專利名稱：茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法及其糖苷酶活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶多酚中兒茶素成分的分離純化方法及所得到的單體的用途。
尤其涉及茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、表沒 食子兒茶素(EGC)三種重要兒茶素成分的分離純化方法及對三種重要兒茶素 成分a-葡萄糖苷酶和ci-淀粉酶的抑制活性，可用于制備減少碳水化合物吸 收的減肥產(chǎn)品或降低餐后血糖的藥物或保健品。
背景技術(shù)：
表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC) 是茶葉中含量最高的兒茶素類成分，也是重要的活性成分，具有抗腫瘤、降血 脂、抗氧化、抗衰老、抗艾滋病毒、抗癌轉(zhuǎn)移、抗纖維化、抑菌、抗霉菌、抑 制血管生成等多種活性。
近年來各國積極推進應用開發(fā)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒 茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)，用于天然抗氧化劑、自由基清除劑，廣 泛用于食品加工、醫(yī)藥保健和日用化工等，故研究其分離方法和簡便高效的生 產(chǎn)工藝具有重要現(xiàn)實意義。目前公開的方法主要是用S印hadex LH-20方法， 如CN1199965C、 CN1193994C、 CN1212319C、 CN1283636C;還有用HPLC方法制 備，如CN1164583C;大孔樹脂法如CN1733753A;極性樹脂XAD-7方法如 EP1767097A2。
上述S印hadex LH-20方法、HPLC方法成本高，周期長。如采用單一大孔 樹脂方法或聚酰胺方法經(jīng)初步研究難以制得高純度單體，因此要大量制備純度 高的EGCG需要尋找分離操作簡單，分離效率高，成本低的分離純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題第一方面是通過對目前報道的表沒食子兒茶 素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)分離工藝的改進，提供了一種分離純化方法簡單，分離效率高，成本低，產(chǎn)品得率高的茶 多酚中主要兒茶素成分分離純化方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題第二方面是提供上述分離純化后得到的表沒
食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)單 體的糖苷酶活性。
作為本發(fā)明第一方面的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，包括以下
步驟
(1) 將茶多酚提取物加入倍量水使之溶解，上非極性或弱極性聚苯乙烯
型大孔吸附樹脂柱后，依次用水和重量百分比濃度為10% 40%乙醇溶液進行洗 脫，根據(jù)硅膠薄層層析檢測結(jié)果，收集表沒食子兒茶素沒食子酸酯流份；
(2) 將表沒食子兒茶素沒食子酸酯流份減壓回收乙醇至干得樣品固體B， 樣品固體B用水溶解上層析用聚酰胺柱，然后依次用水和重量百分比濃度為 10% 30%乙醇洗脫，收集聚酰胺柱水洗脫液和乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓蒸 干，再加去離子水溶解重結(jié)晶即得表沒食子兒茶素沒食子酸酯；
(3) 聚酰胺柱水洗脫液減壓蒸干得樣品固體C，樣品固體C用重量百分 比濃度為10% 20%乙醇溶解后上層析用反相C18填料柱，用重量百分比濃度為 10% 20%乙醇洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析檢測結(jié)果，先后收集表沒食子兒茶素流 份和表兒茶素流份，將表沒食子兒茶素流份和表兒茶素流份在減壓回收乙醇至 干，用醇液重結(jié)晶即得表沒食子兒茶素、表兒茶素。
所述非極性或弱極性聚苯乙烯型大孔吸附樹脂包括但不限于下述樹脂-D101或HPD100或AB-8。
在上述步驟(1)中，茶多酚提取物的固體重量與所述非極性或弱極性聚 苯乙烯型大孔吸附樹脂重量比為1: 10 50。
在上述步驟(2)中，樣品固體B重量與層析用聚酰胺重量比1: 10 30。 在上述步驟(2)中，乙醇洗脫液在45t:以下減壓蒸干。 在上述步驟(2)中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯加2-5倍重量的去離子 水重結(jié)晶，重結(jié)晶時加熱溶解溫度為45t:-65°C，溶解后在4。C-1(TC條件下放 置，待結(jié)晶析出，過濾后用少量冷水洗滌，然后于45'C以下減壓干燥。
在上述步驟(3)中，乙醇洗脫時，最佳的乙醇重量百分比濃度為10%。 在上述步驟(3)中，樣品固體C的重量與層析用反相C18填料重量比為
51: 15 50。
在上述步驟(3)中，用醇液重結(jié)晶時，采用重量百分比濃度為50%-80% 乙醇重結(jié)晶，重結(jié)晶時加熱溶解溫度為45。C-65°C。
作為本發(fā)明第二方面的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素 (EC)、表沒食子兒茶素(EGC)單體的糖苷酶活性，經(jīng)體外試驗對a-葡萄糖 苷酶和a-淀粉酶均有抑制活性，可用于制備減少碳水化合物吸收的減肥產(chǎn)品 或降低餐后血糖的藥物或保健品。
本發(fā)明的分離操作簡單，分離效率高，成本低。
具體實施例方式
為了更好地理解本發(fā)明，以下將舉實例說明，但這并不意味是對本發(fā)明的 限制。
實施例一
稱取表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量為50%的茶多酚提取物300克，加入 1200mL去離子水使之溶解。取HPD100大孔吸附樹脂4kg用95%乙醇裝入柱中， 用8L95。/。乙醇洗去樹脂中的致孔劑和聚合單體殘余，直至洗脫液經(jīng)濃縮后用氣 相檢測合格為止。然后用去離子水替換柱中乙醇，將上述茶多酚水液以0.4倍 柱體積/小時流速上樣，待樣品進入柱體后，先用2倍柱體積的去離子水以0. 4 倍柱體積/小時流速洗脫，再用4倍柱體積20%乙醇洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析檢 測結(jié)果，收集表沒食子兒茶素沒食子酸酯流份，將表沒食子兒茶素沒食子酸酯 流份在45。C以下減壓濃縮至小體積(1500mL)得樣品B，樣品B以0. 4倍柱體 積/小時流速上2kg層析用聚酰胺(80 100目)柱，待樣品B進入柱體后，用 3倍柱體積去離子水洗脫，然后用4倍柱體積20%乙醇洗脫，收集聚酰胺柱水 洗脫液和20%乙醇洗脫液；20%乙醇洗脫液在45。C以下減壓回收乙醇至干，加 200mL去離子水在5(TC加熱溶解重結(jié)晶，4 1(TC條件下放置，待結(jié)晶析出， 過濾，用少量冷水洗滌，重結(jié)晶2次，結(jié)晶于45'C減壓干燥，得表沒食子兒茶 素沒食子酸酯81克，經(jīng)HPLC測定含量為95. 8%，得率為52%。
取聚酰胺柱水洗脫液5g，用少量的10%乙醇溶解，上75g層析用反相C18 填料(Sigma公司，粒度為40 63pm)柱(柱直徑為3cm)，用10%乙醇洗脫， 根據(jù)硅膠薄層層析檢測結(jié)果，分別收集表沒食子兒茶素流份和表兒茶素流份，45匸以下減壓濃縮至干，分別用50%乙醇重結(jié)晶，結(jié)晶在40 45"C條件下減壓 干燥，得表沒食子兒茶素1. 5g，經(jīng)HPLC測定含量為96. 5%，表兒茶素1.0g， 經(jīng)HPLC測定含量為96. 8%。
實施例二
稱取表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量為50%的茶多酚提取物100克，加入 400mL去離子水使之溶解。取D101大孔吸附樹脂1. Okg用95%乙醇裝入柱中， 用95%乙醇洗去樹脂中的致孔劑和聚合單體殘余，直至洗脫液經(jīng)濃縮后用氣相 檢測合格為止，然后用去離子水替換柱中乙醇，將上述茶多酚水液以0.3倍柱 體積/小時流速上樣，待樣品進入柱體后，先用3倍柱體積的去離子水以0.3 倍柱體積/小時流速洗脫，再用4倍柱體積40%乙醇以0. 3倍柱體積/小時流速 洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析檢測結(jié)果，收集表沒食子兒茶素沒食子酸酯流份，在 45°C以下減壓濃縮至小體積(600mL)得樣品B，樣品B以0. 3倍柱體積/小時 流速上lkg層析用聚酰胺(80 100目)柱，待樣品B進入柱體后，用3倍柱 體積去離子水洗脫，然后用4倍柱體積20%乙醇洗脫，收集聚酰胺柱水洗脫液 和20%乙醇洗脫液；20%乙醇洗脫液在45°C以下減壓濃縮至60mL放入冰箱中， 待結(jié)晶析出，過濾，水洗，結(jié)晶再用水重結(jié)晶2 3次，結(jié)晶于40 45"C減壓 干燥，得表沒食子兒茶素沒食子酸酯28克，經(jīng)HPLC測定含量為95.296，得率 為53%。
取聚酰胺柱的水洗脫液C 5g，用少量的10%乙醇溶解，上100 g層析用 反相C18填料柱(柱直徑為3cm)，用10%乙醇洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析檢測結(jié) 果，分別收集表沒食子兒茶素F和表兒茶素流份G， 45"C以下減壓濃縮至干， 分別用50%乙醇重結(jié)晶，結(jié)晶在40 45-C條件下減壓干燥，得表沒食子兒茶素 1.6g，經(jīng)HPLC測定含量為96.9呢，表兒茶素l.lg，經(jīng)HPLC測定含量為97. 1%。
實施例三
將本發(fā)明制備的表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、表沒食子兒茶素 進行體外a-葡萄糖苷酶和a-淀粉酶抑制試驗。
a-葡萄糖苷酶活力測定
以對石肖基苯酷畫a畫D-P比喃葡萄糖(4-Nitrophenyl a 一D一glucopyranoside，PNPG)為底物。反應系統(tǒng)為67mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8) 2ml, lmg/ml 還原型谷胱甘肽50^1, 0. 57U/ml a -葡萄糖苷酶(sigma公司，Type I: from Bakers Yeast) lOOpl， 37。Cf呆溫lOmin后加入20mmol/L PNPG 200^1，于37°C 反應30min后，加入O. lmol/LNa2C03終止液10ml。以阿卡波糖作為陽性對照。 在400nm處測定吸收值。
A空s一 (A樣品—A背景)
a-葡萄糖苷酶活性抑制率(％) =--------------X100
A空白
式中
Ass:不加樣品反應后的吸收值 A樣品加入樣品反應后的吸收值 A背景只加樣品的吸收值 a -葡萄糖苷酶活力測定的結(jié)果見表1
表l: a -葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果
樣品名濃度(Hg/ml)a -葡萄糖苷酶抑制率(％)
阿卡波糖4033.4
EGCG4088.6
EC494.5
EGC4046.9
a -淀粉酶活力測定
稱2mg淀粉天青(作為反應底物)，懸浮于0.2ml0.05M tris-HCl緩沖液 (pH6.9)，其中含0.01M氯化鈣，煮沸5分鐘，得淀粉液，將該淀粉液于37。C 預培養(yǎng)5分鐘。
把樣品溶于0. 2ml50%DMSO溶劑中，每份上述緩沖液中加0. 1ml豬胰a -淀 粉酶溶液(2. 11單位/ml) 10(^1， 37-C反應10分鐘，然后加0. 5ml5(m冰醋酸 終止反應，反應混合物4。C， 16000轉(zhuǎn)離心5分鐘，上清液于595ran測定吸光 值。以阿卡波糖作為陽性對照。 a-淀粉酶抑制活性的計算
(Ac+- Ac-)-(As—Ab)a-淀粉酶活性抑制率(％) = -------------- X100
Ac+— Ac—
式中
Ac+: 100%酶活性吸收值(僅溶劑中加酶的)
Ac—: 0%酶活性(僅溶劑未加酶) As:試驗樣品(加酶的)
Ab:空白(試驗樣品未加酶的) a -淀粉酶活力測定的結(jié)果見表2
表2: a-淀粉酶活力測定結(jié)果
樣品名濃度(pg/ml)a -淀粉酶抑制率(％)
阿卡波糖4068. 7
EGCG20035.0
EC4045.8
EGC4058.2
9
權(quán)利要求
1.茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將茶多酚提取物加入倍量水使之溶解，上非極性或弱極性聚苯乙烯型大孔吸附樹脂柱后，依次用水和重量百分比濃度為10％～40％乙醇溶液進行洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析檢測結(jié)果，收集表沒食子兒茶素沒食子酸酯流份；(2)將表沒食子兒茶素沒食子酸酯流份減壓回收乙醇至干得樣品固體B，樣品固體B用水溶解上層析用聚酰胺柱，然后依次用水和重量百分比濃度為10％～30％乙醇洗脫，收集聚酰胺柱水洗脫液和乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓蒸干，再加去離子水溶解重結(jié)晶即得表沒食子兒茶素沒食子酸酯；(3)聚酰胺柱水洗脫液減壓蒸干得樣品固體C，樣品固體C用重量百分比濃度為10％～20％乙醇溶解后上層析用反相C18填料柱，用重量百分比濃度為10％～20％乙醇洗脫，根據(jù)硅膠薄層層析檢測結(jié)果，先后收集表沒食子兒茶素流份和表兒茶素流份，將表沒食子兒茶素流份和表兒茶素流份在減壓回收乙醇至干，用醇液重結(jié)晶即得表沒食子兒茶素、表兒茶素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特 征在于，所述非極性或弱極性聚苯乙烯型大孔吸附樹脂包括為D101或HPD100 或AB-8中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特 征在于，在上述步驟(1)中，茶多酚提取物的固體重量與所述非極性或弱極 性聚苯乙烯型大孔吸附樹脂重量比為1: 10 50。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特 征在于，在上述步驟(2)中，樣品固體B重量與層析用聚酰胺重量比1: 10 30。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特 征在于，在上述步驟(2)中，乙醇洗脫液在45。C以下減壓蒸干。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特 征在于，在上述步驟(2)中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯加2-5倍重量的去 離子水重結(jié)晶，重結(jié)晶時加熱溶解溫度為45匸-65°C，溶解后在4'C-l(TC條件 下放置，待結(jié)晶析出，過濾后用少量冷水洗滌，然后于45'C以下減壓干燥。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特征在于，在上述步驟(3)中，乙醇洗脫時，最佳的乙醇重量百分比濃度為10%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特征在于，在上述步驟(3)中，樣品固體C的重量與層析用反相C18填料重量比為1: 15 50。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特征在于，在上述步驟(3)中，用醇液重結(jié)晶時，采用重量百分比濃度為50%_80%乙醇重結(jié)晶，重結(jié)晶時加熱溶解溫度為45'C-65'C。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法，其特征在于，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)具有糖苷酶活性，經(jīng)體外試驗對a -葡萄糖苷酶和a -淀粉酶均有抑制活性，可用于制備減少碳水化合物吸收的減肥產(chǎn)品或降低餐后血糖的藥物或保健品。
全文摘要
本發(fā)明公開了茶多酚中主要兒茶素成分分離純化方法及其糖苷酶活性，其分離純化的方法是將茶多酚提取物經(jīng)非極性或弱極性聚苯乙烯型大孔吸附樹脂吸附，用水和乙醇洗脫，醇洗脫物再經(jīng)層析用聚酰胺柱，分別用水和乙醇洗脫。聚酰胺柱的醇洗脫物經(jīng)水重結(jié)晶得EGCG純品，純度＞95％，得率＞50％；聚酰胺柱的水洗脫物經(jīng)層析用反相C18填料柱層析得EC和EGC，用50％～80％乙醇重結(jié)晶得純品EC、EGC，其純度均在96％以上。經(jīng)體外試驗EGCG、EGC、EC對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有抑制活性，可用于制備減少碳水化合物吸收的減肥產(chǎn)品或降低餐后血糖的藥物或保健品。
文檔編號C07D311/00GK101492440SQ200810033018
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
發(fā)明者葉曉平, 宋純清, 茅仁剛 申請人:上海新康制藥廠