌合體非人動物及其后代的細胞與骨髓瘤融合而形成。
本發(fā)明還有一目的是提供制備生物活性物質(zhì)的方法，它是非人動物、其組織或細胞來表達外源染色體或其片段上基因的表達產(chǎn)物。
發(fā)明公開 為了解決上述問題，本發(fā)明人進行了多種研究，結(jié)果是用微細胞法成功地將來源于人正常纖維母細胞的染色體或其部分片段轉(zhuǎn)移到ES細胞中，得到能穩(wěn)定保持它們的克隆。并且他們從該ES細胞株得到嵌合體小鼠，該小鼠的正常組織中保持有人染色體，并且能表達包含人抗體重鏈基因的數(shù)個人基因。我們通過這一系列方法能夠制備保持巨大DNA片段并表達該DNA片段上基因的動物，而這在目前是不可能的。
本發(fā)明的主旨如下 (1)嵌合體非人動物的制備方法，其特征在于制備含有一個或幾個外源染色體或含有其片段的微細胞，通過與該微細胞融合，將上述的單一或幾個外源染色體或其片段導入具有分化多能性的細胞中。
(2)含有單一或幾個外源染色體或其片段的、具有分化多能性的細胞的制備方法，其特征在于，制作含有一個或幾個外源染色體或含有其片段的微細胞，通過與該細胞融合，將上述的單一或幾個染色體或其片段移入具有分化多能性的細胞中。
(3)用上述(1)的方法能夠制備的保持有單一或多個外源染色體或其片段，并表達該染色體或其片段上基因的嵌合體非人動物及其具有同一特性的后代。
(4)用(2)的方法能夠制備的含有一個或幾個外源染色體或其片段、具有分化多能性的細胞。
(5)(4)中具有分化多能性的細胞用于制備嵌合體非人動物。
(6)上述(3)中的嵌合體非人動物或其后代交配而得到的保持有一個或幾個外源性染色體或其片段、并表達該染色體或其片段上基因的非人動物或其后代。
(7)來源于(3)的嵌合體非人動物或其后代或來源于(6)的非人動物或其后代的組織。
(8)一種細胞，其來源于(3)的嵌合體非人動物或其后代或來源于(6)的非人動物或其后代。
(9)上述(8)的細胞與骨髓瘤細胞融合而得到的雜交瘤。
(10)一種非人動物及其后代，其制備是將(3)的嵌合體非人動物或其后代或?qū)?6)的非人動物或其后代與上述染色體或其片段上同一基因或相似基因缺陷的非人動物系交配而得到的。
(11)一種生物活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于在(3)的嵌合體非人動物或其后代、組織或細胞中或在(6)的非人動物或其后代、組織或細胞中表達一個或幾個外源染色體或其片段上的基因，回收作為表達產(chǎn)物的生物活性物質(zhì)。
(12)一種制備生物活性物質(zhì)的方法，其特征在于，將(3)或?qū)?6)的嵌合體非人動物或其后代與缺乏上述染色體或其片段上同一基因或相似基因的非人動物系交配，在所得到的子代動物、組織或細胞中表達上述一個或幾個外源染色體或其片段上的基因，并回收作為表達產(chǎn)物的生物活性物質(zhì)。
附圖簡述

圖1表示保持有人2號染色體(片段)的A9細胞的分析結(jié)果(PCR分析)。
圖2表示E14耐藥株中保持有人的22號染色體(片段)(PCR分析)。
圖3是一電泳的照片圖，它表明在由于移入了22號染色體的ES細胞而來的嵌合體小鼠中保持有人的L 1序列(Southen分析)。
圖4是一電泳的照片，它表明在導入了人22號染色體的嵌合體小鼠的臟器中保持有人染色體(PCR分析)。
圖5是一電泳的照片，它表明了在導入了人22號染色體的嵌合體小鼠中，人基因表達的結(jié)果(RT-PCR)。
圖6是一電泳的照片，它表明了在導入了人22號染色體的嵌合體小鼠的臟器中，人基因表達的結(jié)果(RT-PCR)。
圖7表示在E14耐藥株中保持有人的4號染色體(片段)(PCR)。
圖8是一電泳的照片，它表示在導入了人4號染色體的E14細胞株中，對人L1序列的檢測結(jié)果(Southern)。
圖9是一電泳的照片，它表明在由導入了人4號染色體的ES細胞而來的嵌合體小鼠中，保持有人L1序列(Southern)。
圖10表示在TT2耐藥株中保持有人14號染色體(片段)(PCR)。
圖11是一電泳的照片，它表明在由導入了人4號染色體的ES細胞而來的嵌合體小鼠的臟器中，保持有人染色體(PCR)。
圖12表示尾部來源的纖維母細胞對G418抗性的試驗結(jié)果。
圖13表示經(jīng)人血清白蛋白免疫的嵌合體小鼠血清中人IgM抗體的濃度(ELISA)。
圖14表示經(jīng)人血清白蛋白免疫的嵌合體小鼠血清中人IgG抗體的濃度(ELISA)。
圖15表示產(chǎn)生人IgM的雜交瘤克隆H4B7的分析結(jié)果(ELISA)。
圖16是一染色體形態(tài)的照片，它表明保持有人2號和14號染色體片段的小鼠ES細胞株(TT2細胞株P(guān)G15)的FISH分析結(jié)果。
圖17表示在經(jīng)人血清白蛋白免疫的嵌合體小鼠血清中抗人血清白蛋白的人IgG抗體的效價增加。
圖18表示在經(jīng)人血清白蛋白免疫的嵌合體小鼠血清中，抗人血清白蛋白的人Igκ抗體的效價增高。
圖19是一電泳的照片，它表示在導入了人22號染色體的TT2細胞中，人L1序列的檢測結(jié)果(Southern分析)。
圖20表示在經(jīng)人血清白蛋白免疫的嵌合體小鼠血清中，抗人血清白蛋白的人Igλ抗體的效價增高。
圖21表明在導入了人2號染色體部分片段的嵌合體小鼠的后代中，保持有人2號染色體的部分片段(PCR)。
圖22表明在導入了人14號染色體的嵌合體小鼠脾臟中，有細胞表面表達人μ鏈的細胞存在(流式細胞術(shù)分析)。
圖23表明LoxP-pst NEO質(zhì)粒DNA的構(gòu)建。
圖24表明小鼠抗體重鏈Cμ基因組DNA的結(jié)構(gòu)。
圖25表明小鼠抗體輕鏈κ基因組DNA的結(jié)構(gòu)。
圖26表明小鼠抗體重鏈靶向載體、Southern印跡法中應用的探針及在同源重組體中能夠檢測到的DNA片段的結(jié)構(gòu)。
圖27表明小鼠抗體輕鏈κ的靶向載體、Southern印跡法中應用的探針及在同源重組體中能夠檢測到的DNA片段的結(jié)構(gòu)。
圖28是一電泳的照片，它表明小鼠抗體重鏈同源重組體及由同源重組體而來的高濃度G418耐藥株的Southern印跡分析結(jié)果。
實施本發(fā)明的最佳方式 保持有人染色體或其片段、并表達該染色體或其片段上的基因的小鼠，其制備如下 (1)制備保持有標記的人染色體或其片段的染色體供體細胞 (2)用微細胞法將人染色體或其片段移入具有分化多能性的小鼠細胞中 (3)用上述小鼠細胞制作嵌合體小鼠， (4)證實在嵌合體小鼠中保持有人染色體，并表達人基因。
這里，保持有人染色體或其片段、表達該染色體或其片段上的基因的非人動物是以小鼠為例的(此后，小鼠稱作“導入人染色體的小鼠”)。
術(shù)語“人染色體”指自然形成的復合體，它由人細胞的核酸和蛋白質(zhì)組成。正常的人類染色體有46條，23種(男性為24種)，每條染色體約含50-300Mb的DNA。本發(fā)明中，獨立染色體是指能穩(wěn)定復制、分離的部分片段，并且也包括能異位到小鼠染色體上，穩(wěn)定保持的部分片段。DNA的大小通常在1Mb以上，也有小于1Mb的情況。本發(fā)明的特征是以染色體為介質(zhì)在小鼠內(nèi)保持、表達人基因，而不用在大腸桿菌、酵母等中克隆或從細胞中提取DNA。
導入人染色體的小鼠指，在其全部或部分正常體細胞中保持有一個或幾個人染色體或其片段。另外，指在其全部或部分體細胞中表達人染色體上的一個或幾個人基因。
(1)制備保持有標記的人染色體或其片段的染色體供體細胞 所希望的染色體供體細胞是1)保持有標記物標記的人染色體，而該標志物可用于受體細胞的篩選2)不含除此之外的人染色體3)形成微細胞的能力高。
來源于人的任何細胞株、癌細胞和原代培養(yǎng)細胞均可用作提供人染色體的物質(zhì)，但正常纖維母細胞較合適，因為它的染色體發(fā)生缺失，擴增等異?，F(xiàn)象的可能性較小，且容易培養(yǎng)。
首先，對(1)來講，人細胞可用表達耐藥性(G418，嘌呤霉素，潮霉素，殺稻瘟素)等標記基因的載體進行轉(zhuǎn)化。希望用于調(diào)節(jié)標記基因的啟動子，不僅在人細胞中而且在小鼠ES細胞等受體細胞中也能很好地發(fā)揮作用。為了達到這一目的可應用與SV和增強子聯(lián)結(jié)的單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Katoh等，細胞結(jié)構(gòu)功能(Cen Struct.Funct.，12575，1987)、小鼠PGK-1啟動子(Soriano等，細胞，64693，1991)。用電穿孔法(石田等，細胞工學實驗操作入門，講談社，1992)進行轉(zhuǎn)化，將導入的標記基因隨機插入23種、46條人染色體上，隨后進行篩選，可得到人細胞轉(zhuǎn)化體文庫。
對于3)，由于大多數(shù)的人正常細胞形成微細胞的能力較低，可將上述的轉(zhuǎn)化體與形成微細胞能力較高的細胞，如小鼠A9細胞(Oshimura，M.，環(huán)境和健康展望，9357，1991)進行整個細胞融合，由此可提高其形成微細胞的能力。已知在小鼠-人的雜交細胞中，人染色體的選擇性消失，用上述的標記物進行選擇，所得到的融合細胞能穩(wěn)定保持標記了的人染色體。
為了滿足2)的條件，希望從這種融合細胞得到微細胞，然后再度與小鼠A9細胞融合。這種情況下用人染色體上的標記物進行選擇，所得到的微細胞株大多能滿足1)、2)、3)的條件。可在最后得到的小鼠-人單染色體雜交細胞中，通過PCR(聚合酶鏈式反應，Saiki等，科學，239487，1988)、Southern印跡分析(Ausukel等，現(xiàn)代分子生物學方法，John Wiley和Sons，Inc.1994)、FISH(熒光原位雜交，Lawrence等，細胞，5251，1988)分析等來鑒定標記的人染色體。如果想轉(zhuǎn)移特定的染色體，則對多個人細胞轉(zhuǎn)化體克隆的每個克隆重復上述過程，檢測目的染色體被標記的克隆。或者對人細胞轉(zhuǎn)化體克隆的混合物實施上述過程，對所得的大量小鼠-人單染色體雜交細胞進行人染色體的鑒定。
此外，可通過所期望染色體上DNA序列的同源重組(Thomas等，細胞，51503，1987)，將標記基因插入到特定的部位。
用γ射線照射小鼠-人雜交細胞制備的微細胞，標記的人染色體成為片段，可移到小鼠A9細胞中。即使微細胞不經(jīng)γ射線照射，部分片段化的人染色體也可以一定的比例轉(zhuǎn)移。這時所得到的微細胞融合株保持了標記的人染色體的部分片段。當想把染色體部分片段轉(zhuǎn)移到受體細胞的時候可應用這些克隆。
(2)向保持有分化多能性的小鼠細胞移入人染色體或其片段。
到目前為止已有這樣的報道，將來源于各種品系小鼠的胚胎腫瘤細胞(EC細胞，Hanaoka等，分化，4883，1991)、胚胎干細胞(ES細胞，Evan等，自然，292154，1981)、胚胎生殖細胞(EG細胞，Matsui等，細胞，70841，1992)注入小鼠的初期胚胎或與之共同培養(yǎng)，可形成正常體細胞，即可制成嵌合體小鼠。ES、EG細胞的這種能力尤其高，許多情況下它們可對生殖細胞起作用，由這些細胞可得到其后代。EC細胞主要從生殖細胞癌獲得，ES細胞來源于胚泡的內(nèi)部細胞塊，EG細胞來源于胚胎發(fā)生初期出現(xiàn)的原始生殖細胞。作為本發(fā)明中移入人染色體的可用這些細胞株及受體細胞其突變株，以及在小鼠中能分化成其全部或部分正常體細胞的任何未分化細胞。
可用由(1)中得到的人染色體供體細胞制備的微細胞或經(jīng)γ射線照射的微細胞作為移到受體細胞中的人染色體的物質(zhì)?？捎们逅匦校毎こ虒W手冊，羊土社，1992中所記載的方法，將受體細胞與微細胞融合，從而把人的染色體轉(zhuǎn)移到受體細胞。微細胞供體細胞中保持有在受體細胞中可以篩選某些人染色體或其片段的標記。應用同(1)一樣的PCR、Sonthem印跡分析、FISH分析等方法，可以從中篩選保持有導入的目的基因或染色體或其片段的克隆，這樣可轉(zhuǎn)移任何人染色體或其片段。另外，依次導入含有不同選擇標記的幾個染色體或其片段，可得到同時保持這些標記的受體細胞。此外，可從已轉(zhuǎn)移了人染色體的細胞克隆中選擇移入的染色體數(shù)目增加了的克隆。這通常是通過提高加到培養(yǎng)液中的篩選藥物的濃度而完成的。
通過下面的方法來證實經(jīng)人染色體上的標記(G418耐性，等)所篩選的受體細胞是否保持供體細胞所保持的全部或部分人染色體。用從篩選的受體細胞中提取的基因組DNA、以人特異的重復序列(L1，Alu等，Korenberg等，細胞，53391，1988)或人基因作探針進行Sonthern印跡分析。或者，用人基因特異的引物進行PCR，以及用人染色體特異的探針進行熒光原位雜交(FISH)等染色體分析方法來進行驗證。
(3)從導入人染色體的ES細胞制備嵌合體小鼠 參照相沢慎一，基因工程手冊，8，基因打靶，羊土社，1995等所描述的方法，從(2)中得到的ES細胞株制備嵌合體小鼠。為了有效地制備嵌合體小鼠，在選擇宿主胚胎的發(fā)生期、品系時，希望用對各個ES細胞株已回顧過的條件。例如，對于CBA×C57BL/6F1來源的TT2細胞(野鼠色，Yagi等，分析生物化學，21470，1993)，希望選用Balb/c(白化體，日本CREA社)或ICR(白化體，日本CREA社)來源的8細胞期胚胎作宿主胚。
(4)嵌合體小鼠中人染色體的保持及人基因的表達。
通過毛色來粗略判斷在由注入了ES細胞的胚胎而產(chǎn)生的小鼠中，ES細胞的貢獻率。但是，即使對毛色一點貢獻也沒有也不能判斷沒有貢獻給其它組織。更為詳細的，可以嵌合體小鼠的各組織中提取基因組DNA，用Sonthern印跡分析、PCR等方法來證實各組織中是否保持人染色體。
通過以下的方法來證實導入的人染色體上基因的表達。用各組織的RNA、通過RT-PCR法(Kawasaki等，美國國家科學院院刊，855698，1988)、Northern印跡法(Ausubel等，同前)來檢測人染色體mRNA的表達?？捎门c小鼠同種蛋白質(zhì)的交差反應性最小的抗人蛋白質(zhì)抗體，通過酶免疫測定法(ELISA，富山·安東，單克隆抗體實驗手冊，講談社Sentific，1987；石川，超高敏感度酶免疫測定法，學會出版中心，1993)、Western印跡法(Ausubel，同前)或者利用電泳泳動度的差別進行同功酶分析(Koi等，日本癌癥研究，80413，1989)等方法來檢測蛋白質(zhì)水平的表達。另外，嵌合體小鼠細胞中人染色體的保持及該染色體上基因的表達，可通過在嵌合體小鼠原代培養(yǎng)細胞中出現(xiàn)表達耐藥性標記基因的耐藥性細胞而證實的。
例如，用與小鼠抗體產(chǎn)生交差反應性最小的抗人Ig抗體進行酶免疫測定法，可檢測由ES細胞所制備的嵌合體小鼠的血清中人IgM、IgG、IgA等，而該ES細胞保持存在人免疫球蛋白重鏈的人14號染色體中?；蛘?，用來源于人的抗原(如血清白蛋白)免疫嵌合體小鼠，將其脾細胞與小鼠的骨髓瘤融合，通過ELISA對此雜交瘤(安東·千葉，單克隆抗體實驗操作入門，講談社Scientific，1991)進行篩選，可得到能產(chǎn)生人免疫球蛋白重鏈的雜交瘤。
以上以小鼠為例說明了保持人染色體或其片段、表達該染色體或其片段上基因的嵌合體非人動物的制作方法，但本發(fā)明中，移入到嵌合體非人動物的染色體或其片段并不限于人，而包括廣泛的外源染色體或其片段，并表達該染色體或其片段上的基因。這里“外源染色體”是以轉(zhuǎn)移到保持有分化多能性的細胞中，在嵌合體非人動物中能表達該染色體或其片段上的基因為特征，其來源的生物種類沒有特別限制。應用本發(fā)明的方法，不僅可制作嵌合體小鼠，也可制作其它的嵌合體動物，如大鼠、豬等哺乳類及其它種類的嵌合體動物。有這樣的報道，ES細胞或ES樣細胞在小鼠以外的動物種類中建立，如在大鼠(Iannaccone等，發(fā)育生物學，163，288-，1994)、豬(Wheeler等，繁殖、生殖和發(fā)育，6，563-，1994)、牛(Sims等，美國國家科學院院刊，91，6143-6147，1994)等，也有用鳉、雞等做過償試(轉(zhuǎn)基因動物，蛋白質(zhì)核酸酶，1995年10月增刊，共立出版)。已知，將ES樣細胞(ED細胞)至少經(jīng)過10代傳代以上而獲得的上皮樣細胞的核移植到未受精卵中，這樣在綿羊中可正常發(fā)育(Campben等，自然，380，64-，1996)。這樣通過以ES或ES樣細胞作受體細胞，移入外源染色體，可與用小鼠一樣，制作出保持外源染色體或其片段、表達該染色體或其片段上基因的嵌合體非人動物。
本發(fā)明中，保持被轉(zhuǎn)移的外源染色體或其片段，具有分化多能性的細胞并不局限于上述的ES細胞、EC細胞和EG細胞。例如可以將外源染色體或其片段轉(zhuǎn)移到骨髓干細胞，而通過這種向骨髓干細胞活體的移植，可進行遺傳病的治療。
保持外源染色體的ES細胞在嵌合體非人動物中分化成生殖細胞時，其所繁殖的后代也能保持轉(zhuǎn)移的染色體或其片段，并能表達導入染色體或其片段上的基因。
利用上面所得到的嵌合體非人動物或其后代來表達外源染色體或其片段上的基因，回收表達產(chǎn)物，可制造生物活性物質(zhì)。具體而言，在能表達外源染色體或其片段上基因的條件下飼養(yǎng)嵌合體非人動物或其后代，然后從動物的腹水和血液中回收表達產(chǎn)物?；蛘咴谀軌虮磉_外源染色體或其片段上基因的條件下培養(yǎng)嵌合體非人動物或其后代的組織、細胞或獲得不死性的細胞(例如，與骨髓瘤細胞融合而形成的不死性雜交瘤)，然后從培養(yǎng)物中回收表達產(chǎn)物。此外可將從這些嵌合體非人動物、或其后代的組織、細胞或它們的不死性細胞中提取的外源染色體或其片段、或?qū)?gòu)成外源染色體或其片段的DNA、或?qū)⑶逗象w非人動物或其后代的組織、細胞或它們的不死性細胞中保持的外源染色體或其片段來源的cDNA轉(zhuǎn)化到動物細胞或昆蟲細胞如CHO細胞、BHK細胞、肝癌細胞、骨髓瘤細胞、SF9細胞)，在表達外源染色體或其片段上基因的條件下培養(yǎng)該細胞，從培養(yǎng)物中回收表達產(chǎn)物(如特定抗原特異的抗體蛋白質(zhì)等)。用離心等眾所周知的方法進行回收，并用硫酸銨分級分離、分配色譜、凝膠過濾色譜、吸附色譜、制備薄層色譜等已知的方法進行純化。生物學活性物質(zhì)包括外源染色體上所編碼的任何物質(zhì)，如抗體、尤其是抗人抗體。例如，可克隆從嵌合體動物的脾細胞或其雜交瘤等不死性細胞而來的染色體上的人抗體基因，轉(zhuǎn)移到中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和骨髓瘤細胞，就能生產(chǎn)人抗體(Lynette等，生物工程學，10，1121-，1992；Bebbington等，生物工程學，10，169-，1992)。
本發(fā)明中所得到的保持人2號、14號、22號染色體(片段)的嵌合體小鼠及其后代保持有人抗體重鏈(14號染色體上)、輕鏈κ(2號染色體上)、輕鏈λ(22號染色體上)各種基因功能序列的大部分。也就是說，與利用酵母人工染色體等轉(zhuǎn)移人抗體基因的一部分這一已知的轉(zhuǎn)基因小鼠相比(Green等，Nature Genetics，7，13-，1994，Lonberg等，自然，368，856-，1994等)，能夠表達與人非常相似的、非常多樣的人抗體庫(repertory)。另外，依照本發(fā)明所得到的同時保持2號+14號、22號+14號等染色體(片段)的嵌合體小鼠及其后代、以及它們交配所得到的同時保持2號+14號+22號等染色體(片段)的小鼠及其后代，可產(chǎn)生重鏈、輕鏈二者均來源于人的完全人抗體。這些小鼠可識別人抗原，把它當作異物與之進行免疫反應，這樣可產(chǎn)生抗原特異的人抗體。這些特性對于得到治療用的人單克隆抗體、多克隆抗體非常有益(Green等，同前；Lonberg等，同前)。另一方面，為了更有效地獲得對特定抗原親和性高的人抗體，希望能制成不產(chǎn)生小鼠抗體、只產(chǎn)生人抗體的小鼠(Green等，同前；Lonberg等，同前)。本發(fā)明中可根據(jù)下面已知的方法A或方法B來完成。
方法A利用小鼠抗體缺陷的ES細胞及小鼠抗體缺陷的嵌合體宿主胚的方法 方法B從導入了人染色體的嵌合體小鼠得到保持人染色體的后代，與小鼠抗體基因缺陷的小鼠品系進行交配的方法 以下對A、B每種方法的典型實施例進行具體描述。
方法A的具體過程 1.用目的基因同源重組(Joyner等，基因打靶，1993，IRL出版)的方法破壞小鼠ES細胞中以2拷貝存在的小鼠抗體重鏈基因中的一個。隨后通過定點特異重組除去基因破壞部分兩側(cè)可能的序列，如loxP序列(用Cre重組酶進行重組，Sauer等，同前，用FLP重組酶-FRT序列O′Gorman等，科學，251，1351-，1991等例)，在基因破壞的部位插入G418耐藥基因等標記基因。
2.在高濃度藥物存在的條件下培養(yǎng)上述一個抗體重鏈基因被破壞了的耐藥性小鼠ES細胞，選擇耐高濃度藥物的克隆。通過篩選這些克隆可獲得兩個抗體重鏈基因均被破壞了的克隆(相沢慎一，同前)。
3.將在1中耐藥基因的兩端插入的重組序列間引起定點特異性重組的酶基因，如Cre重組酶基因(Sauer等，同前)瞬時轉(zhuǎn)移到2中所得到的2個抗體重鏈基因場被破壞了的小鼠ES細胞中，去除插入到能在loxP序列間引起重組反應的2個抗體重鏈基因中的耐藥性基因，選擇這樣的藥物敏感性克隆(高津圣志等，實驗醫(yī)學分冊，免疫研究的基本技術(shù)，p255-，1995，羊土社)。
4.對小鼠抗體輕鏈κ基因重復上述1-3的操作過程，最終可獲得抗體重鏈和κ鏈完全缺失的藥物敏感性克隆。
5.以4的克隆(抗體重鏈、κ鏈缺失的小鼠ES細胞)作受體細胞，通過微細胞融合導入用耐藥標記基因(如G418耐藥基因)標記了的、含有人抗體重鏈基因的人14號染色體(片段)。
6.以5中所得到的克隆為受體細胞，通過微細胞融合，導入用與5中不同的耐藥標記基因(如嘌呤霉素耐藥基因)標記了的、含有人抗體輕鏈基因的人2號染色體(片段)或22號染色體或二者均導入。
7.以從不能產(chǎn)生自身抗體的小鼠品系(如RAG-2基因敲除小鼠，Shinkai等，細胞，68，855-，1992；膜型μ鏈敲除小鼠，Kitamura等，自然，350，423-，1991)得到的胚胎為宿主胚，用6中得到的ES細胞制作嵌合體小鼠。
8.所得嵌合體小鼠中的大多數(shù)功能性B淋巴細胞來源于ES細胞(高津圣志等，實驗醫(yī)學分冊，免疫研究的基礎技術(shù)，P234，羊土社，1995)。由于這種B淋巴細胞缺乏小鼠重鏈、κ鏈，所以主要由導入的染色體上功能性人抗體基因的表達而產(chǎn)生人的抗體。
方法B的具體過程 1.從保持含有人抗體重鏈、輕鏈κ或輕鏈λ的人染色體或其片段的嵌合體小鼠得到能穩(wěn)定保持這些人染色體或其片段并可連續(xù)傳給下一代的后代。
2.從1中所得能表達抗體重鏈或輕鏈的小鼠品系或由其交配而得到表達人抗體重鏈和輕鏈的小鼠品系，將該品系與缺乏自身抗體基因的小鼠品系(如膜型μ鏈基因敲除小鼠，同前；輕鏈κ敲除小鼠，Chen等，EMBO J.，3，821-，1993)進行交配，可得到缺乏小鼠抗體重鏈及輕鏈的純合子及保持含人抗體重鏈(14號)+輕鏈κ(2號)、抗體重鏈(14號)+輕鏈λ(22號)或人抗體重鏈(14號)+輕鏈κ(2號)+輕鏈λ(22號)的人染色體的小鼠品系。在這一小鼠品系中由于缺乏小鼠抗體重鏈、輕鏈κ基因，所以只要由于轉(zhuǎn)移的染色體上功能性人抗體基因的表達而只產(chǎn)生人的抗體。
上述的方法A和方法B不只用于生產(chǎn)人抗體，而且可用于生產(chǎn)外源染色體上存在的任何基因的表達產(chǎn)物。
以下用實施例進行具體說明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。(實施例1)保持G418耐性標記的人染色體(片段)的染色體供體細胞的制備 用限制性酶SalI(寶酒造)將含有G418耐性基因的質(zhì)粒pSTneoB(Katoh等，細胞的結(jié)構(gòu)、功能，12575，1987；日本研究生物制品保藏中心(JCRB)，保藏號VE 039)線性化，導入人的正常纖維母細胞HFL-1(RIKEN細胞庫，RCB0251)。用胰酶處理HFL-1細胞，以5×106細胞/ml的濃度懸浮在Dulbecco′s磷酸緩沖鹽水(PBS)中，在10μg DNA存在的情況下，用基因脈沖儀(Bio-Rad)進行電穿孔(石田等，細胞工程學實驗操作入門，講談社，1992)。以25μF的電容，用4mm距離的電穿孔細胞(165-2088，Bio-Rad)在室溫下加1000V的電壓。將電穿孔的細胞接種到3-6個100mm的組織培養(yǎng)用的塑料平皿中(Corning)，其中含有增加了15％胎牛血清(PBS)的Eagle′s F12培養(yǎng)基(以下稱作F12)。1天后，換用含有200μg/ml G418(GENETICIN，Sigma)，添加了15％FBS的F12培養(yǎng)基。2-3周后，收集形成的克隆，100個為一組，共52組，然后將每一組的克隆重新接種到100mm的平皿中，進行培養(yǎng)。
用添加了10％胎牛血清(PBS)的Dulbecco′s改良培養(yǎng)液(以下為DMEM)，在100mm的平皿中培養(yǎng)小鼠A9細胞(Oshimura，環(huán)境和健康展望.，9357，1991，JCRB0211)。分別在100mm平皿中用補充了15％胎牛血清(FBS)和200μg/ml的G418的F12培養(yǎng)52組G418抗性HFL-1細胞。用胰酶處理小鼠A9細胞和HFL-1細胞，每種細胞取1/4-1/2進行混合，在100mm平皿中將添加了10％胎牛血清(FBS)的DMEM與添加了15％胎牛血清(FBS)的F12進行等量混合，將細胞接種到混合物中培養(yǎng)半天到一天。參照(清水等，細胞工程學手冊，羊土社，p.127-，1992)所描述的方法進行細胞融合。用DMEM洗滌細胞表示2次，之后在2ml PEG(1∶1.4)溶液中處理1分鐘，再換用2ml PEG(1∶3)溶液處理1分鐘。吸去PEG溶液后用無血清培養(yǎng)基(DMEM)洗滌3次，之后用常規(guī)的培養(yǎng)基(10％FBS、DMEM)培養(yǎng)1天。用胰酶處理細胞使之分散，懸浮劑含有烏木箭毒苷(1×10-5M，Sigma)和G418(800μg/ml)的二重選擇培養(yǎng)基中，接種到3枚100mm的平皿中。大約培養(yǎng)3周后，用胰酶處理生成的克隆使之分散，在含有G418(800μg/ml)的選擇培養(yǎng)基(10％FBS、DMEM)上培養(yǎng)。
用胰酶處理細胞使之分散后，將2組收集為1組，在6個25cm2離心用的培養(yǎng)瓶中(Costar，3025)培養(yǎng)到細胞密度達到70-80％的匯合度。換成含Colcemid(0.05μg/ml，demecolcine，和光純藥)的培養(yǎng)基(20％FBS、DMEM)，培養(yǎng)2天以形成微細胞。去除培養(yǎng)液，用預溫(37℃)的細胞松弛素B溶液(10μg/ml，Sigma)充滿離心用培養(yǎng)瓶，將瓶插入到丙烯酰基離心容器內(nèi)，在34℃，以800rpm離心1小時。當小鼠A9細胞達到80％匯合狀態(tài)時，向25cm2瓶中加入純化的微小核，用PEG溶液進行融合。在含G418的選擇培養(yǎng)基中分離形成的克隆。用以下的方法來鑒定各克隆中所保持的人染色體(2號、4號、14號、22號)。除上面以外的所有實驗操作及試劑均參照(清水等，細胞工程學手冊，羊土社，p.127-)。
(1)PCR分析 培養(yǎng)分離的細胞，用Puregene DNA分離試劑盒(Gentra System社)提取基因組DNA，以該基因組DNA為模板、用人染色體特異的引物、通過PCR來選擇保持有2、4、14、22號人染色體的克隆。PCR的擴增大約使用0.1μg的基因組DNA(Innis等，PCR實驗手冊，HBJ出版局，1991，熱循環(huán)儀，GeneAmp 9600，Perkin-Elmer社)。Taq聚合酶購自Rerkin-Elmer公司，反應條件是94℃、5分鐘1循環(huán)后、94℃變性，15秒、54℃～57℃、退火15秒鐘(根據(jù)引物而適當改變)、72℃延伸20秒，進行35個循環(huán)?？捎萌旧w上存在的基因(O′Brien，基因圖譜，第6版，Book 5，Cold Spring HarborLaboratony Press，1993)和多形性標記(多形性STS引物對，BIOS社；Weissenbach等，自然359794，1992；Walter等，Nature Genetics，722，1994)等作引物。可以GenBank、EMBL等數(shù)據(jù)庫獲得的堿基序列為基礎來制作基因引物。下面將以實施例來說明每個染色體的多形性引物的名稱和基因引物的序列(2號實施例1，4號實施例6，14號實施例9，22號實施例2)。用以下所示的基因標記和多形性標記(多形性STS引物對，BIOS社D2S207，D2S177，D2S156，D2S 159。BIOS社)來鑒定2號染色體。
Cκ(免疫球蛋白κ恒定區(qū))5′-TGGAAGGTGGATAACGCCCT(序列號1)，5’-TCATTCTCCTCCAACATTAGCA(序列號2) FABP1(肝脂肪酸結(jié)合蛋白-1)5’-GCAATCGGTCTGCCGGAAGA(序列號3)，5’-TTGGATCACTTTGGACCCAG(序列號4) Vk3-2(免疫球蛋白κ可變區(qū))5′-CTCTCCTGCAGGGCCAGTCA(序列號5)，5′-TGCTGATGGTGAGAGTGAACTC(序列號6) Vk1-2(免疫球蛋白κ可變區(qū))5’-AGTCAGGGCATTAGCAGTGC(序列號7)，5’-GCTGCTGATGGTGAGAGTGA(序列號8) (2)熒光原位雜交(FISH) 根據(jù)(松原等，F(xiàn)ISH實驗方案，秀潤社，1994)所記載的方法，用人2號、4號、14號、22號染色體特異的探針(CHROMOSOMEPAINTING SYSTEM，Cambio社)進行FISH分析。
例如在26組(745克隆)中有10組可以得到保持2號染色體的克隆。其中有5個克隆對2號染色體特異的引物全部呈陽性，將這些克隆進行FISH分析。根據(jù)(松原等，F(xiàn)ISH實驗方案，秀潤社，1994)所記載的方法，用人2號染色體特異的探針(CHROMOSOMEPAINTING SYSTEM，CANBIO社)進行FISH分析。在對所有引物呈現(xiàn)陽性的細胞中可觀察到人2號染色體的完整形態(tài)，在只對一部分引物陽性的一些克隆中可觀察到比人2號染色體較小的獨立染色體，或觀察到含有與人2號染色體以外的染色體發(fā)生融合的染色體的細胞(圖1)。圖1中橫軸為克隆名稱，縱軸為PCR中應用的引物。●表示陽性，×表示陰性。底行表示通過FISH所觀察到的人2號染色體存在的形態(tài)。未做描述的表明沒有實施。
同樣可得到保持人2號、14號、22號染色體的A9細胞。(實施例2)用微細胞法將人22號染色體導入小鼠ES細胞。
用(實施例1)中得到的保持人22號染色體的A9細胞株(以下稱作A9/#22)作染色體供體細胞。用小鼠ES細胞株E14(Martin L.Hopper，Hooper等，自然，326292，1987)作染色體受體細胞。參照(相沢慎一，生物手冊，8，基因打靶，羊土社，1995)所描述的方法培養(yǎng)E14細胞，并用絲裂霉素c(Sigama)處理的G418耐性STO細胞株(大阪大學，近藤壽人教授)作飼養(yǎng)細胞。首先，參照清水等(細胞工程學手冊，羊土社，1992)所報道的方法，從大約108A9/#22制備微細胞。將所得微細胞懸浮到5ml的DMEM中。用胰酶分散大約107的E14，之后用DMEM洗滌3次，懸浮到5ml的DMEM中，然后混合微細胞，1250rpm、離心10分鐘，棄上清。輕扣沉淀使之分散，加入0.5ml的1∶1.4PEG溶液(5g PEG 1000(和光純藥)、1mlDMSO(Sigma)溶解到6ml DMEM中)，室溫靜置1分30秒，然后緩慢加入10ml的DMEM。立即離心1250rpm，10分鐘，棄上清，將沉淀懸浮到30ml培養(yǎng)ES細胞用的培養(yǎng)基中，接種到3個直徑100mm、接種了飼養(yǎng)細胞的組織培養(yǎng)用塑料瓶(Corning)中。24小時后，換成添加了300μg/ml G418(GENETICIN，Sigma)的培養(yǎng)基，其后，每天換培養(yǎng)基。1周-10天后出現(xiàn)耐藥性克隆，其出現(xiàn)頻率為每107個E14細胞出現(xiàn)0-5個。挑選克隆進行增殖，每5×106個懸浮到1ml的保存培養(yǎng)基<ES細胞培養(yǎng)液+10％DMSO(Sigma)>中，-80℃凍存。同時用Puregene DNA分離試劑盒(Gentra System社)從每種耐藥克隆的106×107個細胞中制備基因組DNA。
用γ射線照射微細胞使人22號染色體片段化(koi等，科學，260361，1993)。將從108個A9/#22所得的微細胞懸浮到5ml DMEM中，用Gammacell 40(加拿大原子能公共公司)在冰上進行60Gyγ射線的照射(1.2Gy/分×50分)。經(jīng)γ射線照射的微細胞的融合與耐藥株的選擇與未經(jīng)照射的微細胞一樣，其選擇結(jié)果是，耐藥株的出現(xiàn)頻率是每107個E14細胞出現(xiàn)1-7個。與未照射的情況一樣對耐藥株進行凍存、提取DNA。
根據(jù)下面(1)～(3)的方法來證實未經(jīng)照射的微細胞耐藥株E14/#22-9、E14/#22-10、γ射線照射的微細胞耐藥株E14/#22-14、E14/#22-25中所導入染色體的保持。
(1)PCR分析(圖2) 以耐藥株基因組DNA為模板，通過PCR來檢測人22號染色體上存在的基因((Genetic Maps)基因圖譜，同前)和多形性標記(多形性STS引物對，BIOS社D22S315，D22S275，D22S278，D22S272，D22S274；自然，359794，1992)的存在。下面是以GenBank、EMBL等的數(shù)據(jù)庫獲得的堿基序列為基礎制備的基因引物-寡核苷酸序列。
PVALB(小白蛋白)5’-TGGTGGCTGAAAGCTAAGAA (序列號9)，5’-CCAGAAGAATGGTGTCATTA(序列號10) MB(肌紅蛋白)5′-TCCAGGTTCTGCAGAGCAAG(序列號11)，5’-TGTAGTTGGAGGCCATGTCC(序列號12) DIA1(細胞色素b-5還原酶)5′-CCCCACCCATGATCCAGTAC(序列號13)，5’-GCCCTCAGAAGACGAAG CAG(序列號14) Igλ(免疫球蛋白λ)5’-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT(序列號15)，5’-GGAGACCACCAAAC CCTCCAAA(序列號16) ARSA(芳基硫酸酯酶)5’-GGCTATGGGGACCTGGGCTG(序列號17)，5’-CAGAGACACAGGCACGTAGAAG(序列號18) 以大約10μg的基因組DNA作模板，用上述10種引物進行PCR擴增(Innis等，同前)。其結(jié)果是未經(jīng)照射的2個克隆對所有的引物、經(jīng)γ射線照射的2個克隆對部分引物產(chǎn)生所期待長度的擴增產(chǎn)物。圖2示上述結(jié)果。圖2中左邊是以人22號染色體的G帶為基礎制作的染色體模式圖和一些位置明確的標記在G帶的位置(O′Brien，基因圖譜，第6版，第5冊等)。根據(jù)目前獲得的信息(科學，人類基因圖，1994；Nature Genetics，722，1994；自然，359794，1992等)，基因和多形性標記的排列表明其大致的位置關(guān)系，其順序未必準確。用PCR對4種G418耐性E14細胞克隆進行檢測，能得到所期待擴增產(chǎn)物的標記用■表示，不能檢測出的標記用□表示。下面是通過FISH分析觀察到的結(jié)果。A9/#22是染色體供體細胞。
(2)Southern印跡分析 參照(Ausubel等，現(xiàn)代分子生物學方案，John Wiley Sons公司，1994)所描述的方法，以人特異的重復序列L1序列(每單倍體基因組存在104-105拷貝，來自RIKEN DNA Bank；核酸研究，137813，1995；來自pUK的1.4kb的EcoRI-BamHI片段)作探針，對經(jīng)限制酶(BglII，寶酒制造)處理的約2μg的基因組DNA進行Southern印跡分析。其結(jié)果是，在各耐藥克隆DNA中，大多能檢測出與人L1序列進行雜交的雜交帶。有2個未照射的克隆，其帶型和根據(jù)各帶密度而推測出的人染色體DNA對小鼠基因組DNA的定量比與A9/#22相同。γ射線照射克隆的全部信號強度與A9/#22相比，與PCR分析所顯示的缺損程度相關(guān)。
(3)熒光原位雜交(FISH) 參照(松原等，F(xiàn)ISH實驗方案，秀潤社，1994)所記載的方法，應用人22號染色體特異的探針(CHROMOSOME PAINTINGSYSTEM，Cambio社)進行FISH分析。其結(jié)果是，在幾乎所有觀察到的分裂像中，對于E14/#22-9能檢測到異位到小鼠染色體上的形態(tài)，而對于其它3株則能檢測到獨立的人22號染色體。
通過以上實驗可知，所得到的G418耐藥株E14/#22-9、E14/#22-10保持全部或大部分的人22號染色體，E14/#22-14、E14/#22-15則保持有其部分片段。
(實施例3)從保持人22號染色體的ES細胞制備嵌合體小鼠。
(實施例3)由保持人22號染色體的ES細胞制備嵌合體小鼠 參照(相沢慎-，生物手冊，8，基因打靶，羊土社，1995)所記載的方法，用常規(guī)技術(shù)從小鼠獲取胚胎、培養(yǎng)，將ES細胞注入胚胎，移植到代孕母親的子宮等。將(實施例2)中得到的、經(jīng)證實保持人22號染色體的、凍存的G418耐性ES細胞株E14/#22-9融化，培養(yǎng)，注入到C57B2/6×C3H F1雌性小鼠(日本CREA社)與C3H雄性小鼠(日本CREA社)交配而得到的胚泡期胚中，每一胚胎注入約10-15個細胞。在代孕母親ICR小鼠(日本CREA社)偽妊娠2.5天后，將注入大約10個細胞的胚胎移植到子宮的兩側(cè)。(第1表)表示了其結(jié)果。
表1.從保持人22號染色體(片段)的E14細胞制備嵌合體小鼠
其移植了166個注入胚，誕生了29只子鼠。由宿主胚而來的毛色為野鼠色(深棕色)，其中若能見到由E14細胞而來的淺灰色，則可判定為嵌合體。所生29只中具有明顯淺灰色的，也就是說能識別出由E14細胞貢獻的個體有16只。在K22-22中最大的貢獻率為40％。
根據(jù)該結(jié)果可表明保持人22號染色體的小鼠ES細胞株/#22-19能形成嵌合體，即使有分化或小鼠正常組織的能力。
(實施例4)在保持人22號染色體的ES細胞而來的嵌合體小鼠的各組織中證實人染色體DNA的保持。
在(實施例3)中用毛色判斷的基礎上，以從尾部制備的基因組DNA為模板，通過PCR來證實導入染色體的保持。參照(騰木元也，發(fā)育工程學實驗手冊，講談社Scientific，1987)的方法，從出生后3周的嵌合體小鼠獲取尾部，用Puregene DNA分離試劑盒提取DNA。以該基因組DNA為模板，應用(實施例2)中使用的多形性引物中的PVALB、D22S278，來證實擴增產(chǎn)物。對能觀察到毛色貢獻的10只小鼠進行分析，結(jié)果在所有的小鼠中可檢測到至少由一引物而產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物。
Southern印跡分析與(實施例2)相同，用人L1序列作引物，對從6個嵌合體小鼠、1個非嵌合體小鼠尾部得到的2μg基因組DNA進行分析。結(jié)果可證實在所有的嵌合體小鼠中存在多數(shù)的人L1序列，其帶型與E14/#22-9相類似。與小鼠基因組的定量比率最多可達到10％(圖3)。圖3中每道中均使用BglII消化的2μg基因組DNA。用32P標記的人L1序列作探針，通過圖像分析儀BAS2000(富士照相膠片公司)來檢測信號。從右邊數(shù)是由嵌合體小鼠(K22-6，7，8，9，10，11，129為非嵌合體)尾部而來的基因組DNA和對照DNA(CC是E14/#22-9與E14基因組DNA以1∶9的重量比混合)。左邊表示DNA分子量，右邊表示各嵌合體的嵌合率。(-0％；+～10％；++10～30％)。
用ISOGEN(日本Gene公司)從毛色貢獻達到5％的嵌合體小鼠(K22-7)的腦、肝臟、肌肉、心臟、脾、胸腺、卵巢、腎獲取基因組DNA，用(實施例2)中所用基因引物中的MB、DIA1，對各種組織進行PCR分析。結(jié)果是在所有的組織中，2個引物均產(chǎn)生所期待的擴增產(chǎn)物。(圖4)是用DIA1引物所產(chǎn)生的結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)20％瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠染色進行檢測。圖4中每一泳道從左開始為B腦，L肝，SM骨骼肌，H心臟，Sp脾，Th胸腺，Ov卵巢，K腎，nc非嵌合體小鼠尾部的NDA(陰性對照)，pc人纖維母細胞(HFL-1)DNA(陽性對照)。
該結(jié)果表明，E 14/#22-9在小鼠各種正常組織中起作用，并確證保持有人22號染色體。
(實施例5)由保持人22號染色體的ES細胞而來的嵌合體小鼠中人基因的表達 將毛色貢獻達5％個體(K22-7)的尾部在液氮中凍結(jié)粉碎后，可作為證實人基因表達的材料。這是皮膚、骨、骨肉、血液等組織的混合物。用ISOGEN(日本Gene)從中提取總RNA，通過RT-PCR檢測人肌紅蛋白(MB)、人細胞色素b5還原酶(DIA1)的mRNA。參照(Innts等，PCR實驗手冊，HBJ出版局，1991)的方法進行RT-PCR。用隨機六聚物寡核苷酸(終濃度1000pmol，寶酒制造)作逆轉(zhuǎn)錄反應的引物，逆轉(zhuǎn)錄酶使用BRL公司的Super Script。下面是用cDNA作模板進行擴增時用的引物。
MB5′-TTAAGGGTCACCCAGAGACT (序列號19)，5′-TGTAGTTGGAGGCCATGTCC(序列號20) DIA15′-CAAAAAGTCCAACCCTATCA(序列號21)，5′-GCCCTCAGAAGACGAAGCAG(序列號22) 該結(jié)果可檢測出兩基因mRNA特異的擴增產(chǎn)物(圖5)。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)20％瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠染色進行檢測。圖5中M表示標準(Hind III消化λDNA+Hae III消化

X174DNA，寶酒造)，MB表示人肌紅蛋白，DIA1為細胞色素-b5-還原酶，WT為野生型C3H小鼠。
由對同一個體(K22-7)，用ISOGEN從腦、心臟、胸腺、肝、脾、腎、卵巢、骨骼肌提取總RNA，用上述2種引物對各臟器進行RT-PCR。結(jié)果在所有的臟器中發(fā)現(xiàn)DIA1所期待的擴增產(chǎn)物，僅在心臟和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)MB所期待的擴增產(chǎn)物(圖6)。肌紅蛋白對肌細胞特異性表達(Bassel-Duby等，MCB，125024，1992)，由此可知導入的人染色體上的基因在小鼠中能接受正常組織特異性表達的調(diào)控。PCR產(chǎn)物經(jīng)20％瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠染色進行檢測。圖6中，各泳道從左開始分別為B腦，H心臟，Th胸腺，L肝臟，Sp脾臟，K腎，Ov卵巢，SM骨骼肌，M標準(同前)。據(jù)認為MB的結(jié)果中所觀察到的低分子量帶是非特異性產(chǎn)物。
總之，導入的人22號染色體在嵌合體小鼠的正常組織中能發(fā)揮功能。
(實施例6)將人4號染色體或其部分片段導入ES細胞 用(實施例1)中得到的保持人4號染色體的小鼠A9細胞(以下稱作A9/#4)作為染色體供體細胞。用小鼠ES細胞的E14(與實施例2相同)作染色體受體細胞。微細胞融合試驗及G418耐性克隆的選擇與(實施例2)相同。耐藥性克隆出現(xiàn)的頻率為每107個E14細胞出現(xiàn)1-2個。耐藥性克隆的凍存、基因組DNA的提取與(實施例2相同)。用以下(1)-(3)的方法來證實耐藥性克隆E14/#4-4、E14/#4-7、E14/#4-11中人染色體或其片段的保持情況。
(1)PCR分析(圖7) 以耐藥株基因組DNA為模板，通過PCR來檢測人4號染色體上存在的基因((Genetic Maps)基因圖譜，同前)和多形性標記(多形性STS引物對，BIOS社D4S395，D4S412，D4S422，D4S413，D4S418，D4S426，F(xiàn)11；自然，359794，1992)的存在。下面是以Gen Bank、ENBL等數(shù)據(jù)庫獲得的堿基序列為基礎制備的基因引物-寡核苷酸序列。
HD(享廷頓疾病)5′-TCGTTCCTGTCGAGGATGAA(序列號23)，5′-TCACTCCGAAGCTGCCTTTC(序列號24) IL-2(白介素-2)5′-ATGTACAGGATGCAACTCCTG(序列號25)，5′-TCATCTGTAAATCCAGCAGT(序列號26) KIT(c-kit)5′-GATCCCATCGCAGCTACCGC(序列號27)，5′-TTCGCCGAGTAGTCGCACGG(序列號28) FABP2(脂肪酸結(jié)合蛋白2，腸)5′-GATGAACTAGTCCAGGTGAGTT(序列號29)，5′-CCTTTTGGCTTCTACTCCTTCA(序列號30) 對上述11種引物進行PCR擴增，結(jié)果有3株能得到全部或部分引物所期待的擴增產(chǎn)物。也可看到象E14/#4-4、E14/#4-7一樣缺乏一部分區(qū)域。以上結(jié)果如圖7所示。圖7中，左邊是以人4號染色體的G帶為基礎制作的染色體模式圖和一些位置明確的標記在G帶的位置(參照實施例2)。根據(jù)目前的資料(參照實施例2)基因和多形性標記的排列表明其大致的位置關(guān)系，其順序末必準確。用PCR對3種G418耐性E14細胞克隆進行檢測，能得到所期待擴增產(chǎn)物的標記用■表示，不能檢測出的標記用□表示。下面是通過FISH分析觀察到的結(jié)果。A9/#4是染色體供給細胞。
(2)Southern印跡分析(圖8) 與(實施例2)的方法相同，用人L1序列作探針，對E14/#4-4、E14/#4-7的基因組DNA進行Southern印跡分析。其結(jié)果是，在兩株DNA中，大多能檢測出與人L1序列進行雜交的雜交帶。與A9/#4相比，全部信號強度與PCR分析所顯示的缺損程度相關(guān)。圖8中，各泳道均使用經(jīng)BglII消化了的2μg基因組DNA。以32P標記的人L1序列作探針，通過圖像分析儀BAS2000(富士照相膠片公司)檢測信號。圖8中，各道從左依次為1A9/#4(染色體供體細胞)、2A9/#4+A9(1∶2)、3A9/#4+A9(1∶9)、4A9、5E14/#4-7、6E 14/#4-4。2、3中2種DNA按括號內(nèi)的比例進行混合。左側(cè)為分子量。
(3)熒光原位雜交(FISH) 用與(實施例2)相同的方法，用人4號染色體特異的探針(CHROMOSOME PAINTING SYSTEM，Cambio社)進行FISH分析。結(jié)果在3株幾乎所有的分裂像中能檢測出人4號染色體或其部分片段。E14/#4-4中能檢測到易位到小鼠染色體上的形態(tài)，其它2株才能檢測到獨立的染色體。所觀察到的人染色體的相對大小當用PCR分析的結(jié)果推測出的一致。
以上實驗表明，所得G418耐藥株保持人4號染色體的全部或部分片段。
(實施例7)由保持人4號染色體部分片段的ES細胞制備嵌合體小鼠 將證實保持人4號染色體部分片段的G418耐性ES細胞株E14/#4-4、E14/#4-7的凍存株融化，注入到按(實施例3)的方法所得胚泡期胚胎中，每個胚胎注入10～15個細胞。代孕母親ICR小鼠(日本AREA)偽孕2.5天后，移植到其子宮中，每側(cè)子宮移入大約10個ES細胞注入胚。結(jié)果如(表2)所示。
表2.由保持人4號染色體(片段)的ES細胞制備嵌合體小鼠
其移植了240個注入胚，誕生了13只子鼠。由宿主胚而來的毛色為野鼠色(深棕)，其中若能見到由E14細胞而來的淺灰色，則可判定為嵌合體。所生13只中具有明顯淺灰色的，也就是說能識別出由E14細胞貢獻的個體有7只。在E14/#4-7的1小鼠中，最大的貢獻率為15％。
根據(jù)該結(jié)果可表明保持人4號染色體的小鼠ES細胞株E14/#4-4、E 14/#4-7能形成嵌合體，即使有分化或小鼠正常組織的能力。(實施例8)在保持人4號染色體的ES細胞而來的嵌合體小鼠中證實人染色體DNA的保持和G418耐性基因的表達 (1)PCR分析 (實施例7)中所得嵌合體小鼠中，來源于E14/#4-7的1只(K#4-7-1嵌合率約5％)、來源于E14/#4-4的一只(K#4-4-41嵌合率約5％)，用(實施例4)的方法，從它們的尾部制備基因組DNA。以該DNA為模板，用(實施例6)中分析4號染色體用的引物中檢測出E14/#4-7、E14/#4-4的多形性標記F11進行PCR分析。結(jié)果2只小鼠均檢測出所期待的擴增產(chǎn)物。
(2)Southern印跡分析(圖9) 與(實施例2)相同，用人L1序列作探針，對E14/#4-7來源的1只小鼠(K#4-7-1嵌合率約5％)。尾部的2μg基因組DNA進行Southern印跡分析。結(jié)果可以看到多數(shù)存在人L1序列，其帶型與E14/#4-7相類似。與小鼠基因組的質(zhì)量比約為E14/#4-7的10％。圖9中所示，各道均使用經(jīng)BglII消化了的2μg尾部基因組DNA。用32P標記的人L1序列作探針，通過圖像分析儀BAS200(富士照片膠片公司)檢測信號。左側(cè)為分子量。各道從左依次為1K#/4-7-1、2空白、3E14/#4-7。
(3)尾部纖維母細胞的G418耐性試驗 嵌合體小鼠中，來源于E14/#4-7的1只(K#4-7-1嵌合率約5％)、來源于E14/#4-4的1只(K#4-4-41“嵌合率約5％)，按以下的方法從它們的尾部制備纖維母細胞。DNA的制備與(實施例4)相同，切嵌合體小鼠的尾部5mm～10mm，在PBS/1mM EDTA中洗滌數(shù)次后，過網(wǎng)除去切下的表皮，用網(wǎng)研細內(nèi)部組織。將組織細片移入盛有5ml PBS/1mM EDTA的試管中，室溫靜置30分鐘-1小時。其后余下1ml的PBS/EDTA，除去上清，加入1ml 0.25％胰酶/PBS，室溫放置5-10分，邊輕扣或邊吹打邊攪拌組織。1000rpm，離心10分鐘，將沉淀懸浮到2ml的DMEM(10％FCS)中，接種到35mm培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)7-10天后，用胰酶處理細胞使之脫離皿壁，接種到2塊35mm培養(yǎng)皿，每瓶約104個細胞，其中1瓶中加入終濃度400μg/ml的G418，培養(yǎng)5～7天，觀察每瓶中的活細胞。這種條件下，來源于野生型ICR小鼠的纖維母細胞在G418的存在下幾乎100％死亡。結(jié)果在2只小鼠中均見到G418耐性纖維母細胞的存在。
這些結(jié)果表明，E14/#4-7、E14/#4-4在小鼠中貢獻給各種正常組織，且保持人4號染色體部分片段。
(實施例9)將人14號染色體或其片段導入小鼠ES細胞 用(實施例1)中得到的保持人14號染色體的小鼠A9細胞株(以下稱作A9/#14)作染色體供體細胞。用小鼠ES細胞株TT2(購自Lifetech Oriental公司，Yagi等，分析生化，21470，1993)作受體細胞。TT2的培養(yǎng)方法參照(相沢慎一，生物學手冊系列，8，基因打靶，羊土社，1995)的方法進行，飼養(yǎng)細胞選用絲裂霉素c(Sigma)處理的G418耐性原代培養(yǎng)細胞(購自Lifetech Oriental公司)。微細胞融合實驗及G418耐藥株的篩選與(實施例2)相同。耐藥株的出現(xiàn)頻率為每107個TT2細胞出現(xiàn)326個。耐藥株的凍存、基因組DNA的制備與(實施例2)相同。
用γ射線照射微細胞可得到人14號染色體的片段(Koi等，科學，260361，1993)。將從約108個A9/#14獲取的微細胞懸浮劑5mlDMEM中，通過用Gammacell 40(同前)、在冰上照射30Gy的γ射線(1.2Gy/分×25分)。經(jīng)γ射線照射的微細胞的融合以及耐藥株的篩選與未經(jīng)照射的微細胞相同，結(jié)果耐藥株的出現(xiàn)頻率為每107個TT2細胞出現(xiàn)3個。耐藥株的凍存、DNA提取與(實施例2)相同。
根據(jù)下面(1)(2)的方法來證實未經(jīng)照射的微細胞G418耐藥株1-4、1-5，γ射線照射的微細胞G418耐藥株3～1、3-2，4株中人14號染色體的保持。
(1)PCR分析(圖10) 以耐藥株基因組DNA為模板，通過PCR來檢測人14號染色體上存在的基因((Genetic Maps)基因圖譜，同前)和多形性標記(多形性STS引物對，BIOS社D14S43，D14S51，D14S62，D14S65，D14S66，D14S67，D14S72，D14S75，D14S78，D14S81，PCI；自然，359794，1992)的存在。下面是以GenBank、EMBL等的數(shù)據(jù)庫獲得的堿基序列為基礎制備的基因引物-寡核苷酸序列。
NP(核苷磷酸化酶)5’-ATAGAGGGTACCCACTCTGG(序列號31)，5’-AACCAGGTAGGTTGATATGG(序列號32) TCRA(T-細胞受體α)5’-AAGTTCCTGTGATGTCAAGC(序列號33)，5′-TCATGAGCAGATTAAACCCG(序列號34) MYH6(心肌球蛋白重鏈)5’-TGTGAAGGAGGACCAGGTGT(序列號35)，5)，5’-TGTAGGGGTTGACAGTGACA(序列號36) IGA2(免疫球蛋白α-2恒定區(qū))5’-CTGAGAGATGCCTCTGGTGC(序列號37)，5’-GGCGGTTAGTGGGGTCTTCA(序列號38) IGG1(免疫球蛋白γ-1恒定區(qū))5′-GGTGTCGTGGAACTCAGGCG(序列號39)，5’-CTGGTGCAGGACGGTGAGGA(序列號40) IGM(免疫球蛋白μ恒定區(qū))5’-GCATCCTGACCGTGTCCGAA(序列號41)，5′-GGGTCAGTAGCAGGTGCCAG(序列號42) IGVH3(免疫球蛋白高鏈可變區(qū))5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG(序列號43)，5’-GTTGTGCTACTCCCATCACT(序列號44) 以4個耐藥株的基因組DNA作模板，用與(實施例2)相同的方法對上述18種引物進行了PCR擴增，結(jié)果全部或部分引物得到所期待的擴增產(chǎn)物。用經(jīng)γ射線照射的微細胞而得到的耐藥株3-1、3-2才發(fā)現(xiàn)14號染色體的一部分區(qū)域有缺失傾向。另外，用未經(jīng)照射的微細胞耐藥株1-4株也有缺失現(xiàn)象。結(jié)果如圖10所示。圖10中左邊為以人14號染色體的G帶為基礎制作的染色體模式圖和一些位置明確的標記在G帶的位置(參照實施例2)。根據(jù)目前獲得的信息(參照實施例2)，基因和多形性標記的排列表明其大致的位置關(guān)系，其順序未必準確。用PCR對4種G418耐性TT2細胞克隆進行檢測，能得到所期待擴增產(chǎn)物的標記用■表示，不能檢測出的標記用□表示。A9/#22是染色體供體細胞。右端表示實施例11(1)的結(jié)果。
(2)熒光原位雜交(FISH) 參照(松原等，F(xiàn)ISH實驗方案，秀潤社，1994)所記載的方法，應用人14號染色體特異的探針(CHROMOSOME PAINTINGSYSTEM，Cambio社)進行FISH分析。其結(jié)果是，對于4株在幾乎所有觀察到的分裂像中，能觀察到人14號染色體或其部分片段是獨立的染色體。所觀察到的人染色體的相對大小與用PCR分析結(jié)果進行的推測一致。
通過以上實驗可以證實所得G418耐藥株1-4、1-5、3-1、3-2保持人14號染色體的全部或其部分片段。
(實施例10)由保持人14號染色體片段的ES細胞制備嵌合體小鼠 將在(實施例9)中得到的，經(jīng)證實保持人14號染色體的4株G418耐性ES細胞株(1-4，3-1，3-2，1-5)的凍存株融化，注入到ICR或MCH(ICR)(日本CREA)雄雌小鼠進行交配而得到的8細胞期胚胎中，每個胚胎注入8-10個。用ES培養(yǎng)基(實施例9)培養(yǎng)一晚，形成胚泡后，移植到經(jīng)偽孕處理2.5天后的代孕母親ICR小鼠(日本CREA)的子宮中，每側(cè)移入大約10個注入胚。結(jié)果如(表3)所示。
表3.由保持人14號染色體(片段)的TT2細胞株制備嵌合體小鼠
共移植了494個注入胚，誕生了64只子鼠。由宿主胚而來的毛色為野鼠色(深棕)，其中若能見到由E 14細胞而來的淺灰色，則可判定為嵌合體。所生64只中具有明顯淺灰色的，也就是說能識別出由E14細胞貢獻的個體有8只。在來源于1-4的1小鼠中最高的貢獻率為80％。
根據(jù)該結(jié)果可表明保持人14號染色體的小鼠ES細胞株(1-4，1-5，3-1，3-2)能形成嵌合體，即有分化或小鼠正常組織的能力。
(實施例11)在保持人14號染色體片段的ES細胞而來的嵌合體小鼠中證實人14號染色體片段的保持。
通過下面(1)～(3)的方法來證實(實施例10)中所得嵌合體小鼠中保持人14號染色體部分片段(1)用各組織的DNA進行PCR分析。
用與(實施例4)相同的方法，從嵌合體小鼠中來源于3-1的小鼠(K3-1-1嵌合率約25％)的尾部制備基因組DNA。以此作模板，用(實施例9)中所示分析14號染色體時應用的引物中的能檢測出3-1的全部14種引物進行PCR分析。結(jié)果所有14種引物均檢測到預期的擴增產(chǎn)物(圖10)。
此外，用Puregene DNA分離試劑盒從同一小鼠(K3-1-1)的腦、腎、脾、心、肝、胸腺提取基因組DNA，用IGM引物(實施例9)對各組織進行PCR分析。結(jié)果在所有的組織中發(fā)現(xiàn)預期的擴增產(chǎn)物(圖11)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠染色進行檢測。圖11中各泳道從左依次為B腦，K腎，Sp脾，H心臟，Th胸腺，Pc人纖維母細胞(HFL-1)DNA(陽性對照)，nc非嵌合體小鼠尾部DNA(陰性對照)，M標準(HindIII消化入DNA+HaeIII消化

X174DNA，寶酒造)。
(2)尾部纖維母細胞的G418耐性試驗 用以下方法，從嵌合體小鼠中來源于3-2的小鼠2個(K-3-2-1嵌合率約25％，K3-2-3嵌合率約50％)、來源于1-4的1個小鼠(K1-4-1嵌合率約80％)的尾部制備纖維母細胞。DNA制備與(實施例4)相同，從3～6周齡嵌合體小鼠的尾部取5～10mm，在PBS/1mM EDTA中洗數(shù)次后，過網(wǎng)除去切下的表皮，在網(wǎng)上研磨內(nèi)部組織。將組織細片移到盛5ml PBS/1mM EDTA的試管中，室溫靜置30分～1小時。其后剩余1ml PBS/EDTA，去除上清，加入1ml 0.25％胰酶/PBS，室溫放置5-10分鐘，邊輕扣或吹打邊攪拌組織。1000rpm離心10分鐘，將沉淀懸浮到2ml的DMEM(10％FCS)中，接種到35mm培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)7～10天后，用胰酶處理細胞使之脫離皿壁，接種到4個35mm培養(yǎng)皿，每個皿中約104個細胞，在其中2皿中加入400μg/ml的G418，培養(yǎng)5-7天后，計算每皿中的存活細胞數(shù)。來源于野生型ICR小鼠的纖維母細胞，在G418存在的條件下幾乎100％死亡。假如G418耐性纖維母細胞的增殖速度在2種條件下相同，那么選擇培養(yǎng)基中存活的細胞數(shù)與非選擇培養(yǎng)基上存活的細胞數(shù)的比率能夠反映對G418耐性ES細胞株來源的纖維母細胞的纖維母細胞集落的貢獻率。結(jié)果如(圖12)所示，可看到3株中均存在G418耐性纖維母細胞。在圖12中，耐性率是每個個體從2組選擇/非選擇35mm培養(yǎng)皿得到的值進行平均。ICR表示野生型ICR小鼠。
(3)尾部來源的G418耐藥纖維母細胞的FISH分析 用與(實施例2)相同的方法，對上面(2)得到的G418耐藥纖維母細胞(K3-2-3，K1-4-1來源)進行FISH分析。用FITC標記從HFL-1細胞(實施例1)提取的人總DNA(松原等，F(xiàn)ISH實驗方案，秀潤社，1994)，以此作探針。結(jié)果在2株細胞中均在幾乎所有分裂像中觀察到獨立的人染色體部分片段。
這些結(jié)果證實，保持人14號染色體部分片段的TT2細胞株在小鼠中貢獻給各種正常組織，并且其中保持人14號染色體部分片段。
(實施例12)將人2號染色體部分片段導入ES細胞 用(實施例1)中獲得的保持人2號染色體部分片段的小鼠A9細胞W23(以下簡稱A9/#W23)作染色體供體細胞。用小鼠ES細胞株TT2(實施例9)作染色體受體細胞。微細胞融合及G418耐藥株的選擇與(實施例2)相同。耐藥株的出現(xiàn)頻率為每107個TT2細胞出現(xiàn)1-3個。耐藥株的凍存、基因組DNA的制備與(實施例2)相同。通過下面(1)、(2)的方法證實耐藥株5-1、5-2、5-3中保持有人2號染色體部分片段。
(1)PCR分析 以耐藥株基因組DNA為模板，存在于人2號染色體上的基因(基因圖譜，同前)中選擇在染色體供給細胞A9/#W23中檢測出的Cκ、FABPI進行PCR。
對各引物進行擴增，結(jié)果在3株中均檢測出兩個引物所期待的擴增產(chǎn)物。
(2)熒光原位雜交(FISH) 與(實施例2)相同，用人2號染色體特異的探針(CHROMOSOMEPAINTING SYSTEM，Cambio社)進行FISH分析。結(jié)果在3株幾乎所有的分裂像中檢測出人2號染色體部分片段是獨立的染色體。其大小與在A9/#2W23中觀察到的相同。
以上實驗證實，所得G418耐藥株保持有人2號染色體部分片段。(實施例13)由保持人2號染色體片段的ES細胞制備嵌合體小鼠 將(實施例12)中得到的、證實保持有人2號染色體部分片段的G418耐性ES細胞株5-1的凍存株融化，注入到ICR或MOH(ICR)(日本CREA)雄雌小鼠交配而得到的8細胞期胚胎中，每個胚胎注入10-12個細胞。用ES培養(yǎng)基(實施例9)培養(yǎng)一晚上形成胚泡后，移植到經(jīng)偽孕處理的2.5天的代孕母親ICR小鼠(日本CREA)子宮中，每側(cè)注入約10個注入胚。
結(jié)果如(表4)所示。
表4.由保持人2號染色體(片段)的TT2細胞株制備嵌合體小鼠
共移植了264個注入胚，結(jié)果產(chǎn)生51只子鼠。根據(jù)毛色可判斷嵌合體小鼠在來源于宿主胚(ICR)的白色中有可識別的來源于TT2細胞的野鼠色(濃茶)。所生51只小鼠中，毛色明顯野鼠色，即可看出由ES細胞貢獻的個體有18只。另外，最高的嵌合率為80％。
該結(jié)果證實，保持人2號染色體部分片段的G418耐性ES細胞(5-1)有形成嵌合體的能力，即有分化成小鼠正常組織的能力。(實施例14)在導入了人14號染色體的嵌合體小鼠血清中檢測人抗體重鏈 用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)來測定血清中人抗體的濃度。依照下面所描述的方法來進行ELISA。富山·安東，單克隆抗體實驗手冊，講談社，1987；安東·千葉，單克隆抗體實驗操作入門，講談社，1991；石川，超敏感性酶免疫測定法，學會出版中心，1993；EdHarlow，Darid lane，抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室，1988；A.Doyle，J.B.Griffiths，細胞和組織培養(yǎng)實驗室方法，John Wiley&Sons Ltd.，1996。參照這些文獻中描述的方法調(diào)整反應條件，反應在4℃，過夜進行。測定時要把抗人免疫球蛋白的抗體或抗原稀釋為0.5-10μg/ml(100-5000倍)，鋪ELISA板，4℃，過夜。測定血清樣品時，用補充了5％小鼠血清(Sigma，M5905)的PBS封閉。稀釋樣品和標記的抗體，在對雜交瘤培養(yǎng)上清進行測定的時候，用補充了1％胎牛血清的PBS。用PBS將嵌合體小鼠血清稀釋20倍。洗滌后將鋪層過的板封閉1小時以上。洗板后，加樣品，培養(yǎng)30分鐘。洗板后，加入稀釋了100-5000倍的酶標記的抗人免疫球蛋白抗體溫育1小時后，洗板，加底物液進行顯色。另外，對于不同的測定系統(tǒng)基本上進行同樣的操作步驟，但用生物素標記的抗體時，洗板后加入親和素-酶復合體，培養(yǎng)后，洗滌，加入底物液。用(酶標儀)微板讀數(shù)儀(Biotech，EL312e)測定吸光度。
從出生后29-35天的嵌合體小鼠(實施例10，K3-1-2，K-3-2-2，K3-2-2，K3-2-3)中采血，進行ELISA分析。將用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6稀釋的抗人IgM小鼠單克隆抗體(Sigma，16385)鋪到96孔微滴度板上，加入用補充有小鼠血清(Sigma，M5905)的PBS稀釋的血清樣品。然后加入過氧化物酶標記的抗人IgM的羊抗體(Tago，2392)，培養(yǎng)后加入ABTS底物(Kirkegaard&Perry Laboratories Inc.，506200)，用405nm的吸光度測定酶活性。用純化的人IgM抗體(CAPPEL，6001-1590)或人IgG抗體(Sigma，14506)作標準。用補充了小鼠血清的PBS對標準物進行梯度稀釋。在測定人IgG時，將抗人IgG的羊抗體(Sigma，13382)固定到板中，用過氧化物酶標記的抗人IgG羊抗體(Sigma，A0170)進行檢測。結(jié)果如(表5)所示。人IgM和IgG的被檢測出。
將2ml溶于PBS的人血清白蛋白(HSA，Sigma，A3782)與佐劑(MPL+TDM乳液，RIBI免疫化學研究公司)混合制成抗原溶液。在出生后的第27天、34天、41天對保持人14號染色體片段的嵌合體小鼠(實施例10，K3-1-1，K3-2-1)進行3次免疫，每次用0.2ml的0.25mg/ml的抗原溶液。用ELISA對這些嵌合體小鼠的血清進行同樣地分析。其結(jié)果如(圖13、圖14)所示。結(jié)果是用HSA免疫的嵌合體小鼠血清中，人抗體的濃度在免疫后上升，免疫后的第17天可在K3-1-1的血清中檢測出人IgM18μg/ml和IgG2.6μg/ml。在未移入人染色體的小鼠血清中，人抗體的效價不明顯。
表5.嵌合體小鼠血清中人抗體的濃度(ELISA)
(實施例15)從導入了人14號染色體的嵌合體小鼠中獲取產(chǎn)生人抗體重鏈的雜交瘤 在(實施例14)中用人白蛋白免疫的嵌合體小鼠(K3-1-1，實施例14)出生后44天，取出其脾臟，與骨髓瘤細胞進行細胞融合，制作雜交瘤細胞。參照<安東，單克隆抗體實驗操作入門，講談社(Scientific，1991)的方法，使用P3X63-Ag.8.653(購自大日本制藥，05-565)作骨髓瘤細胞進行雜交瘤的制備。雜交瘤鋪到10塊96孔板中，培養(yǎng)1周后用ELISA方法對培養(yǎng)上清進行分析。同實施例14一樣，將抗人IgM小鼠單克隆抗體(Sigma，I6385)固定到板中來進行ELISA，得到6個陽性克隆。另外，在50mM的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6中將抗原HSA配成5μg/ml的溶液，以每孔100μl加到ELISA板的全部孔中。用過氧化物酶標記的抗人IgA+IgG+IgM羊抗體(Kirkegaard&Perry Labrrotaries Inc.，04-10-17)進行檢測。10塊板中檢測出1個有陽性克隆的。這個克隆是6個人IgM陽性克隆中的一個。將該克隆(H4B7)再進行培養(yǎng)，稀釋培養(yǎng)上清，以HSA為抗原，與上面相同，用過氧化酶標記的抗人IgM羊抗體(Tago，2392)進行ELISA，可以看到隨著培養(yǎng)上清稀釋度的增加吸光度減少。而從培養(yǎng)人IgM(CAPPEL，6001-1590)得到的稀釋為2μg/ml的樣品中，吸光度較低，且與稀釋度無關(guān)。這表明雜交瘤H4B7所產(chǎn)生的抗體是對HSA具有特異性的抗體(圖15)。圖15中，橫軸為培養(yǎng)上清樣品的稀釋率，縱軸表示405nm處的吸光度。
(實施例16)G418耐性標記的人2號染色體片段對嘌呤霉素耐性的再標記 在100mm平皿中，用含有G418(800μg/ml)的選擇培養(yǎng)基(10％FBS、DMEM)培養(yǎng)保持G418耐性標記的人2號染色體片段的A9細胞(W23)(參照實施例1、圖1)。在轉(zhuǎn)染前，用限制酶SaII(寶酒造)線性化含有嘌呤霉素耐性基因的質(zhì)粒pPGKPuro(WHITEHEADINSTITUTE，Dr.Peter W.Laird提供)。用胰酶處理細胞，以5×106/ml的濃度懸浮到Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(PBS)中，參照(實施例1)，在10μg DNA存在的條件下，用Gene.Pulser(基因脈沖儀)(Bio-rad)進行電穿孔。以25μF的電容、用4mm距離的電穿孔細胞(實施例1)、在室溫下施加1000V的電壓。將電穿孔后的細胞接種到3-6塊100mm平皿中。1日后換成含10μg/ml嘌呤霉素(Sigma，P-7255)和G418(800μg/ml)的雙重選擇培養(yǎng)基。2-3周后，將所生成的克隆200個左右收集為一組。將3組中每組的細胞培養(yǎng)到2-3個25cm2的培養(yǎng)瓶中，將形成的微細胞與在25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠A9細胞進行與實施例1相同的細胞融合。然后將融合細胞移入2塊100mm平皿中，用含G418和嘌呤霉素的上述雙重選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，3組中有1組得到具有2種雙重耐藥性的克隆。該克隆中，嘌呤霉素耐性標記導入人2號染色體的可能性很高。
(實施例17)導入了人染色體的ES細胞中所導入的人染色體的加倍 用添加了高濃度G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)保持G418耐性基因標記的人14號染色體片段的ES細胞(E14/#14-36)，可得到染色體加倍了的ES細胞克隆(生物手冊，8，基因打靶，羊土社，1985)。將未經(jīng)絲裂霉素處理的G418耐性小鼠原代細胞(購自Lifetech Oriental)接種到100mm的平皿中作為飼養(yǎng)細胞。將E14/#14-36接種到該100mm平皿中，半日后換成G418濃度為16mg/ml的培養(yǎng)基。每1-2天換一次培養(yǎng)基，1周后將G418變?yōu)?0mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，從生成的克隆中選出15個進行培養(yǎng)，用人14號染色體特異的探針(參照實施例9)對染色體進行FISH分析。結(jié)果在8個克隆中出現(xiàn)人14號染色體的加倍。
(實施例18)同時保持人2號和4號染色體部分片段的小鼠ES細胞的獲得 以(實施例16)中得到的具有雙重耐藥性克隆中的PG1為供體細胞、野生型A9細胞為受體細胞進行微細胞轉(zhuǎn)移試驗，可以證實PG1所保持的人2號染色體部分片段標記有嘌呤霉素耐性基因。微細胞的獲得以及與A9細胞的融合與(實施例1)相同。結(jié)果在微細胞融合10天后其出現(xiàn)59個G418耐性克隆。將這些克隆的培養(yǎng)液換為含8μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基，然后再培養(yǎng)3天，有45個(76％)克隆生存。由于微細胞法中，大多數(shù)情況下1個受體細胞中只能移入1條或少數(shù)幾個染色體，所以兩個耐性基因同時以高頻率轉(zhuǎn)移表明PG1中所保持的G418耐性標記的人2號染色體部分片段標記有嘌呤霉素耐性基因。此外，為了檢測人2號染色體部分片段上各個標記基因，分別以pSTneoB(實施例1)、pPGKPuro(實施例16)為探針對A9/#2W23(只對G418耐性，實施例16)和PG1進行了FISH分析(松原等，F(xiàn)ISH實驗方案，秀潤社，1994)。結(jié)果在A9/#2W23中，在(實施例12)所證實的人2號染色體部分片段的相應姊妹染色體上分別有1個信號，共觀察到2個信號，這表明pSTneoB插入到人2號染色體部分片段上的1個位點。在PG1中，在同等大小的染色體片段上觀察到4個信號。pSTneoB和pPGKPuro的載體部分具有相同的序列，用pPGKPuro探針也可檢測出pSTneoB。因此認為在PG1中所觀察到的4個信號，其中2個為pSTneoB，另外2個是來源于pPGKPuro的信號。由此可以表明，PG1所保持的人2號染色體部分片段標記有G418耐性、嘌呤霉素耐性兩種標記。
為了獲得同時具有人2號、14號染色體部分片段的小鼠ES細胞，就以PG1細胞作為染色體供體細胞。用已保持有人14號染色體部分片段G418耐性TT2細胞1-4(實施例9)作染色體受體細胞。微細胞融合實驗及嘌呤霉素耐藥株的選擇，除嘌呤霉素的濃度為0.75μg/ml外，其它與(實施例9)中G418耐藥株的選擇相同。該結(jié)果中嘌呤霉素耐藥株的出現(xiàn)頻率為每107個1-4細胞出現(xiàn)3～7個。由此可以說明這些嘌呤霉素耐藥株在G418以300μg/ml存在的情況下只能增殖，并同時保持了G418耐性。雙重耐藥株的凍存、基因組DNA的獲得與(實施例2)相同。參照下面(1)的方法來證實雙重耐藥株P(guān)G5、PG15、PG16中保持人2號和14號染色體部分片段，而PG15也可參照(2)進行。
(1)PCR分析 以雙重耐藥株的基因組DNA為模板進行PCR擴增。在人2號、14號染色體上的基因(基因圖譜，同前)中，應用(實施例12；A9/#2W23)中所證實的存在于2號染色體的引物以及在(實施例9；TT2/#141-4)中所證實的存在于14號染色體上的引物。在3株細胞中，所有的引物均有期待的擴增產(chǎn)物。
(2)熒光原位雜交(FISH) 與(實施例11)相同，用FITC標記的人總DNA作探針進行FISH分析。結(jié)果幾乎在所有的分裂相，可觀察到大、小兩個染色體片段。與(實施例9；TT2/#141-4)中由人14號染色體特異的探針所確定的部分片段的大小相同，而小的與(實施例12；TT2/#25-1)中由人2號染色體特異的探針所確定的部分片段的大小相同。(圖16)為其結(jié)果。圖中亮度低的染色體為小鼠的染色體，由于FITC熒光染色而呈現(xiàn)高亮度的大小2個染色體片段(箭頭所示)是人的，認為分別是人14號、2號染色體部分片段。
以上的實驗證實所得到的雙重耐藥性ES細胞同時保持人2號、14號染色體部分片段。
(實施例19)用同時保持人2號、14號染色體部分片段的ES細胞株制備嵌合體小鼠 將(實施例18)中得到的、經(jīng)證實保持人2號、14號染色體部分片段、具有G418、嘌呤霉素雙重耐藥性的TT2細胞株P(guān)G5、PG15、PG16的凍存株融化，注入到ICR或MCH(ICR)(日本CREA社)雄雌小鼠交配而得到的8細胞期胚胎中，每個胚胎注入10-12個細胞。用培養(yǎng)ES細胞的培養(yǎng)基(實施例9)培養(yǎng)1晚上形成胚泡后，移植到假孕處理2.5天后代孕母親ICR小鼠(日本CREA社)的子宮中，每側(cè)子宮大約移植10個注入胚。
結(jié)果如(表6)所示。
表6.用同時保持人2號和14號染色體部分片段的ES細胞株制備嵌合體小鼠
共移植了551個注入胚，結(jié)果產(chǎn)生了73只子代小鼠?？筛鶕?jù)毛色，由宿主胚(ICR)產(chǎn)生的白色中有TT2細胞來源的野鼠色(深棕)來判斷嵌合體的左右。73只后代中毛色明顯呈野鼠色的，也就是說能夠識別由ES細胞貢獻的個體有23只。
該結(jié)果表明，保持人2號和14號染色體部分片段的ES細胞株(PG5、PG15、PG16)具有形成嵌合體的能力，即保持有分化成小鼠正常組織的能力。
(實施例20)從同時保持人2號和14號染色體部分片段的ES細胞來源的嵌合體小鼠血清中檢測人抗體。
將溶于PBS的人血清白蛋白(HSA，Sigma，A3782)與佐劑(MPL+TDM乳液，RIBI)混合，配成0.25mg/ml的HSA溶液，用它來免疫(實施例19)中制備的嵌合體小鼠KPG-15(9周齡，來源于PG5，嵌合率10％)、KPG-18(5周齡，來源于PG5，嵌合率10％)2只小鼠，每只0.2ml。免疫前及免疫8天后，從嵌合體小鼠采血，用ELISA方法(參照實施例14)檢測血清中的人抗體μ鏈和人抗體κ鏈。將用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6稀釋的抗人抗體κ鏈的羊抗體加到96孔微滴度板中，加入血清樣品，然后加入生物素標記的抗人抗體κ鏈的羊抗體(VECTORLABORATORIES，INC.，BA-3060)，培養(yǎng)，再加入生物素化的辣根過氧化物酶和親和素DH 的復合體(VECTORLABORATORIES，INC.，Vectastain ABC Kit PK 400)，培養(yǎng)后加入底物3，3′，5，5′四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ，住友Bakelite ML-1120T)，用450nm的吸光度檢測酶活性。用純化的含有κ鏈的、已知濃度的人IgG(Sigma，I-3889)作標準，用補充有小鼠血清的PBS對標準物進行梯度稀釋。μ鏈的檢測是這樣的，將用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6稀釋的抗人抗體μ鏈的小鼠單克隆抗體(Sigma，I-6385)加到96孔微滴度板中，加入血清樣品，然后加入過氧化酶標記的抗人μ鏈的小鼠抗體(The Binding Site Limited，MP008)，培養(yǎng)后加入TMBZ(住友Bakelite，ML-1120T)，用450nm的吸光度測定酶活性。純化的含有μ鏈的濃度已知的人IgM(CAPPEL，6001-1590)作標準，用補充了小鼠血清(Sigma，M5905)的PBS進行梯度稀釋。結(jié)果在免疫前的2只小鼠中均檢測出人抗體μ鏈和κ鏈，其在血清中的濃度隨免疫后上升(表7、表8)。
表7.嵌合體小鼠KPG15中人抗體的濃度(ELISA)
該結(jié)果表明由保持人2號和14號染色體部分片段的ES細胞而來的嵌合體小鼠中，人抗體重鏈和輕鏈基因能發(fā)揮功能。
(實施例21)在導入了人14號染色體片段的嵌合體小鼠血清中檢測抗HSA的人抗體γ鏈 用(實施例10)中的方法制備保持人14號染色體片段的嵌合體小鼠(K9、K11，均來自TT2細胞株3-2，嵌合率分別為50％、30％)，在小鼠出生后第79天、93天、107天、133天，用與(實施例20)相同的方法，用HSA進行4次免疫(K9)，或在出生后74天、88天、111天，對(K11)進行3次免疫。用ELISA方法(參照實施例14)來檢測嵌合體小鼠血清中含有抗人血清白蛋白的人γ鏈的抗體。將用50mM碳酸鹽-碳酸鹽緩沖液，pH9.6稀釋的HSA(Sigma，A3782)加到96孔微滴度板中，加入樣品，然后加入過氧化酶標記的抗人IgG小鼠抗體(Pharmagen，08007E)，培養(yǎng)后，加入過氧化酶的底物液鄰苯二胺(OPD，住友Bakelite，ML-11300)，用490nm的吸光度測定酶活性。用HSA免疫的嵌合體小鼠血清中抗人HSA的人IgG的效價在免疫后增多。在對照ICR小鼠中，HSA免疫后，抗HSA人IgG的效價處于背景水平。結(jié)果如(圖17)所示。圖17中，橫軸為用HSA免疫嵌合體小鼠后的天數(shù)，縱軸為490nm處的吸光度。該結(jié)果表明，在保持人14號染色體部分片段的嵌合體小鼠中，HSA抗原的刺激能引起對抗原特異性的人IgG抗體效價的增加。
(實施例22)在導入了人22號染色體片段的嵌合體小鼠血清中檢測人抗體λ鏈 從9個月齡的嵌合體小鼠(實施例3，K22-7，嵌合率10％)采血，用ELISA方法檢測血清中的人抗體λ鏈(參照實施例14)。將用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6稀釋的抗人抗體λ鏈的羊抗體(VECTOR LABORATORIES，INC.，A1-30％)加到96孔微滴度板中，加入血清樣品，然后加入生物素標記的抗人抗體λ鏈的羊抗體(VECTOR LABORATORIES，INC.，BA-3070)，培養(yǎng)，再加入生物素化的辣根過氧化物酶和親和素DH的復合體(VECTORLABORATORIES，INC.，Vectastain ABC Kit，PK4000)，培養(yǎng)，之后加入過氧化物酶的底物TMBZ(住友Bakelite，ML-1120T)，用450nm的吸光度測定酶活性。用純化的含有λ鏈的濃度已知的人IgG(Sigma，I-4014)作標準，用補充有小鼠血清的PBS進行梯度稀釋。從嵌合體小鼠中可檢測出相當于180ng/ml人IgG的人抗體λ鏈。該結(jié)果表明，保持人22號染色體的嵌合體小鼠中，人抗體λ鏈的基因能發(fā)揮功能。
(實施例23)在導入了人2號染色體片段的嵌合體小鼠血清中檢測人抗體κ鏈 從5周齡的嵌合體小鼠(實施例13，K2-8，嵌合率為70％)和9周齡的嵌合體小鼠(實施例13，K2-3，K2-4，K2-12，嵌合率分別為50％、20％、80％)采血，用ELISA方法(參照實施例14)來檢測血清中的人抗體κ鏈。將用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6稀釋的抗人抗體κ鏈的羊抗體(VECTORLABORATORIES，INC.，AL-3060)加到96孔微滴度板中，加入血清樣品，然后加入生物素標記的抗人抗體κ鏈的羊抗體(VECTORLABORATORIES，INC.，BA-3060)，培養(yǎng)，再加入生物素化辣根過氧化物酶和親合物DH的親合體(VECTOR LABORATORIES，INC.，Vectastain ABC Kit)，培養(yǎng)后加入TMBZ(住友Bakelite，ML1120T)，用在450nm的吸光度測定酶活性。用純化的含有κ鏈的已知濃度的人IgG(Sigma，I-3889)作標準，用補充有小鼠血清的PBS進行梯度稀釋，結(jié)果如(表9)所示。
表9.嵌合體小鼠中人抗體κ鏈的濃度(ELISA) 嵌合體小鼠 Igκ(mg/l)
用與(實施例20)相同的方法，在保持人2號染色體片段的嵌合體小鼠(實施例13、K2-3和K2-4)出生后的第66天、80天、102天，用HSA進行3次免疫?；蛘咴谇逗象w小鼠(K2-12)出生后的第13天、77天、91天、116天，用ELISA方法(參照實施例14)檢測該嵌合體小鼠血清中抗HSA的人抗體κ鏈。將用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6稀釋的HSA(Sigma，A3782)鋪到96孔微滴度板中，加入樣品，然后加入生物素標記的抗人抗體κ鏈的羊抗體(VECTOR LABORATORIES，INC.，BA-3060)，培養(yǎng)，由加入生物素化的辣根過氧化物酶和親和素DH的復合體(VECTORLABORATORIES，INC.，Vectastain ABC Kit)，培養(yǎng)后加入過氧化物酶的底物OPD(住友Bakelite，ML-11300)，用490nm的吸光度測定酶活性。在HSA免疫的嵌合體小鼠血清中，抗HSA人κ鏈的效價在免疫后上升。而在對照ICR小鼠中，HSA免疫后抗HSA的人抗體κ鏈的效價處于背景水平。結(jié)果如(圖18)所示。圖18中，橫軸為嵌合體小鼠經(jīng)HSA初次免疫后的天數(shù)，縱軸為490nm處的吸光度。該結(jié)果表明，在保持人2號染色體部分片段的嵌合體小鼠中，人抗體κ鏈基因能發(fā)揮功能，而且HSA抗原的刺激能引起抗原特異性人Igκ抗體效價的上升。
(實施例24)由移入人14號染色體的嵌合體小鼠獲得能產(chǎn)生人抗體重鏈(μ鏈或γ鏈)的雜交瘤。
在(實施例21)中用HSA免疫的嵌合體小鼠K9出生后第136天，取出其脾臟，與骨髓瘤細胞融合，制備雜交瘤。參照(安東·千葉，單克隆抗體實驗操作入門，講談社Scientific，1997)的方法，用SP-2％-Ag14(大日本制藥，05-554)作骨髓瘤細胞進行雜交瘤的制備。培養(yǎng)液中加入10％ORIGEN雜交瘤克隆因子(HCF，Bokusui.Brown)，鋪到8塊96孔板中，3天后向培養(yǎng)液中加入1mg/ml的G418。培養(yǎng)1～3周后，用ELISA方法對培養(yǎng)上清進行分析(參照實施例14)。檢測μ鏈時，將用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH9.6稀釋的抗人μ鏈小鼠單克隆抗體(Sigma，I-6385)加到96孔微滴度板中，加入用PBS稀釋的樣品，然后加入過氧化酶標記的抗人μ鏈小鼠抗體(The Binding Site Limited、MP 008)，培養(yǎng)后加入底物2，2′-連氮基-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，Kirkegaard&Perry Laboratories Inc.，04-10-17)，可檢測出7個陽性孔。檢測γ鏈時，將抗人γ鏈的小鼠單克隆抗體(Sigma，I-6260)鋪到96孔微滴度板中，加入PBS稀釋的樣品，然后加入過氧化酶標記的抗人γ鏈小鼠抗體(pharmingen，08007E)，培養(yǎng)后，用ABTS(Kirkegaard&Perry Labonatories Inc.，04-10-17)檢測出2個人抗γ鏈陽性的孔。
(實施例25)用導入了人2號染色體的嵌合體小鼠制備能產(chǎn)生人抗體輕鏈的雜交瘤 在(實施例23)中用HSA免疫的嵌合體小鼠K2-3出生后第105天，取出其脾臟，與骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤。參照(安東·千葉，單克隆抗體實驗操作入門，講談社Scientific，1991)的方法，用P3X63Ag8.653(大日本制藥，05-565)作骨髓瘤細胞進行雜交瘤的制備。將培養(yǎng)液中添加10％HCF(Bokusui Brown)鋪到10塊96孔板中，3天后向培養(yǎng)液中加入G418，1mg/ml，1～3周后用ELISA方法分析出現(xiàn)克隆孔的培養(yǎng)上清。ELISA方法與(實施例23)的相同，得到2個人抗體κ鏈特性的克隆。
(實施例26)G418耐性標記的人22號染色體對嘌呤霉素耐性的再標記 用與(實施例16)相同的方法，對保持G418耐性標記的人22號染色體的A9細胞(A9/#22γ2；實施例1中獲得)進行人22號染色體的嘌呤霉素耐性的再標記。用pPGKPuro對γ2細胞進行電穿孔而得到雙重耐藥性克隆，每200個克隆收集到一組，這樣3組(P1、P2、P3)作供體細胞，野生型小鼠A9細胞為受體細胞，進行微細胞轉(zhuǎn)移。結(jié)果從P1得到6個雙重耐藥性克隆，從P2得到1個，從P3得到3個。在所得雙重耐藥性克隆中，以P3來源的6-1作微細胞供給細胞，野生型A9細胞為受體細胞進行微細胞轉(zhuǎn)移實驗，由此可以證實人22號染色體還標記有嘌呤霉素耐性基因(實施例18)。微細胞的獲得和與A9細胞的融合，與(實施例11)中的方法相同。結(jié)果在微細胞導入11日后出現(xiàn)28個G418耐性克隆。將這些克隆的培養(yǎng)基換成含嘌呤霉素8μg/ml的培養(yǎng)基后，再培養(yǎng)3天，有21個(75％)克隆生存。微細胞法中，對于1個供體細胞多數(shù)情況下只能移入1條或少數(shù)幾個染色體，所以兩個耐性基因能同時、高頻率導入表明6-1保持的G418耐性標記的人22號染色體還標記有嘌呤霉素耐性基因。
(實施例27)從產(chǎn)生人抗體重鏈的雜交瘤獲得人抗體重鏈可變區(qū)的cDNA并測定其堿基序列 在(實施例15)中所得能產(chǎn)生人抗體重鏈(IgM)的雜交瘤中，從H4B7(HSA特異的)和H8F9(非特異的)用ISOGEN(日本基因)提取總RNA。用Ready-To-Go T-primed Ist strand Kit(Pharmacia)，使用5μg的每個總RNA來合成cDNA。用下面所示的引物(參照Larrick等，生物/技術(shù)，7，934-，1989；Word等，國際免疫學，1，296-，1989制作)對所得cDNA進行PCR，擴增人抗體重鏈可變區(qū)。
CM1(人IgM恒定區(qū))5′-TTGTATTTCCAGGAGAAAGTG(序列號45) CM2(人IgM恒定區(qū))5′-GGAGACGAGGGGG AAAGGG(序列號46) HS1(人重鏈可變區(qū)域)5′-ATGGACTGGACCTGGAGG(AG)TC(CT)TCT(GT)C(序列號47)(8種的混合物) HS2(人重鏈可變區(qū)域)5′-ATGGAG(CT)TTGGGCTGA(GC)CTGG(GC)TTT(CT)T(序列號48)(16種的混合物) HS3(人重鏈可變區(qū)域)5′-ATG(AG)A(AC)(AC)(AT)ACT(GT)TG(GT)(AT)(GCT)C(AT)(CT)(GC)CT(CT)CTG(序列號49)(6144種的混合物) *()は表示其位置的堿基是()內(nèi)任一個形成的混合物。
H4B7、H8F9的第一輪PCR均用HS1×CM1、HS2×SM1、HS3×CM13種引物的組合物進行，(94℃1分、50℃2分、72℃3分，40個循環(huán)，Perkin-Elmer公司，熱循環(huán)儀140)，分別用HS1×CM2、HS2×CM2、HS3×CM2的引物對其PCR產(chǎn)物進行再次擴增(溫度條件同前，30個循環(huán))。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后，根據(jù)溴化乙錠染色進行檢測。結(jié)果用HS3×CM2的引物時，從H4B7得到490bp的擴增產(chǎn)物。另外，對于H8F9，用HS3×CM2引物時，在相同位置得到一微量帶，因此用該引物進行了再次擴增(溫度條件同前，30個循環(huán))。結(jié)果在擴增產(chǎn)物中檢測出非常強的信號。參照石田等(基因表達實驗手冊，講談社Scientific，1995)的方法，將這些PCR產(chǎn)物在pBlueScriptll SK+(Stratagere)載體的Smal部位進行克隆。在插入了擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒中選擇質(zhì)粒#2、#3、#4(H4B7)、#11、#13、#14(H8F9)，用自動熒光測序儀(Applyed Bio System社)檢測擴增產(chǎn)物的堿基序列。將所得堿基序列和預計的氨基酸序列與已報道的人抗體VH區(qū)(Marks等，歐洲免疫學雜志，21，985-，1991)、JH區(qū)(Raretch等，細胞，27，583-，1981)的序列進行比較，結(jié)果表明H4B7、H8F9均含有VH4家族和JH的組合。該結(jié)果表明在保持人14號染色體部分片段的嵌合體小鼠中能產(chǎn)生有完整功能的人抗體重鏈蛋白質(zhì)。
(實施例28)從表達人抗體κ鏈的嵌合體小鼠脾臟獲取人抗體κ鏈cDNA并測定其堿基序列 用與(實施例5)相同的方法，從(實施例13)中獲得的。在(實施例23)中證實能表達人抗體κ鏈的嵌合體小鼠K2-8脾臟中合成cDNA，應用下面的引物(參照Larrick等，生物/技術(shù)，7，934-，1989；Whitehurt等，核酸研究，20，4929-，1992制作)進行PCR，擴增人κ鏈可變區(qū)。陰性對照可應用K2-8的肝臟cDNA及(實施例10)的TT2/#143-2來源的嵌合體小鼠K3-2-2的脾臟cDNA。KC2(人Igκ鏈恒定區(qū))5′-CAGAGGCAGTTCCAGATTTC(序列號50)KC3(人Igκ鏈恒定區(qū))5′-TGGGATAGAAGTTATTCAGC(序列號51)KVMIX(人Igκ鏈可變區(qū))5′-ATGGACATG(AG)(AG)(AG)(AGT)(CT)CC(ACT)(ACG)G(CT)(GT)CA(CG)CTT(序列號52)(3456種的混合物) *()表示其結(jié)果的堿基是()內(nèi)任何一種組成的混合物。
PCR的條件是，使用KVMIX×KC2、KKVMIX×KC3引物的組合物，以94℃15秒、55℃15秒、72℃20秒進行40個循環(huán)(Perlin-Elmer，熱循環(huán)儀9600)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠染色進行檢測。結(jié)果檢測到所期望的約420bps(KC2)、450bps(KC3)長度的擴增產(chǎn)物。而在2種陰性對照中未檢測出特異的擴增產(chǎn)物。參照石田等(基因表達實驗手冊，講談社Scientific，1995)的方法將這些擴增產(chǎn)物克隆到pBlue ScriptII SK+(Stratagene)載體的SmaI或EcoRV部位。在插入了擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒中選擇來源于KVMIX×KC2的VK-#1克隆，用自動熒光測序儀(Applyed BioSystem)測定擴增產(chǎn)物的堿基序列。由于在所得到的堿基序列中，從人Igκ鏈的起始密碼子到恒定區(qū)不含有終止密碼子，所以認為克隆的擴增產(chǎn)物編碼功能性人Igκ鏈的可變區(qū)。另外，已報道的人抗體Vκ區(qū)(Klein等，歐洲免疫學雜志，23，3248-，1993)、Jκ區(qū)(Whitehurst等，同前)的堿基序列相比較，結(jié)果表明γ-1克隆含有Vκ3家族、Jκ的組合。該結(jié)果表明在保持人2號染色體部分片段的嵌合體小鼠中，能產(chǎn)生完整功能的人抗體κ鏈蛋白質(zhì)。
(實施例29)在保持人14號染色體片段的嵌合體小鼠血清中檢測人抗體γ鏈亞類和μ鏈，并進行定量 從(實施例10)中出生后11周齡的嵌合體小鼠(K15A和K16A；來源于1-4，嵌合率為70、50％)采血，參照(實施例14)，用ELISA方法檢測血清中人抗體γ鏈亞類的濃度。
[人IgG1的測定]用PBS稀釋抗人IgG抗體(Sigma，I-6260)，鋪到96孔微滴度板中。加入血清樣品，然后加入過氧化酶標記的抗人IgG1抗體(Phamnigen，08027E)，培養(yǎng)后加入7MBZ(住友Bakelite，ML-1120T)，用450mm的吸光度測定酶活性。用補充了小鼠血清的PBS梯度稀釋純化的濃度已知的標準人IgG1(Sigma，I-3889)。
〔人IgG 2的測定〕用PBS稀釋抗人IgG 2抗體(Sigma，I-9513)，鋪到96孔微滴度板中。加入血清樣品，然后加入過氧化酶標記的抗人IgG抗體(Sigma，A-0170)培養(yǎng)后加入TMBZ(同上)，用450nm的吸光度測定酶活性。用純化的，濃度已知的人IgG 2(Sigma，I-4139)作標準，用補充有小鼠血清的PBS進行梯度稀釋。
〔人IgG 3的測定〕用100mM鹽酸-甘氨酸緩沖液pH 2.5稀釋抗人IgG3抗體(Sigma，I-7260)，室溫放置5分鐘后，用100mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0稀釋到10倍。鋪到96孔微滴度板中。加入血清樣品，然后加入過氧化酶標記的抗人IgG抗體(pharmingen，08007E)，培養(yǎng)后加入TMBZ(同前)，用450nm的吸光度測定酶活性。用純化的，濃度已知的人IgG 3作標準(Sigma，I-4389)，用補充有小鼠血清的PBS進行梯度稀釋。
〔人IgG 4測定〕用100mM甘氨酸鹽酸緩沖液pH 2.5，稀釋抗人IgG 4抗體(Sigma，I-7635)，室溫放置5分鐘后，用100mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0稀釋到10倍。鋪到96孔微滴度板中。加入血清樣品，然后加入過氧化物酶標記的抗人IgG抗體(pharmingen，08007E)，培養(yǎng)后加入TMBZ(同前)，用450nm的吸光度測定酶活性。用純化的，已知濃度的人IgG 4(Sigma，I-4639)作標準，用補充有小鼠血清的PBS進行梯度稀釋。
〔人IgM的測定〕測定μ鏈時，將PBS稀釋的抗人μ鏈小鼠單克隆抗體(Sigma，I-6385)鋪到96孔微滴度板中。加入血清樣品，然后加入過氧化酶標記的抗人μ鏈小鼠抗體(The Binding Site limited，MP008)，培養(yǎng)后，加入過氧化酶的底物TMBZ(同前)，用450nm的吸光度測定酶活性。以純化的，含有μ鏈的濃度已知的人IgM(CAPPEL，6001-1590)作標準，用補充有小鼠血清(Sigma，M 5905)的PBS進行梯度稀釋。
結(jié)果如表10所示，在嵌合體小鼠K15A和K16A中，檢測出IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的全部亞類和IgM。
表10嵌合體小鼠中人抗體IgG亞類和IgM的濃度
(實施例30)保持人22號染色體的小鼠ES細胞株(TT2)的制備 為了制備保持人22號染色體的小鼠ES細胞(TT2)，用(實施例26)中制備的6-1(A9/#22，G418，嘌呤霉素耐性)細胞株作染色體供體細胞。用野生型TT2細胞株(實施例9)作染色體受體細胞。微細胞融合試驗和嘌呤霉素耐藥株的選擇，除嘌呤霉素的濃度為0.75mg/ml外，其它的與(實施例9)中G418耐藥株的選擇一樣。結(jié)果嘌呤霉素耐藥株的出現(xiàn)頻率為107個TT2細胞出現(xiàn)1～2個。嘌呤霉素耐藥株的凍存、基因組DNA的制備與(實施例2)相同。根據(jù)下面(1)、(2)的方法來證實嘌呤霉素耐藥株P(guān)G 22-1中保持有人22號染色體。
(1)PCR分析 以嘌呤霉素耐藥株基因組DNA為模板進行PCR擴增。存在于人22號染色體的基因(基因圖譜，同前)，證實在(實施例2；A9/#22)中存在的有10種引物；用這些引物進行PCR擴增，結(jié)果檢測出(實施例2；A9/#22)上存在的全部標記。
(2)Southern印跡分析 參照(實施例2)的方法，用人L1序列作探針，對來源于陰性對照野生型TT2、染色體供體細胞6-1、嘌呤霉素耐性TT2細胞株P(guān)G 22-1的基因組DNA進行Southern印跡分析。結(jié)果如(圖19)所示。圖中左側(cè)為DNA分子量。由于PG 22-1中的帶型與6-1的一致，且信號強度也相同，所以可以表明6-1細胞株中的22號染色體確實導入到PG 22-1中。
以上實驗證明嘌呤霉素耐性TT2細胞株P(guān)G 22-1保持全部或部分人22號染色體。
(實施例31)用保持人22號染色體的小鼠ES細胞株(TT2)制備嵌合體小鼠 將(實施例30)中制備的，經(jīng)證實保持有人22號染色體的嘌呤霉素耐藥性TT2細胞株P(guān)G 22-1的凍存株融化，注入ICR或MCH(ICR)(日本CREA)雄雌小鼠交配而得到的8細胞期胚胎中，每個胚胎注入10～12個細胞。用(實施例9)中培養(yǎng)ES細胞用的培養(yǎng)基培養(yǎng)一晚上，形成胚泡后。移植到偽孕處理后2.5天的代孕母親ICR小鼠(日本CREA)的子宮中，每側(cè)子宮約移植10個注入胚。
結(jié)果如(表11)所示。共移植了266個注入胚，結(jié)果產(chǎn)生了36只子代小鼠。嵌合體的判斷可依據(jù)毛色，在來源于宿主胚(ICR)的白色中能見到來源于TT2細胞的野鼠色(深棕)。在所生的36只子代小鼠中，毛色呈明顯野鼠色的部分，即能夠識別出由ES細胞貢獻的有8只。
該結(jié)果表明保持人22號染色體的ES細胞株(來源于TT2，PG 22-1)有形成嵌合體的能力，也就是說具有分化成小鼠正常組織的能力。
表11用保持人22號染色體的TT2細胞株制備嵌合體小鼠
(實施例32)在保持人22號染色體的嵌合體小鼠的血清中檢測人抗體λ鏈并進行定量 參照(實施例14)，用ELISA方法對(實施例31)的嵌合體小鼠KPG 22-1～3血清中人抗體濃度進行定量。從出生后2個月的嵌合體小鼠采血，用ELISA方法檢測血清中的人抗體λ鏈。將PBS稀釋的抗人免疫球蛋白λ鏈抗體(VECTOR LABORATORIES，INC，BA-3070)鋪到96孔微滴度板中，加入血清樣品，然后加入生物素標記的抗人免疫球蛋白λ鏈抗體(VECTOR LABORATORIES，INC.，BA-3070)，培養(yǎng)，再加入生物素化的辣根過氧化酶和親合素DH的復合物(VECTOR LABORATORIES，INC.，Vectastain ABC kit)，培養(yǎng)后加入TMBZ(同前)，用450nm的吸光度測定酶活性。用純化的含λ鏈濃度已知的人IgM(大日本制藥，U13200)作標準，用補充有小鼠血清的PBS進行梯度稀釋。結(jié)果如表12所示。該結(jié)果表明人抗體λ鏈基因保持人22號染色體的嵌合體小鼠中能起作用。
表12嵌合體小鼠中人抗體λ鏈的濃度
(實施例33)導入了人22號染色體的嵌合體小鼠血清中抗人HSA人抗體λ鏈的檢測 與(實施例20)的方法相同，在嵌合體小鼠(實施例31，KPG 22-3)出生后的第79天、94天、110天，用HSA免疫3次。參照(實施例14)，用ELISA方法檢測血清中人抗體λ鏈。將50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，pH 9.6稀釋成5μg/ml的HSA(Sigma，A 3782)鋪到96孔微滴度板中，加入血清樣品，然后加入生物素標記的抗人免疫球蛋白λ鏈抗體(VECTOR LABORATORIES，Inc.，BA-3070)，培養(yǎng)，再加入生物素化的辣根過氧化酶和親合素DH的復合物(VECTORLABORATORIES INC.，Vectastain ABC kit)，培養(yǎng)后，加入TMBZ(同前)，用450nm的吸光度測定酶活性。用HSA免疫的嵌合體小鼠血清中抗HSA人λ鏈的效價在免疫后升高。而在對照的ICR小鼠中，HSA免疫后的抗HSA人抗體λ鏈的效價處于背景水平。結(jié)果如(圖20)所示。圖20中，橫軸為嵌合體小鼠初次HSA免疫后的天數(shù)，縱軸為450nm處的吸光度。該結(jié)果表明保持人22號染色體的嵌合體小鼠中人抗體λ鏈基因起到作用，而且HSA抗原的刺激能引起抗原特異性人Igλ的效價上升。
(實施例34)用導入了人22號染色體的嵌合體小鼠制備產(chǎn)生人抗體輕鏈的雜交瘤 與(實施例25)的方法相同，在(實施例33)中用人白蛋白免疫的嵌合體小鼠KPG 22-3出生后第113天取出其脾臟，與骨髓瘤細胞融合，制備雜交瘤。參照<安東·千葉，單克隆抗體實驗操作入門，講談社Scientific，1991>的方法，用SP-2/0-Ag 14(大日本制藥，05-554)作骨髓瘤細胞進行雜交瘤的制備。在培養(yǎng)液中添加10％的HCF(Air Brown)，加到5塊96孔板中，培養(yǎng)1～3周，用ELISA方法分析出現(xiàn)克隆孔的培養(yǎng)上清。ELISA方法同(實施例33)相同，得到4個人抗體λ鏈的陽性克隆。
(實施例35)制備同時保持人22號和14號染色體部分片段的小鼠ES細胞株 為了制備同時保持人22號和14號染色體部分片段的小鼠ES細胞，用在(實施例26)中制備的6-1(A9/#22。G418，嘌呤霉素耐性)細胞株作染色體供體細胞。用已經(jīng)保持人14號染色體部分片段的G418耐性TT2耐性株1-4(實施例9)作染色體受體細胞。微細胞融合實驗和嘌呤霉素耐藥株的選擇除嘌呤霉素的濃度為0.75μg/ml外，其它與(實施例9)中G418耐藥株的選擇相同。結(jié)果嘌呤霉素耐藥株的出現(xiàn)頻率為每107個1-4細胞出現(xiàn)1～2個。這些嘌呤霉素耐藥株在G418以300μg/ml存在的情況下仍能增殖，這表明它們同時具有G418耐性。雙重耐藥株的凍存、基因組DNA的制備與(實施例2)相同。根據(jù)下面的PCR分析來證實雙重耐藥株P(guān)G 22-5保持人22號和14號染色體部分片段。用雙重耐藥株的基因組DNA為模板進行PCR擴增。22號、14號染色體上存在的基因(基因圖譜，同前)中，選擇(實施例2；A9/#22)中證實的存在于22號染色體的引物和(實施例9；TT2/#141-4)中證實的存在于14號染色體上的引物進行擴增，結(jié)果檢測出22號染色體上10種標記中的3種(D22S275，D22S315，Igλ)，在TT2/#141-4中檢測出全部存在于14號染色體上的標記。上面的實驗表明所得到的雙重耐藥性TT2細胞株同時保持人22號和14號染色體的部分片段。(實施例36)用同時保持人22號和14號染色體部分片段的小鼠ES細胞株制備嵌合體小鼠 將(實施例35)中制備的，證實保持人22號和14號染色體部分片段的G418、嘌呤霉素雙重耐藥性TT2細胞株P(guān)G 22-5的凍存株融化，注入到ICR或MCH(ICR)(日本CREA)雄雌小鼠交配而得到的8細胞期胚胎中，每個胚胎注入10～12個。用(實施例9)中ES細胞用的培養(yǎng)基培養(yǎng)1晚，形成胚泡后，移植到經(jīng)偽孕處理2.5天后的代孕母親ICR小鼠(日本CREA)的子宮中，每側(cè)子宮注入約10個的注入胚。
結(jié)果如(表13)所示。其移植了302個注入胚，結(jié)果產(chǎn)生了16只子代小鼠?？筛鶕?jù)毛色來判斷嵌合體，來源于宿主胚(ICR)的白色中有可識別的來源于TT2細胞的野鼠色(深棕)。所生16只子鼠中有5只毛色呈明顯的野鼠色，即有5只是ES細胞貢獻的個體。
該結(jié)果表明，保持人22號和14號染色體部分片段的ES細胞株(PG22-5)具有形成嵌合體的能力，即具有分化成小鼠正常組織的能力。
表13用保持人22號和14號染色體的TT2細胞株制備嵌合體小鼠
(實施例37)由同時保持人22號和14號染色體部分片段的ES細胞而來的嵌合體小鼠血清中人抗體λ鏈和人抗體μ鏈的檢測和定量 用HSA免疫(實施例36)中的嵌合體小鼠(KPG 22-9、10和12)。KPG 22-9和KPG 22-10在出生后10周齡時進行免疫，免疫2周后采血。KPG 22-12在出生后7周齡和9周齡進行2次免疫，第2次免疫2周后采血。
參照(實施例14)用ELISA方法檢測血清中含有人抗體μ鏈的抗體和含人抗體λ鏈的抗體以及含有人λ鏈及人μ鏈的抗體。
檢測完整抗體時，將用PBS稀釋的抗人免疫球蛋白λ鏈抗體(Kirkegaard&Perry Laboratories Inc.，01-10-11)鋪到96孔微滴度板中，加入血清樣品，然后加入過氧化酶標記的抗人免疫球蛋白μ鏈抗體(The Binding Site limited MP 008)，培養(yǎng)后，加入過氧化物酶的底物TMBZ(同前)，用450mm的吸光度測定酶活性，以純化的，含有λ鏈濃度已知的人IgM(大日本制藥，U13200)作標準，用補充有小鼠血清的PBS進行梯度稀釋，與此相比較求出血清中人抗體的濃度。用ELISA，按照與(實施例29)和(實施例32)相同的方法對人抗體μ鏈和人抗體λ鏈進行檢測和定量。結(jié)果如表14所示。在嵌合體小鼠中檢測出λ鏈和μ鏈。也檢測出含人抗體μ鏈并含λ鏈的抗體。該結(jié)果表明，在由保持人22號和14號染色體部分片段的ES細胞而來的嵌合體小鼠中，人抗體λ鏈基因和人抗體μ鏈基因同時起作用，并且在一部分B細胞中能產(chǎn)生重鏈和輕鏈均為人源性的完整抗體。
而在對照中，在只保持人14號染色體(實施例10)的嵌合體小鼠(K9)，只保持人22號染色體(實施例31)的嵌合體小鼠(KPG 22-2)的血清中，含人抗體μ鏈或λ鏈的抗體濃度處于背景水平，這表明，在該檢測系統(tǒng)中只檢測出保持人λ鏈及μ鏈的完整抗體。
表14嵌合體小鼠中人抗體的濃度
(實施例38)在由同時保持人2號和14號染色體部分片段的ES細胞而來的嵌合體小鼠血清中檢測人抗體(含有人κ鏈和μ鏈的抗體) 將溶于PBS的人血清白蛋白(HSA，Sigma，A3782)和佐劑(MPL+TDM乳液，RIBI免疫化學研究公司)混合，配制成0.75mg/ml的HSA溶液，用該溶液免疫(實施例19)中制備的嵌合體小鼠KPG-15(來源于TT2ES PG5，嵌合率10％)，從出生后第2～3個月齡開始免疫，每次0.2ml，免疫3回，然后采血。另外從出生后6周齡的(實施例19)中的嵌合體小鼠KPG-26(來源于TT2ES PG6，嵌合率40％)采血。參照(實施例14)用ELISA方法檢測血清中完整人抗體的濃度。將在PBS中稀釋的抗人免疫球蛋白κ鏈抗體(Kirkegaard&PerryLaboratories Inc.01-10-10)鋪到96孔微量滴度板中，加入用補充了小鼠血清(Sigma，M 5905)的PBS稀釋的血清樣品，然后加入過氧化物酶標記的抗人免疫球蛋白μ鏈抗體(The Binding Site limited，MP 008)，培養(yǎng)后加入過氧化物酶底物TMBZ(住友Bakelite，ML-11207)，用450mm處的吸光度測定酶活性，用純化的，含有κ鏈，濃度已知的人IgM(CAPPEL，6001-1590)作標準，用補充有小鼠血清的PBS進行梯度稀釋。用與(實施例20)相同的方法求出κ鏈，μ鏈的濃度。結(jié)果如表15所示。檢測出既含人抗體μ鏈又含有κ鏈的抗體。而在對照中，即在只保持人14號染色體(實施例10)的嵌合體小鼠(K9)，只保持人2號染色體(實施例13)的嵌合體小鼠(K2-9)的血清中既含有人抗體κ鏈又含有μ鏈的抗體濃度在0.002mg/ml以下，處于背景水平。該結(jié)果表明，在由同時保持人2號和14號染色體部分片段的ES細胞而來的嵌合體小鼠中，人抗體κ鏈基因和人抗體μ鏈基因能同時發(fā)揮功能，在一部分B細胞中能產(chǎn)生重鏈和輕鏈均為人源性的完整抗體。
表15嵌合體小鼠中人抗體的濃度
(實施例39)保持人2號染色體部分片段的小鼠ES細胞株(TT2F，X0)的制備 為了制備保持人2號染色體部分片段的小鼠ES細胞，用(實施例16)中制備的PG1細胞株作染色體供給細胞。用TT2F細胞(購自LifetechOriental公司)作染色體受體細胞，據(jù)報道該細胞株具有(39，X0)的染色體組型，在嵌合體小鼠中能有效地分化成卵母細胞(相尺慎一，生物手冊，8，基因打靶，羊土社，1995)。微細胞融合及嘌呤霉素耐藥株的選擇除嘌呤霉素的濃度為0.75μg/ml外，其余用(實施例9)中G418耐藥株的選擇相同。結(jié)果嘌呤霉素耐藥株的出現(xiàn)頻率為每107個TT2F細胞出現(xiàn)5個。這些嘌呤霉素耐藥株的凍存，基因組DNA的制備與(實施例2)相同。根據(jù)下面的PCR分析來證實耐藥株P(guān)-20、P-21中保持有人2號染色體。以耐藥株基因組DNA為模板，用存在于人2號染色體上的基因(基因圖譜，同前)中，在(實施例1；A9/#2W23)中證實存在的引物Cκ、FABP1、Vκ1-2的3種進行PCR擴增，結(jié)果在2克隆株中，所有的三種引物均產(chǎn)生所期待的擴增產(chǎn)物。
以上實驗表明，所得嘌呤霉素耐藥株ES細胞株(TT2F，XO)保持有人2號染色體部分片段。
(實施例40)用保持人2號染色體部分片段的小鼠ES細胞株(TT2F，XO)制備嵌合體小鼠 將(實施例39)中制備的，證實含有人2號染色體部分片段的嘌呤霉素耐藥性TT2細胞株P(guān)-21的凍存株融化，注入到ICR或MCH(ICR)(日本CREA)雄雌小鼠交配而得到的8細胞期胚胎中，每個胚胎注入10～12個細胞。用(實施例9)中ES細胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)1晚上，形成胚泡后，移植到經(jīng)偽孕處理2.5天后的代孕母親ICR小鼠(日本CREA)的子宮中，每側(cè)子宮注入大約10個注入胚。
其移植了141個注入胚，結(jié)果產(chǎn)生20只小鼠。可根據(jù)毛色來判斷嵌合體，在來源于宿主胚(ICR)的白色中有可識別的來源于TT2細胞的野鼠色(深棕)。結(jié)果如(表16)所示。在所生的20只小鼠中毛色中有明顯野鼠色部分，也就是說可以識別由ES細胞所貢獻的個體有9只。其中有4只毛色完全呈野鼠色(ES細胞來源)。
該結(jié)果表明，保持人2號染色體部分片段的ES細胞株(P-21)具有形成嵌合體的能力，即具有分化成小鼠正常組織的能力。
表16用保持人2號染色體部分片段的TT2細胞株制備嵌合體小鼠
(實施例41)由保持人2號染色體部分片段的TT2F而來的嵌合體小鼠血清中人抗體κ鏈的檢測及定量 從(實施例40)中出生后約1個月的嵌合體小鼠(來源于P-21嵌合率為100％，K2-1F～4F)采血，用與(實施例20)相同的ELISA方法對人抗體κ鏈的濃度進行定量。
結(jié)果如表17所示。結(jié)果表明當用TT2F ES細胞株時，人抗體κ鏈基因在嵌合體小鼠中能發(fā)揮作用。
表17嵌合體小鼠中人抗體κ鏈的濃度

(實施例42)在由保持人2號染色體部分片段的小鼠ES細胞(TT2F，X0)而來的嵌合體小鼠的后代中檢測人染色體的保持 將(實施例40)中所得的雌性嵌合體小鼠中的K2-1F、K2-4F(二者毛色的嵌合率為100％)與雄性ICR小鼠進行交配，檢測能否得到來源于ES細胞的后代，交配過程中用ICR雄性小鼠(白化，隱性)的精子使嵌合體小鼠的卵子受精，若卵子來源于TT2F細胞(野鼠色，顯性)則產(chǎn)生野鼠色小鼠，若卵子來源于ICR則產(chǎn)生白化小鼠。分別經(jīng)1次交配所得到的可生存子代小鼠(K2-1F10只，K2-4F5只)全部表現(xiàn)來源于ES細胞的野鼠色。從這些子代小鼠的尾部制備基因組DNA，通過PCR來檢測人染色體片段的保持。用P-21(實施例39)中證實存在的3種引物進行PCR擴增，結(jié)果證實10只中有4只(K2-1F)、5只中有2只(K2-4F)存在P-21中檢測出的3種引物。15只子鼠的PCR結(jié)果如(圖21)所示。圖中右側(cè)為標記物(φX174，HaeIII片段，日本Gene)和主要帶的分子量，左側(cè)用箭頭表示的是各個引物預期的擴增產(chǎn)物的長度。右側(cè)也表示用陽性對照親代嵌合體K2-1F、K2-4F尾部DNA的結(jié)果。這些結(jié)果表示保持人2號染色體部分片段的TT2F細胞株P(guān)-21在嵌合體小鼠中能分化成功能性卵子，并且將人2號染色體部分片段傳遞給由其卵子而來的后代。
(實施例43)在由保持人2號染色體部分片段的小鼠ES細胞株(TT2，XY)而來的嵌合體小鼠后代中檢測人染色體的保持 將(實施例13)中得到的嵌合體小鼠中的K2-18(雄性，嵌合率70％)、K2-19L(雌性，嵌合率60％)及同胞的非嵌合體雌鼠進行混合交配，檢測能否產(chǎn)生來源于ES細胞的后代。因為TT2細胞具有(40，XY)的染色體組型，所以在雄性嵌合體K2-18中有分化成功能性精子的可能。這種情況下嵌合體小鼠中來源于TT2細胞(野鼠色，顯性)的精子使ICR(白色隱性)來源的卵子受精可產(chǎn)生野鼠色子鼠。交配而產(chǎn)生的可生存的子代小鼠共110只，其中有10只顯示來源于ES細胞的野鼠色。從這10只野鼠色子鼠中選7只，用其尾部制備基因組DNA，用PCR檢測人染色體片段的保持。用證實在5-1株(TT2/#2fg.，實施例12)中存在的2種引物(Cκ，F(xiàn)ABP1)和在(實施例1)中顯示的Vκ1-2引物進行PCR擴增，結(jié)果證實7只中有2只全存在這3種標記。該結(jié)果顯示，保持人2號染色體部分片段的TT2細胞株5-1在嵌合體小鼠中能分化成功能性的精子，并且可將人2號染色體部分片段傳遞給由其精子而來的后代。
(實施例44)嵌合體小鼠后代的血清中人抗體κ鏈的檢測和定量 用ELISA方法對(實施例42)的嵌合體小鼠后代K2-1F-1～10F及K2-4F-1～5血清中人抗體κ鏈濃度進行定量。從出生后約4～6周齡的小鼠采血，用與(實施例20)相同的ELISA方法對血清中人抗體κ鏈進行檢測。結(jié)果與(實施例42)中所得保持染色體的結(jié)果一起用(表18)表示。該結(jié)果證實嵌合體小鼠所生后代中的人抗體κ鏈基因也能發(fā)揮作用。
表18嵌合體小鼠后代中人抗體κ鏈的濃度
(實施例45)對導入了人14號染色體部分片段的嵌合體小鼠脾細胞的分析 參照下列文獻所描述的方法用流式細胞術(shù)進行分析。日本生化學會編，新生化學實驗講座12，分子免疫學I-免疫細胞。細胞因子，1989，東京化學同仁；東京大學醫(yī)科學研究所，制癌研究部編，細胞工程分冊第8卷，新細胞工學實驗方案，1991，秀潤社；A.Doyle and J.B.Griffiths，“細胞和組織培養(yǎng)實驗室方法”John Wiley&Sons Ltd.出版，1996。從(實施例19)出生后約6個月齡的嵌合體小鼠(KPG06；來源于PG 16，嵌合率為30％)取脾，經(jīng)氯化銨水溶液處理后，用含1％大鼠血清的PBS中異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗小鼠CD 45R(B220)抗體(Pharmingen，01124A)進行染色。洗滌后，與含5％小鼠血清的PBS中生物素標記的抗人IgM抗體(Pharmigen，08072D)或作為對照的生物素標記的抗人λ鏈抗體(Pharmingen，08152D)進行反應，之后用鏈霉親和素藻紅蛋白(Pharmigen，13025D)染色，用流式細胞儀(BD，F(xiàn)ACSort)進行分析。結(jié)果如圖22所示。圖中橫軸為人IgM，縱軸為CD45R(B220)。B細胞標記～CD45R陽性(FITC)且人IgM陽性(PE)的細胞群增加了4％，這證實在嵌合體小鼠中存在細胞表面表達了人抗體μ鏈的細胞。
(實施例46)用分別表達人抗體重鏈、κ鏈、λ鏈的嵌合體小鼠脾臟cDNA克隆人抗體基因的可變區(qū)并測定堿基序列 從在(實施例29)、(實施例23)、(實施例32)中證實分別表達人抗體重鏈、κ鏈、λ鏈的嵌合體小鼠K15A(來源于1-4株，按實施例10的方法制作)、K2-8(實施例13中制作)、KPG22-2(實施例31中制作)的脾臟提取RNA，用與(實施例5)相同的方法合成cDNA，用下面的引物進行PCR，分別擴增人抗體基因的可變區(qū)。從非嵌合體小鼠ICR取脾制備cDNA，用它作陰性對照。無參考文獻的引物的制作是以GenBank等數(shù)據(jù)庫中堿基序列為基礎的。
K15A(重鏈) 恒定區(qū)用HIGMEX 1-25′-CCAAGCTTCAGGAGAAAGTGATGGAGTC(序列號53) HIGMEX 1-15′-CCAAGCTTAGGCAGCCAACGGCCACGCT(VH3BACK的第2輪PCR使用)(序列號54)可變區(qū)用VH1/5BACK(59℃，35個循環(huán)，Marks等，歐洲免疫學雜志，21，985-，1991)，VH4BACK(59℃，35個循環(huán)，Marks等，同前)，VH3BACK(第1次PCR59℃，35個循環(huán)，第2次PCR59℃，35個循環(huán)，Marks等，同前)。
·K2-8(輕鏈κ) 恒定區(qū)用KC2H5′-CCAAGCTTCAGAGGCAGTTCCAGATTTC(序列號55) 可變區(qū)用Vκ1/4BACK(55℃，40個循環(huán)，Marks等，歐洲免疫學雜志，21，985-，1991)，Vκ2BACK(55℃，40個循環(huán)，Marks等，同前)，Vκ3BACK(55℃，40個循環(huán)，Marks等，同前)。
·KPG22-2(輕鏈λ) 恒定區(qū)用CλMIX(以下3種引物等摩爾比混合) IGL 1-CR5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTGATCAG(序列號56) IGL2-CR5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG(序列號57) IGL7-CR5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG(序列號58) 可變區(qū)用Vλ1LEA1(55℃，40個循環(huán)，Williams等，歐洲免疫學雜志，23，1456-，1993)，Vλ2MIX(55℃，40個循環(huán)，如前面Williams等的報道中，將Vλ2LEA1、Vλ2JLEAD等摩爾比混合。Vλ3MIX(55℃，40個循環(huán)，如前面Williams等的報道，將Vλ3LEA1、Vλ3JLEAD、Vλ3BACK4等摩爾比混合)。
PCR是這樣進行的各個恒定區(qū)域與可變區(qū)域(重鏈3種、κ鏈3種、λ鏈3種)引物的組合在94℃，15秒，各個可變區(qū)引物的退火溫度15秒，72℃，20秒用各個可變區(qū)引物的循環(huán)數(shù)(使用Perkin-Elmer，熱循環(huán)儀9600)。VH3BACK的第2輪PCR是將第1輪PCR的擴增產(chǎn)物與(HIGMEX1-1×VH3BACK)的引物組合進行再度擴增。全部的擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠染色進行檢測。結(jié)果在所有的組合中檢測出所期待的長度(重鏈，約470bp，輕鏈κ400bp，輕鏈λ約510bp)的擴增產(chǎn)物。除在陰性對照中，在全部相同位置粉末檢測出特異的擴增產(chǎn)物。用Prep.A.gene(Bio-Rad)將所有的擴增產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠提取出，然后用限制性酶處理(重鏈HindIII-Pst I，重鏈κHind III-Pvull，輕鏈λHind III-EcoR I)，克隆到pUC 119(泵酒透)載體的Hind III，PstI部位(重鏈)，Hind III，Hincll部位(κ鏈)，Hind III，EcoRI部位(λ鏈)。用下面的引物(右側(cè)表示克隆數(shù))進行擴增所得到的擴增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，用自動熒光測序儀(Applyed Bio System)測定擴增產(chǎn)物的堿基序列。
·HIGMEX1-2×VH1/5BACK10克隆 ·HIGMEX1-2×VH4BACK8克隆 ·HIGMEX1-2(2nd PCR，HIGMEX1-1)×VH3BACK5克隆 ·KC2H×Vκ1/4BACK6克隆 ·KC2H×Vκ2BACK7克隆 ·KC2H×Vκ3BACK4克隆 ·CλMIX×Vλ1LEA15克隆 ·CλMIX×Vλ2MI X6克隆 ·CλMIX×Vλ3MI X5克隆 用DNASIS(日立軟件工程公司)分析所得堿基序列，結(jié)果表明所有的序列來自人，它們是從起始密碼子到恒定區(qū)域間不包含終止密碼子的功能序列，所有的κ鏈、λ鏈、23種重鏈中的21種中均如此。在所確定的序列中去除同一序列后，可確定各不相同的可變區(qū)序列重鏈為17種，κ鏈11種，λ鏈12種。
(實施例47)從分別表達人抗體重鏈，κ鏈、λ鏈的嵌合體小鼠脾臟制備cDNA，用它分析人抗體基因可變區(qū)的堿基序列 在以下幾個方面分析(實施例46)中所確定的堿基序列(重鏈17克隆、κ鏈11克隆、λ鏈12克隆)。
1.鑒定各可變區(qū)序列中使用的已知胚系V基因區(qū)段 2.鑒定各可變區(qū)序列中使用的已知胚系J基因區(qū)段 3.鑒定重鏈可變區(qū)中使用的已知胚系D區(qū)段 4.在1、2、3結(jié)果的基礎上鑒定重鏈可變區(qū)中N領(lǐng)域的付加 5.確定從各可變區(qū)序列推斷出的氨基酸序列 結(jié)果如(表19)所示。1、2的鑒定是通過用DNASIS檢素Genbank中登記的同源胚系V及J區(qū)段。分別參照(Cook等，Nature genetics7，162-1994)，(Klein等，歐洲免疫學雜志，23，3248-，1993)、(Williams等，同前)所描述的方法，VH區(qū)段、V κ區(qū)段。Vλ區(qū)段和各V區(qū)段家族的名稱一起列在表中。在3中，用DNASIS檢素(Ichinhara等，The EMBO J.，7，13，4141-，1988)報道中的同源胚系D區(qū)段，以連續(xù)8bp以上的一放性為標準來確定，結(jié)果如表中所示。認為DN*是(Green等，Nature Genetics，7，13-1994)報道中的新DN*家族。4中，在1(V)、2(J)、3(D)結(jié)果的基礎上，將在任何胚系區(qū)段中都不出現(xiàn)的堿基序列確定為N區(qū)。結(jié)果在確定為D區(qū)的13種順序列中的11種中有N區(qū)，其平均長度為8.7bp。5中用DNASIS將各堿基序列變換為用單符號表示的氨基酸序列。表中只表示了CD3區(qū)。表中右側(cè)為克隆各可變區(qū)時使用的引物名稱及各克隆名稱。
表19
(實施例48)制備用于敲除掉TT2(或TT2F)的細胞的抗體基因(重鏈、軟鏈κ)靶向載體 小鼠抗體基因(重鏈、軟鏈κ)破壞后，可將G418耐藥基因標記的人14號染色體片段(實施例9)和嘌呤霉素耐藥基因標記的人2號(實施例18)或22號染色體(實施例35)導入TT2(或TT2F)細胞。這樣參照(主鏈+κ鏈實施例19，主鏈+λ鏈實施例36)的方法，應用導入的人14號+2號或人14號+22號染色體、小鼠抗體基因(主鏈、轉(zhuǎn)鏈κ)基因破壞了的TT2(或TT2F)的細胞，可制成嵌合體小鼠，期望它能產(chǎn)生重鏈和輕鏈主要來源于人的抗體。以下表示圖23～27中限制性酶的簡稱。
限制性酶KpKpnI、BBamHI、RIEcoRI、RVEcoRV、NNotI、SIIScaII、ScaScaI、SfiSfiI、SmSmaI、XXhoI、SISaII、dKpKpnI的刪除、(X)λ載體的XhoI酶切位點。
點線部分pBluescript SKII(+)質(zhì)粒DNA。


LoxP序列 1.制備G418耐藥基因兩側(cè)插入了LoxP序列的LoxP-pstNEO質(zhì)粒 TT2(或TT2F)細胞的抗體基因被除掉以后，為了去除G418耐藥基因，有必要在G418耐藥基因(實施例1)的兩端同向插入Cre重組酶(Sauer等，美國國家科學院院刊，85，5166-，1988)的識別序列LoxP序列(Sauer等，同前)。用限制酶XhoI把pstNEO基因從pSTneoB質(zhì)粒DNA(實施例1)切出，用瓊脂糖凝膠電泳純化DNA片段，用T4DNA聚合酶(Takara社制Blunting end kit)將兩端平端化。含LoxP序列的質(zhì)粒DNA pBS246(質(zhì)粒pBS246，LoxP2盒式載體，U.S.專利4959317)購自GIBCO BRL公司。在該質(zhì)粒的EcoRI和SpeI切斷位點插入XhoI接頭DNA。變成XhoI的識別序列。將上述pstNEO DNA片段插入這一改變的pBS246的EcoRV酶切位點，得到質(zhì)粒LoxP-pstNEO(圖23)。
2.包含來源于C57BL/6的抗體重鏈Cμ(IgM恒定區(qū))、輕鏈Jκ-Cκ(Igκ連結(jié)區(qū)域和恒定區(qū))的基因組DNA克隆的分離 由于TT2(或TT2G細胞)來源于C57BL/6小鼠和CBA小鼠的F1代小鼠，本發(fā)明者打算用來源于C57BL/6小鼠的基因組DNA克隆制備敲除掉抗體基因用的載體。用來源于Clontech公司成熟C57BL/6N雄性小鼠肝臟的基因組DNA文庫作基因組DNA庫。用以下的合成DNA序列(60聚體)作篩選用的探針。
重鏈Cμ探針5′-ACC TTC ATC GTC CTC TTC CTC CTG AGC CTCTTC TAC AGC ACC ACC GTC ACC CTG TTC AAG-3′(序列號59)輕鏈κ探針5′-TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCCACC ATC CAG TGA GCA GTT AAC ATC TGG AGG-3′(序列號60)。
分析分離出的λ克隆，將含有重鏈Cμ或輕鏈Jκ-Cκ的DNA片段亞克隆到pBluescript SKII(+)質(zhì)粒(Stratagene公司)中(重鏈Cμ圖24；輕鏈Jκ-Cκ圖25)。用這些DNA片段制備破壞以下TT2(或TT2F)ES細胞中的小鼠抗體基因的靶向載體。
3.制備破壞小鼠抗體重鏈基因用的載體-質(zhì)粒 在編碼含有2中制備的小鼠抗體重鏈恒定區(qū)的基因組DNA Cμ的區(qū)域內(nèi)，用1中制備的LoxP-pstNEO基因替換含有第2～第4外顯子的DNA片段(BamHI～XhoI)(圖26)。pstNEO的轉(zhuǎn)錄方向與抗體基因的轉(zhuǎn)錄方向相反。用大腸桿菌JM109擴增該質(zhì)粒DNA，通過氯化銫平衡離心進行純化(細胞工學實驗操作入門，1992年講談社刊)。用限制性酶SacII在一個位點酶切純化的質(zhì)粒DNA，用于TT2(或TT2F)ES細胞的轉(zhuǎn)染。為了從轉(zhuǎn)化體TT2(或TT2F)ES細胞檢測抗體重鏈部分與靶向載體間同源重組而形成的克隆，用Cμ上游存在的轉(zhuǎn)換區(qū)DNA片段(約500對堿基)作轉(zhuǎn)化體基因組DNA Southern印跡用的探針。該DNA片段是在以下條件用PCR擴增129小鼠基因組DNA而得到的。
有義引物5′-CTG GGG TGA GCC GGA TGT TTT G-3′(序列號61) 反義引物5′-CCA ACC CAG CTC AGC CCA GTT C-3′(序列號62) 模板DNAEcoRI消化的129小鼠基因組DNA 1μg 反應緩沖液脫氧核苷混合物、Taq DNA聚合酶，均為Takara公司產(chǎn)品。
反應條件94℃，3分，1次→94℃，1分；55℃，2分；72℃，2分；3次→94℃，45秒；55℃，1分；72℃，1分；36次。
證實所擴增的DNA能按照Genbank的數(shù)據(jù)庫，用H限制性酶HindIII在一位點酶切后，將它亞克隆到pBluescript質(zhì)粒的EcoRV酶切部位。用限制性酶BamHI和XhoI酶切該質(zhì)粒DNA(S8)，用瓊脂糖凝膠電泳純化PCR片段(約550堿基對)，用來作探針。用EcoRI和XohI消化靶向載體轉(zhuǎn)化的TT2(或TT2F)ES細胞的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，分離，進行Southern印跡，用上述探針進行檢測。4.制備破壞小鼠抗體基因輕鏈κ用的載體 將2中制備的含小鼠抗體輕鏈κJ區(qū)及恒定區(qū)的基因組DNA的含J區(qū)(J1-J5)的DNA片段(EcoRI～SacII)用1中制備的LoxP-pstNEO基因替換(圖27)。pst NEO的轉(zhuǎn)錄方向與抗體基因的轉(zhuǎn)錄方向相同。用大腸桿菌JM 109擴增該質(zhì)粒DNA，通過氯化銫平衡離心進行純化。用限制性酶KpnI在一個位點酶切純化的質(zhì)粒DNA，用以轉(zhuǎn)染TT2(或TT2F)ES細胞。為了從轉(zhuǎn)化體TT2(或TT2F)ES細胞檢測抗體重鏈部分與靶向載體進行同源重組而形成的克隆而進行轉(zhuǎn)化體基因組DNA Southern印跡分析時用輕鏈Jκ-Cκ基因組DNA(參照圖25)的3′端DNA片段(XhoI～EcoRI；約1.4k bp)作探針。用EcoRI和NotI消化靶向載體轉(zhuǎn)化的TT2(或TT2F)ES細胞的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，進Southern印跡分析，有上述的探針檢測。
(實施例49)獲取抗體基因破壞了的小鼠ES細胞株 為了獲得抗體重鏈基因的同源重組體，用限制酶SacII(寶酒造)使(實施例48)中制備的抗體重鏈靶向載體線性化，參照(相尺慎一、生物學手冊，8，基因打靶，羊土社，1995)的方法，導入小鼠ES細胞TT2F。用胰酶處理TT2F細胞，以2.5×107/ml的濃度懸浮到HBS中，加入5μg DNA，用基因脈沖儀(Bio-Rad，未連接電阻器裝置)進行電穿孔。用4mm距離的電穿孔細胞，在960μF、250V的條件下于室溫進行。將經(jīng)過電穿孔的細胞懸浮到20ml的ES培養(yǎng)基中，接種到2塊預先鋪有飼養(yǎng)細胞的100mm組織培養(yǎng)用的塑料平皿中(Corning)。同樣用10，15μgDNA進行實驗。1天后換成含300μg/ml的G418(GENETICIN，Sigma)的培養(yǎng)基。7-9天后，挑選生成的176個克隆，分別在12孔培養(yǎng)板中進行增殖至匯合，將其4/5懸浮到0.2ml的保存用培養(yǎng)基(ES培養(yǎng)基+10％DMSO(Sigma))中，-80℃凍存。將剩余的1/5接種到12孔明膠板中，培養(yǎng)2天，用(實施例2)的方法提取基因組DNA。用限制性酶EcoRI和XhoI(寶酒造)消化這些G418耐藥性TT2F細胞的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，進行Southern印跡分析，用(實施例48)-3中所示的探針檢測同源重組體。結(jié)果176株中得到3株同源重組體。野生型TT2F細胞和同源重組體#131、#141的Southern印跡分析結(jié)果如(圖28)左側(cè)第3列所示。用EcoRI、XhoI消化野生型TT2F細胞可檢測出2條帶(a、b)，預期在同源重組體中這2條帶均消失，出現(xiàn)新的下部的帶(c)。結(jié)果圖中#131、#141中a帶消失，出現(xiàn)新的c帶。圖中左側(cè)表示DNA的大小。結(jié)果表明這些克隆中抗體重鏈基因的一個等位基因被同源重組所破壞。
(實施例50)用抗體重鏈同源重組體ES細胞制備嵌合體小鼠 將(實施例49)中所得到的抗體重鏈同源重組體TT2F細胞株#131的凍存株融化，注入到ICR或MCH(ICR)(日本CREA)雄雌小鼠交配而得到的8細胞期胚胎中，每個胚胎注入10～12個。用ES細胞的培養(yǎng)基(實施例9)培養(yǎng)一晚上，形成胚泡后，移植到偽孕2.5天的代孕母親ICR小鼠(日本CREA)的子宮中，每側(cè)注入約10個注入胚。其移植了94個注入胚，結(jié)果產(chǎn)生了22只子鼠。根據(jù)毛色，來源于宿主胚(ICR)的白色中有可識別的來源于TT2F細胞的野鼠色(深棕)，來判斷嵌合體。所生22只子鼠中毛色中有明顯呈野鼠色部分的，也就是說可識別由ES細胞所貢獻的有18只。其中16個是毛色有80％以上野鼠色(來源于ES細胞)的雌性嵌合體小鼠。該結(jié)果表明，抗體重鏈同源重組體ES細胞株#131具有形成嵌合體的能力。由于所得嵌合體小鼠中貢獻率非常多的個體多為雌性，表明ES細胞分化成機能性生殖細胞(卵子)的可能性較多。將嵌合體小鼠中貢獻率為100％的2個雌性嵌合體，與MCH(ICR)雄性小鼠交配，結(jié)果所生子鼠全部為野鼠色。這些子鼠來自#131(參照實施例42)，我們認為破壞的抗體重鏈等位基因以2∶1的比例進行遺傳。
(實施例51)從抗體重鏈同源重組體制備雙重破壞株 有這樣的報道因G418耐藥基因的插入而破壞了一個等位基因的ES細胞株，在高濃度G418的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，篩選高濃度G418耐藥株，可得到2個等位基因同時破壞了的細胞株(相沢慎一等，生物學手冊系列8，基因打靶，羊土社，1995)?；诖?，為了得到TT2F抗體重鏈同源重組體#131、#141的2個等位基因破壞株，我們進行了以下實驗。首先，為了測定#131、#141兩株的G418致死濃度，以每個平皿約100個細胞的比例接種到10塊35mm的平皿中(該例中使用未經(jīng)絲裂霉素處理的G418耐性原代培養(yǎng)細胞作營養(yǎng)細胞，參照實施例9)，在G418的濃度分別為0，0.5，1，2，3，5，8，10，15，20mg/ml(GENETICIN，Sigma)的ES培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。結(jié)果在3mg/ml時還能看到克隆，而到5mg/ml時則未見克隆形成。由此可確定最小致死濃度為5mg/ml，在濃度為4，5，6，7，8mg/ml的情況下篩選高濃度G418耐藥株。將#131、#141分別以每塊平皿約106個細胞的比例接種到10個100mm平皿中，在含有上述各濃度G418的ES培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(5個濃度，每個濃度兩塊平皿)。培養(yǎng)開始12天后在7mg，8mg/ml的平皿中挑選明確的克隆(#13112株，#14110株)，用與(實施例49)相同的方法進行凍存、提取DNA。用限制性酶EcoRI和XhoI(寶酒造)消化這些高濃度G418耐藥株的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后進行Southern印跡分析，用(實施例48)-3中所示的探針檢測破壞了2個等位基因的克隆。結(jié)果從#131得到，株(#131-3)2個等位基因被破壞了的細胞株。對#131的6株進行Southern印跡分析的結(jié)果如(圖28)所示。用EcoRI、XhoI進行消化，在野生型TT2F細胞中檢測出2條野生型帶(a、b)。在一個等位基因同源重組體(#131、#141)中上部的a帶消失，出現(xiàn)新的c帶(實施例49)。預期在2個等位基因被破壞的情況下，另一個野生型帶b消失，只出現(xiàn)破壞型c帶。在圖中的3號(#131-3)克隆中可觀察到這一帶型。也就是說該克隆是抗體重鏈基因的2個等位基因均被破壞了的克隆。(實施例52)從抗體重鏈缺陷的純合子TT2F細胞株中除去G418耐性標記基因 通過以下步驟除去(實施例51)中獲得的抗體重鏈2個等位基因均被破壞了的細胞株(高濃度G418耐藥株，#131-3)中G418耐藥性標記基因，參照(相沢慎一，生物學手冊系列8，基因打靶，羊土社，1995；高津圣志等，實驗醫(yī)學分冊，免疫研究的基礎技術(shù)，p255-，1995，羊土社)的方法，將含有能在G418耐藥標記基因兩端插入的LoxP序列(實施例48-1)間引起位點特異性重組的Cre重組酶基因的表達載體-PBS 185(BRL)導入#131-3。用胰酶處理#131-3細胞，以2.5×107/ml的濃度懸浮到HBS中，加入30μg的pBS 185DNA，用基因脈沖儀(Bio-Rad，未接電阻器裝置)進行電穿孔。用4mm距離電穿孔細胞(實施例1)，在960μF、250V的情況下進行。將經(jīng)過電穿孔的細胞懸浮到5ml ES培養(yǎng)基中，接種到1塊預先鋪有飼養(yǎng)細胞的、60mm組織培養(yǎng)用塑料培養(yǎng)瓶中(Corning)。2天后用胰酶處理細胞，再次接種到預先鋪有飼養(yǎng)細胞、100mm的培養(yǎng)瓶中，每個接種100、200、300個細胞，共接種3瓶?；蛎}沖儀的設定條件只改變?yōu)?接連電阻器裝置，電阻值無限大)，其余同前。7天后，挑選長出的96個克隆，經(jīng)胰酶處理后，分成2份，分別接種到2塊鋪有飼養(yǎng)細胞的48孔板中和只經(jīng)凝膠處理的48孔板中。在含有300μ/ml G418(GENETIC、Sigma)的培養(yǎng)基中，將后者培養(yǎng)3天，根據(jù)其生存率來判斷G418耐性。結(jié)果有6個克隆在G418存在的情況下死亡。將這些G418敏感株在35mm培養(yǎng)瓶中增殖至匯合，將其4/5懸浮到0.5ml保存時應用的培養(yǎng)基(ES培養(yǎng)基+10％DMSO<Sigma>)中，-80℃保存。將剩余的1/5接種到12孔凝膠鋪過的板中，按(實施例2)的方法培養(yǎng)2天，制備基因組DNA。用限制性酶EcoRI(寶酒造)消化這些G418敏感性TT2F細胞株的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后進行Southern印跡分析，用包含G418耐藥基因、來源于pSTneoB的3.2kb XhoI片段(探針A)來證實G418耐藥基因的去除。其結(jié)果在所有的敏感株中均未檢測出在#131-3中所觀察到的與探針A雜交的帶。由此可證實，在所得G418敏感株中，G418耐性標記基因確實被去除。此外，用同樣的方法，以EcoRI消化pBS 185DNA的探針B進行Southern印跡分析，結(jié)果在這些G418敏感株中沒有檢測到與探針B雜交而形成的特異性帶，這表明含有Cre重組酶的pBS 185未插入到敏感株的染色體中。也就是說，這些敏感株可與實施例48-4中所示由于敲除抗體輕鏈的載體(G418耐藥基因的兩端存在LoxP序列)進行轉(zhuǎn)化。
(實施例53)將人14號染色體(抗體重鏈)導入抗體重鏈缺陷的ES細胞株 按(實施例9)的方法，用微細胞法將G418耐藥基因標記的人14號染色體(含有抗體重鏈基因)導入(實施例52)中所得的內(nèi)源性抗體重鏈的缺陷小鼠ES細胞株中(來于TT2F，G418敏感性)。用PCR分析等方法(實施例9)證實在所得G418耐藥株中保持有包含人抗體重鏈基因的人14號染色體(片段)。
(實施例54)將人2號染色體片段或人22號染色體導入保持人14號染色體(片段)、抗體重鏈缺陷的ES細胞株中 按照(實施例18、35)，用微細胞法，將嘌呤霉素耐藥基因標記的人2號染色體(含有人抗體輕鏈κ基因)或人22號染色體(含有人抗體輕鏈λ基因)導入在(實施例53)中得到的、保持人14號染色體片段、抗體重鏈缺陷的小鼠ES細胞株(G418耐性)中。通過PCR分析等(實施例18、35)來證實在所得嘌呤霉素、G418雙重耐藥株中保持有人14號染色體(片段)和2號染色體片段或22號染色體(片段)。
(實施例55)用內(nèi)源性抗體重鏈缺陷，保持含人抗體重鏈基因的14號染色體(片段)的ES細胞制作嵌合體小鼠 按照(實施例10)中的方法，用(實施例53)中獲得的缺乏內(nèi)源性抗體重鏈、保持含人抗體重鏈基因的14號染色體(片段)的ES細胞制作嵌合體小鼠。用(實施例14)的方法在所得嵌合體小鼠中檢測來源于ES細胞株的B細胞所產(chǎn)生的人抗體重鏈。由于來源于ES細胞的B細胞中的功能性抗體重鏈基因只有導入染色體上的人源基因，所以大多數(shù)來源于ES細胞株的B細胞產(chǎn)生人抗體重鏈。
(實施例56)用保持人14號+2號、14號+22號染色體(片段)、內(nèi)源性抗體重鏈缺陷的ES細胞制備嵌合體小鼠 參照(實施例19、36)的方法，用在(實施例54)中獲取的保持人14號+2號、14號+22號染色體(片段)、缺乏內(nèi)源性抗體重鏈的小鼠ES細胞制備嵌合體小鼠。用(實施例14、23、32)中所示的方法在所得嵌合體小鼠中來源于ES細胞株的B細胞中檢測人抗體重鏈和輕鏈κ或輕鏈λ。與(實施例55)相同由于來源于ES細胞的B細胞中的功能性抗體重鏈基因只有導入染色體土的人源基因，所以多數(shù)來源于ES細胞的B細胞產(chǎn)生人抗體重鏈。另外，按如(實施例37、38)所示的方法，也檢測出重鏈、輕鏈均來源于人的完整人抗體分子。
(實施例57)用保持人14號+2號、14號+22號染色體(片段)、內(nèi)源性抗體重鏈缺陷的小鼠ES細胞來源的嵌合體小鼠制備產(chǎn)生人抗體的雜交瘤 與(實施例15、25、34)相同，用目的抗原免疫(實施例56)中制備的嵌合體小鼠，取脾，與骨髓瘤細胞進行細胞融合，制成雜交瘤。用ELISA法分析1～3周間的培養(yǎng)上清。按(實施例14、15、21、24、25、33、34、37、38)中所示的方法進行ELISA，可得到人抗體陽性以及人抗體陽性且對免疫抗原特異的克隆。
(實施例58)用抗體重鏈缺陷的純合子小鼠ES細胞制備破壞了抗體輕鏈基因的細胞株 通過以下步驟制備同源重組體，該同源重組體是在(實施例52)中獲得的抗體重鏈缺陷純分子TT2F細胞株(G418敏感性)中又破壞了抗體輕鏈基因。用限制性酶KpnI(寶酒造)將(實施例48-4)中制備的抗體輕鏈靶向載體線性化，參照(相沢慎一、生物學手冊系列8，基因打靶，羊土社，1995)的方法，導入到上述TT2F細胞株(G418敏感性)。7～9天后挑選所生克隆，按(實施例49)的方法凍存、提取基因組DNA。用限制性酶EcoRI和NotI(寶酒造)消化G418耐藥株的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后進行Southern印跡分析，用(實施例48-4)中的探針檢測同源重組體。
(實施例59)從抗體輕鏈同源重組體制備雙重破壞株 依照下面程序，從(實施例58)的TT2F抗體輕鏈同源重組體(并且抗體重鏈缺陷的純合子)制備破壞了輕鏈兩側(cè)等位基因的克隆。用(實施例51)的方法制備高濃度G418耐藥株，凍存、提取DNA。用限制性酶EcoRI和NotI(寶酒造)消化高濃度G418耐藥株的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后進行Southern印跡分析，用(實施例48-4)中的探針檢測破壞了兩側(cè)等位基因的細胞株。
(實施例60)從抗體輕鏈缺陷的純合子(并且抗體重鏈缺陷的純合子)TT2F細胞株除去G418耐性標記基因 按(實施例52)中的步驟除去(實施例59)中抗體輕鏈兩側(cè)等位基因破壞株(高濃度G418耐藥株)的G418耐性標記基因。將含有Cre重組酶基因的表達載體pBS 185(BRL)按(實施例52)的方法導入上述細胞株，其中Cre重組酶基因能在G418耐性標記基因兩側(cè)插入的LoxP序列(實施例48-1)間引起位點特異性重組。與(實施例52)相同，將所得G418敏感株在35mm培養(yǎng)瓶中進行增殖至匯合，將其4/5懸浮到0.5ml保存用培養(yǎng)基(ES培養(yǎng)基+10％DMSO<Sigmn>)中，-80℃凍存。將剩余的1/5接種到12孔鋪有凝膠的板中，培養(yǎng)2天，按(實施例2)的方法提取基因組DNA。用限制性酶EcoRI(寶酒造)消化這些G418敏感性TT2F細胞的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后進行Southern印跡分析，用含有G418耐性基因、來源于pSTneoB的3.2kb XhoI片段作探針證實G418耐性基因的去除。
(實施例61)將人14號染色體(抗體重鏈)導入抗體重鏈、輕鏈缺陷的ES細胞株 參照(實施例9)，用微細胞法將G418耐性基因標記的人14號染色體(含有人抗體重鏈基因)導入(實施例60)中內(nèi)源性抗體重鏈和輕鏈缺陷的小鼠ES細胞株(來于TT2F，G418敏感性)，用PCR分析等方法(實施例19)來證實在所得G418耐藥株中保持有含人抗體重鏈基因的人14號染色體(片段)。
(實施例62)將人2號染色體(輕鏈κ)導入抗體重鏈、輕鏈缺陷且保持人14號染色體(抗體重鏈)的ES細胞株中 參照(實施例18)，用微細胞法將嘌呤霉素耐性基因標記的人2號染色體(含人抗體輕鏈κ基因)部分片段導入(實施例61)中內(nèi)源性抗體重鏈和輕鏈缺陷，且保持人14號染色體的小鼠ES細胞株(來源于TT2F，G418耐性)中。用PCR分析等方法(實施例18)來證實在G418雙重耐藥株中保持有人14號染色體(片段)和人2號染色體片段。
(實施例63)將人22號染色體(輕鏈λ)導入抗體重鏈、輕鏈且保持人14號染色體(抗體重鏈)的ES細胞株 參照(實施例35)，用微細胞法將嘌呤霉素耐性基因標記的人22號染色體(含人抗體輕鏈λ基因)導入在(實施例61)中得到的內(nèi)源性抗體重鏈和輕鏈缺陷且保持人14號染色體的小鼠ES細胞株中(來自TT2F、G418耐性)。通過PCR分析等方法(實施例35)在所得嘌呤霉素、G418雙重耐藥株中證實人14號染色體(片段)和人22號染色體(片段)的保持。
(實施例64)制備同時保持人2號(抗體輕鏈κ)、14號(抗體重鏈)、22號(抗體λ鏈)染色體或其片段、內(nèi)源性抗體重鏈、輕鏈缺陷的小鼠ES細胞 為了得到同時保持3種人染色體的小鼠ES細胞，將殺稻瘟素耐性(Izumi等，實驗細胞研究，197，229，1991)、潮霉素耐性(Wind等，細胞，82，321-，1995)等標記基因插入到人2號或22號染色體進行標記。按照(實施例16、26)的方法進行。用與(實施例9)相同的方法將殺稻瘟素耐性或潮霉素耐性標記的人22號染色體(含有人抗體輕鏈λ基因)導入在(實施例62)中得到的、內(nèi)源性抗體重鏈和輕鏈缺陷且保持人14號染色體(片段)及2號染色體部分片段的小鼠ES細胞株中(來自TT2F，G418耐性、嘌呤霉素耐性)。使用分別與選擇標記相適應的飼養(yǎng)細胞用于ES細胞的培養(yǎng)。使用潮霉素耐性標記的時候，選用保持、表達該標記的轉(zhuǎn)基因小鼠的原代培養(yǎng)纖維母細胞(Johnson等，核酸研究，23卷，7期，1273-，1995)。用PCR分析等方法(實施例9，18，35)來證實所得G418、嘌呤霉素、潮霉素(或殺稻瘟素三重耐藥株是否保持上述3種人染色體(片段)。用同樣的方法將潮霉素或殺稻瘟素耐性基因標記的人2號染色體導入(實施例63)中所得的、內(nèi)源性抗體重鏈和輕鏈缺陷且保持人14號染色體(片段)及22號染色體部分片段的小鼠ES細胞株(來自TT2F，G418耐性、嘌呤霉素耐性)。
(實施例65)從保持含人抗體基因(重鏈+輕鏈)的染色體(片段)、內(nèi)源性抗體重鏈、輕鏈缺陷基因的小鼠ES細胞制備嵌合體小鼠 按照(實施例10)的方法，用(實施例61、62、63、64)中得到的保持有含人抗體基因的染色體(片段)、內(nèi)源性抗體重鏈、輕鏈基因缺陷的小鼠ES細胞株制作嵌合體小鼠。用(實施例14、23、32)的方法檢測所得嵌合體小鼠中，來自宿主胚的B細胞產(chǎn)生的小鼠抗體和來自ES細胞株的B細胞所產(chǎn)生的人抗體。由于來源于ES細胞的B細胞中，功能性抗體重鏈及輕鏈κ基因只有存在于導入染色體上的人源基因，所以來源于ES細胞的B細胞多數(shù)產(chǎn)生人抗體重鏈和輕鏈κ(Lonberg等，自然，368，856-，1994)。此外，用(實施例37、38)的方法檢測重鏈、輕鏈均為人源性的完整人抗體分子。(實施例66)用來源于小鼠ES細胞的嵌合體小鼠制備產(chǎn)生人抗體的雜交瘤，其中ES細胞保持有含人抗體基因(重鏈+輕鏈)的染色體(片段)且內(nèi)源性抗體重鏈、輕鏈基因缺陷。
與(實施例25)相同，用目的抗原免疫(實施例65)中得到的嵌合體小鼠，取其脾，與骨髓瘤細胞進行細胞融合，制作雜交瘤。用ELISA方法分析1-3周間進行培養(yǎng)的培養(yǎng)上清。ELISA方法按(實施例14、15、21、22、23、24、25、33、34、37、38)的方法進行，可得到人抗體陽性以及人抗體陽性且對免疫抗原特異的克隆。
(實施例67)用重鏈基因缺陷的宿主胚制備嵌合體小鼠 來源于(實施例49)中內(nèi)源性抗體重鏈缺陷一側(cè)等位基因的TT2F細胞株的嵌合體小鼠的后代中，呈野鼠色的個體，通過Southern印跡分析或PCR(實施例49)等方法選拔保持等位基因缺陷的個體(預期可能性為1/2)?？贵w重鏈缺陷的雜合子雌雄個體進行交配產(chǎn)生子代小鼠，用Southern印跡分析(參照實施例49)來分析其淋巴細胞表示μ鏈的表達(Kitamura等，自然，350，423-，1991)，可得到雙側(cè)等位基因缺陷、基本不能產(chǎn)生自身功能性抗體的抗體重鏈缺陷的純合子(預期出現(xiàn)率為1/4，在膜型μ鏈缺陷小鼠中的結(jié)果參照Kitamura等，自然，350，423-，1991)。在清潔環(huán)境中飼養(yǎng)的純合體雌雄個體進行交配，由此而得到胚胎，可用這胚胎作制備嵌合體小鼠時的宿主。這種情況下制備的嵌合體小鼠中，功能性B細胞基本上來源于注入的ES細胞。RAG-2缺陷小鼠(Shinkai等，細胞，68，855-，1992)等不能制備自身功能性B細胞的其它小鼠品系也可用于此目的。在該系統(tǒng)中應用(實施例62，63，64)中得到的內(nèi)源性抗體重鏈和輕鏈缺陷且保持人14號+2號、或14號+22號或14號+2號+22號染色體(片段)的小鼠ES細胞株，參照(實施例10)的方法制作嵌合體小鼠。所得嵌合體小鼠中，由來源于ES細胞的B細胞中功能性人抗體重鏈(14號染色體上)、輕鏈κ(2號染色體上)、輕鏈λ(22號染色體上)基因的表達而產(chǎn)生主要由人重鏈和人輕鏈組成的抗體。
(實施例68)導入了人14號染色體(片段)的ES細胞來源的嵌合體小鼠后代中人染色體的保持 按照(實施例9)的方法以及將(實施例9)中的小鼠ES細胞替換為TT2F(39，XO，實施例39)的方法得到保持人14號染色體(片段)的嵌合體小鼠，將它們與野生型ICR小鼠(白色，日本CREA)混合，交配。從所生野鼠色子鼠的尾部制備基因組DNA，通過PCR來檢測人14號染色體片段的保持(實施例9、42、43)。如(實施例42)和(實施例43)所示，保持人14號染色體(片段)的小鼠ES細胞株在嵌合體小鼠中能分化成功能性卵子或精子，人14號染色體(片段)能遺傳給其后代。也就是說可建立一種小鼠品系，它保持有含人抗體重鏈基因的人14號染色體(片段)，并可遺傳給后代。在本實施例以及下面的實施例69-74中，人14號染色體(片段)指含有人抗體重鏈基因的染色體(片段)，人2號染色體(片段)指含有人輕鏈κ基因，人22號染色體(片段)指含有人抗體λ鏈基因的染色體(片段)。
(實施例69)導入了人22號染色體(片段)的ES細胞來源的嵌合體小鼠后代中人染色體的保持 用與(實施例30)相同的方法或稍作調(diào)整將(實施例30)的小鼠ES細胞替換為TT2F(39，XO)得到保持人22號染色體(片段)的嵌合體小鼠，將其與ICR小鼠混合，交配。從所生野鼠色子代鼠的尾部制備基因組DNA，用PCR法檢測其中人22號染色體片段的保持(參照實施例42、43、30)。如(實施例42)和(實施例43)所示，保持人22號染色體或其部分片段的小鼠ES細胞株在嵌合體小鼠中能分化成功能性卵子或精子，并可將人22號染色體(片段)遺傳給其后代。也就是說可建立一種小鼠品系，它保持有含人抗體輕鏈λ基因的22號染色體(片段)，并能遺傳給后代。
(實施例70)通過交配制備同時保持人2號染色體片段和14號染色體(片段)的小鼠 將(實施例42)或(實施例43)中得到的保持人2號染色體片段的小鼠品系與(實施例68)中得到的保持人14號染色體(片段)的小鼠品系進行交配，從所生子代小鼠的尾部制備基因組DNA，通過PCR方法等(實施例9、42、43)進行分析，得到同時保持人2號染色體部分片段和人14號染色體(片段)的小鼠。
(實施例71)通過交配制備同時保持人22號染色體(片段)和14號染色體(片段)的小鼠。
將(實施例69)中得到的保持人22號染色體(片段)的小鼠品系與(實施例68)中得到的保持人14號染色體(片段)的小鼠品系進行交配，從所生子代小鼠的尾部制備基因組DNA，通過PCR方法等(實施例30、42、43)進行分析，得到同時保持人22號染色體(片段)和人14號染色體(片段)的小鼠。
(實施例72)通過交配制備同耐保持人2號染色體片段，14號染色體(片段)和22號染色體(片段)的小鼠。
將(實施例71)中得到的保持人22號和14號染色體(片段)的小鼠品系與(實施例42、43)中得到的保持人2號染色體片段的小鼠品系進行交配，從所生小鼠的尾部制備基因組DNA，用PCR等方法(實施例9、30、42、43)進行分析，得到同時保持人22號和14號染色體(片段)及人2號染色體部分片段三種染色體的小鼠。或者將(實施例70)中所得保持人2號染色體(片段)和人14號染色體(片段)的小鼠品系與(實施例69)中所得保持人22號染色體片段的小鼠品系進行交配，同樣可得到同時保持3種人染色體的小鼠。
(實施例73)通過交配制備能主要產(chǎn)生完整人抗體的小鼠品系 將保持人2號+14號(實施例70)、14號+22號(實施例71)、2號+14號+22號(實施例72)染色體的小鼠品系與內(nèi)源性抗體重鏈缺陷(實施例67；Kitamura等，自然，350，423-，1991)、輕鏈κ(Zou等，EMBO.J.12，811-，1993；Chem等，EMBO.J.，12，821-，1993)基因缺陷的小鼠品系進行反復交配，通過PCR等分析(實施例9、30、42、43)篩選保持人2號+14號、14號+22號、或2號+14號+22號染色體的小鼠，建立主要產(chǎn)生完整的人抗體的小鼠系統(tǒng)(Green等，Nature Genetics，7，13-，1994；Lonberg等，自然，368，856-，1994)。
(實施例74)從交配得到的保持含人抗體基因的人染色體的小鼠品系制備產(chǎn)生人抗體的雜交瘤 與(實施例25)相同，用目的抗原免疫(實施例42、43、68、69、70、71、72、73)中得到的、保持有含人抗體基因的人染色體的小鼠，取脾，與骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤。用ELISA方法分析1～3周培養(yǎng)期間的培養(yǎng)上清。按(實施例14、15、21、22、25、33、34、37、38)的方法進行ELISA，得到人抗體陽性及人抗體陽性且對免疫抗原特異的克隆。
(實施例75)小鼠抗體重鏈兩側(cè)等位基因均破壞了的TT2F細胞株來源的嵌合體小鼠血清中小鼠IgM的檢測及定量。
按照(實施例40)的方法，從(實施例51)中獲得的小鼠抗體重鏈兩個等位基因均破壞了的TT2F細胞株(#131-3)所產(chǎn)生的子代小鼠中分別得到嵌合率為0％、50％、99％的3個小鼠，對其血清中小鼠IgM進行檢測和定量。從出生后2周齡的嵌合體小鼠采血，用(實施例14)的ELISA方法對血清中小鼠IgM的濃度進行定量。固定PBS稀釋的抗小鼠IgM抗體(Kirkegaard&Perry Laboratories Inc.，01-18-03)，然后加入血清樣品，血清樣品用添加了5％FBS的PBS稀釋。加入過氧化物酶標記的抗小鼠IgM抗體(Kirkegaard&PerryLaboratories Inc.，074-1803)，以TMBZ作底物，測定450nm的吸光度。以純化的小鼠IgM(Phamningn，03081D)作標準，用補充有FBS的PBS進行梯度稀釋。結(jié)果如表20所示，該結(jié)果顯示由小鼠抗體重鏈兩側(cè)等位基因破壞了的TT2F細胞而來的嵌合體小鼠中，嵌合率為99％的小鼠中小鼠IgM濃度低，這表明ES細胞的小鼠重鏈基因基本上沒有功能。
表20嵌合體小鼠中小鼠IgM的濃度(ELISA)
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性 本發(fā)明提供了一種嵌合體非人動物，它保持有單一或多個外源染色體或其片段，并能表達該染色體或其片段上的基因。利用本發(fā)明的嵌合體非人動物，可制備生物活性物質(zhì)。
本發(fā)明提供具有分化多能性的細胞，它保持有單一或多個外源染色體或其片段，并能表達該外源染色體或其片段上的基因。利用該細胞，通過骨髓移植等方法可治療遺傳病。
序列表
序列號1
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TGGAAGGTGG ATAACGCCCT
序列號2
序列長度22
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TCATTCTCCT CCAACATTAG CA
序列號3
序列長度21
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸 合成DNA
序列
TGTAGGGGAC CTGGAGCCTT G
序列號4
序列長度21
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TTGACAACTC ACCTGGACTA G
序列號5
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA
序列號6
序列長度22
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TGCTGATGGT GAGAGTGAAC TC
序列號7
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
AGTCAGGGCA TTAGCAGTGC
序列號8
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GCTGCTGATG GTGAGAGTGA
序列號9
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TGGTGGCTGA AAGCTAAGAA
序列號10
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CCAGAAGAAT GGTGTCATTA
序列號11
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TCCAGGTTCT GCAGAGCAAG
序列號12
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TGTAGTTGGA GGCCATGTCC
序列號13
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CCCCACCCAT GATCCAGTAC
序列號14
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GCCCTCAGAA GACGAAGCAG
序列號15
序列長度22
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GAGAGTTGCA GAAGGGGTGA CT
序列號16
序列長度22
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸 合成DNA
序列
GGAGACCACC AAACCCTCCA AA
序列號17
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GGCTATGGGG ACCTGGGCTG
序列號18
序列長度22
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CAGAGACACA GGCACGTAGA AG
序列號19
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TTAAGGGTCA CCCAGAGACT
序列號20
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TGTAGTTGGA GGCCATGTCC
序列號21
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸 合成DNA
序列
CAAAAAGTCC AACCCTATCA
序列號22
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GCCCTCAGAA GACGAAGCAG
序列號23
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TCGTTCCTGT CGAGGATGAA
序列號24
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TCACTCCGAA GCTGCCTTTC
序列號25
序列長度21
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸 合成DNA
序列
ATGTACAGGA TGCAACTCCT G
序列號26
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TCATCTGTAA ATCCAGCAGT
序列號27
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GATCCCATCG CAGCTACCGC
序列號28
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TTCGCCGAGT AGTCGCACGG
序列號29
序列長度22
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GATGAACTAG TCCAGGTGAG TT
序列號30
序列長度22
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CCTTTTGGCT TCTACTCCTT CA
序列號31
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
ATAGAGGGTA CCCACTCTGG
序列號32
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
AACCAGGTAG GTTGATATGG
序列號33
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
AAGTTCCTGT GATGTCAAGC
序列號34
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TCATGAGCAG ATTAAACCCG
序列號35
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TGTGAAGGAG GACCAGGTGT
序列號36
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TGTAGGGGTT GACAGTGACA
序列號37
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CTGAGAGATG CCTCTGGTGC
序列號38
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GGCGGTTAGT GGGGTCTTCA
序列號39
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GGTGTCGTGG AACTCAGGCG
序列號40
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CTGGTGCAGG ACGGTGAGGA
序列號41
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GCATCCTGAC CGTGTCCGAA
序列號42
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GGGTCAGTAG CAGGTGCCAG
序列號43
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
AGTGAGATAA GCAGTGGATG
序列號44
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GTTGTGCTAC TCCCATCACT
序列號45
序列長度21
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TTGTATTTCC AGGAGAAAGT G
序列號46
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GGAGACGAGG GGGAAAAGGG
序列號47
序列長度27
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
ATGGACTGGA CCTGGAGGRT CYTCTKC
序列號48
序列長度27
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
ATGGAGYTTG GGCTGASCTG GSTTTYT
序列號49
序列長度27
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
ATGRAMMWAC TKTGKWBCWY SCTYCTG
序列號50
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CAGAGGCAGT TCCAGATTTC
序列號51
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TGGGATAGAA GTTATTCAGC
序列號52
序列長度20
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
ATGGACATGR RRDYCCHVGY KCASCTT
序列號53
序列長度28
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CCAAGCTTCA GGAGAAAGTG ATGGAGTC
序列號54
序列長度28
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CCAAGCTTAG GCAGCCAACG GCCACGCT
序列號55
序列長度28
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CCAAGCTTCA GAGGCAGTTC CAGATTTC
序列號56
序列長度28
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTGATCAG
序列號57
序列長度28
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTTATGAG
序列號58
序列長度28
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
GGGAATTCGG GTAGAAGTCA CTTACGAG
序列號59
序列長度60
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
ACCTTCATCG TCCTCTTCCT CCTGAGCCTC TTCTACAGCA
CCACCGTCAC CCTGTTCAAG
序列號60
序列長度60
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
TGATGCTGCA CCAACTGTAT CCATCTTCCC ACCATCCAGT
GAGCAGTTAA CATCTGGAGG
序列號61
序列長度22
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CTGGGGTGAG CCGGATGTTT TG
序列號62
序列長度22
序列類型核酸
鏈數(shù)單鏈
拓樸學線性
序列的種類其它核苷酸合成DNA
序列
CCAACCCAGC TCAGCCCAGT TC
權(quán)利要求
1.制備能表達人抗體基因的嵌合非人動物或其子代的方法，其包括下述步驟制備包含至少一個下述的人染色體片段的微細胞，所述的染色體片段選自堿基長度不小于1Mb、包含編碼人抗體的基因或其大片段功能序列部分的染色體2，14和22的片段；通過與所述的微細胞融合將所述的染色體片段轉(zhuǎn)化到非人動物多能細胞中，由此制備保有所述的至少一個人染色體片段的多能細胞；由所述的多能細胞制備所述的嵌合非人動物；可選擇地，由所述的嵌合非人動物生產(chǎn)其子代。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的非人動物、其子代或多能細胞保有包含人抗體重鏈基因的人染色體14的片段。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的非人動物、其子代或多能細胞保有包含人抗體輕鏈κ基因的人染色體2的片段。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的非人動物、其子代或多能細胞保有包含人抗體輕鏈λ基因的人染色體22的片段。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的非人動物、其子代或多能細胞保有包含人抗體輕鏈κ基因的人染色體2的片段和包含人抗體輕鏈λ基因的人染色體22的片段。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的非人動物、其子代或多能細胞保有包含人抗體重鏈基因的人染色體14的片段和包含人抗體輕鏈κ基因的人染色體2的片段。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的非人動物、其子代或多能細胞保有包含人抗體重鏈基因的人染色體14的片段和包含人抗體輕鏈λ基因的人染色體22的片段。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的含有至少一個染色體片段的微細胞是通過誘導下述雜合細胞得來的，所述雜合細胞是由衍生所述染色體片段的細胞與具備有效形成微細胞能力的細胞融合形成的。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述的含有至少一個染色體片段的微細胞是通過誘導下述細胞得來的，所述細胞是將誘導上述雜合細胞所得的微細胞與具備有效形成微細胞能力的細胞進一步融合所得的。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，作為所述至少一個染色體片段的來源的細胞是人正常二倍體細胞。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，具備有效形成微細胞能力的細胞是小鼠A9細胞。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的多能細胞是胚胎干細胞。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的ES細胞來源于小鼠。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的多能細胞具有經(jīng)破壞的、與所述染色體片段上的編碼人抗體的基因或其大片段功能序列同一或同源的基因。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的嵌合非人動物細胞抗原能夠?qū)⑺龅闹辽僖粋€染色體片段傳遞到其子代中。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的嵌合非人動物是哺乳動物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述的哺乳動物是小鼠。
18.制備人抗體的方法，其包括在由權(quán)利要求1的方法制備的除小鼠之外的、嵌合非人動物、其子代、其組織或其細胞中表達至少一個染色體片段上的人抗體基因，并收集人抗體。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述的嵌合非人動物或其子代的細胞是B細胞。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的B細胞通過與骨髓瘤細胞融合無限增殖化。
21.制備多克隆人抗體的方法，其包括用抗原免疫由權(quán)利要求1的方法制備的除小鼠之外的、嵌合非人動物或其子代，從所述動物的血液或腹水中收集抗血清。
22.制備單克隆人抗體的方法，其包括用抗原免疫由權(quán)利要求1的方法制備的除小鼠之外的、嵌合非人動物或其子代，從來源于所述動物或其子代的雜交瘤收集針對所述抗原的單克隆抗體。
23.制備人抗體的方法，其包括用抗原免疫由權(quán)利要求1的方法制備的除小鼠之外的、嵌合非人動物或其子代，從經(jīng)免疫的動物中提取人抗體基因或其大片段功能序列；將所述的人抗體基因或其大片段功能序列轉(zhuǎn)化到細胞中；培養(yǎng)所述的細胞；收集針對所述抗原的抗體。
全文摘要
一種制備嵌合體非人動物的方法，包括制備保持單一或多個外源染色體或其片段的微細胞，通過與該微細胞融合將該外源染色體或其片段轉(zhuǎn)移到分化多能性細胞；一種嵌合體非人動物，可通過上述方法進行構(gòu)建，或其后代；來源于它們的組織和細胞；一種應用這些組織和細胞的方法；含有單個或多個外源染色體或其片段和持續(xù)分化多能性細胞；一種構(gòu)建該細胞的方法；一種應用該細胞的方法。
文檔編號C07K16/18GK101333516SQ20081000997
公開日2008年12月31日 申請日期1996年8月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月29日
發(fā)明者富塚一磨, 吉田均, 石田功, 花岡和則, 押村光雄 申請人:麒麟醫(yī)藥株式會社