專利名稱：一種利用囊膜病毒出芽特性高效獲得動物膜蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)工程中的蛋白表達與分離純化的領(lǐng)域，特別涉及一 種利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白的方法。
背景技術(shù)：
生物膜有著重要的生物功能，如提供細胞識別位點，介導(dǎo)細胞與細胞、細 胞與基質(zhì)之間的連接等等。膜蛋白的研究也正成為蛋白質(zhì)組研究的熱點。膜蛋 白是許多藥物的作用靶位點，研究膜蛋白不僅有利于低豐度蛋白的研究，更為 藥物研發(fā)和疾病的診斷提供靶體與標記蛋白質(zhì)。然而，膜蛋白的分離是膜蛋白 研究的"瓶頸"，研究蛋白的高效方法雙向電泳技術(shù)也不適合膜蛋白的研究。
桿狀病毒出芽時能帶走宿主細胞部分膜成分，但桿狀病毒具有限制性，只
能感染昆蟲細胞。然而，1995年，Hofmann等研究發(fā)現(xiàn)在桿狀病毒DNA中插入 C匿(human cytomegalovirus immediate-early region)后，桿狀病毒可以在人 肝細胞中表達。1997年，Barsoum等研究報道，在桿狀病毒DNA中插入VSV-G (vesicular stomatitis virus G protein)能擴大宿主范圍并增力口轉(zhuǎn)染率。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種膜蛋白分離與純化新的技術(shù)方法。
本發(fā)明的一種利用囊膜病毒出芽特性高效獲得動物膜蛋白的方法，是通過 重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA感染動物宿主細胞后增殖，在病毒出芽時帶走宿 主細胞膜成分而形成自身的囊膜，將病毒粒子分離出，再獲得囊膜成分，反復(fù) 凍融，獲得膜蛋白。
利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白的方法，具體包括以下步驟 (1 )重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA以5M0I感染動物宿主細胞，37°C、 5 %(:02條件下培養(yǎng)3 4天，用PBS沖洗細胞，收獲細胞；
(2 ) 1000rpm離心，去除上述步驟(1 )所得細胞的碎片，上清液進行超 速離心，35000rpm， 30 60min，收集病毒粒子，沉淀的病毒粒子用PBS緩沖液 重懸溶解，用于蔗糖密度梯度超速離心，35000rpm離心3小時后，按峰收集樣
口
(3)將上述步驟(2)的密度梯度收集的有活性的病毒粒子樣品在液氮 和37"C之間反復(fù)凍融3 5次，使囊膜破裂，12000rpm，離心20 60min，使大 片的囊膜沉淀下來，得到膜蛋白。
所述重組桿狀病毒BacmidCMV-G-Ha的構(gòu)建方法在pFastBac 載體中插入 CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用Bac-to-Bac 系統(tǒng)獲得BacmidCMV-G-HA。
所述重組桿狀病毒BacmidCMV-G-Ha的構(gòu)建方法包括以下步驟
(1) 融合基因HA與質(zhì)粒pFastBacTM同時進行EcoR I和Xho I雙酶切，在 T4連接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBacTM質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細 胞E.coli DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切測序鑒定出正確連接的質(zhì)粒 pFastBac-HA;
(2) 通過pHCMV-VSV-G的序列設(shè)計一對PCR引物，擴增出CMV-VSV-G的序 列，含BamH I位點的上游弓l物atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoR I 位點的下游引物gcgaattcgacggatccttatcactttc， PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳，純 化回收反應(yīng)產(chǎn)物；
(3) 步驟(2)純化后的PCR產(chǎn)物與步驟(1)所得質(zhì)粒pFastBac-HA分別 進行BamH I和EcoR I雙酶切，在T4連接酶的作用下使PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒 pFastBac-HA中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切和 測序鑒定正確插入的重組質(zhì)粒PFastBacCMV-G-HA;
(4) 根據(jù)Bac-to-Bac 系統(tǒng)，取5ul步驟(3)所得重組質(zhì)粒 pFastBacCMV-G-HA轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細胞中，平板于37'C培養(yǎng)24-48h后 挑取白色克隆，劃線接種至平板上，過夜培養(yǎng)，證實是陽性克隆；第二天，挑 取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA; (5)取重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA的DNA約5ul加入lOOul Sf-900 II SFM，取cellfectin 試劑加入到lOOul的Sf-900 II SFM，再將兩者混勻，室 溫放置15 30min， Sf9培養(yǎng)在含50個單位的青霉素和鏈霉素的SFM中，將細 胞轉(zhuǎn)移到27。C至少放置lh，再用不含抗生素的SFM培養(yǎng)基洗滌兩次后，加入上 述的DNA混合物，27。C培養(yǎng)5h，移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM，于27 。C培養(yǎng)72h，收獲細胞，獲得重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA。 所述的融合基因HA的構(gòu)建包括以下步驟
(1) 以gp64DNA為模板，PCR擴增gp64信號肽基因，PCR所用的兩種引
物為
Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3，
Psp2: 5， tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3，；
(2) 以gp64DNA為模板，PCR擴增gp64跨膜域基因，PCR所用的兩種引
物為
Ptml: 5， cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3' Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，；
(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因序列為模板，擴增HA基因，PCR所用的兩 種引物為
Phal: 5， aaagaacgttactgttacac 3， Pha2: 5' atgcaaattctgcattgtaa 3';
(4) 以gp64信號肽基因和HA基因為模板，利用PCR方法擴增出sp-HA融 合基因序列，PCR所用的兩種引物為
Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3，
(5) 以融合基因sp-HA與gp64跨膜域基因為模板，構(gòu)建出HA融合基因， PCR所用的兩種引物為
Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3，
Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，。
步驟(4 )中所述的DH10BacTM感受態(tài)細胞含Bacmid質(zhì)粒。
步驟(4)中所述的平板含Bluo-gal、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、 IPTG。
步驟(4)中所述的液體培養(yǎng)基含卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素。 步驟(5)中所述的含抗生素的SFM，所述的抗生素為青霉素和鏈霉素。
本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明提供了一種新的膜蛋白分離純化的技術(shù)方 法，通過囊膜病毒感染動物宿主細胞，病毒攜帶的HA融合基因表達后將會定位 于宿主的細胞膜上，以HA為膜蛋白上的一個標志，有HA活性則表明有細胞膜 成分存在。膜蛋白質(zhì)的研究一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的瓶頸，本發(fā)明主要針對膜 蛋白，能促進膜蛋白組學(xué)研究的發(fā)展，有助于發(fā)現(xiàn)藥物蛋白作用的耙點，促進 藥物學(xué)、醫(yī)學(xué)的發(fā)展。
具體實施例方式
本發(fā)明利用桿狀病毒出芽并帶走宿主細胞部分膜成分的特性，先分離出出 芽病毒(囊膜病毒)，再獲得囊膜(膜蛋白)。本發(fā)明的目的是提供一種新的 膜蛋白分離純化的技術(shù)方法，通過囊膜病毒感染動物宿主細胞，病毒攜帶的HA 融合基因表達后將會定位于宿主的細胞膜上，以HA為膜蛋白上的一個標志，有 HA活性則表明有細胞膜成分存在。當(dāng)病毒以出芽方式帶走宿主細胞的細胞膜而 形成病毒的囊膜時，分離出囊膜病毒，反復(fù)凍融使囊膜破裂，離心收獲囊膜蛋 白，再對囊膜蛋白進行高效液相色譜(HPLC)與質(zhì)譜分析，從而鑒定并獲得膜 蛋白。
為了能使桿狀病毒能感染動物的細胞，本發(fā)明構(gòu)建了 BacmidCMV-G-HA重組 桿狀病毒，通過從質(zhì)粒pHCMV-VSV-G中擴增出CMV-VSV-G的序列，同時構(gòu)建出 HA融合基因(在HA基因的N端與C端分別連接上信號肽和跨膜區(qū))，再分別將 兩者插入到pFastBacTM載體中，形成pFastBacCMV-G-HA質(zhì)粒，根據(jù)Bac-to-Bac 桿狀病毒表達系統(tǒng)而獲得BacmidCMV-G-HA重組桿狀病毒。
下面結(jié)合實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案
實施例1HA基因的作用相當(dāng)于一個分子標記，在此發(fā)明中HA可以用其他的基因或標 記物代替，如綠色熒光蛋白GFP，本發(fā)明僅以HA基因為例，但這些實施例并不 用于限定本發(fā)明。
1、融合基因HA的構(gòu)建
在HA基因(Genbank DQ520855)的5，和3，端分別連接編碼桿狀病毒囊 膜蛋白gp64信號肽基因序列和gp64跨膜區(qū)基因序列，并在融合基因的5'和 3'端分別引入EcoR I和Xho I酶切位點。分別以桿狀病毒(AcNPV)囊膜糖蛋 白(gp64)信號肽基因序列(家蠶桿狀病毒基因組，Genbank號NP 074525)、 禽流感病毒H5N1 HA基因序列(禽流感病毒H5N1杭州流行株，Genbank DQ520855)和AcNPV gp64跨膜區(qū)基因序列(家蠶桿狀病毒基因組，Genbank號 NP 074525)為模板設(shè)計3對引物，首先擴增目的片段gp64信號肽(以下簡 稱sp) 、 HA和gp64跨膜域(以下簡稱tm)，然后利用各目的片段互為引物 和模板合成融合基因HA。設(shè)計引物如下
Pspl5，gcgaattcatgctactagtaaatcag 3'
Psp25，tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3'
Phal5，aaagaacgttactgttacac 3'
Pha25，atgcaaattctgcattgtaa 3'
Ptml5，cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3，
Ptm25，gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，
(1) gp64信號肽(sp)的擴增
以gp64 DNA (家蠶桿狀病毒基因組，Genbank號NP 074525)為模板，進 行PCR反應(yīng)，先94'C預(yù)變性3min，然后進行30個循環(huán)，其循環(huán)條件為94°C 變性30s， 68。C復(fù)性延伸30s;循環(huán)結(jié)束后，再68。C延伸5min。
在一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分
10XPCR Buffer 10 u 1
25mmol MgC12 8u 1
2. 5 mmol dNTPs 8 u 1
Pspl 1 u 1
Psp2 1 u 1
模板 1 u 1
KOD-PlusDNA聚合酶(TOYOBO公司，日本) lul 加無菌雙蒸水至100 u 1
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié) 束后，電泳鑒定擴增片斷，同時切膠回收目的片斷。
(2) gp64跨膜域(tm)的擴增
以gp64DNA為模板，進行PCR反應(yīng)，先94。C預(yù)變性3min，然后進行30個 循環(huán)，其循環(huán)條件為94。C變性30s， 68。C復(fù)性延伸30s;循環(huán)結(jié)束后，再68°C 延伸5min。
100ul的反應(yīng)體系同上，所用引物為Ptml和Ptm2 ，各組分混勻后，放入 PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴增片斷 同時切膠回收目的片斷。
(3) HA基因的擴增
以禽流感病毒H5N1 HA基因序列(從患病雞血清中提取，序列見Genbank DQ520855)為模板，進行PCR反應(yīng)，先94'C預(yù)變性3min，然后進行30個循 環(huán)，其循環(huán)條件為94。C變性30s， 68。C復(fù)性延伸lmin;循環(huán)結(jié)束后，再68°C 延伸5min。在一個無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分10XPCR BufferlO ul， 25mmo1 MgC12 8ul， 2.5 mmol dNTPs 8ti1，引物Phal lul，引物Pha2 lul，模板lul， KOD-Plus DNA聚合酶lul，加無菌雙蒸水至100ul。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng) 結(jié)束后，電泳鑒定擴增片斷，同時切膠回收目的片斷。
(4) gp64信號肽sp基因與HA基因的融合
進行PCR反應(yīng)，先94。C預(yù)變性5min，然后進行30個循環(huán)，其循環(huán)條件 為94。C變性30s， 68"C復(fù)性延伸lmin;循環(huán)結(jié)束后，再68。C延伸7min。在一 個無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分10 X PCR Buf f er10 u 1 ， 25mmo1 MgC12 8ul， 2.5 mmol dNTPs 8ul，引物Pspl lul，引物Pha2 lul，模板 sp lul，模板HA lul， KOD-Plus面A聚合酶(TOYOBO公司，日本)lul， 加無菌雙蒸水至100 u 1。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng) 結(jié)束后，電泳鑒定擴增片斷，同時切膠回收目的片斷。
因為sp的下游引物Psp2設(shè)計時加入了 HA基因5，端的部分序列，所以 PCR擴增出的sp片斷3'端序列與HA基因5'端序列存在重疊，再次利用上述 PCR方法就可以擴增出sp-HA融合基因序列。
(5)融合基因sp-HA再次與tm的融合，構(gòu)建出HA融合基因
PCR反應(yīng)參數(shù)為94'C預(yù)變性5min，然后進行30個循環(huán)，其循環(huán)條件為94 。C變性30s, 68。C復(fù)性延伸1.5min;循環(huán)結(jié)束后，再68。C延伸10min。在一個 無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分10XPCR BufferlOul， 25畫1 MgC12 8ul， 2.5畫l dNTPs 8ul，引物Pspl lul，引物Ptm2 lul，模板sp-HA 1 "1，模板tm lul， KOD-Plus DNA聚合酶lul，加無菌雙蒸水至100u 1。
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng) 結(jié)束后，電泳鑒定擴增片斷，同時切膠回收目的片斷。
同上，因為tm的上游引物Ptml設(shè)計時加入了HA基因3，端的部分序列， 所以PCR擴增出的tm片斷5'端序列與HA基因3'端序列存在重疊，再次利用 PCR方法就可以擴增出融合基因HA。
2. 構(gòu)建pFastBac-HA質(zhì)粒
上述得到的融合基因HA與質(zhì)粒pFastBac (invitrogen公司Bac-to-Bac baculovirus expression system[kits])同時進行EcoR I禾口 Xho I雙 酶切，在T4連接酶(TAKARA公司試劑盒，按說明書操作進行)的作用下使HA 融合基因插入到pFastBacTM質(zhì)粒中。根據(jù)kits中說明書操作，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細 胞E. coli DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切測序鑒定出正確連接的質(zhì)粒 pFastBac-HA。
3. 構(gòu)建pFastBacCMV-G-HA質(zhì)粒
通過pHCMV-VSV-G (Genebank NO. AJ318514)的序列設(shè)計一對PCR引物， 擴增出CMV-VSV-G的序列。上游引物(含BamH I位點) atggatccgagcttggcccattgcatac ， 下游弓l物(含 EcoR I 位點) gcgaattcgacggatccttatcactttc。 PCR程序設(shè)計如下94。C預(yù)變性7min， 94°C 變性lmin， 68'C復(fù)性延伸3min， 30個循環(huán)，68。C延伸10min。在一個無菌的 0. 5ml離心管中，混合下列成分10XPCR Buffer 10u 1， 25mmol MgC12 8ul， 2. 5 mmol dNTPs 8ii 1，引物各3u 1，質(zhì)粒模板1 u 1， KOD-Plus DNA聚合酶1 nl，加無菌雙蒸水至100ul。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳，純化回收反應(yīng)產(chǎn)物。
純化的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pFastBac-HA分別進行BamH I和EcoR I雙酶切， 在T4連接酶的作用下使PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pFastBac-HA中。轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細 胞E.coli DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定正確插入的重組質(zhì) 粒pFastBacCMV-G-HA。
4. 桿狀病毒表達質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA
根據(jù)Bac—to—Bac baculovirus expression system操作說明書進行，取 5ul (約lng)重組質(zhì)粒pFastBacCMV-G-HA的DNA轉(zhuǎn)化到含Bacmid質(zhì)粒的 DHlOBac 感受態(tài)細胞(invitrogen公司 Bac-to-Bac baculovirus expression system[kits])中，平板(含Bluo—gal，卡夷]3霉素，慶大霉素，四 環(huán)素，IPTG)于37'C培養(yǎng)24-48h后挑取白色克隆。劃線接種至平板上，過夜培 養(yǎng)，證實是陽性克隆。第二天，挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基(含卡那霉素、 慶大霉素、四環(huán)素)中培養(yǎng)，用來分離重組Bacmid質(zhì)粒，根據(jù)說明書的操作而 獲得重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA。 PCR鑒定重組質(zhì)粒序列正確。
5. 含重組質(zhì)粒的重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA的獲得
根據(jù)bac-to-bac baculovirus expression systems說明書操作的。取 重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA的DNA約5ul加入lOOul Sf-900 II SFM (不含抗生 素,invitrogen, Bac_to-Bac baculovirus expression system[kits])， 取cellfectin 試劑(invitrogen, Bac-to-Bac baculovirus expression system[kits])加入到lOOul的Sf-900 II SFM (不含抗生素)，再將兩者混 勻，室溫放置15-30min。 Sf9 (9X 105cells/35mm well)培養(yǎng)在含50個單位的 青霉素和鏈霉素的SFM中，將細胞轉(zhuǎn)移到27。C至少放置lh，再用不含抗生素的 SFM培養(yǎng)基洗滌兩次后，加入上述的DNA混合物，27r培養(yǎng)5h。用移液器移去
DNA混合物，加入SFM (含抗生素青霉素和鏈霉素)，于27。C培養(yǎng)72h。收獲 細胞，獲得重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA。
6. 重組桿狀病毒感染小鼠肝細胞
此重組桿狀病毒可以感染哺乳類動物細胞，本發(fā)明以小鼠肝細胞為例。 重組桿狀病毒以5M0I感染小鼠肝細胞細胞(購于上海麥莎生物)，37°C、 5XC02條件下培養(yǎng)3—4天，用PBS沖洗細胞，收獲細胞并破碎細胞。
7. 重組桿狀病毒分離
1000rpm離心，去除細胞碎片。上清液進行超速離心，35000rpm， 30-60min，收集病毒粒子。沉淀的病毒粒子用PBS緩沖液重懸溶解，用于蔗糖密度 梯度超速離心。密度梯度的上樣順序為PBS、病毒粒子重懸樣品、20%蔗糖、30% 蔗糖、52%蔗糖，35000rpm離心3小時后，按峰收集樣品。
8. HA活性檢測
測活方法采用紅細胞凝集試驗。取24孔細胞培養(yǎng)板，在每一排的1到6孔 (A1-A6)加250ul生理鹽水(0.85%)后，加入250ul樣品于第一孔，做倍 比稀釋，同時設(shè)置陰性對照孔，加入不含樣品的液體做倍比稀釋，再加入1%雞 紅細胞懸液250ul至每一孔內(nèi)，輕輕震蕩培養(yǎng)板，于37'C孵育4小時后觀察 結(jié)果。結(jié)果顯示是陽性，說明病毒粒子帶有囊膜。
9. 囊膜(膜蛋白)的分離
密度梯度收集的有活性的病毒粒子樣品在液氮和+37"C之間反復(fù)凍融3-5 次，使囊膜破裂。12000rpm，離心20-60min，使大片的囊膜沉淀下來，用于后 面的HPLC分析。
10. HPLC與Q-TraP LC-MS/MS分析囊膜
沉淀的囊膜用20。/。乙腈(acetonitrile)反復(fù)溶解后，取上清用于HPLC上 樣，0.5ml/管收集樣品。
收集的樣品用質(zhì)譜級胰酶(trypsin, sigma)進行酶解，于37。C反應(yīng)過夜。 酶解后的樣品再進行HPLC分析，按峰或按管收集樣品，用于質(zhì)譜分析。
經(jīng)HPLC分析的樣品進行Q-Tr鄰LC-MS/MS(ABI公司)分析，得到可能氨基 酸序列。
11. 數(shù)據(jù)檢索
質(zhì)譜所測得的可能性氨基酸序列在NCBI上小鼠蛋白數(shù)據(jù)庫中進行檢索，同 時通過NPS@提供的跨膜區(qū)域分析軟件及TMH麗服務(wù)器 (hUp:〃www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM)對檢索到的蛋白進行跨膜分析，分 析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，90%以上的蛋白為膜蛋白，具有跨膜區(qū)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從 本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范 圍。
序列表
SEQ ID NO 1:
28 atggatccga gcttggccca ttgcatac SEQ ID NO 2:
28 gcgaattcga cggatcctta tcactttc SEQ ID NO 3:
26 gcgaattcat gctactagta aatcag SEQ ID NO 4:
44 tgtgtaacag taacgttctt ttccgcaaag gcagaatgcg ccgc SEQ ID NO 5:
45 cgttacaatg cagaatttgc attggtgata ctgggctatc caaaa SEQ ID NO 6:
30 gtgagctctt actttccaag tcggttcatc SEQ ID NO 7:
20 aaagaacgtt actgttacac SEQ ID NO 8:
20 atgcaaattc tgcattgtaa
權(quán)利要求
1、一種利用囊膜病毒出芽特性高效獲得動物膜蛋白的方法，其特征在于重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA感染動物宿主細胞后增殖，在病毒出芽時帶走宿主細胞膜成分而形成自身的囊膜，將病毒粒子分離出，再獲得囊膜成分，反復(fù)凍融，獲得膜蛋白。
2 、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白的方 法，其特征依次包括以下步驟(1 )重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA以5M0I感染動物宿主細胞，37°C、 5%0)2條件下培養(yǎng)3 4天，用PBS沖洗細胞，收獲細胞；(2 ) 1000rpm離心，去除上述步驟(1 )所得細胞的碎片，上清液進 行超速離心，35000rpm， 30 60min，收集病毒粒子，沉淀的病毒粒子用PBS 緩沖液重懸溶解，用于蔗糖密度梯度超速離心，35000rpm離心3小時后，按 峰收集樣品；(3)將上述步驟(2)的密度梯度收集的有活性的病毒粒子樣品在液 氮和37t:之間反復(fù)凍融3 5次，使囊膜破裂，12000rpm，離心20 60min， 使大片的囊膜沉淀下來，得到膜蛋白。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白 的方法，其特征在于所述重組桿狀病毒BacmidCMV-G-Ha的構(gòu)建方法在 pFastBac 載體中插入CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用 Bac-to-Bac 系統(tǒng)獲得BacmidCMV-G-HA。
4 、根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白的方 法，其特征在于所述重組桿狀病毒BacmidCMV-G-Ha的構(gòu)建方法包括以下步(1) 融合基因HA與質(zhì)粒pFastBac 同時進行EcoR I和Xho I雙酶切， 在T4連接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBacTM質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到感受 態(tài)細胞E.coli DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，酶切測序鑒定出正確連接 的質(zhì)粒pFastBac-HA;(2) 通過pHCMV-VSV-G的序列設(shè)計一對PCR引物，擴增出CMV-VSV-G的 序列，含BamH I位點的上游弓l物atggatccgagcttggcccattgcatac,含EcoR I位點的下游弓l物gcgaattcgacggatccttatcactttc， PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳， 純化回收反應(yīng)產(chǎn)物；(3) 步驟(2)純化后的PCR產(chǎn)物與步驟(1)所得質(zhì)粒pFastBac-HA分 別進行BamH I和EcoR I雙酶切，在T4連接酶的作用下使PCR產(chǎn)物克隆至 質(zhì)粒pFastBac-HA中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5a中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒， 酶切和測序鑒定正確插入的重組質(zhì)粒pFastBacCMV-G-HA;(4) 根據(jù)Bac-to-Bac 系統(tǒng)，取5ul步驟(3)所得重組質(zhì)粒 pFastBacCMV-G-HA轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細胞中，平板于37。C培養(yǎng)24_48h 后挑取白色克隆，劃線接種至平板上，過夜培養(yǎng)，證實是陽性克??；第二天， 挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA;(5) 取重組質(zhì)粒BacmidCMV-G-HA的DNA約5ul加入lOOul Sf-900 II SFM，取cellfectin(E)試劑加入到lOOul的Sf-900 II SFM,再將兩者混勻， 室溫放置15 30min， Sf9培養(yǎng)在含50個單位的青霉素和鏈霉素的SFM中， 將細胞轉(zhuǎn)移到27'C至少放置lh，再用不含抗生素的SFM培養(yǎng)基洗滌兩次后， 加入上述的DNA混合物，27'C培養(yǎng)5h，移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM， 于27'C培養(yǎng)72h，收獲細胞，獲得重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA。
5 、根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白的方 法，其特征在于所述的融合基因HA的構(gòu)建包括以下步驟(1) 以gp64DNA為模板，PCR擴增gp64信號肽基因，PCR所用的兩種 引物為Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3，Psp2: 5， tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3，；(2) 以gp64 DNA為模板，PCR擴增gp64跨膜域基因，PCR所用的兩種 引物為Ptml: 5' cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3' Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，；(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因序列為模板，擴增HA基因，PCR所用 的兩種引物為Phal: 5， aaagaacgttactgttacac 3， Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3，(4) 以gp64信號肽基因和HA基因為模板，利用PCR方法擴增出sp-HA 融合基因序列，PCR所用的兩種引物為-Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3，；(5) 以融合基因sp-HA與gp64跨膜域基因為模板，構(gòu)建出HA融合基因， PCR所用的兩種引物為Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，。
6 、根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白的方 法，其特征在于步驟(4)中所述的DH10BacTM感受態(tài)細胞含Bacmid質(zhì)粒。
7 、根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白的方 法，其特征在于步驟(4)中所述的平板含Bluo-gal、卡那霉素、慶大霉 素、四環(huán)素、IPTG。
8 、根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白的方 法，其特征在于步驟(4 )中所述的液體培養(yǎng)基含卡那霉素、慶大霉素、 四環(huán)素。
9、根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用囊膜病毒出芽特性高效獲得膜蛋白的方 法，其特征在于步驟(5)中所述的含抗生素的SFM，所述的抗生素為青霉 素和鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用囊膜病毒出芽特性高效獲得動物膜蛋白的方法，是通過重組桿狀病毒BacmidCMV-G-HA感染動物宿主細胞后增殖，在病毒出芽時帶走宿主細胞膜成分而形成自身的囊膜，將病毒粒子分離出，再獲得囊膜成分，反復(fù)凍融，獲得膜蛋白。本發(fā)明的有益之處在于提供了一種新的膜蛋白分離純化的技術(shù)方法，通過囊膜病毒感染動物宿主細胞，病毒攜帶的HA融合基因表達后將會定位于宿主的細胞膜上，以HA為膜蛋白上的一個標志，有HA活性則表明有細胞膜成分存在，有助于發(fā)現(xiàn)藥物蛋白作用的靶點。
文檔編號C07K14/435GK101348800SQ20081006133
公開日2009年1月21日 申請日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者呂正兵, 吳祥甫, 張耀洲, 健 陳 申請人:浙江理工大學(xué)