專(zhuān)利名稱(chēng)：一種胸腺肽α1-胸腺五肽融合肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合肽及其制備，尤其涉及一種胸腺肽a1-胸腺五肽融合肽 (Tocl-TP5)及其制備方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胸腺五肽(Thymopentin, TP5)是胸腺生成素的第32_36的氨基酸殘基肽段，是一 個(gè)雙向免疫調(diào)節(jié)劑，現(xiàn)已在臨床上用于免疫缺陷病、自體免疫性疾病等的治療。研究證 明，它的半衰期較短，只有30秒。如此短的半衰期不僅使胸腺五肽在體內(nèi)的作用時(shí)間 短，而且也增加患者的用藥費(fèi)用，影響了胸腺五肽在臨床上的效用。如果能夠通過(guò)一定 的手段增加胸腺五肽的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)其體內(nèi)半泰期以減少給藥劑量或延長(zhǎng)給藥周期，將會(huì)大 大提高胸腺五肽的治療效果，降低用藥費(fèi)用，促進(jìn)其在臨床上的應(yīng)用。胸腺肽al (Tocl，又稱(chēng)胸腺素al)，最早是從胸腺內(nèi)提取的，是由28個(gè)氨基酸殘基 構(gòu)成的多肽。胸腺肽al在臨床上也作為免疫調(diào)節(jié)劑用于病毒感染性疾病、免疫缺陷病、 自體免疫性^^病、腫瘤等的治療。根據(jù)肽鏈的延長(zhǎng)能夠延長(zhǎng)小分子肽體內(nèi)半衰期的原理，利用基因工程技術(shù)將胸腺肽al 和胸腺五肽進(jìn)行融合制備胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)，可延長(zhǎng)胸腺肽al和胸腺 五肽的半衰期，并同時(shí)發(fā)揮兩者的免疫調(diào)節(jié)作用，以提高療效。經(jīng)檢索，本研究的相關(guān)論文 和專(zhuān)利還未見(jiàn)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容針對(duì)胸腺五肽半衰期較短的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種胸腺肽al-胸腺 五肽融合肽(Tal-TP5)及其制備方法。本發(fā)明所述的胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)，是由Tal-TP5融合基因通過(guò) 基因工程構(gòu)建成表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5，再經(jīng)發(fā)酵、分離與純化等步驟后制備的， 獲得的Tal-T^5融合肽經(jīng)測(cè)定體外血漿半衰期為140 min，相比胸腺五肽半衰期明顯延 長(zhǎng)。本發(fā)明所述胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)，其特征是所述融合肽的氨基 酸序列如SEQ IDNO.l所示，其相對(duì)分子質(zhì)量約為4470道爾頓，由相對(duì)分子質(zhì)量為3208 道爾頓的胸腺肽al和相對(duì)分子質(zhì)量為679.77道爾頓的胸腺五肽融合而成?；蛘呤撬?述融合肽是包含SEQ ID NO.l所示氨基酸序列的、分子量小于10000道爾頓的肽或蛋白 質(zhì)。本發(fā)明所述胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)的制備方法，由以下步驟組成 (1)表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5的構(gòu)建Tal-TP5融合基因通過(guò)PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，其中，設(shè)計(jì)的前導(dǎo)引物含五co/U位點(diǎn)，后序引物含AW I和凝血酶位點(diǎn)；將質(zhì)粒pGAPZaA及純化后的Tal-TP5融合基因均用 ￡COR I和I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的載體和Tal-TP5融合基因片斷， 用T4 DNA連接酶4"連接16 h構(gòu)建成表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸 桿菌，挑取陽(yáng)性克隆，用DNA電泳和序列分析鑒定重組質(zhì)粒。(2) 含表達(dá)載體pGAPZocA/Tal-TP5工程菌的構(gòu)建 表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5經(jīng)Bln酶切后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建含表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5的工程菌；陽(yáng)性克隆用含濃度為lOOOpg.mL—1抗生素 Zeocin的PYD篩選；采用PCR技術(shù)鑒定陽(yáng)性克隆的Tal-TP5融合基因，用電泳和質(zhì)譜 法鑒定目的Tal-TP5融合肽。(3) Tal-TP5融合肽的表達(dá)和分離與鑒定將構(gòu)建的畢赤酵母GS115-pGAPZaA/Tal-TP5工程菌在30 32。C條件下，于PYD 培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)4 5天；離心去除酵母細(xì)胞，培養(yǎng)液用鎳離子親和色譜分離Tal-TP5 融合肽，并用電泳鑒定；分離的Tal-TP5融合肽進(jìn)一步經(jīng)凝血酶酶切后用Sephadex G-50 分離得到純化的Tal-TP5融合肽。其中所述鎳離子親和色譜采用鎳離子親和色譜體系，包括結(jié)合緩沖液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl， 20mmol/L咪唑，pH7.4; 洗脫緩沖液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl, 0.5 mol/L咪唑，pH7.4; Tal-TP5融合肽的脫鹽體系Tris緩沖液，0.02 mol/LTris堿，0.001 mol/LEDTA， pH7.4;所述凝血酶酶切采用凝血酶酶切體系50mmol/LNH4HCO3溶液，pH8.4， 28°C4h; 所述Sephadex G-50洗脫液為50mmol/L (NH4)2S04， pH8,0。 應(yīng)用本發(fā)明方法獲得的胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Tal-TP5)其體外血漿半衰期為140min，通過(guò)對(duì)脾細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)證明，Tal-TP5融合肽具有顯著的促進(jìn)昆明小鼠脾細(xì)胞增殖活性戶 '具體活性研究證明方法如下1.Tal-TP5融合肽體外血漿半衰期測(cè)定 通過(guò)HPLC測(cè)定得出，測(cè)定方法由以下步驟組成(1) 色譜條件色譜柱Shim-pack VP-ODSCis 150 mmx4.6mm，5[im;柱溫25°C;檢測(cè)波長(zhǎng)TP5 為215ran， Tal.為210nm, Tal-TP5為210 nm;進(jìn)樣量15pL;流速0.3^L。流動(dòng)相TP5為乙腈水=20: 80， TFA為0.1%， Tal-TP和Tal的流動(dòng)相均為乙 酸銨(5mmol/L):乙腈=10: 90，三氟乙酸(TFA)為0.1%。(2) 以上實(shí)驗(yàn)所得出的回收率TP5為57.97%， Tal的為70.94%， Tal-TP5的為 74.92%。G) TP€與Tal的體外血槳半衰期 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)測(cè)得TP5與Tal的體外血漿半衰期分別為5.6 min和127 min，Tal-TP5 融合肽的體外血漿半衰期為140min。2. Tal-TP5融合肽促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖活性研究以常規(guī)MTT法進(jìn)行胸腺肽al-胸腺五肽融合肽(Totl-TP5)對(duì)脾細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果Tal-TP5,融合肽具有顯著的促進(jìn)昆明小鼠脾細(xì)胞增殖活性。上述活性研究證實(shí)本發(fā)明制得的Tal-TP5融合肽與TP5相比，不僅保留了其免 疫活性，而且還具有半衰期長(zhǎng)、活性好等特性，在臨床上將具有好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例h(1) 表達(dá)載體pGAPZccA-Ta 1-TP5的構(gòu)建① 融合基因的設(shè)計(jì)與擴(kuò)增設(shè)計(jì)Tal-TP5融合基因，其前端含五coRl位點(diǎn)，后端 含7VWI和凝血酶位點(diǎn)。通過(guò)常規(guī)PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行12 g/L瓊脂糖凝 膠電泳鑒定擴(kuò)增物，并用PCR回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。② 融合基因和載體進(jìn)行酶切將pGAPZaA和PCR產(chǎn)物經(jīng)￡coRI/iVW I雙酶切， 并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定連接產(chǎn)物。③ 表達(dá)載體的構(gòu)建純化后的連接產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶構(gòu)建為表達(dá)載體 pGAPZaA/Tccl-TP5，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆，用DNA電泳和序列分析鑒 定重組質(zhì)粒。(2) 含表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5工程菌的構(gòu)建① 轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pGAPZocA-Tal-TP5經(jīng)Bin酶切后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受 態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建含表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5的工程菌。② 篩選用含濃度為1000吸mL"抗生素Zeodn對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選；采用PCR 方法鑒定陽(yáng)性克隆的融合基因Tal-TP5，用電泳鑒定目的Tal-TP5融合肽，融合肽的氨 基酸序列如SEQ ID NO.l所示。(3) Tal-TP5融合肽的表達(dá)和分離與鑒定① 發(fā)酵將構(gòu)建的畢赤酵母GS115-pGAPZaA-Tal-TP5工程菌在30。C條件下，于 PYD培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)4 5天。② 融合肽的分離除去酵母細(xì)胞的培養(yǎng)液用鎳離子親和色譜分離Tal-TP5融合肽， 并用電泳鑒定；Tal-TP5融合肽進(jìn)一步經(jīng)凝血酶酶切后用Sephadex G-50分離得到純化的 Tal-TP5融合肽。其中所述鎳離子親和色譜采用鎳離子親和色譜體系，包括結(jié)合緩沖液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl， 20mmol/L咪唑，pH7.4; 洗脫緩沖液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl， 0.5mol/L咪唑，pH7.4; Tal-TP5融合肽的脫鹽體系Tris緩沖液，0.02 mol/LTris堿，0.001 moI/LEDTA， pH7.4;所述凝血酶酶切采用凝血酶酶切體系50mmol/LNH4HCO3溶液，pH8.4， 28。C4h; 所述Sephadex G-50洗脫液為50mmol/L (NH4)2S04， pH8.0。序列表<110>山東大學(xué)<120>—種胸腺肽(1 1-胸腺五肽融合肽及其制備方法<141〉2008-1-22<160>1<210>1<211>39<212>PRT<213>人工序列<221>胸腺肽0 1-胸腺五肽融合肽 <222> (1)…(39) <400> 1Glu Phe Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu lie Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu 1 5 10 15 20Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Gin Arg Lys Asp Val Tyr Leu Val Pro Arg 25 30 3權(quán)利要求
1.一種胸腺肽α1-胸腺五肽融合肽，其特征是所述融合肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其相對(duì)分子質(zhì)量為4470道爾頓。
2. 如權(quán)利要求1所述的胸腺肽cxl-胸腺五肽融合肽，其特征是所述融合肽是包含SEQ IDNO.l所示氨基酸序列的、分子量小于10000道爾頓的肽或蛋白質(zhì)。
3. 權(quán)利要求1所述的胸腺肽al-胸腺五肽融合肽的制備方法，由以下步驟組成(1) 表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5的構(gòu)建融合基因Tal-TP5通過(guò)PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，其中，設(shè)計(jì)的前導(dǎo)引物含五coR I位點(diǎn)， 后序引物含AW I和凝血酶位點(diǎn)；將質(zhì)粒pGAPZctA及純化后的融合基因Tal-TP5均用 ￡C0R I和iVo〗I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的載體和融合基因Tal-TP5片斷， 用T4 DNA連接酶4'C連接16 h構(gòu)建成表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸 桿菌，挑取陽(yáng)性克隆，用DNA電泳和序列分析鑒定重組質(zhì)粒；(2) 含表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5工程菌的構(gòu)建 表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5經(jīng)Bln酶切后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建含表達(dá)載體pGAPZaA/Tal-TP5的工程菌；陽(yáng)性克隆用含濃度為100(Hig.mU1抗生素 Zeocin的PYD篩選；采用PCR技術(shù)鑒定陽(yáng)性克隆的Tal-TP5融合基因，用電泳和質(zhì)譜 法鑒定目的Tal-TP5融合肽；(3) Tal-TP5融合肽的表達(dá)和分離與鑒定將構(gòu)建的畢赤酵母GS115-pGAPZaA/Tal-TP5工程菌在30 32。C條件下，于PYD 培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)4 5天；離心去除酵母細(xì)胞，培養(yǎng)液用鎳離子親和色譜分離Tal-TP5 融合肽，并用電泳鑒定；分離的Tal-TP5融合肽進(jìn)一步經(jīng)凝血酶酶切后用Sephadex G-50 分離得到純化的Tal-TP5融合肽；其中所述鎳離子親和色譜釆用鎳離子親和色譜體系，包括結(jié)合緩沖液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl， 20mmol/L咪唑，pH7.4; 洗脫緩沖液20mmol/LNa2HPO4， 0.5 mol/LNaCl, 0.5mol/L咪哇，pH7.4; Tal-TP5融合肽的脫鹽體系Tris緩沖液，0.02 mol/LTris堿，0.001 mol/LEDTA， pH7.4;所述凝血酶酶切采用凝血酶酶切體系50 mmol/LNH4HC03溶液，pH8.4， 28。C 4 h; 所述Sepliadex G-50洗脫液為50mmol/L (NH4)2S04 ， pH8.0 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種胸腺肽α1-胸腺五肽融合肽，其特征是所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其相對(duì)分子質(zhì)量為4470道爾頓。本發(fā)明將胸腺肽α1(Tα1)基因與胸腺五肽(TP5)基因融合在一起，插入到畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαA中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA/Tα1-TP5；利用PYD培養(yǎng)基產(chǎn)生融合蛋白，然后經(jīng)凝血酶酶切后得Tα1-TP5融合肽。本發(fā)明的胸腺肽α1-胸腺五肽融合肽體外血漿半衰期遠(yuǎn)長(zhǎng)于胸腺五肽和胸腺肽α1，并能明顯促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖，與胸腺五肽相比，本發(fā)明的融合肽不僅保留了胸腺五肽的免疫調(diào)節(jié)活性，而且具有半衰期長(zhǎng)、活性好等特性，在臨床上將具有好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101225113SQ20081001412
公開(kāi)日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2008年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月30日
發(fā)明者建 張, 張須龍, 曹吉超, 王鳳山, 高得民 申請(qǐng)人:山東大學(xué)