專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速分離純化r-藻紅蛋白、r-藻藍(lán)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白快速分離純化的方法，屬于紅藻分離純化技 術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景藻膽蛋白是一類(lèi)存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中的水溶性的捕光色素蛋白復(fù)合物， 在光合作用中起高效捕獲和傳遞光能的作用，可分為別藻藍(lán)蛋白(APC)、藻藍(lán)蛋白(PC)、藻 紅藍(lán)蛋白(PEC)和藻紅蛋白(PE)四大類(lèi)?；钚詷?gòu)象下的藻膽蛋白具有摩爾消光系數(shù)大、斯托 克位移大及熒光信號(hào)強(qiáng)之優(yōu)點(diǎn)。自十九世紀(jì)八十年代藻膽蛋白被用作熒光染料用于診斷，作 為熒光染料廣泛用于雙色、三色和多色熒光免疫分析。同常規(guī)的熒光標(biāo)記物相比，藻膽蛋白 具有安全、無(wú)毒，摩爾消光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高(超過(guò)90%)，背景干擾和假陽(yáng)性率低， 在pH4-11的范圍內(nèi)穩(wěn)定的特點(diǎn)。還作為食品或化妝品的色素、示蹤劑、抗氧化劑、光敏治 療劑及光合作用機(jī)理和進(jìn)化研究、免疫增強(qiáng)劑等，并且這類(lèi)試劑的應(yīng)用范圍還在不斷擴(kuò)大。目前，藻膽蛋白主要從藻類(lèi)中提取。由于藻類(lèi)細(xì)胞壁中含有多量的多糖成分和雜質(zhì)，給 分離純化帶來(lái)很大困難。多數(shù)純化方法存在純度低、得率低、操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。限 制了藻膽蛋白的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，同時(shí)也造成價(jià)格昂貴。藻膽蛋白及其診斷試劑主要由Molecular Probes公司、Sig腿公司等生產(chǎn)、銷(xiāo)售。我國(guó)依賴(lài)進(jìn)口。由于提取困難和價(jià)格昂貴，多用于 細(xì)胞流式儀，尚未應(yīng)用到普及型的臨床診斷。多管藻、三叉仙菜等是生長(zhǎng)在我國(guó)沿海地區(qū)潮間帶的特有海洋紅藻，含有大量的R-藻 紅蛋白和R-藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白。試驗(yàn)證明多管藻是提取R-藻紅蛋白和R-藻藍(lán)蛋白的比 較理想的試材。R-藻紅蛋白是藻膽蛋白中應(yīng)用最廣泛的熒光染料之一；R—藻藍(lán)蛋白是唯一 同時(shí)含有PEB和PCB的藻膽蛋白。開(kāi)發(fā)R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白的快速大量分離純化技術(shù)， 實(shí)現(xiàn)高純度R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白的低成本大量制備，對(duì)于R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白的 研究和應(yīng)用具有重要的意義。 發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不能夠同時(shí)、大量、高效提取R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的缺陷，本發(fā) 明的提供一種R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的快速大量分離純化方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下.---種快速分離純化R-藻紅蛋白、R —藻藍(lán)蛋白的方法，步驟如下(1) 制備R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白粗提液原料為紅藻，采用凍溶和低離子強(qiáng)度溶漲的方法，使紅藻細(xì)胞解體，得R-藻紅蛋白、R 一藻藍(lán)蛋白粗提液，使R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白以有活性狀態(tài)釋放出來(lái)。(2) R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白的初步純化應(yīng)用硫酸銨沉淀法，將R-藻紅蛋白、R藻藍(lán)蛋白的粗提液中的R-藻紅蛋白、R藻藍(lán)蛋白 從溶液中沉淀出來(lái)，離心收集沉淀，再用緩沖液溶解并透析，除去硫酸銨；(3) 離子交換層析大量制備R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白將步驟(2)得到的透析液利用離子交換層析技術(shù)，用具有恒定的離子強(qiáng)度、pH梯度的緩沖液分步進(jìn)行洗脫，先使用高pH值的緩沖液洗脫，得到R—藻藍(lán)蛋白；再用低pH值的緩沖液洗脫，得到R-藻紅蛋白。步驟(2)粗提液中的蛋白成分主要是R—藻紅蛋白和R—藻藍(lán)蛋白兩種，根據(jù)藻膽蛋白 在較寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的特性和二者等電點(diǎn)不同，利用離子交換層析技術(shù)，用具有恒 定的離子強(qiáng)度、pH梯度的緩沖液分步進(jìn)行洗脫，先使用高pH值的緩沖液洗脫后，再用低 pH值的緩沖液洗脫，將溶液中的R-藻紅蛋白和R—藻藍(lán)蛋白完全分開(kāi)，實(shí)現(xiàn)R-藻紅蛋白、 R—藻藍(lán)蛋白粗品的大量制備。上述步驟(1)原料紅藻，優(yōu)選多管藻。優(yōu)選的，上述步驟(1)具體操作步驟為將冷凍的多管藻按重量體積比1: 1 (g/ml 或kg/1)加入20mM醋酸緩沖液(pH5.8)， 25'C下融化20 min，多層紗布過(guò)濾得到藻膽蛋 白粗提液，4'C10000rpm離心15min，上清液即為R-藻紅蛋白、R —藻藍(lán)蛋白的粗提液。優(yōu)選的，上述步驟(2)具體操作步驟為向步驟(1)得到的R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋 白的粗提液中加入固體硫酸銨，至濃度為50-60。/。(w/v)，放置4 5h，然后4'C 10000-12000 rpm 離心15-20min，棄去上清，沉淀重溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5.8)中，所述沉淀與醋酸 緩沖液的比例沒(méi)有嚴(yán)格限定，只要沉淀能夠完全溶解即可。將所得溶液用20mM醋酸緩沖液 (pH5.8，含50mMNaCl)透析，收集透析液。優(yōu)選的，上述步驟(3)具體操作如下將步驟(2)得到的透析液通過(guò)陰離子交換色譜 柱進(jìn)行離子交換層析，該陰離子交換色譜柱是經(jīng)20mM醋酸緩沖液(pH5.8，含50mMNaCI) 預(yù)平衡的，加入R—藻紅蛋白、R —藻藍(lán)蛋白透析液進(jìn)行吸附，用含50mMNaCl的20mM醋 酸緩沖液(pH5.8，)洗脫過(guò)量樣品，再利用不連續(xù)pH剃度洗脫，分別得到R—藻藍(lán)蛋白和 R-藻紅蛋白。所述不連續(xù)pH剃度洗脫的具體方法是先用20mM醋酸緩沖液(pH4.8，含50mM NaCl) 洗脫，洗脫速度為60mL/h，檢測(cè)波長(zhǎng)280mn，收集洗脫的藍(lán)色液體，得到純化的R—藻藍(lán)蛋 白。然后用20mM醋酸緩沖液(pH4.0，含50mM NaCl)洗脫，洗脫速度為60mL/h，檢測(cè) 波長(zhǎng)280nm，收集洗脫的紅色液體，得到純化的R-藻紅蛋白。經(jīng)吸收光譜檢測(cè)，得到的純化R-藻紅蛋白A56o/A，達(dá)到5.3、 R—藻藍(lán)蛋白A6i8/A，達(dá) 到3.2、 Aws/A55o達(dá)1.7。(如圖l、圖2所示)。 一般認(rèn)為，R-藻紅蛋白A隨/A2犯達(dá)到4.0、 R 一藻藍(lán)蛋白A^/A55o達(dá)到1.5以上為純品。聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)，只有一個(gè)條帶，表明 分離純化的R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白沒(méi)有其它蛋白的污染(如圖3所示)。現(xiàn)有技術(shù)制備R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的方法為將細(xì)胞破碎粗提液經(jīng)過(guò)多次羥基磷灰 石柱，再用凝膠過(guò)濾層析，最后得到的R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白量少、耗時(shí)而且純度低。 對(duì)比技術(shù)中得到的R-藻紅蛋白純度達(dá)到5.3。與現(xiàn)有技術(shù)的三步操作相比，本發(fā)明是將粗提 液經(jīng)過(guò)一次離子交換層析，就可以得到大量純的R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白溶液制品，而且 有效的降低了成本?，F(xiàn)有技術(shù)制備R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白時(shí)，使用的羥基磷灰石層析多次純化，而羥基 磷灰石柱有層析速度慢、上樣少而且不能將樣品中的藻紅蛋白完全去除的特點(diǎn)，這一步是在 R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白提取過(guò)程中的非常耗時(shí)的。本發(fā)明針對(duì)這一現(xiàn)有技術(shù)的不足，用 一步離子交換層析大量制備純度較高的R-藻紅蛋白、R —藻藍(lán)蛋白制品發(fā)明的方法不僅制備 量大，而且純度高、耗時(shí)少。先根據(jù)R-藻紅蛋白和R—藻藍(lán)蛋白的等電點(diǎn)不同和離子交換層析具有上樣量大、分辨率高及濃縮效應(yīng)，預(yù)先用20mM醋酸緩沖液(pH5.8) +100 mM氯 化鈉平衡過(guò)的陰離子柱，樣品用同樣緩沖液透析的藻膽蛋白粗提液，然后用20mM醋酸緩沖 液(pH4.8)洗脫，得到大量比較純的R—藻藍(lán)蛋白。用20mM醋酸緩沖液(pH4.0)洗脫， 得到大量比較純的R-藻紅蛋白。本發(fā)明的優(yōu)良效果還在于，以多管藻為材料，經(jīng)凍溶和低離子強(qiáng)度溶漲快速提取R-藻 紅蛋白、R —藻藍(lán)蛋白，經(jīng)硫酸銨沉淀以后，使用陰離子交換層析法進(jìn)行一步純化，得到體 積大大縮小的相對(duì)較純的R—藻藍(lán)蛋白和高純度的R-藻紅蛋白。與傳統(tǒng)的應(yīng)用羥基磷灰石層析結(jié)合分子篩層析的復(fù)雜分離純化程序相比，本方法克服了 難于規(guī)?；焖僦苽涞碾y題，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，容易大量制 備并且大大降低了 R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的制備成本，從而為將R-藻紅蛋白、R —藻藍(lán) 蛋白應(yīng)用于超靈敏的生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)和光合作用機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)，具有很好的理論研究?jī)r(jià) 值和應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1本發(fā)明分離純化的R—藻藍(lán)蛋白的吸收光譜(實(shí)現(xiàn))和熒光發(fā)射光譜(虛線(xiàn))。在 540nm、 618nm處有兩個(gè)吸收峰。A訓(xùn)/A幼。達(dá)到了 3. 2， A磁/A咖達(dá)到1. 7。用498nm激發(fā)，熒光 發(fā)射峰位于575 nm，與標(biāo)準(zhǔn)熒光發(fā)射峰相同。圖2本發(fā)明分離純化的R-藻紅蛋白的吸收光譜(實(shí)現(xiàn))和熒光發(fā)射光譜(虛線(xiàn))。在 498nm、 540nm、 565nm處有三個(gè)吸收峰。&65/&8。達(dá)到了 5. 3。用580nm激發(fā)，熒光發(fā)射峰位 于632 nm，與標(biāo)準(zhǔn)熒光發(fā)射峰相同。圖3本發(fā)明分離純化的R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白溶液的活性電泳圖譜。圖中RPE、 RPC 分別對(duì)應(yīng)R藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白。只有一個(gè)條帶，進(jìn)一步說(shuō)明分離純化的R藻紅蛋白、R 一藻藍(lán)蛋白沒(méi)有其它蛋白的污染。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不限于此。實(shí)施例中使用的陰離子交換色譜柱為瓊脂糖凝膠FF (DEAE Sepharose Fast Flow),規(guī)格 為4X20cm。 實(shí)施例1.R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的快速高效分離純化方法，步驟如下(1) R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的提取 原料為天然多管藻,-20 °C冷凍保存。取冷凍保存的多管藻藻體10g，加入20mM醋酸緩沖液(pH5.8) 10ml，反復(fù)凍溶，懸 液4'C10000rpm離心15min，上清液即為R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的粗提液。(2) R—藻紅蛋白、R —藻藍(lán)蛋白的初步純化向上述步驟(2)得到的R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入固體硫酸銨，至濃 度為60%(w/v)，放置4h, 4°C 10000 rpm離心15 min，收集沉淀部分。將沉淀溶于20mM的 醋酸緩沖液(pH5.6)中，然后用20mM的醋酸緩沖液(pH5.6)進(jìn)行透析。收集透析液。(3) 離子交換層析大量制備R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白將預(yù)先用20mM醋酸緩沖液(pH5.6)(含50mMNaCl)平衡過(guò)的陰離子交換柱，加入 緩沖液為20mM醋酸緩沖液(pH5.6)的R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白粗提液進(jìn)行吸附。將吸附滿(mǎn)R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的陰離子交換柱，使用20mM醋酸緩沖液(pH5.6)沖洗陰 離子交換柱，將陰離子交換柱上過(guò)量的R—藻紅蛋白、R —藻藍(lán)蛋白沖洗掉。先用20mM醋 酸緩沖液(pH5.0)(含50mMNaCl)進(jìn)行洗脫，將R—藻藍(lán)蛋白洗脫下來(lái)，就可以得到大量 比較純的R —藻藍(lán)蛋白。再用20mM醋酸緩沖液(pH4.0)(含50mMNaCl)進(jìn)行洗脫，將R 一藻紅蛋白洗脫下來(lái)，就得到大量高度純化的R—藻紅蛋白。所得R —藻藍(lán)蛋白的吸收光譜(實(shí)現(xiàn))和熒光發(fā)射光譜(虛線(xiàn))如圖1。在540,、 618nm 處有兩個(gè)吸收峰。A,/A洲,達(dá)到了 3.2， A訓(xùn)/A刷達(dá)到1.7，表明已經(jīng)高度純化。用498腦激發(fā)， 熒光發(fā)射峰位于575 nm，與標(biāo)準(zhǔn)熒光發(fā)射峰相同。所得R—藻紅蛋白的吸收光譜(實(shí)現(xiàn))和熒光發(fā)射光譜(虛線(xiàn))如圖2。在498腦、540nm、 565nm處有三個(gè)吸收峰。夂65"28。達(dá)到了 5. 3，表明已經(jīng)高度純化。用580nm激發(fā)，熒光發(fā)射 峰位于632 nm，與標(biāo)準(zhǔn)熒光發(fā)射峰相同，與標(biāo)準(zhǔn)熒光發(fā)射峰相同。的R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白溶液的活性電泳圖譜如圖3。圖中RPE、 RPC只有一個(gè)條 帶，進(jìn)一步說(shuō)明分離純化的R藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白沒(méi)有其它蛋白的污染。實(shí)施例2.如實(shí)施例1所述的R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的快速分離純化方法，不同之處在于 步驟(2)中直接加入固體硫酸銨至濃度為50% (w/v)，放置4h， 4。C10000rpm離心20min， 收集沉淀部分。
權(quán)利要求
1.一種快速分離純化R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白的方法，步驟如下(1)原料為紅藻，采用凍溶和低離子強(qiáng)度溶漲的方法，使紅藻細(xì)胞解體，得R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白粗提液，(2)應(yīng)用硫酸銨沉淀法，將上述R-藻紅蛋白、R藻藍(lán)蛋白的粗提液中的R-藻紅蛋白、R藻藍(lán)蛋白從溶液中沉淀出來(lái)，離心收集沉淀，再用緩沖液溶解并透析，除去硫酸銨；(3)將步驟(2)得到的透析液利用離子交換層析技術(shù)，用具有恒定的離子強(qiáng)度、pH梯度的緩沖液分步進(jìn)行洗脫，先使用高pH值的緩沖液洗脫，得到R-藻藍(lán)蛋白；再用低pH值的緩沖液洗脫，得到R-藻紅蛋白。
2. 如權(quán)利要求l所述的快速分離純化R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于， 步驟(1)的原料為多管藻。
3. 如權(quán)利要求2所述的快速分離純化R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于， 具體操作步驟為將冷凍的多管藻加入pH5.8、 20mM醋酸緩沖液，25'C下融化20 min，多 層紗布過(guò)濾得到藻膽蛋白粗提液，4'C10000rpm離心15min，上清液即為R-藻紅蛋白、R— 藻藍(lán)蛋白的粗提液。
4. 如權(quán)利要求l所述的快速分離純化R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于， 步驟(2)具體操作步驟為向步驟(1)得到的R-藻紅蛋白、R —藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入 固體硫酸銨，至濃度為50-60%(w/v)，放置4 5h，然后4°C 10000-12000 rpm離心15-20min， 棄去上清，沉淀重溶于pH5.8、 20mM的醋酸緩沖液中，將所得溶液用pH5.8、含50mMNaCl 的20mM醋酸緩沖液透析，收集透析液。
5. 如權(quán)利要求1所述的快速分離純化R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于， 步驟(3)具體操作如下將步驟(2)得到的透析液通過(guò)陰離子交換色譜柱進(jìn)行離子交換層 析，該陰離子交換色譜柱是經(jīng)pH5.8、含50mMNaCl的20mM醋酸緩沖液預(yù)平衡的，加入 R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白透析液進(jìn)行吸附，用pH5.8、含50mMNaCl的20mM醋酸緩沖 液洗脫過(guò)量樣品，再利用不連續(xù)pH剃度洗脫，分別得到R—藻藍(lán)蛋白和R-藻紅蛋白。
6. 如權(quán)利要求5所述的快速分離純化R-藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于， 所述不連續(xù)pH剃度洗脫的具體方法是先用pH4.8、含50mMNaCl的20mM醋酸緩沖液洗 脫，洗脫速度為60mL/h，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，收集洗脫的藍(lán)色液體，得到純化的R—藻藍(lán)蛋白; 然后用pH4.0、含50mM NaCl的20mM醋酸緩沖液洗脫，洗脫速度為60mL/h，檢測(cè)波長(zhǎng) 280nra，收集洗脫的紅色液體，得到純化的R-藻紅蛋白。
全文摘要
一種快速分離純化R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白的方法，屬于紅藻分離純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以紅藻為材料，應(yīng)用經(jīng)凍溶和低離子強(qiáng)度溶漲提取R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白，經(jīng)硫酸銨沉淀進(jìn)行初步純化，然后使用陰離子交換層析吸附富集R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白，并通過(guò)一步陰離子交換層析分步洗脫大量制備得到高純度的R-藻紅蛋白、R-藻藍(lán)蛋白。本方法省去了傳統(tǒng)的應(yīng)用分子篩層析結(jié)合羥基磷灰石層析多步層析的復(fù)雜分離純化程序，克服了難于規(guī)模化快速制備的難題，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，得率高。
文檔編號(hào)C07K1/30GK101240009SQ20081001440
公開(kāi)日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者周百成, 張熙穎, 張玉忠, 陳秀蘭, 顏世敢 申請(qǐng)人:山東大學(xué)