專利名稱：：二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的制備和分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯的制備和分離方法。
背景技術(shù)：
：微藻是一類含有葉綠素的海洋微生物，其生長習(xí)性于藻類相同。研究表明，微藻脂肪中含有豐富的co-3多烯脂肪酸。醫(yī)學(xué)界的多年研究，已經(jīng)證實(shí)"-3多烯脂肪酸對人體健康有多種獨(dú)特的生理功效，尤其是EPA(二十碳五烯酸)、DPA(二十二碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)，其獨(dú)特的保健功效被越來越多的人認(rèn)可和接受。目前人類使用的"-3多烯脂肪酸保健品中的有效成分多來自深海魚油和海豹油。隨著世界海洋漁業(yè)資源告急，以及魚油易受重金屬污染等問題的存在，使魚油的應(yīng)用受到了限制；每年北極地區(qū)對海豹的屠殺更是引起全世界的不滿。近年來的研究表明，海洋微藻才是"-3多烯脂肪酸的真正合成者，魚類和海豹體內(nèi)的w-3多烯脂肪酸均是攝取自各自的食物鏈。而且微藻具有易于培養(yǎng)和易于控制生產(chǎn)規(guī)模，總脂含量高，脂肪中"-3多烯脂肪酸含量高等特點(diǎn)，因此越來越受到人們的重視。另一方面，人們也發(fā)現(xiàn)不同的co-3多烯脂肪酸，其生理功能也不同，例如EPA具有改善血液循環(huán)、軟化血管、調(diào)整血脂、降低血壓和血糖以及抗炎作用，適合中老年人服用。DHA具有營養(yǎng)大腦、促進(jìn)胎兒和兒童大腦發(fā)育、保護(hù)視力、調(diào)節(jié)免疫和抗癌作用，DPA也具有促進(jìn)青少年大腦發(fā)育的作用，適合在青少年的食譜中添加。但由于EPA對青少年發(fā)育所必需的花生四烯酸的攝取有競爭作用，會(huì)對青少年視力及大腦的發(fā)育產(chǎn)生不利影響。微藻油脂肪酸成分較為簡單，在含有豐富DPA和DHA的同時(shí)，不含或只含極少量EPA，便于加工成面向不同人群的保健食品，尤其是適合作為青少年食品營養(yǎng)添加成分。同時(shí)DPA和DHA的生理功用也有一些差別，如將兩者分離開來，再針對不同的目標(biāo)人群加以調(diào)配，可以更好的發(fā)揮各自的功能，提高產(chǎn)品效能。本發(fā)明采用的硝酸銀柱法是利用Ag+能與不飽和脂肪酸中的碳碳雙鍵可逆反應(yīng)生成絡(luò)合物的性質(zhì)，生成的絡(luò)合物的穩(wěn)定性與脂肪酸分子中雙鍵數(shù)和分子量有關(guān)，分子量越小，雙鍵數(shù)越多，生成的絡(luò)合物越穩(wěn)定。不同脂肪酸分子的雙鍵數(shù)和分子量都不相同，因此可以用不同極性的洗脫液將它們分別洗脫下來，從而達(dá)到分離的目的。利用該方法可以從微藻油中分別獲得高純度二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯。申請?zhí)?3150169.9公開了一種從魚油中提取高純EPA、DHA的方法，其方法采用乙酯化工藝，皂化反應(yīng)時(shí)間長達(dá)10小時(shí)。由于多不飽和脂肪酸具有熱不穩(wěn)定性，在受熱情況下會(huì)產(chǎn)生較多自由基，會(huì)影響產(chǎn)品品質(zhì)。事實(shí)上，多不飽和脂肪酸甲酯和乙酯均難于被人體吸收，需在后續(xù)處理中將其轉(zhuǎn)化成甘油脂才能作為食品添加成分。因此甲酯化受熱時(shí)間短，可以有效減少多不飽和脂肪酸的損失。申請?zhí)?3113397.5公開了一種經(jīng)鹵蝦蛋白粉制取DHA價(jià)值的方法，該法前期制取鹵蝦粉工藝復(fù)雜，且也采用乙酯化方法，降低了得率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是利用硝酸銀柱法得到高純度二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯，其中DPA含量由原料油的20.32%提高到99.61%，DHA含量44.83%提高到99.02%以上，硝酸銀柱法收率均在90%以上，尤其是二十二碳五烯酸(DPA)甲酯的提純工藝為本專利之首創(chuàng)。在對二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯及其制備方法充分理解的基礎(chǔ)上，我們經(jīng)過大量的探索和試驗(yàn)提出了本發(fā)明，本發(fā)明的工藝方法發(fā)揮了硝酸銀柱法的優(yōu)勢，可以從微藻油中分別獲得高純度二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯。本發(fā)明的二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的制備方法，是以微藻油為原料制備的二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸混合脂肪酸制備二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯。其方法如下采用BF3甲酯化法，取從微藻油中得到的二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸混合脂肪酸與BFr甲醇溶液混合，6075'C下水浴回流1030分鐘，加入飽和NaCl溶液除去BF3，正己烷萃取混合甲酯后，蒸發(fā)除去溶劑即得混合脂肪酸甲酯。本發(fā)明的二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的分離方法，是采用硝酸銀柱法進(jìn)行分離。所述的二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的分離方法，其步驟如下將混合脂肪酸甲酯以硝酸銀硅膠柱層析，使用濃度梯度為0.5%15%的丙酮-正己烷溶液為洗脫劑梯度洗脫，所得洗脫液蒸去溶劑后用氣相色譜檢測，合并相同組分的洗脫液，可分別得到高純度DPA甲酯和DHA甲酯。所述的硝酸銀柱法中混合脂肪酸甲酯上樣質(zhì)量為填充的硝酸銀硅膠質(zhì)量的0.5%10%，洗脫梯度為含.0.5%15%丙酮的正己垸溶液，洗脫速度為0.55ml/min。本發(fā)明所述的高純度二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯的制備和分離方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明之工藝方法分別得到高純度二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯。尤其是本發(fā)明的工藝方法可以得到高純度DPA甲酯，為以往專利之空白。以往專利從未公開過制取高純度DPA甲酯之方法。此為本專利之首創(chuàng)。2、本發(fā)明的工藝方法純度高，收率高。如說明書附圖所示，圖1為原料微藻油氣相色譜分析結(jié)果。峰1為溶劑峰，峰2為十四垸酸，峰3為十六垸酸，峰4為二十二碳五烯酸(DPA)，峰5為二十二碳六烯酸(DHA)。圖1中DPA含量(峰4)為20.32%,DHA含量(峰5)為44.83%,經(jīng)本工藝方法提純后，如圖2所示，DPA含量(峰4)提高到99.61。/。(DPA甲酯)，如圖3所示，DHA含量(峰5)提高到99.02%(DHA甲酯)，兩者收率也均在90%以上。3、本發(fā)明所使用的甲酯化方法和硝酸銀柱法相結(jié)合分別得到二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯，與以往常用的蒸餾方法相比原料受熱時(shí)間短，最大限度的避免了活性成分的損失。4、本發(fā)明工藝采用甲酯化方法，比以往常用的乙酯化方法的酯化時(shí)間短，減少了"-3多烯脂肪酸有效成分的損失。5、本發(fā)明工藝方法采用海洋微藻油為原料，避免了使用魚油和海豹油的種種不足。運(yùn)行費(fèi)用低，生產(chǎn)規(guī)模易于放大。采用本發(fā)明所用方法可以高效制取高純度二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯，不僅可以作為科研工作相關(guān)分析試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)樣品使用，而且便于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。圖1為海藻油原料粗脂肪酸甲酯化后經(jīng)氣相色譜分析得到的結(jié)果。圖2為二十二碳五烯酸(DPA)甲酯產(chǎn)品氣相色譜分析得到的結(jié)果。圖3為二十二碳六烯酸(DHA)甲酯產(chǎn)品氣相色譜分析得到的結(jié)果。具體實(shí)施方式'以下為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述實(shí)施例是為進(jìn)一步描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。[實(shí)施例1]應(yīng)用硝酸銀柱法制備高純度二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯，包括如下步驟1)粗脂肪酸的制備取500g微藻油、50gKOH、1000ml甲醇，加入三頸燒瓶，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣，不斷攪拌，6012(TC下水浴回流14小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑后加入6mol/L的鹽酸酸化，以300ml石油醚分三次萃取脂肪酸后，加5%NaCl水溶液洗滌醚相，至洗液呈中性。加入無水Na2S04吸收醚相中殘留水分，6(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去溶劑即得粗脂肪酸。2)DPA和DHA混合脂肪酸的制備取100g粗脂肪酸、30g300g尿素、600ml甲醇混合，609(TC下水浴回流15分鐘后，置于0'C環(huán)境下冷卻結(jié)晶330小時(shí)，快速抽濾。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑后，加水溶解。以石油醚分兩次萃取脂肪酸，分液。用水洗去醚相中殘留的尿素后，加入無水Na2S04吸收醚相中殘留水分，6(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去溶劑即得高含量DPA和DHA混合脂肪酸。3)DPA和DHA混合物的甲酯化將50gDPA和DHA混合脂肪酸，10m1100mlBF3-甲醇溶液混合后，60卯'C下水^谷回流15分鐘，然后在反應(yīng)物中加入飽和NaCl溶液，震蕩片刻至生成白色沉淀，以150ml正己烷萃取DPA甲酯和DHA甲酯混合物，蒸發(fā)除去溶劑。4)硝酸銀柱法分別得到DPA甲酯和DHA甲酯①Ag+硅膠的預(yù)制。稱取50g250g硅膠(柱層析用，200300目)，加入250g乙醇調(diào)成糊狀，持續(xù)攪拌10分鐘。將2克20gAgNCb溶于100ml乙醇中(70%，v/v)，與糊狀硅膠混合，繼續(xù)攪拌1090分鐘。揮去溶劑后，將Ag+硅膠移入12(TC烘箱中活化1224小時(shí)。取出放入干燥器中避光待用。②稱取20g制得的Ag+硅膠，以正己烷為洗脫液濕法裝柱。取DPA甲酯和DHA甲酯混合物lg上樣。分別以0.5。/。丙酮的正己垸溶液500ml2000ml、3%丙酮的正己烷溶液500ml2000ml、10%丙酮的正己垸溶液1000ml5000ml洗脫，每60ml為一個(gè)樣品，蒸發(fā)除去溶劑，以氣相色譜檢測，合并相同的組分，可分別得到高純度DPA甲酯和DHA甲酯。[實(shí)施例2]基本工藝同實(shí)施例l，具體操作參數(shù)如下1)粗脂肪酸的制備取250g海藻油、50gKOH、500ml甲醇，加入三頸燒瓶，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣，不斷攪拌，6012(TC下水浴回流2小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑后加入6mol/L的鹽酸酸化，以300ml石油醚分三次萃取脂肪酸后，加5%NaCl水溶液洗滌醚相，至洗液呈中性。加入無水Na2S04吸收醚相中殘留水分，60'C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去溶劑即得粗脂肪酸。2)DPA和DHA混合脂肪酸的制備取75g粗脂肪酸、150g尿素、600ml甲醇混合，508(TC下水浴回流15分鐘后，置于-l(TC環(huán)境下冷卻結(jié)晶27小時(shí)，快速抽濾。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑后，加水溶解。以100ml石油醚分兩次萃取脂肪酸，分液。用水洗去醚相中殘留的尿素后，加入無水Na2S04吸收醚相中殘留水分，6(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去溶劑即得高含量DPA和DHA混合脂肪酸。3)DPA和DHA混合物的甲酯化將50gDPA和DHA混合脂肪酸，500m舊F3-甲醇溶液混合后，5080'C下水浴回流15分鐘，然后在反應(yīng)物中加入飽和NaCl溶液，震蕩片刻至生成白色沉淀，以正己垸萃取DPA甲酯和DHA甲酯混合物，蒸發(fā)除去溶劑。4)硝酸銀柱法分別得到DPA甲酯和DHA甲酯按實(shí)例1中方法制取Ag+硅膠，稱取50g制得的Ag+硅膠，以正己烷為洗脫液濕法裝柱。取DPA甲酯和DHA甲酯混合物5g上樣。分別以1Q/o丙酮的正己烷溶液2000ml、7%丙酮的正己垸溶液500ml、15%丙酮的正己烷溶液1000ml洗脫，每60ml為一個(gè)樣品，蒸發(fā)除去溶劑，以氣相色譜檢須ij，合并相同的組分，可分別得到高純度DPA甲酯和DHA甲酯。[實(shí)施例3]基本工藝同實(shí)施例l，具體操作參數(shù)如下1)粗脂肪酸的制備，DPA和DHA混合脂肪酸的制備及DPA和DHA混合物的甲酯化同實(shí)施例2。2)硝酸銀柱法分別得到DPA甲酯和DHA甲酯按實(shí)例1中方法制取Ag+硅膠，稱取100g制得的Ag+硅膠，以正己烷為洗脫液濕法裝柱。取DPA甲酯和DHA甲酯混合物0.5g上樣。分別以0.5%丙酮的正己烷溶液2000ml、10%丙酮的正己垸溶液500ml、15%丙酮的正己烷溶液10001111洗脫，每60ml為一個(gè)樣品，蒸發(fā)除去溶劑，以氣相色譜檢測，合并相同的組分，可分別得到高純度DPA甲酯和DHA甲酯。[實(shí)施例4]對原料微藻油以及實(shí)施例13所得產(chǎn)品進(jìn)行色譜含量分析，其中DPA、DHA的含量見下表(單位重量百分比％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明提出的高純度二十二碳五烯酸(DPA)甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)甲酯的制備和方法，已通過實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)技術(shù)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的制作方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。權(quán)利要求1.一種二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的制備方法，其特征在于以微藻油為原料制備的二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸混合脂肪酸制備二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯。2.如權(quán)利要求1所述的二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的制備方法，其特征在于方法如下采用BF3甲酯化法，取從微藻油中得到的二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸混合脂肪酸與BF3-甲醇溶液混合，6075'C下水浴回流1030分鐘，加入飽和NaCl溶液除去BF3，正己烷萃取混合甲酯后，蒸發(fā)除去溶劑即得混合脂肪酸甲酯。3.由權(quán)利要求1或2所述的二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的分離方法，其特征是采用硝酸銀柱法進(jìn)行分離。4.如權(quán)利要求3所述的二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的分離方法，其特征在于步驟如下將混合脂肪酸甲酯以硝酸銀硅膠柱層析，使用濃度梯度為0.5%15%的丙酮-正己垸溶液為洗脫劑梯度洗脫，所得洗脫液蒸去溶劑后用氣相色譜檢測，合并相同組分的洗脫液，可分別得到高純度DPA甲齙和DHA甲酯。5.如權(quán)利要求4所述的二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的分離方法，其特征在于所屬的硝酸銀柱法中混合脂肪酸甲酯上樣質(zhì)量為填充的硝酸銀硅膠質(zhì)量的0.5%10%，洗脫梯度為含0.5%15%丙酮的正己垸溶液，洗脫速度為0.55ml/min。全文摘要本發(fā)明涉及二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的制備和分離方法。是以微藻油為原料制備的二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸混合脂肪酸制備二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯。本發(fā)明的二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯的分離方法，是采用硝酸銀柱法進(jìn)行分離。所述的硝酸銀柱法中混合脂肪酸甲酯上樣質(zhì)量為填充的硝酸銀硅膠質(zhì)量的0.5％～10％，洗脫梯度為含0.5％～15％丙酮的正己烷溶液，洗脫速度為0.5～5ml/min。本發(fā)明是利用硝酸銀柱法得到高純度二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸(甲酯，其中DPA含量由原料油的20.32％提高到99.61％，DHA含量44.83％提高到99.02％以上，硝酸銀柱法收率均在90％以上。文檔編號C07C67/08GK101265185SQ200810052839公開日2008年9月17日申請日期2008年4月22日優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日發(fā)明者輝丁,張艷華,徐世民,嵩王申請人:天津大學(xué)