專利名稱：呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的人工抗原、抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)免疫化學(xué)和殘 留分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的人工 抗原、抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
呋喃唑酮屬于硝基呋喃類藥物，是一種人工合成的抗菌藥，藥效穩(wěn)定， 能抑制或殺滅多種革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌，并對(duì)某些原蟲、真菌有一定作用。 因其效高價(jià)廉，故在醫(yī)藥、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖中均得到了廣泛應(yīng)用。但呋喃唑 酮也有一定的副作用，如會(huì)引起視神經(jīng)炎、藥疹、精神障礙等，且長期攝入 會(huì)產(chǎn)生毒性反應(yīng)，引起人體的各種疾病。據(jù)FAO和WHO食品添加劑聯(lián)合專 家委員會(huì)第40次會(huì)議報(bào)告，該藥有致癌性，且易產(chǎn)生抗藥菌株。1995年， 歐盟國家禁止呋喃唑酮用于食品動(dòng)物，隨后美國、日本、澳大利亞等國均取 消呋喃唑酮在畜禽生產(chǎn)上的使用。2004年美國FDA公布了禁止在進(jìn)口動(dòng)物 源性食品中使用的ll種藥物名單，其中包括呋喃唑酮。中國農(nóng)業(yè)部1997年 規(guī)定呋喃唑酮在動(dòng)物性食品中為零殘留(農(nóng)牧[1997]7號(hào))，2002年3月發(fā)布 食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》將呋喃唑酮列為禁用藥。呋喃唑酮原藥在體內(nèi)代謝速度很快，穩(wěn)定性只有數(shù)小時(shí)。經(jīng)研究表明， 呋喃唑酮的代謝物中有相當(dāng)數(shù)量是以其完整側(cè)鏈3-氨基-2-惡唑垸酮即AOZ 與蛋白結(jié)合的殘留物形式存在，AOZ進(jìn)一步代謝可產(chǎn)生具致癌、致突變作用 的羥乙基肼。給動(dòng)物喂飼帶有示蹤標(biāo)記的呋喃唑酮代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明原藥 殘留檢測的意義甚微，而結(jié)合殘留物檢測中，靶組織中結(jié)合殘留物總量與 AOZ呈顯著相關(guān)關(guān)系，雖然隨代謝進(jìn)行，AOZ結(jié)合殘留物約有5y。的降解或 向其他形式結(jié)合物的轉(zhuǎn)化，但其仍是最合適的呋喃唑酮?dú)埩舯O(jiān)測的靶化合物。然而，由于分子量小于1000道爾頓的小分子有毒化學(xué)品，如獸藥及其代 謝產(chǎn)物，其傳統(tǒng)的殘留分析方法主要是依靠氣相色譜(GC)、液相色譜(HPLC) 或質(zhì)譜等物化分析手段，該傳統(tǒng)的理化分析方法，繁瑣復(fù)雜、成本較高、分 析速度慢，難以滿足實(shí)際分析的需要，因此迫切要求發(fā)展簡便、快速、靈敏 的分析技術(shù)。與大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特點(diǎn) (l).小分子化合物(分子量小于1000道爾頓) 一般不具有免疫原性，不 能直接免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體、必須合成突出分子立體結(jié)構(gòu)特異性部位的半抗原，并與大分子載體連接構(gòu)成接合物，才能免疫動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)這一目標(biāo) 小分子化合物的特異性抗體，這種半抗原與大分子載體的結(jié)合物稱為人工抗 原。人工抗原的制備不是任意的，包括結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合方式、載體種類、以 及半抗原與目標(biāo)分析物任何結(jié)構(gòu)上的差異如大小、形狀、成份、構(gòu)型、構(gòu)象、 極性、電子云密度等等在內(nèi)的諸因素，都可能極大地影響著相應(yīng)抗體的性質(zhì)， 因此它們是決定產(chǎn)生其特異性抗體和建立免疫分析方法的關(guān)鍵。(2) .雖然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反應(yīng)原性，即具有與相應(yīng) 抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)的能力，并可體外定量進(jìn)行，遵循質(zhì)量作用定律。(3) .基于抗原抗體免疫反應(yīng)檢測小分子化合物的分析技術(shù)，目前多采用酶 聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。酶聯(lián)免疫吸附測定的基本原理是將酶與抗原 或抗體用交聯(lián)劑結(jié)合起來，此種酶標(biāo)記抗原或抗體與待測樣品中相應(yīng)抗體或 抗原發(fā)生特異反應(yīng)，并牢固結(jié)合，在加入相應(yīng)的酶的底物時(shí)，底物被酶催化 生成呈色產(chǎn)物，可根據(jù)呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。由于此 技術(shù)是建立在抗原抗體反應(yīng)和酶的高效催化作用的基礎(chǔ)上，故而該技術(shù)具有 檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。獸藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)，依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué) 基本原理和生物技術(shù)手段，該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)、合成和 人工全抗原及抗體的制備。因此，目標(biāo)分析物分子免疫學(xué)特性，以及如何通 過化學(xué)或生化技術(shù)突出和利用這些特性，是該領(lǐng)域重要的研究內(nèi)容。這一技 術(shù)目前已成為微量分析研究的一個(gè)嶄新領(lǐng)域，可與傳統(tǒng)分析方法并列作為一 項(xiàng)新的分析途徑。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的人工抗原、抗體及其制備方法，是通過設(shè)計(jì)合成具有3-氨基-2-惡唑烷酮分子結(jié)構(gòu)的獸藥呋喃唑酮的半抗原和人工抗原，突出了此獸 藥分子特異性抗原決定簇又克服了化學(xué)合成的困難，并采用免疫動(dòng)物誘導(dǎo)產(chǎn) 生親和性很高的特異性抗體。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑垸酮的人工抗原，其特征在于是 以3-氨基-2-惡唑烷酮和對(duì)醛基苯甲酸的化合物為半抗原CPAOZ，與載體蛋 白鑰孔血蘭蛋白相連接合成人工抗原，分子結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 5</formula>而且，所述的半抗原CPAOZ的分子量為234，分子結(jié)構(gòu)式為:一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的抗體，其特征在于抗體是 用3-氨基-2-惡唑烷酮人工抗原經(jīng)動(dòng)物免疫、取血，分出抗血清，純化制得 的特異性抗體；具體制備方法是用雄性日本大耳白兔進(jìn)行免疫，三次免疫 后由兔子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清進(jìn)行效價(jià)檢測，末次免疫后采 用股動(dòng)脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血清，采取免疫親合 層析法進(jìn)行抗體純化，即得抗體。一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的人工抗原、抗體的制備方法，其制備方法的步驟是(1) .半抗原的合成采用3-氨基-2-惡唑垸酮與對(duì)醛基苯甲酸反應(yīng)，合成 半抗原CPAOZ，具體做法是加入蒸餾水和對(duì)醛基苯甲酸，再滴加N， N-二甲基甲酰胺至對(duì)醛基苯甲酸完全溶解，攪拌中加入3-氨基-2-惡唑垸酮，室 溫反應(yīng)1.5 2.5h，過濾，水洗，即可得到半抗原；(2) .人工抗原的合成取半抗原CPAOZ、 N-羥基琥珀酰亞胺和N，N-二環(huán) 己基碳二亞胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4 6h后，離心取 上清液；將血蘭蛋白溶于碳酸氫鈉溶液中，攪拌中，將CPAOZ半抗原反應(yīng) 液在冰浴下滴加入血蘭蛋白溶液中，滴加完畢后3 5。C下攪拌反應(yīng)過夜，然 后將反應(yīng)液裝入透析袋，用0.01mol/LPBS溶液充分透析，得到人工抗原；(3) .酶標(biāo)抗原的制備用半抗原CPAOZ與辣根過氧化物酶(HRP)連接及制成酶標(biāo)抗原，其 合成方法同于同人工抗原的合成方法；(4) .抗體的制備選用雄性日本大耳白兔進(jìn)行六次免疫，三次免疫后由兔 子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清進(jìn)行效價(jià)檢測，末次免疫后采用股動(dòng) 脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血清，采取免疫親合層析法 進(jìn)行抗體純化，即得抗體，該抗體添加0.1% (W/V)疊氮鈉后于3 5'C儲(chǔ) 存?zhèn)溆?。而且，所述的酶?biāo)抗原是以3-氨基-2-惡唑烷酮和對(duì)醛基苯甲酸的化合物 (CPAOZ)為半抗原，與辣根過氧化物酶(HRP)相連接合成，分子結(jié)構(gòu)式 為<formula>formula see original document page 6</formula><formula>formula see original document page 7</formula>本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是-1. 本發(fā)明與其他同類方法相比，具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、快速、方便、 廉價(jià)等特點(diǎn)，所設(shè)計(jì)、合成的半抗原為制備特異性良好的抗體奠定了基礎(chǔ)。2. 本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證上述半抗原，其合成方法簡便，合成效率高，反應(yīng) 步驟少，提高了反應(yīng)的可控性；另外，合成產(chǎn)物的提取、純化方法簡便，其 合成半抗原的方法與其他方法相比較，更加易于推廣普及。


圖1本發(fā)明CPAOZ-直接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例做進(jìn)一步說明；下述實(shí)施例是說明性的， 不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。 (1).半抗原的合成本發(fā)明選擇3-氨基-2-惡唑垸酮和對(duì)醛基苯甲酸的化合物(CPAOZ)為半 抗原，其分子量為234，分子結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 7</formula>具體制備方法是加入lmL蒸餾水和對(duì)醛基苯甲酸0.1076 g，緩慢滴 加N， N-二甲基甲酰胺(DMF)至對(duì)醛基苯甲酸完全溶解，攪拌中加入AOZ 0.0510g，室溫反應(yīng)2h，過濾，水洗3次得白色固體，即半抗原CPAOZ。(2).人工抗原的合成采用半抗原CPAOZ通過活化酯法連接到血蘭蛋白(KLH)上，合成人工抗 原，其分子結(jié)構(gòu)式為<formula>formula see original document page 7</formula>具體制備方法是取CPA0Z 10 mg， NHS 3.4 mg， DCC 12.4 mg，溶于260UL DMF中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4 h后，有沉淀產(chǎn)生，5000 r/min離心10 min， 上清液為A液。稱取10 mg KLH溶于3 mL 0.13 mol/L碳酸氫鈉溶液(pH 8.1) 中，即為B液。攪拌下，將A液逐滴加入到B液，4。C下攪拌反應(yīng)過夜。然后 將反應(yīng)液裝入透析袋，4"C下、pH 7.4的O.Ol mol/L PBS溶液充分透析，然 后精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積，測定濃度和結(jié)合比，分裝，-2(TC保存。 (3).酶標(biāo)抗原的制備用CPA0Z與辣根過氧化物酶(HRP)連接即制成酶標(biāo)抗原，用于顯色反應(yīng)。 其分子結(jié)構(gòu)式是其具體制備方法同人工抗原的合成方法。 (4).抗體的制備免疫動(dòng)物選擇日本大耳白兔3只，月齡3個(gè)月，體重1.5公斤左右，分 別編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)。免疫采取皮下和肌肉注射法共同進(jìn)行。免疫程序初次免疫為提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐劑乳化的免疫原，劑量為1 mg，溶于1 mL 0.9%的NaCl，再與1 mL的弗氏完全佐 劑混合進(jìn)行乳化。加強(qiáng)免疫初次免疫后第14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量為0.5 mg，溶于1 mL 0.9%的NaCl，再與1 mL的弗氏不完全佐劑混合進(jìn)行乳化。 以后每隔30天加強(qiáng)免疫一次，共免疫6次。從第2次加強(qiáng)免疫開始，每次免 疫10天后對(duì)動(dòng)物試采血進(jìn)行血清效價(jià)測定和親和力測定。末次免疫后采用頸 動(dòng)脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血清，采取免疫親合層析 法進(jìn)行抗體純化，所得抗體添加0.1% (W/V)的疊氮鈉后于4"C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?免疫檢測方法的步驟1) 將制備好的抗體溶于pH 9.6 Na2C03—NaHC03的緩沖液中，將CPAOZ 多克隆抗體稀釋為l.O ug/100 uL作為包被液，96孔微孔板每孔各加入100 UL，室溫放置過夜或者37-C恒溫溫育2 3小時(shí)，用PBST即磷酸鹽緩沖液 0.05%(V/V)， Tween20洗液洗滌三次；2) 每孔加入200 uL 1%牛血清蛋白(BSA) /PBS封閉液，封閉1小時(shí)， 用洗液洗滌四次；3) 將各種濃度的CPAOZ標(biāo)準(zhǔn)液加入到各自的微孔中，要雙孔平行加樣， 然后再在各種濃度CPAOZ標(biāo)準(zhǔn)液各自的微孔中分別加入酶標(biāo)記CPAOZ抗原溶 液，震蕩混勻5 10 min，室溫反應(yīng)1 2小時(shí)；4) 用洗液洗微孔板3 4次，將孔內(nèi)液體甩掉，用吸水紙扣干，加入底 物A和底物B的混合液，該底物A和底物B的混合液的配比為14.6: 0.45， 室溫下反應(yīng)0. 5小時(shí)；5) 向各微孔中加入終止液以終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，根據(jù)不 同濃度CPA0Z標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值繪制CPA0Z的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
權(quán)利要求
1.一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的人工抗原，其特征在于是以3-氨基-2-惡唑烷酮和對(duì)醛基苯甲酸的化合物為半抗原CPAOZ，與載體蛋白鑰孔血蘭蛋白相連接合成人工抗原，分子結(jié)構(gòu)式為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的人工抗 原，其特征在于所述的半抗原CPAOZ的分子量為234，分子結(jié)構(gòu)式為
3. —種如權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的抗體， 其特征在于抗體是用3-氨基-2-惡唑垸酮人工抗原經(jīng)動(dòng)物免疫、取血，分 出抗血清，純化制得的特異性抗體；具體制備方法是用雄性日本大耳白兔 進(jìn)行免疫，三次免疫后由兔子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清進(jìn)行效價(jià) 檢測，末次免疫后采用股動(dòng)脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部 血清，采取免疫親合層析法進(jìn)行抗體純化，即得抗體。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的人工 抗原、抗體的制備方法，其特征在于制備方法的步驟是(1) .半抗原的合成采用3-氨基-2-惡唑烷酮與對(duì)醛基苯甲酸反應(yīng)，合成半抗原CPAOZ,具體做法是加入蒸餾水和對(duì)醛基苯甲酸，再滴加N， N-二甲基甲酰胺至對(duì)醛基苯甲酸完全溶解，攪拌中加入3-氨基-2-惡唑烷酮，室 溫反應(yīng)1.5 2.5h，過濾，水洗，即可得到半抗原；(2) .人工抗原的合成取半抗原CPAOZ、 N-羥基琥珀酰亞胺和N,N-二環(huán) 己基碳二亞胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4 6h后，離心取 上清液；將血蘭蛋白溶于碳酸氫鈉溶液中，攪拌中，將CPAOZ半抗原反應(yīng) 液在冰浴下滴加入血蘭蛋白溶液中，滴加完畢后3 5。C下攪拌反應(yīng)過夜，然 后將反應(yīng)液裝入透析袋，用0.01mol/LPBS溶液充分透析，得到人工抗原；(3) .酶標(biāo)抗原的制備2用半抗原CPAOZ與辣根過氧化物酶(HRP)連接及制成酶標(biāo)抗原，其 合成方法同于同人工抗原的合成方法；(4).抗體的制備選用雄性日本大耳白兔進(jìn)行六次免疫，三次免疫后由兔 子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清進(jìn)行效價(jià)檢測，末次免疫后采用股動(dòng) 脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血清，采取免疫親合層析法 進(jìn)行抗體純化，即得抗體，該抗體添加0.1% (W/V)疊氮鈉后于3 5-C儲(chǔ) 存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的人工抗 原、抗體的制備方法，其特征在于所述的酶標(biāo)抗原是以3-氨基-2-惡唑烷酮 和對(duì)醛基苯甲酸的化合物(CPAOZ)為半抗原，與辣根過氧化物酶(HRP) 相連接合成，分子結(jié)構(gòu)式為
全文摘要
本發(fā)明涉及一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的人工抗原、抗體及其制備方法，是以3-氨基-2-惡唑烷酮和對(duì)醛基苯甲酸的化合物為半抗原CPAOZ，與載體蛋白鑰孔血蘭蛋白相連接合成人工抗原，抗體是人工抗原經(jīng)動(dòng)物免疫、取血，分出抗血清，純化制得。本發(fā)明是通過設(shè)計(jì)合成具有3-氨基-2-惡唑烷酮分子結(jié)構(gòu)的獸藥呋喃唑酮的半抗原和人工抗原，突出了此獸藥分子特異性抗原決定簇又克服了化學(xué)合成的困難，并采用免疫動(dòng)物誘導(dǎo)產(chǎn)生親和性很高的特異性抗體；與其他同類方法相比，具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、快速、方便、廉價(jià)等特點(diǎn)，所設(shè)計(jì)、合成的半抗原為制備特異性良好的抗體奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K2/00GK101215322SQ200810052028
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月9日
發(fā)明者燕 張, 蓓 徐, 碩 王, 王俊平 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)