專利名稱：：一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法和其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化合物的提純制備方法和其醫(yī)藥用途，具體地說是一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法和其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：土木香為菊科土木香(InulaheleniumL)的干燥根。土木香根中含有1-3%的揮發(fā)油，油中的主要成分為十木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、二氫土木香內(nèi)酯等。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，土木香的功能主要為健脾和胃，行氣解郁，止痛安胎。臨床上主要用于治療胸腹脹滿疼痛，嘔吐泄瀉，痢疾，胎動不安?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究已確認土木香揮發(fā)油具有抗菌，驅(qū)蟲，鎮(zhèn)痛，影響平滑肌、心血管的作用。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，土木香的提取物通常為混合物，故其療效不確切，毒副作用大。例如，土木香揮發(fā)油所含的土木香內(nèi)酯及其衍生物均易溶于醇，故其提取物不純且副作用多(詳見中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所等.中藥志(第一冊)〔M)北京人民衛(wèi)生出版杜，1979，86)。因此，長期以來人們一直都在致力于尋找更好的土木香有效成分的提純制備方法，同時也在積極探索土木香有效成分的新醫(yī)藥用途。.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是耍提供一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法，同時提供一種異土木香內(nèi)酯的新的醫(yī)藥用途。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明所提供的異土木香內(nèi)酯的提純制備方法，包括以下步驟(a)以菊科旋覆花屬植物土木香為原料，用90-99%的乙醇冷浸提取，過濾，濾液減壓濃縮得浸膏；(b)將浸膏懸浮在飽和的鹽水中，使其濃度達到0.8—1.2g/ml，在609(TC條件下，用石油醚萃取3次，萃取溶劑體積分別為相當于水溶液體積的2/3，1/2，1/3，合并石油醚萃取液，并用無水Na2S04脫水后減壓濃縮至近干，分別得石油醚提取物；(c)采用硅膠柱色譜進行分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)進行梯度洗脫，洗脫液配比為10:1，8:2，6:4，5:5，最后依次用乙酸乙酯、甲醇沖柱至洗脫完全，洗脫液按體積接收，每份500mL，減壓濃縮各流份，采用薄層色譜進行檢測，按照薄層色譜結(jié)果將相同流份進行合并；在8-19流份得化合物異土木香內(nèi)酯。本發(fā)明方法中所用的倍半萜化合物異土木香內(nèi)酯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下其波譜數(shù)據(jù)為'H-NMR5ppm:6.13(1H,br.s,H-13a)，5.59(1H,br.s，H-13b),4.77(1H,br.s,H陽15a)，4.44(1H,br.s，H陽15b),4.50(1H，br.S，H-8),2.99(1H,m,H-7),2.34(1H,d，■/=12.0Hz,H-3b),2.20(1H，d,J=16.0Hz，H-9a),2.01(1H,m,H-3a)，1.85(1H,J=12.5Hz,H-5)，1.75(1H,o.m,H-6a),1.71(1H,o.m,H-9b),1.60(2H,o.m,H-2)，L54(1H,o.m，H-la),1.40(1H，m,H-6b),1.25(1H，m,H-lb),0.83(3H,s，14-CH3)。13C-NMR5ppm:41.33(C-l),22.68(C陽2),36.79(C-3)，148.97(C-4),46.18(C-5),27.45(C-6),40.51(C-7),76.82(C-8)，42.16(C-9),34.26(C-10),142.16(C-ll)，170.67(C-12),120.18(C-13),17.65(C-14)，106.61(C-15)。本發(fā)明方法制備的異土木香內(nèi)酯其純度高、晶型好、產(chǎn)量大。試驗表明，采用本發(fā)明方法提純制備異土木香內(nèi)酯，其純度可達80-97%,產(chǎn)品收率與一般的醇提法相比可提高2-3倍。本發(fā)明人經(jīng)過長期大量的研究還發(fā)現(xiàn)丫異土木香內(nèi)酯的新的藥理活性，從而完成了異土木香內(nèi)酯在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的發(fā)明目的。本發(fā)明所述異土木香內(nèi)酯尤其適于在制各抗消化道腫瘤藥物中應(yīng)用。特別是在制備抑制消化道腫瘤細胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述異土木香內(nèi)酯的新的藥理活性通過以下試驗得到了驗證。試驗用細胞株HeLa:人子宮頸癌細胞株;HEC-1:人子宮內(nèi)膜癌細胞株；SHIN-3和HOC-21:人卵巢透明癌細胞株；HAC-2:人卵巢囊腺癌細胞株；T-98和U251-SP:人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株；HLE:人肝癌細胞株；MM1-CB和HMV-1:人黑色素瘤細胞株；KT:腦轉(zhuǎn)移細胞株。(一)異土木香內(nèi)酯抑制腫瘤細胞增殖活性試驗實驗方法細胞增殖實驗法。在含有20%胎牛血清的D-MEM/hams培養(yǎng)基中，將被試細胞調(diào)成密度為2Xl()S細胞/mL。將上述腫瘤細胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔50|il，分別加入空白對照磷酸鹽緩沖液(PBS)、溶劑對照0.1%二甲基亞砜、陽性對照順鉑(DDP)以及不同濃度單體化合物各5(^1，每組均設(shè)3個復(fù)孔。置于飽和濕度、37。C和5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，于培養(yǎng)結(jié)束前4小時，各培養(yǎng)孔加入5mg/ml四氮唑鹽(MTT)lO!il，培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清，懸浮細胞需離心后棄去上清，每孔加入反應(yīng)停止液150^1，靜置1小時，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光度(OD)值，測定波長A:570nm，參考波長入630nm，并計算腫瘤細胞生存率。本發(fā)明化合物溶解于DMSO，添加后的最終濃度在0.1%以下。以只添加DMSO的培養(yǎng)基作為對照。試驗結(jié)果本發(fā)明化合物的抑制腫瘤細胞增殖活性以相對于對照(添加DMSO)的結(jié)果在下表l、表2中表示。表1異土木香內(nèi)酯抗婦科腫瘤細胞增殖活性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2異土木香內(nèi)酯抗其它腫瘤細胞增殖活性異土木香內(nèi)酯抑制細胞增殖活性(％)濃度((iM)T-98U25卜SPHLEMM1-CBHMV-1KT100567164788563104229142720122601224(二)異土木香內(nèi)酯抑制體內(nèi)移植腫瘤細胞增殖活性試驗實驗方法體內(nèi)移植腫瘤細胞實驗法。取冷凍保存的腹水型肉瘤S180和腹水型肝癌H22細胞，2000r/min離心5min，棄上清液，用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整瘤細胞至2X106細胞/mL;取5只健康昆明種小鼠，每只用上述細胞懸液0.4mL，腹腔注射，710天后接種小鼠腹部明顯增大，凸出。將其麻醉處死，無菌抽取乳白色腹水液，以生理鹽水h1稀釋后計算活細胞數(shù)>95%，調(diào)整瘤細胞密度為2X106細胞/mL，待用。將腹腔傳代的肝癌細胞(H22)及肉瘤細胞(S，)接種部位于小鼠右前肢腋下，接種量為2><106細胞/只，分別灌胃給予自來水，腹腔給予環(huán)磷酰胺(30mg/kg)，灌胃給予各濃度的異土木香內(nèi)酯(100mg/kg，10mg/kg和lmg/kg)，各處理組的給藥溶劑為0.2mL/10g體重，連續(xù)給藥10天。.于給藥的第IO天，脫頸椎處死小鼠，立即剝?nèi)∧[瘤，摘取荷瘤小鼠的胸腺和脾臟，分別稱重，計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。異土木香內(nèi)酯在體內(nèi)抑制腫瘤細胞增殖活性的結(jié)果見表3:表3異土木香內(nèi)酯體內(nèi)移植腫瘤細胞增殖活性異土木香內(nèi)酯抑制細胞增殖活性(％)胸腺指數(shù)(mg/10g)脾指數(shù)(mg/10g)給藥量(mg/kg)S180H22S180H22S180H2210069665343102411052425349931051422354'4092106以上試驗表明，異土木香內(nèi)酯具有良好的腫瘤細胞增殖活性抑制作用。其可在制備抗癌藥物中得到應(yīng)用。腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病。目前臨床上用于治療食道癌、胃癌和婦科等惡性腫瘤的藥物，因其在抑制癌細胞增殖的同時，無選擇地也抑制骨髓等細胞的增殖，因而普遍存在毒副作用大的問題。目前臨床急切期待研究人員能夠研發(fā)出毒副作用低、選擇性高的抗惡性腫瘤藥物。本發(fā)明為人們制備抗癌藥物提供了一種新的選擇。本發(fā)明所述異土木香內(nèi)酯在制備抗腫瘤藥物時，可按照常規(guī)的制劑方法以異土木香內(nèi)酯為藥物活性成分，添加適宜的藥物載體，制成各種藥物劑型，如片劑、滴丸、膠囊劑、散劑、注射劑、緩控釋劑等等。在用于治療腫瘤疾病時，口服制劑的用量一般可控制在每日服用異土木香內(nèi)酯300-600mg。其他劑型的用量可參考該用量。本發(fā)明的藥物用法用量，也不完全限于此，臨床醫(yī)師也可以根據(jù)病人的具體情況決定藥物的用法用量。具體實施例方式下面的實施例可更詳細地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例1異土木香內(nèi)酯的提純制備'a)以河北菊科旋覆花屬植物土木香為原料，用99%的乙醇冷浸提取，過濾，濾液減壓濃縮得浸膏；b)將浸膏懸浮在飽和鹽水中，使其濃度達到約lg/ml，在75t:條件下，用石油醚萃取3次，萃取溶劑體積分別為相當于水溶液體積的2/3，1/2，1/3，合并石油醚萃取液，并用無水Na2S04脫水后減壓濃縮至接近無水分，分別得石油醚提取物；c)采用硅膠柱色譜進行分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)進行梯度洗脫，洗脫液配比為10:1，8:2，6:4，5:5，最后依次用乙酸乙酯、甲醇沖柱至洗脫完全，洗脫液按體積接收，每份500mL，減壓濃縮各流份，采用薄層色譜進行檢測按照薄層色譜結(jié)果將相同流份進行合并；在8-19流份得化合物異土木香內(nèi)酯。其含量為87.6%。實施例2本發(fā)明藥物顆粒劑將實施例l所制異土木香內(nèi)酯干燥物粉碎成粉，加入乙醇作黏合劑，加入淀粉作填充劑，壓制成顆粒。實施例3:本發(fā)明藥物口服液將實施例l所制異土木香內(nèi)酯溶于1000ml水中，制成2.5%濃度的水溶液，加入適量的混懸劑，混合均勻，裝入20ml藥瓶中，封口、消毒。實施例4:本發(fā)明藥物片劑將實施例1所制異土木香內(nèi)酯10公斤，按常規(guī)片劑制備方法，加入淀粉，糊精、硬酯酸鎂等，混合制成濕粒，機器沖壓成片，每片含本發(fā)明藥物干浸膏200mg。本發(fā)明的藥物劑型不完全限于此，它可以制備成更多的劑型，如滴丸、膠囊劑、軟膠囊劑、緩控釋制劑、注射劑等等。權(quán)利要求1、一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法，其特征在于它包括以下步驟(a)以菊科旋覆花屬植物土木香為原料，用90--99％的乙醇冷浸提取，過濾，濾液減壓濃縮得浸膏；(b)將浸膏懸浮在飽和的鹽水中，使其濃度達到約0.8-1.2g/ml，在60～90℃條件下，用石油醚萃取3次，萃取溶劑體積分別為相當于水溶液體積的2/3，1/2，1/3，合并石油醚萃取液，并用無水Na2SO4脫水后減壓濃縮至近干，分別得石油醚提取物；(c)采用硅膠柱色譜進行分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)進行梯度洗脫，洗脫液配比為10∶1，8∶2，6∶4，5∶5，最后依次用乙酸乙酯、甲醇沖柱至洗脫完全，洗脫液按體積接收，每份500mL，減壓濃縮各流份，采用薄層色譜進行檢測按照薄層色譜結(jié)果將相同流份進行合并；在8-19流份得化合物異土木香內(nèi)酯。2、異土木香內(nèi)酯在制備抗癌藥物中的應(yīng)fl。3、異土木香內(nèi)酯在制備抗消化道腫瘤藥物中的應(yīng)用。4、異土木香內(nèi)酯在制備抑制消化道腫瘤細胞增殖藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明方法包括以下步驟土木香為原料，用90-99％的乙醇冷浸提取，濾液減壓濃縮得浸膏；將浸膏懸浮在飽和的鹽水中，在60～90℃條件下，用石油醚萃取3次，合并石油醚萃取液，并用無水Na₂SO₄脫水后減壓濃縮至近干，分別得石油醚提取物；采用硅膠柱色譜進行分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)進行梯度洗脫，依次用乙酸乙酯、甲醇沖柱至洗脫完全，洗脫液按體積接收，每份500mL，減壓濃縮各流份將相同流份，進行合并；在8-19流份得化合物異土木香內(nèi)酯。本發(fā)明方法制備的異土木香內(nèi)酯其純度高、晶型好、產(chǎn)量大。文檔編號C07D307/92GK101624387SQ20081005537公開日2010年1月13日申請日期2008年7月10日優(yōu)先權(quán)日2008年7月10日發(fā)明者斌叢,史清文,玫董申請人:河北醫(yī)科大學(xué)