專利名稱：可脫保護的硫代核苷酸單體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到化學基團修飾的硫代核苷或核苷酸分子，修飾硫代核苷或核苷酸 分子的化學基團在一定條件下能夠轉(zhuǎn)變成羥基，并能被用于多聚核苷酸序列的分 析，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。技術(shù)背景在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一歩研究和改造目的基因的基礎。 目前用于最為廣泛應用的測序技術(shù)是Sanger等(1977)發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止 法，Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上 的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反 應構(gòu)成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一種不 同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-0H基團，使延 長的寡聚核苷酸選擇性地在G、 A、 T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧 而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應得到一組長幾百至幾 千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可 通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射 自顯影或非同位素標記進行檢測。目前，人類基因組序列30億堿基的測序工作已 經(jīng)完成，已識別出一批重要的人類疾病相關(guān)的基因。此外，很多的模式生物以及 細菌、古細菌、支原體和酵母等全基因組的測序己經(jīng)完成。Sanger法的優(yōu)勢在于 可以分析未知的DNA序列，而且單向反應的讀序能力較長，目前的技術(shù)可以達到 1000bp以上，然后，在實際工作中，很多情況需要對已知序列的DNA片段進行序 列驗證或是對為數(shù)不多的位點進行分析驗證，在這種情況下，較短序列的高通量 測序方法更為適用。測序技術(shù)可以在多個領(lǐng)域進行應用，在分子診斷學方面，可以用于病原微生物的快速鑒定，遺傳病分子診斷(如SNPs， SNP等位頻率)，在法醫(yī)鑒定方面，如對 線粒體D-Loop區(qū)的HVI和HVII高可變區(qū)進行分析，在藥物基因組學方面，如瑞 典EuronaMedical AB與Pyrosequencing公司合作對血管緊張轉(zhuǎn)換酶(ACE)的SNP 進行分析以及在農(nóng)業(yè)生物方面都有諸多應用。測序技術(shù)的發(fā)展與出現(xiàn)，是建立在測序試劑發(fā)展的基礎上的，從最初的放射性 同位素標記的雙脫氧核糖核苷酸，進而發(fā)展到單色熒光標記的雙脫氧核糖核苷酸， 以及四色熒光標記的雙脫氧核糖核苷酸，到現(xiàn)在的可脫保護的四色熒光標記的雙 脫氧核糖核苷酸。測序試劑的發(fā)展推動著新的測序技術(shù)的出現(xiàn)，為新測序技術(shù)提 供了高速度、低成本和高通量的技術(shù)途徑.發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種可脫保護的硫代核苷酸單體，為新的測 序技術(shù)所能利用的測序試劑，為新測序技術(shù)的低成本、高速度和高通量奠定基礎。技術(shù)方案本發(fā)明以預制的硫代核苷或核苷酸單體為基本原料，利用優(yōu)化的化學合成途徑用取代基對核糖或脫氧核糖基團2'和3'位置上的原子進行取代，所得修飾的核苷或核苷酸可被應用于新測序技術(shù)以及相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，所述修飾的核 苷酸具有以下基本結(jié)構(gòu)-<formula>formula see original document page 5</formula>其中上述硫代核苷或硫代核苷酸分子由堿基基團Y、核糖或脫氧核糖基團和 硫代三磷酸根基團構(gòu)成;核糖或脫氧核糖基團2'和3'位置上連接著Rl和R2基團， Rl或R2基團可以被分解,形成羥基。其中堿基基團是嘌呤(purine)或者嘧啶(pyrimidine)，三磷酸根基團是硫 代三磷酸根基團。所述的R1和R2可以是相同的基團，也可以是不同的基團，Rl 和R2可以是但不限于是以下的基團H， 0H，羰基，<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>Rfi所述的R4， R5和R6分別是R4可以是氫原子或烴基；R5可以是氫原子或烴 基；R6可以是烴基，環(huán)烴基，鏈烯基，環(huán)烯基或芐基。制備的是核苷或核苷酸分子，該分子由堿基基團和核糖或脫氧核糖基團構(gòu)成， 核糖或脫氧核糖基團2'和3'位置上連接著R1和R2基團，在一定條件下，Rl或 R2基團可以被分解，形成羥基(一OH)。所述的堿基基團是嘌呤(purine)或者嘧 啶(pyrimidine)。所述的嘌呤是氮雜嘌呤(deazapurine)。所述的X是氫原子， 磷酸根基團，二磷酸根基團或三磷酸根基團。所述的三磷酸根基團是硫代三磷酸 根基團。所述的R1和R2可以是相同的基團，也可以是不同的基團。所述的R4， R5和R6分別是R4可以是氫原子或烴基；R5可以是氫原子或烴基；R6可以是烴 基，環(huán)烴基，鏈烯基，環(huán)烯基或芐基。以下三類取代基修飾的脫氧核糖核苷酸是本發(fā)明的優(yōu)選化合物<formula>formula see original document page 7</formula><formula>formula see original document page 8</formula>有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點本發(fā)明的最大優(yōu)點是降低測序成本?，F(xiàn)有的測序核苷酸試劑，特別是相同或 相似測序方法的技術(shù)中所用的測序試劑通常都是需要兩種化學修飾，因此合成產(chǎn) 率很低，導致這一類試劑價格很高，本發(fā)明對核苷酸進行一種修飾，產(chǎn)率相對較 高，因此，合成成本較低。本發(fā)明是應用廣泛，適合多種測序方法，而這些測序方法可以在醫(yī)藥、醫(yī)療、 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及生命科學研究等多個方面應用。
具體實施方式
實例1:優(yōu)選化合物HCW-2的化學合成lmmol硫代三磷酸脫氧核糖核苷酸，27mmol NaOH和0. 4mol溴丙烯在12mL 苯種混合，回流5小時后，停止反應，濾去固體物質(zhì)，將濾液濃縮得到物質(zhì)溶于 50mL 3XCCl3C00H/氯仿溶液中，攪拌一分鐘后，用飽和NaHCO:,溶液中和，分出有 機相，水相以氯仿萃取多次后合并，無水Na2S04干燥，蒸干溶液后得黃色泡裝物 2.45克，得率為85%。實例2:優(yōu)選化合物HCW-3的化學合成將4.8克硫代三磷酸脫氧核糖核苷酸溶于無水丙腈，共蒸發(fā)后，再溶于85mL 無水二氯甲垸中。再將8.92克JH丁基氰基乙基-N,N-二異丙基磷酰胺 (n-butylcyanoethyl-N, N-diisopropylphosphoramidite)力口入至U上述溶液中。經(jīng)過劇烈振蕩混勻后，加入1.92克四氮唑(Tetrazole)，攪拌10小時。反應 混合物在鹽冰浴中(-10。C)冷卻后，緩慢加入10mL叔丁基氫過氧化物 (t-butylhydroperoxide)的癸烷溶液(4 5Mol)。反應2 3小時后，將反應混 合物轉(zhuǎn)入分液漏斗，并用50mL含5%二硫化鈉的二氯甲烷洗滌兩次，再用50mL 飽和氯化鈉洗滌一次。待乳濁液分層后，分離并保留有機相，用旋轉(zhuǎn)真空干燥儀 揮發(fā)二氯甲烷。用3X25mL乙醚洗潘癸垸，洗滌之后小心去掉上層乙醚，將油相 溶于12.5mL二氯甲烷中，并加入125mL乙醚，靜置15分鐘，倒掉溶劑，并在真 空中干燥油相，將干燥后的油相溶于甲醇中(每克油加入lOmL甲醇)，并加入2 當量的NaOH，室溫下攪拌1 2小時，反應混合物經(jīng)過真空濃縮后，共蒸發(fā)去除殘 留的水分，產(chǎn)物加入100mL丙腈，反應1 2小時后，進行真空干燥處理，得到產(chǎn) 物HCW-3。實例3:基于3'端可脫保護硫代堿基修飾保護往復延伸的熒光測序法測定人基 因組p16外顯子1序列設計一對針對人基因組p16外顯子1的PCR引物，其中一條引物5'端修飾著 氨基。用PCR引物擴增人樣本(血液、組織等)中的pl6外顯子l序列片段，PCR 產(chǎn)物純化后，通過點樣的辦法在醛基修飾的基片上形成陣列，氨基與醛基縮合后， 洗去未結(jié)合的PCR產(chǎn)物，采用變性的辦法去除未固定的DNA鏈，得到單一的模板 鏈，將修飾保護的引物與固定的DNA模板雜交，并確保模板鏈的3'端突出5 6 個堿基以上。加入四種不同熒光修飾的ddNTP和聚合酶的混合液，在引物的3'端進行一個 堿基的延伸，通過掃描， 一次性確定模板序列第一個堿基的信息，然后用核酸外 切酶III切除掉延伸的四種不同熒光堿基ddNTP，加入四種3'端可脫保護硫代堿 基(HCW—2)，在聚合酶的作用下，填充ddNTP原先的位置，并且只延伸一個堿基， 加入脫保護液(0.05mol/L碘化鉀)，3'端可脫保護硫代堿基進行脫保護同時3' 端進行活化，得到羥基，清洗干凈后，再加入四種不同熒光修飾的ddNTP和聚合 酶的混合液，進行下一步的延伸過程，如此循環(huán)，直到PCR序列確定。
權(quán)利要求
1.一種可脫保護的硫代核苷酸單體，其特征在于該硫代核苷或硫代核苷酸單體分子結(jié)構(gòu)為其中上述硫代核苷或硫代核苷酸分子由堿基基團Y、核糖或脫氧核糖基團和硫代三磷酸根基團構(gòu)成；核糖或脫氧核糖基團2′和3′位置上連接著R1和R2基團，R1或R2基團可以被分解，形成羥基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可脫保護的硫代核苷酸單體，其特征在于所述的Rl 基團選自下列化學基團之一<formula>formula see original document page 2</formula>
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可脫保護的硫代核苷酸單體，其特征在于所述的的 R2是與R1相同的基團，或是與R1不同的基團并選自H、 0H、羰基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的可脫保護的硫代核苷酸單體，其特征在于所述 的R4是氫原子或烴基；R5是氫原子或烴基；R6是烴基、環(huán)烴基、鏈烯基、環(huán)烯 基或芐基中的一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可脫保護的硫代核苷酸單體，其特征在于所述的核 苷或核苷酸分子存在的對映異構(gòu)體。
全文摘要
可脫保護的硫代核苷酸單體涉及到化學基團修飾的硫代核苷或核苷酸分子，修飾硫代核苷或核苷酸分子的化學基團在一定條件下能夠轉(zhuǎn)變成羥基，并能被用于多聚核苷酸序列的分析，該硫代核苷或硫代核苷酸單體分子結(jié)構(gòu)如上，其中上述硫代核苷或硫代核苷酸分子由堿基基團Y、核糖或脫氧核糖基團和硫代三磷酸根基團構(gòu)成；核糖或脫氧核糖基團2′和3′位置上連接著R1和R2基團，R1或R2基團可以被分解，形成羥基。
文檔編號C07H19/00GK101235064SQ200810020799
公開日2008年8月6日 申請日期2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者孫蓓麗, 羅俊峰, 肖鵬峰, 超 賈, 陸祖宏 申請人:東南大學