專利名稱：核酸分子si-cypj-3及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤疾病現(xiàn)已上升為世界第2號〃殺手〃，其死亡人數(shù)僅次于心血管病。幾年來， 國外醫(yī)學界對于腫瘤疾病的發(fā)病機理在細胞基礎(chǔ)上又有了新的認識。基于對腫瘤發(fā) 病機制的進一步理解，人們利用各種途徑來研制和開發(fā)能夠特異，有效地殺傷腫瘤細 胞而對正常細胞無毒性的藥物。目前，對于癌癥的治療仍以化療及放療為首選，兩 者雖對腫瘤的治療取得了相當?shù)寞熜?，但由于缺乏對腫瘤細胞的特異性因而具有較大 的毒副作用以及某些腫瘤細胞對化療和放療處理的不敏感，因此在很大程度上限制了 它們在臨床中的應(yīng)用。近年來，為了開發(fā)出能特異性地殺傷癌細胞而對正常細胞無 毒負作用的藥物，人們對癌癥的發(fā)病機制從細胞，分子水平上的研究予以高度重視和 巨額投資。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子。 本發(fā)明的另一個目的是提供上述核苷酸分子的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有抑制腫瘤生長的 活性并且其序列包括5' -UACACCGUAIMJGGAAAGG-3，或者5， - TACACCGTATTTGGAAAGG -3'。在本發(fā)明中被稱為SI-CYPJ-3。
其中，A、 T、 U、 G和C分別是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、 鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語"核苷酸分子SI-CYPJ-3 "該術(shù)語還包括 5' -UACACCGUAUUUGGAAAGG-3，或者5， - TACACCGTATTTGGAAAGG -3，的核苷酸序列 變異形式。這些變異形式包括若干個(通常為1-15個，較佳地1-10個，更佳地l-5 個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(通常為IO個以 內(nèi)，較佳地為5個以內(nèi))核苷酸。例如，在5' -UACACCGUAUUUGGAAAGG-3，后(3 '端) 加入若干dT (脫氧胸苷)后形成的序列。
本發(fā)明中，SI-CYPJ-3可以是具有抑制腫瘤生長的活性并且包括 5' -UACACCGUAUUUGGAAAGG-3' dTdT的序列。
本發(fā)明中，SI-CYPJ-3可以是具有抑制腫瘤生長的活性并且是 5， -UACACCGUAUUUGGAAAGG-3， dTdT的序列。
本發(fā)明中，SI-CYPJ-3可以是具有抑制腫瘤生長的活性并且是5'-TACACCGTATTTGGAAAGG -3' 的序列。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，與SI-CYPJ-3連 接成為重組載體。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林腦炎病毒表達系統(tǒng)(Semliki Forest Virus)。慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，以人類免疫缺陷病毒 (human i咖unod efficiency virus, HIV)為代表.慢病毒不僅具有感染分裂耙 細胞并整合其基因組中，尤其是具有感染包括神經(jīng)元細胞、巨噬細胞、肝細胞、心肌 細胞和干細胞等在內(nèi)的多種非分裂細胞能力，因而，慢病毒載體已作為基因轉(zhuǎn)移的有 效工具，被廣泛應(yīng)用于基因功能尤其是基因治療的研究。
另一方面，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子SI-CYPJ-3的制備方法，即按 SI-CYPJ-3的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。
本發(fā)明的核苷酸分子SI-CYPJ-3可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的 核苷酸分子SI-CYPJ-3序列通?？梢杂妹附夥ɑ蛉斯ず铣傻姆椒ǐ@得。
本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子SI-CYPJ-3在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 實驗表明，本發(fā)明的SI-CYPJ-3可明顯抑制腫瘤細胞增殖。將SI-CYPJ-3或者 含有SI-CYPJ-3的細胞施用于裸鼠，與相同培養(yǎng)條件下未施用SI-CYPJ-3的裸鼠(所用的干擾RNA正向序列為GTACACCGTATTTGGAAAGG)相比，前者瘤體的增長明顯受到 抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時間的推移日益明顯。
本發(fā)明的核苷酸分子SI-CYPJ-3及其類似物，當在治療上進行施用(給藥)時， 可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水 性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制 物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進 行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的核苷酸分子SI-CYPJ-3為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載 體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。 這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。 藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的核苷酸分子SI-CYPJ-3可以被制成針劑形 式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如 片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、
片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微 克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的SI-CYPJ-3還可與其他治療劑一 起使用。
當本發(fā)明的核苷酸分子SI-CYPJ-3被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施 用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情 況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體 重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技 能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明中，所述的抗腫瘤藥物是由含有效治療量的核苷酸分子SI-CYPJ-3和藥 學上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片劑。其 有效治療量可以為每天1微克/千克至10毫克/千克體重。
本發(fā)明中，所述藥物可以是針劑、粉劑或者片劑。
本發(fā)明的核苷酸分子SI-CYPJ-3可以明顯抑制腫瘤細胞增殖；施用于裸鼠時， 與相同培養(yǎng)條件下的對照裸鼠相比，瘤體的增長明顯受到抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時 間的推移日益明顯。本發(fā)明為腫瘤的治療和緩解提供了一種新的途徑和手段。
具體實施例方式
實施例一 SI-CYPJ-3抑制腫瘤細胞增殖
LV-CYPJ-RNAi是攜帶靶向CYPJ小發(fā)夾狀RNA(sh-RNA)的病毒載體，而 LV-non-silencing是攜帶對照片段的病毒載體。慢病毒從上海吉凱基因技術(shù)有限公 司購得。
病毒感染肝癌細胞株SK-H印l: (A)實驗前一天分別接種3 5X103個目的細胞 于96孔培養(yǎng)板中，所加培養(yǎng)基體積為100 14。 (B)實驗時取-7(TC保存的病毒在冰上 融化，按照需要稀釋病毒。(C)從培養(yǎng)箱中拿出細胞棄去原培養(yǎng)液，用50W無血清 培養(yǎng)基清洗細胞，然后加入50W無血清培養(yǎng)基后，加入病毒稀釋液50W。培養(yǎng)液總 體積為100W,混勻后放于37。C培養(yǎng)。48 h后換為含血清的正常培養(yǎng)基。(D)在病 毒感染72h后用倒置熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光(或者RFP紅色熒光)，檢測病毒 對目的細胞的感染情況。結(jié)果顯示，感染率達到70%以上，細胞生長明顯減緩。
實施例二抑制裸鼠腫瘤生長
2.1裸鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)成瘤大量培養(yǎng)檢測SK-H印1細胞， 胰酶消化，離心收獲所培養(yǎng)的細胞，用PBS洗滌后計數(shù)，重懸于PBS，并將細胞用一 次性注射器對裸鼠進行皮下注射，每組注射》5只，(雌性，30-40天)，每只裸鼠的 細胞注射量為200 "1，細胞數(shù)約為2X106, —周后腫瘤長出。
2.2病毒注射當腫瘤體積長至10-30咖3體積時，將20 W含有3 X 107 TU 滴度病毒的PBS用注射器直接注射進入腫瘤內(nèi)。實驗組注射LV-CYPJ-RNAi病毒，對 照組注射LV-non-silencing病毒。兩天后，再用同樣的方法和劑量注射一次病毒。
2.3腫瘤監(jiān)測和瘤塊切取每天檢測小鼠的狀態(tài)，每三天測量一次腫瘤的體積。 實驗組和對照組小鼠各五只進行測量，從感染第29天起，實驗組腫瘤和對照組腫瘤 體積出現(xiàn)顯著差異(代O.OI) 。 32天后，處死小鼠，并從皮下取出瘤塊進行稱量。 實驗組腫瘤的平均體積為0. 43±0. 12cm3，對照組腫瘤的平均體積為0. 70±0. 08 cra3， 差異顯著(代O.Ol)。實驗組腫瘤的平均重量為0.21±0.07 cm3，對照組腫瘤的平 均重量為0.5土0. 15 cm3,差異顯著(代O.Ol)。對瘤體的切片、染色和熒光檢測顯 示，LV-CYPJ-RNAi和LV-non-silencing病毒均成功感染了瘤體。
結(jié)果顯示，與對照組相比，注射病毒(含有SI-CYPJ-3)的裸鼠瘤體生長明顯減慢。 這說明，本發(fā)明的SI-CYPJ-3可以明顯抑制腫瘤生長。
權(quán)利要求
1. 一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長的活性并且其序列包括5’-UACACCGUAUUUGGAAAGG-3’或者5’-TACACCGTATTTGGAAAGG-3’。
2. 如權(quán)利要求l所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長 的活性并且其序列包括5， - UACACCGUAUUUGGAAAGG dTdT -3，。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長 的活性并且其序列是5， - UACACCGUAUUUGGAAAGG dTdT -3，。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長 的活性并且其序列是5' - TACACCGTATTTGGAAAGG -3，。
5. —種如權(quán)利要求1-4中任一種核苷酸分子的制備方法，其特征在于，按權(quán) 利要求1-4中任一種核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團或者脫氧核糖核酸基團 依次脫水縮合。
6. 如權(quán)利要求卜4中任一種核苷酸分子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有抑制腫瘤生長的活性并且其序列包括5’-UACACCGUAUUUGGAAAGG-3’或者5’-TACACCGTATTTGGAAAGG-3’。在本發(fā)明中被稱為SI-CYPJ-3。本發(fā)明的核苷酸分子SI-CYPJ-3可以明顯抑制腫瘤細胞增殖；施用于裸鼠時，與相同培養(yǎng)條件下的對照裸鼠相比，瘤體的增長明顯受到抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時間的推移日益明顯。本發(fā)明為腫瘤的治療和緩解提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號C07H21/02GK101503444SQ20081003357
公開日2009年8月12日 申請日期2008年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月5日
發(fā)明者龍 余, 張明君, 帥 陳 申請人:復(fù)旦大學