專利名稱：人源化抗cd25單鏈抗體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體，尤其涉及一種單鏈抗體。 本發(fā)明還涉及表達該單鏈抗體的表達載體和宿主細胞。 本發(fā)明還涉及該單鏈抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
CD25是IL-2受體的a亞基，在靜息T細胞上不表達或只有很低水平的表達， 在活化后的T細胞上高表達，成為活化T細胞的標(biāo)志之一，因此又稱作Tac抗原 (T細胞活化抗原)[Robb RJ， Kutny RM. Structure-function relationships for the IL-2 receptor system. J Immunol 1987; 139:855-62]。抗CD25抗體可以通過封閉 CD25,阻斷IL-2的信號傳遞，抑制T細胞活化，例如抗CD25單抗anti-Tac可顯 著降低移植排斥發(fā)生率[KirkmanRL， SaqiroME. Carpcer CB. Transplantation. 1991; 51: 107 13]。此外，CD25在一些惡性血液疾病細胞上組成型高表達， 包括皮膚T淋巴細胞瘤、毛細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、霍奇金病、 成人T細胞性白血病等。在許多自身免疫性疾病中，CD25在T細胞上也過量表 達。因此，抗CD25抗體及免疫毒素對這些腫瘤及自身免疫性疾病也可能提供 有效治療[Waldmann TA. Daclizumab (anti-Tac, Zenapax) in the treatment of leukemia/lymphoma. Oncogene. 2007， 26， 3699 - 3703]。
最早用于制備單抗的方法為雜交瘤法，所獲抗體為鼠源性，但臨床研究發(fā) 現(xiàn)其鼠源性會誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體(人抗鼠抗體，HAMA) [LoBuglio AF, Wheeler RH， Trang J, Haynes A， Rogers K, Harvey EB， et al. Mouse/human chimeric monoclonal antibodies in man: kinetics and immune response. Proc Natl Acad Sci USA 1989;86:4220-4.]。為克服這一缺點，人們對anti-Tac進行了人源化改造。 1997年，美國羅氏公司生產(chǎn)的人源化抗CD25單克隆抗體daclizumab成為第一個 被FDA批準(zhǔn)上市的人源化抗體，用于防治移植排斥[Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S. Design of humanized antibodies From anti-Tac to Zenapax. Methods.2005; 36: 69—83]。
源自人IgGl恒定區(qū)和Eu骨髓瘤抗體的可變框架區(qū)，鼠源序列源自鼠抗-Tac抗 體的互補決定區(qū)，從DNA序列估計其分子量為144kDa。人源化改造后的抗體 具備了以下優(yōu)點引起HAMA的幾率低，在血漿中的半衰期由鼠源抗體的40 小時延長到20天，而且通過其人源的Fc段可介導(dǎo)抗體依賴的細胞毒(ADCC) 反應(yīng)[Morris JC， Waldmann TA. Advances in interleukin 2 receptor targeted treatment. Ann Rheum Dis. 2000， 59(suppl I):il09 - il 14]。
單鏈抗體(single chain fragment variable antibody, scFv)是——禾中基因工程 抗體，通過DNA重組技術(shù)將抗體輕鏈可變區(qū)(VJ和重鏈可變區(qū)(VH)通過 一段連接短肽(linker)首尾連接而成，是保留完整抗原結(jié)合部位的最小功能 片段。和完整抗體相比，單鏈抗體具有以下優(yōu)點1)分子量小，大小僅為完 整抗體的六分之一，免疫原性較低；2)組織穿透力強，容易進入實體瘤周圍 的微循環(huán)；3)血液清除快，腎臟蓄積很少；4)無Fc段，非特異結(jié)合低；5) 易于通過基因工程大量生產(chǎn)；6)易于基因操作，更易構(gòu)建重組免疫毒素。
在國內(nèi)外研究中，已有基于鼠源性抗CD25單抗的scFv構(gòu)建和生產(chǎn)報道， 但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時仍可能會有HAMA產(chǎn)生。目前，尚沒有相關(guān) 文獻涉及用人源化抗CD25抗體daclizumab構(gòu)建的scFv。
另外，單鏈抗體的表達可使用多種表達系統(tǒng)。其中大腸桿菌表達系統(tǒng)最常 用，其表達抗體的產(chǎn)量高，但表達產(chǎn)物多為沒有活性的不可溶的包涵體狀態(tài)， 因此在后續(xù)的工藝中需要進行復(fù)性，導(dǎo)致制備的單鏈抗體收率低，成本高。近 年來發(fā)展建立的畢赤酵母表達系統(tǒng)得到了日益廣泛的應(yīng)用，其主要優(yōu)點為1) 表達產(chǎn)物多為可溶性活性蛋白；2)易于高密度發(fā)酵；3)具有甲醇嚴(yán)格調(diào)控的 強啟動子；4)能分泌表達，利于純化。然而，畢赤酵母表達系統(tǒng)不一定適合 所有蛋白質(zhì)表達，而且有的蛋白雖然表達成功但產(chǎn)量很低或者沒有活性 [Hackel BJ, Huang D, Bubolz JC, Wang XX， Shusta EV. Production of soluble and active transferrin receptor-targeting single-chain antibody using Saccharomyces cerevisiae. PharmRes. 2006 Apr;23(4):790-7.]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種人源化抗CD25單鏈抗體Dmab(scFv)，所述的單鏈抗 體是基于人源化抗CD25抗體daclizumab構(gòu)建的單鏈抗體，其至少具有輕鏈可 變區(qū)、重鏈可變區(qū)和位于輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)之間的中間連接肽，其中所 述的輕鏈可變區(qū)具有SEQ IDNo.l所示的氨基酸序列，所述的重鏈可變區(qū)具有 SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，所述的中間連接肽為(GGGGS) 3.5。
上述單鏈抗體具有如SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一種編碼上述單鏈抗體的核苷酸分子，具有SEQ ID No.4 所示的核苷酸序列。
為了方便地對單鏈抗體進行檢測純化和進一步的操作，可以在上述序列的 基礎(chǔ)上進一步設(shè)計酶切位點和識別序列， 一個優(yōu)選的含有酶切位點和6His-Tag 序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
本發(fā)明還提供了一種含有編碼上述單鏈抗體的核苷酸分子的表達載體。所 述的表達載體為酵母表達載體。
本發(fā)明還提供了一種制備上述人源化抗CD25單鏈抗體的方法，所述方法 包括
1 )構(gòu)建基于daclizumab的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，如SEQ IDNo.3所示；
2) 將所述核苷酸序列可操作地插入畢赤酵母pPIC9K，構(gòu)建畢赤酵母表達 載體，表達載體結(jié)構(gòu)如圖2所示； '
3) 將步驟2)所述的畢赤酵母載體轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌株；
4) 在適宜條件下培養(yǎng)步驟3)所得的轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株，誘導(dǎo)單鏈抗體 的表達；
5) 分離純化步驟4)所得培養(yǎng)產(chǎn)物即可獲得所述人源化抗CD25單鏈抗體。
本發(fā)明成功地構(gòu)建了基于Daclizumab單抗的單鏈抗體，并在酵母表達系 統(tǒng)成功表達。釆用畢赤酵母分泌表達上述人源化抗CD25單鏈抗體，與大腸桿 菌表達載體相比較，其可獲得易于大量生產(chǎn)和純化的可溶性活性蛋白。


圖1是實施例1的人工合成的Dmab(scFv)核苷酸及其氨基酸序列；
圖2是pPIC9K-Dmab(scFv)重組載體的結(jié)構(gòu)圖3是基因拷貝數(shù)對Dmab(scFv)表達量影響的SDS-PAGE分析圖中分析的蛋白來自轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)后的培養(yǎng)上清，其中l(wèi)ane 1、含空載體 pPIC9K的轉(zhuǎn)化子；lane 2-8、含pPIC9K-Dmab(scFv)的轉(zhuǎn)化子，G418抗性濃度 分別為0.25 mg/ml (lane 2， 3)、 0.5 mg/ml (lane 4, 5)、 1.0 mg/ml (lane 6， 7)、 2.0 mg/ml (lane 8); M、蛋白marker;
圖4是誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH對scFv表達量影響的SDS-PAGE分析圖和對酵母 生長狀況影響的活細胞數(shù)量分析圖5是誘導(dǎo)物甲醇濃度對scFv表達量影響的SDS-PAGE分析圖和對酵母 生長狀況的影響的活細胞數(shù)量分析圖6是誘導(dǎo)起始濃度對scFv表達量影響的SDS-PAGE分析圖和對酵母生 長狀況的影響的活細胞數(shù)量分析圖7是誘導(dǎo)時間對scFv表達量影響的SDS-PAGE分析圖和對酵母生長狀 況的影響的活細胞數(shù)量分析圖8是Dmab(scFv)純化的SDS-PAGE和Western印跡分析圖中M、蛋白marker; lane 1,3、純化前的誘導(dǎo)培養(yǎng)上清中總蛋白；lane 2， 4、經(jīng)Ni-agarose親和層析純化后蛋白；
圖9是Dmab(scFv)對CD25陽性和陰性的人腫瘤細胞株結(jié)合能力比較；
圖10是Dmab(scFv)對活化和未活化人淋巴細胞結(jié)合能力比較；
圖11是Dmab(scFv)對活化和未活化大鼠淋巴細胞結(jié)合能力比較。
具體實施例方式
實施例1人源化抗CD25單鏈抗體Dmab(scFv)的獲得 1.基因的設(shè)計和合成
Dmab(scFv)的基因是基于daclizumab的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)氨基酸序歹U (Naoya Tsurushita, Paul R. Hinton， Shankar Kumar Design of humanized antibodies: From anti-Tac to Zenapax. Methods, 2005, 36: 69—83)， 以 VH-(Gly4Ser)3-Vt的模式設(shè)計的。6His-Tag被引入合成基因的3'端以便檢測和純化。同時，為便于克隆到酵母表達載體，合成時在5，和3，端分別加上EcoRI 和NotI酶切位點。設(shè)計的Dmab(scFv)核苷酸及其氨基酸序列如圖l所示，由 invitrogen公司進行基因全合成。
2. 酵母表達質(zhì)粒的構(gòu)建
按照常規(guī)分子克隆方法，用EcoRI和Notl酶切合成的Dmab(scFv)基因， 經(jīng)膠回收后，連接到經(jīng)同樣酶切的畢赤酵母表達載體pPIC9K (invitrogen公 司)，產(chǎn)生pPIC9K-Dmab(scFv)重組子(圖2)。
3. 酵母轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選
按照invitrogen公司pPIC9K操作手冊所述方法，將5-20昭的 pPIC9K-Dmab(scFv)用Sacl線性化，通過電轉(zhuǎn)化法(Bio-Rad Gene Pulser: 1.5kV， 200Q， 25pF)使其轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌株GS115 (invitrogen公司)感受態(tài)中，以 表達Dmab(scFv)蛋白。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在組氨酸缺乏的MD平板上，培養(yǎng)48h 后可獲得His+轉(zhuǎn)化子。由于插入基因拷貝數(shù)和G418抗性基本呈正相關(guān)，而且 多拷貝可能提高目的蛋白表達水平[the manual of Pichia Expression Kit, invitrogen公司]，因此通過不同G418濃度平板0.25， 0.5， 1， 2mg/ml，在 His+轉(zhuǎn)化子中篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子。
4. 小量表達和表達優(yōu)化
為比較不同G418抗性水平轉(zhuǎn)化子表達量的差異，我們用小量表達獲取表 達產(chǎn)物分析。挑取單克隆，接種于100ml BMGY培養(yǎng)基，在250ml三角瓶中 以280rpm轉(zhuǎn)速于28。C培養(yǎng)，直到OD600=2。為誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達，3000g 離心5min收集酵母細胞，以10mlBMMY培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)到100ml三角瓶中， 280rpm于28。C培養(yǎng)96h，每24h加甲醇至終濃度0.5%。誘導(dǎo)完成后，4°C 20kg 離心10min,收集培養(yǎng)上清。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖3所示，不同G418抗 性濃度轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，均在目標(biāo)蛋白預(yù)期分子量處獲得了較高水平表 達，表達量約占培養(yǎng)基上清蛋白的50% (通過Quantity One軟件分析)，相互
間沒有顯著差異。
為進一步提高目標(biāo)蛋白表達量，我們選取最高G418抗性濃度的轉(zhuǎn)化子， 檢測了誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH (pH5.0， 6.0， 6.5， 7.0， 7.5， 8.0)，誘導(dǎo)物(甲醇)濃 度(0.1， 0,5， 1.0， 3.0， 5.0%)，誘導(dǎo)起始濃度(OD600=1 ， 10， 20， 40， 60， 80， 100)，誘導(dǎo)時間(24， 48, 72， 96， 120， 144h)對酵母細胞生長和蛋表達的影響，優(yōu)化最佳誘導(dǎo)條件。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖4-7所示。結(jié)果顯 示，在誘導(dǎo)96h， 3.0%甲醇濃度，pH6.0，誘導(dǎo)起始濃度為OD6()()=60時，最利 于酵母細胞生長，其獲得的蛋白表達量也最大。 5.大量表達和純化
為獲取后續(xù)功能分析的表達產(chǎn)物，我們用以上獲得的最佳誘導(dǎo)條件大量表 達。挑取單克隆，接種于25mlBMGY培養(yǎng)基，在250ml三角瓶中以280 rpm 轉(zhuǎn)速于28。C培養(yǎng)24h，然后全部轉(zhuǎn)入1LBMGY，用3L三角瓶以280 rpm轉(zhuǎn)速 于28'C培養(yǎng)24h。 3000g離心5min收集酵母細胞，以BMMY培養(yǎng)基(pH6.0， 3%甲醇)重懸，調(diào)整誘導(dǎo)起始濃度為OD6(Kf=60，誘導(dǎo)物在十倍體積三角瓶中 以280 rpm轉(zhuǎn)速于28。C培養(yǎng)96h，每24小時加甲醇至終濃度3%。
誘導(dǎo)完成后，4°C 20kg離心10min，收集培養(yǎng)上清，對結(jié)合緩沖液(50mM Tris-HCl， 0.5 mol/LNaCl， 10腿ol/L Imidazole, pH8.0)透析。透析后，4°C 20kg 離心10min，除去可能沉淀的無活性蛋白，上清加到結(jié)合緩沖液平衡后的5ml Ni-NTA柱(QIAGEN)。然后用10倍柱體積結(jié)合緩沖液清洗去除非特異性結(jié) 合的蛋白，最后用洗脫緩沖液(50mmol/LTris-HCl， 0.5 mol/LNaCl， 0.3 mol/L Imidazole, pH8.0)洗脫并收集洗脫峰。洗脫產(chǎn)物用SDS-PAGE和western分 析，結(jié)果如圖8，可見經(jīng)純化后，蛋白純度達到90%以上。用抗6His-Tag抗體 進行的western分析結(jié)果表明，純化的蛋白確為帶6His-Tag的目標(biāo)蛋白。
將純化的目標(biāo)蛋白，對PBS (137mMNaCl， 2.7mMKCl， 2mMKH2P04， 8mMNa2HP04， pH7.4)透析過夜。透析后，4°C 20kg離心10min，除去可能 沉淀的無活性蛋白，上清用DC Protein Assay Kit (Bio-Rad)，以BSA作為標(biāo) 準(zhǔn)，測定蛋白濃度。
實施例2人源化抗CD25單鏈抗體Dmab(scFv)結(jié)合功能檢測 1.蛋白的FITC標(biāo)記
為鑒定生產(chǎn)的Dmab(scFv)結(jié)合活性，我們先用FITC標(biāo)記純化蛋白。參照 Pierce公司EZ-LabelTM FITC Protein Labeling Kit的方法，將溶于PBS的目標(biāo) 蛋白用1MNa2C03調(diào)節(jié)pH至8.5，然后加入10mg/mlFITC (溶于二甲基甲酰 胺)，使蛋白和FITC摩爾比為1:24?；靹蚝?，于室溫避光孵育lh。對PBS 透析去除多余的FITC后，4°C 20kg離心10min，除去可能沉淀的無活性蛋白， 上清即為標(biāo)記好的Dmab(scFv)-FITC 。2.結(jié)合能力和特異性分析
對Dmab(scFv)對CD25抗原的結(jié)合能力及特異性，我們使用CD25陽性和 陰性細胞株或表達水平不同的細胞進行分析。 2.1對CD25陽性人腫瘤細胞株的特異性結(jié)合
據(jù)報道，SNT-8是CD25陽性的人T細胞淋巴瘤細胞株。Raji是一種人 Burkitt's淋巴瘤細胞株。
細胞收集后用PBS洗兩次，重懸至終濃度為lxl07/ml，每管100pl分裝， 與下列抗體4'C避光孵育30min:人IgGl-FITC同型對照(按說明書推薦一次 使用量0.7[ig) (Beckman Coulter),人CD25單克隆抗體-FITC (按說明書推 薦一次使用量62.5ng) (Beckman Coulter), Dmab(scFv)-FITC (lpg)。用1 ml PBS洗兩次后，重懸于0.5 ml PBS中，用流式細胞儀(Beckman Coulter)檢 測陽性細胞百分率。與Dmab(scFv)-FITC孵育的細胞還可用熒光顯微鏡觀測 scFv在細胞中的分布。
如圖9所示，人CD25單克隆抗體與SNT-8結(jié)合后陽性率達95%以上，與 Raji結(jié)合陽性率僅5%以下，證實了 SNT-8為CD25陽性細胞而Raji為CD25 陰性細胞。Dmab(scFv)與這兩個細胞株結(jié)合也得到了相同結(jié)果，說明 Dmab(scFv)可以特異地結(jié)合于SNT-8而不結(jié)合Raji。免疫熒光結(jié)果也顯示， Dmab(scFv)不結(jié)合Raji，特異地結(jié)合于SNT-8細胞膜上。 2.2對活化人淋巴細胞的特異性結(jié)合
未活化的淋巴細胞膜上CD25表達量很低，活化后CD25表達量可明顯提高。
取健康志愿者新鮮肝素抗凝外周血5ml。取少許按每管40 pi分裝，與下 列抗體4。C避光孵育30 min:人IgGlk -FITC同型對照(0.7|ig) (Beckman Coulter),人CD25單克隆抗體-FITC (62.5ng) (Beckman Coulter), Dmab(scFv)-FITC (l昭)。裂解紅細胞后，用流式細胞儀(Beckman Coulter) 檢測的未經(jīng)活化的淋巴細胞陽性細胞含量。剩余外周血用密度梯度離心法分離 獲得人外周單個核細胞(hPBMC)，與ConA共培養(yǎng)48h后收集細胞，用PBS 洗兩次，重懸至終濃度為lxl0々ml，每管100pl分裝，與下列抗體4'C避光孵 育30 min:人IgGlk -FITC同型對照(0.7嗎)(Beckman Coulter),人CD25 單克隆抗體-FITC (62.5ng) (Beckman Coulter), Dmab(scFv)-FITC (l(xg)。用lmlPBS洗兩次后，重懸于0.5mlPBS中，用流式細胞儀(BeckmanCoulter)
檢測活化后淋巴細胞中陽性細胞百分率。
未活化和活化的PBMC還可與Dmab(scFv)-FITC孵育后用熒光顯微鏡觀 察，以檢測scFv在細胞中的分布和特異性。
如圖10所示，人CD25單克隆抗體與未活化的人淋巴細胞孵育后，陽性 細胞率僅為3.4%，活化后陽性細胞率增加到約30%，證實了淋巴細胞活化對 CD25表達的影響。對同樣樣本，Dmab(scFv)也僅和不到5%未活化人淋巴細 胞結(jié)合，與活化細胞孵育后陽性率達到26.5%。免疫熒光結(jié)果顯示，Dmab(scFv) 可結(jié)合活化人淋巴細胞，幾乎不結(jié)合未活化人淋巴細胞。 2.3對活化大鼠淋巴細胞的特異性結(jié)合
在一些體內(nèi)模型中，例如器官移植模型，大鼠是很重要的模型動物。因此， 有必要檢測我們生產(chǎn)的Dmab(scFv)是否能與大鼠的CD25陽性細胞特異性結(jié) 合。我們從大鼠脾臟中分離得到淋巴細胞作為測試對象。
活化前取部分細胞用PBS洗兩次，重懸至終濃度為lxl07/ml，每管100 ^ 分裝，與下列抗體4"避光孵育30 min:人IgGlk -FITC同型對照(0.7嗎) (Beckman Coulter), Dmab(scFv)-FITC (l叱)。用lmlPBS洗兩次后，重懸 于0.5 ml PBS中，用流式細胞儀(Beckman Coulter)檢測陽性細胞百分率。 與Dmab(scFv)-FITC孵育的細胞可用熒光顯微鏡觀測scFv在細胞中的分布。 還可裂解與scFv孵育的細胞，用western分析具有6His-Tag的scFv是否結(jié)合 到大鼠細胞上。
與ConA共培養(yǎng)48h后的細胞按上述同樣方法處理。
結(jié)果如圖11所示，Dmab(scFv)與未活化大鼠淋巴細胞孵育陽性細胞率為 9.2%，與活化細胞孵育后陽性率顯著提高，達到63.4%。免疫熒光結(jié)果表明， Dmab(scFv)可結(jié)合活化大鼠淋巴細胞，幾乎不結(jié)合未活化大鼠淋巴細胞。 Western分析也顯示了同樣結(jié)果。SEQUENCE LISTING
〈110〉四川大學(xué)華西醫(yī)院 <120>人源化抗CD25單鏈抗體及制備方法 〈130〉 08P103359 <160〉 5
<170〉 Patentln version 3. 1
<210> 1
〈211〉 106
<212〉 PRT
<213> Artificial (人工序列) <220>
〈221〉 MISC—FEATURE
<222> (1)..(106)
〈223> ScFv輕鏈可變
〈400〉 1
Asp lie Gin Met Thr 1 5
Asp Arg Val Thr lie 20
His Trp Tyr Gin Gin 35
Thr Thr Ser Asn Leu 50
Gly Ser Gly Thr Glu 65
Asp Phe Ala Thr Tyr 85
Phe Gly Gin Gly Thr 100
<210> 2
11
區(qū)氨基酸序列
Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser lie Ser Tyr Met 25 30
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 40 45
Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 55 60
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Asp 70 75 80
Tyr Cys His Gin Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr 90 95
Lys Vsl Glu Val Lys 105<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial (人工序列) <220>
<221> MISC—FEATURE
<222> (1)..(116)
<223〉 ScFv重鏈可變區(qū)氨基酸序列
〈400〉 2
Gin Val Gin Leu Val 1 5
Ser Val Lys Val Ser 20
Arg Met His Trp Val 35
Gly Tyr lie Asn Pro
Lys Asp Lys Ala Thr 65
Met Glu Leu Ser Ser 85
Ala Arg Gly Gly Gly 100
Thr Val Ser Ser 115
<210> 3 <211> 746 <212> DNA <213> Artificial (人工序列) "
〈220〉
<221> misc_feature
<222> (1)..(746)
<223> ScFv核苷酸分子核苷酸序列
〈400〉 3
gaattccagg tccagcttgt ccagtctggg gctgaagtca agaaacctgg ctcgagcgtg 60
Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 10 15
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 40 45
Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gin Lys Phe 55 60
lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 70 75 80
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 105 110aaggtctcctgcaaggcttctggctacacctttactagctacaggatgca ctgggtaagg120
caggcccctggacagggtctggaatggattggatatatta atccgtcgactgggtatact180
gaatacaatcagaagttc犯ggacaaggca acaattsctgcagacgaatccacc犯taca240
gcctacatggaactgagcagcctgagatctgaggacaccgcagtctatta ctgtgcaeiga300
ggggggggggtctttgactactggggc隱ggaaccctggtcacagtctcctcaggtgga360
ggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggatattcagatgacccagtct420
ccatctaccctctctgctagcgtcggggatagggtcaccataacctgctctgccagctca480
agtataagttacatgcactggtaccagcagsagccaggca犯gctcccaagcttctaatt540
tataccac3tccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtggstctggg600
accgagttcaccctcacaatcagctctctgcagccagatgatttcgccacttattactgc660
catcaaaggagtacttacccactcacgttcggtcaggggac隱ggtggaggtcaaacat720
C3CC3tC3CCatcactgagcggccgc746
<210> 4
<211〉 711
<212> 腿
<213> Artificial (人工序列)
<220>
<221〉 CDS
<222〉 (1)..(711)
<223> ScFv核苷酸分子核苷酸序列
<400〉 4 cag gtc cag Gin Val Gin 1
ctt gtc cag tct ggg get gaa gtc aag aaa cct ggc teg Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 5 10 15
48
age gtg aag gtc tec tgc aag get tct ggc tac acc ttt act age tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
agg atg cac tgg gta agg cag gcc cct gga cag ggt ctg gaa tgg att 144 Arg Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
gga tat att aat ccg teg act ggg tat act gaa tac aat cag aag "c 192 Gly Tyr lie Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
aag gac aag gca aca att act gca gac gaa tec acc aat aca gcc tac 240 Lys Asp Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
atg gaa ctg age age ctg aga tct gag gac acc gca gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
gca卿ggg ggg ggg gtc ttt gac tac tgg ggc c幼gga acc ctg gtc 336 Ala Arg Gly Gly Gly Val Phe A印Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
13aca gtc tec tea ggt gga ggc ggt tea ggc gga ggt ggc tct ggc ggt Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115
120
125
ggc gga teg gat att. cag atg acc cag tct cca tct acc etc tct get Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala
130
135
140
age gtc ggg gat agg gtc acc ata acc tgc tct gcc age tea agt ata Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser lie
145
150
155
160
agt tac atg cac tgg tac cag cag aag cca ggc aaa get ccc aag ctt Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
165
170
175
eta att tat acc aca tec aac ctg get tct gga gtc cct get cgc ttc Leu lie Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
180
185
190
agt ggc agt gga tct ggg acc gag ttc acc etc aca ate age tct ctg Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu
195
200
205
cag cca gat gat ttc gcc act tat tac tgc cat caa agg agt act ta6 Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg Ser Thr Tyr
210
215
220
cca etc acg ttc ggt cag ggg acc aag gtg gag gtc aaa Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
225 230
<210> 5
<211〉 237
<212〉 PKT
<213> Artificial (人工序列)
235
<400> 5
Gin Val Gin 1
Leu Val Gin 5
Ser Gly
Ala Glu Val 10
Lys Lys
Pro Gly 15
Ser
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Arg Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Tyr lie Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65
70
75
80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Gly Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125
384
432
480
528
576
624
672
711Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala 130 135 140
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser lie 145 150 155 160
Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 165 170 175
Leu lie Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe 180 185 190
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 195 200 205
Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg Ser Thr Tyr 210 215 220
Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 225 230 23權(quán)利要求
1、一種人源化抗CD25單鏈抗體，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和位于輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)之間的中間連接肽。
2、 如權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于其具有如SEQ ID No. 5所 示的氨基酸序列。
3、 編碼權(quán)利要求1所述單鏈抗體的核苷酸分子。
4、 如權(quán)利要求3所述的核苷酸分子，其特征在于其具有SEQ ID No.4所 示的核苷酸序列。
5、 如權(quán)利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于所述核苷酸序列中進一 步包含內(nèi)切酶位點和6His-Tag序列，如SEQ ID No. 3所示。
6、 含有權(quán)利要求3、 4或5所述的核苷酸分子的表達載體。
7、 權(quán)利要求6所述的表達載體，其特征在于所述載體為酵母表達載體。
8、 權(quán)利要求7所述的表達載體，其特征在于所述載體為畢赤酵母pPIC9K， 表達載體具有如圖2所示的結(jié)構(gòu)。
9、 由權(quán)利要求6所述的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
10、 一種制備權(quán)利要求1所述的人源化抗CD25單鏈抗體的方法，包括下 述步驟1)構(gòu)建基于daclizumab的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，如SEQ IDNo.4所示；2) 將所述核苷酸序列可操作地插入畢赤酵母pPIC9K，構(gòu)建畢赤酵母表達 載體，表達載體結(jié)構(gòu)如圖2所示；3) 將步驟2)所述的畢赤酵母載體轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌株；4) 在適宜條件下培養(yǎng)步驟3)所得的轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株，誘導(dǎo)單鏈抗體 的表達；5) 分離純化步驟4)所得培養(yǎng)產(chǎn)物即獲得所述人源化抗CD25單鏈抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于人源化抗CD25單克隆抗體daclizumab構(gòu)建的單鏈抗體，本發(fā)明還提供了編碼所述單鏈抗體的核苷酸分子以及制備所述單鏈抗體的方法。本發(fā)明所提供的制備方法可獲得易于大量生產(chǎn)和純化的可溶性活性蛋白。
文檔編號C07K16/28GK101544695SQ200810066250
公開日2009年9月30日 申請日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者琳 萬, 盧曉風(fēng), 杰 張, 李幼平, 李勝富, 宏 步, 程驚秋, 蔡華偉, 陸燕蓉 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院