專(zhuān)利名稱(chēng)：蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽及其編碼基因、重組表達(dá)載體、表達(dá)菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù) 多肽及其編碼基因、重組表達(dá)載體、表達(dá)菌及應(yīng)用。
技術(shù)背景在現(xiàn)代生物科學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，廣泛使用具有生物活性的 各種蛋白質(zhì)制劑。蛋白質(zhì)制劑的存貯方式一般有液體和固體(干粉) 兩種形式。第一種方式的蛋白質(zhì)溶液由于在常溫下容易變性，降低或 喪失生物活性，因此需要存放在低溫環(huán)境中，但在存貯和運(yùn)輸過(guò)程中， 可能由于各種原因?qū)е缕涿撾x低溫環(huán)境，造成蛋白質(zhì)變性沉淀和生物 活性降低。第二種方式是將蛋白質(zhì)制劑成干粉，存放常溫下，但冷凍 干燥過(guò)程中的冷凍和干燥所導(dǎo)致的脫水過(guò)程可對(duì)蛋白質(zhì)造成損傷變 性，導(dǎo)致生物活性降低。此外，在蛋白質(zhì)溶液制劑的使用過(guò)程中，反 復(fù)凍融會(huì)顯著降低蛋白質(zhì)的生物活性。為了保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和保 護(hù)蛋白質(zhì)的生物活性，蛋白質(zhì)制劑中往往加入了各種保護(hù)劑，例如 在蛋白酶溶液中加入血清蛋白和甘油等保護(hù)劑，血清蛋白可以防止蛋 白酶發(fā)生由疏水相互作用引起的聚集和沉淀，甘油可以避免疏水作用 引起的蛋白酶聚集，保護(hù)蛋白酶的生物活性。在蛋白質(zhì)凍干制劑中加 入了糖、多羥基化合物、血清蛋白、表面活性劑和氨基酸等各種保護(hù) 劑，可與蛋白質(zhì)表面的極性基團(tuán)形成氨鍵，防止蛋白質(zhì)在冷凍干燥過(guò)程中失水后氫鍵直接暴露于周?chē)h(huán)境中，減少蛋白質(zhì)的損傷、變性和聚集。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù) 多肽。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物 活性保護(hù)多肽的編碼基因。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物 活性保護(hù)多肽的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與 生物活性保護(hù)多肽的表達(dá)菌。本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性 保護(hù)多肽的應(yīng)用。植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白是胚胎發(fā)生后期伴隨脫水過(guò)程在種子中大量積累的一系列蛋白質(zhì)， 一般分為6組，其中第l組蛋白具高 親水性和熱穩(wěn)定性。本發(fā)明人注意到第1組蛋白含有高度保守的20 氨基酸序列，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所述，該20氨 基酸序列主要由親水性氨基酸組成，含大量自由巻曲結(jié)構(gòu)和左手?jǐn)U展 螺旋結(jié)構(gòu)，本發(fā)明人推測(cè)該20氨基酸序列可防止高溫、干燥或冰凍 引起的脫水及反復(fù)凍融對(duì)蛋白質(zhì)的損傷和變性，保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 和保護(hù)蛋白質(zhì)的生物活性。本發(fā)明人將此20氨基酸序列命名為ZYZ20 多肽，通過(guò)基因工程方法表達(dá)和獲得了含有2-8個(gè)ZYZ20多肽的多肽， 加入到蛋白質(zhì)液體制劑和蛋白質(zhì)固體制劑中，可有效提高蛋白質(zhì)在常 溫條件下的穩(wěn)定性，防止蛋白質(zhì)在冷凍干燥過(guò)程的變性和失活，防止蛋白質(zhì)在反復(fù)凍融過(guò)程中的失活，保護(hù)蛋白質(zhì)的生物活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽，為如下(a)或(b)或(C)所述的多肽(a) ZYZ20多肽，它為序列表中SEQ ID NO. 1所述的氨基酸序列；(b) 由2-8個(gè)ZYZ20多肽首尾串聯(lián)而成的多肽，ZYZ20多肽之 間由2-5個(gè)氨基酸連接起來(lái)；(c) 將(a)或(b)所述的多肽經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的 取代和/或缺失和/或添加而成的具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性保護(hù)功能的 由(a)或(b)衍生的多肽，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加是指在ZYZ20多肽序列的結(jié)構(gòu)域內(nèi)進(jìn)行的取代和/ 或缺失和/或添加。所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)具體為可防止高溫、干燥、冷凍 和反復(fù)凍融對(duì)蛋白質(zhì)損傷、變性和生物活性喪失。在(b)所述多肽中，ZYZ20多肽之間的連接氨基酸較佳為核酸 內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)所編碼。為了使發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽便于純化，本發(fā) 明可在(a)或(b)或(c)所述多肽的氨基末端或羧基末端連接 有Poly-His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽。發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽，較好的為序列表中SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列，它是由2個(gè)ZYZ20多肽首尾串聯(lián)而成的 多肽；更好的為序列表中SEQ ID N0.3所述的氨基酸序列，它是由4 個(gè)ZYZ20多肽首尾串聯(lián)而成的多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。其中(C)所述多肽的編碼基因可通過(guò)將(a)或(b)所述多肽的編碼基因中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在 其5'端連上Poly-His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽的編碼序列得到。本發(fā)明的DNA序列，為如下(a)或(b)所述的DNA序列(a) 編碼上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽的DNA序列；(b) 在嚴(yán)格條件下可與(a)所述DNA序列雜交的DNA序列；所 述嚴(yán)格條件為在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交,然后 用2XSSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。序列表中SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列，是編碼ZYZ20多肽 的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO. 5所述的核苷酸序列，是編碼序 列表中SEQ ID NO. 2所述多肽(申請(qǐng)人將其命名為ZYZ20-2多肽)的核 苷酸序列。序列表中SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列，是編碼序列表 中SEQ ID NO. 3所述多肽的核苷酸序列。本發(fā)明的重組表達(dá)載體，包含有上述本發(fā)明的任何一種DNA序 列?？捎矛F(xiàn)有的原核表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)菌，包含有本發(fā)明的任何一種重組表達(dá)載體或本 發(fā)明的任何一種DNA序列。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽的表達(dá)純化方法，是 將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌例如大腸桿菌后，誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體， 細(xì)胞破碎，離心，親和層析純化，凝膠過(guò)濾。最終獲得蛋白質(zhì)穩(wěn)定與 生物活性保護(hù)多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽可應(yīng)用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定與蛋白質(zhì)活性保護(hù)劑。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)劑，加入蛋白質(zhì)溶 液后，可以防止或降低因高溫、冷凍、干燥或反復(fù)凍融所引起的蛋白 質(zhì)變性、聚集和沉淀，可以防止或降低因高溫、冷凍、干燥或反復(fù)凍融所引起的蛋白質(zhì)生物活性喪失。例如序列表中SEQ ID NO. 2所述 ZYZ20-2多肽加入乳酸脫氫酶溶液后，用液氮冷凍，再在4(TC融化， 反復(fù)多次，可防止乳酸脫氨酶因反復(fù)凍融過(guò)程引起的酶活性下降，對(duì) 反復(fù)凍融過(guò)程中的蛋白質(zhì)生物活性具有明顯的保護(hù)作用。序列表中 SEQ ID N0.2所述ZYZ20-2多肽與海藻糖加入乳酸脫氫酶溶液中，在 高溫(如63°C)條件下，可與海藻糖發(fā)生協(xié)同作用，保護(hù)乳酸脫氫 酶活性的作用效果高于單獨(dú)的ZYZ20-2多肽或海藻糖。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性保護(hù)劑，可保持以液體形式存在的蛋 白質(zhì)在高溫處理或反復(fù)凍融處理下的穩(wěn)定性，保護(hù)蛋白質(zhì)的生物活 性，對(duì)蛋白質(zhì)制劑的應(yīng)用具有重要意義。


圖1是原核表達(dá)載體pET-ZYZ20-2的物理圖譜。圖2是ZYZ20-2多肽誘導(dǎo)表達(dá)圖。圖3是純化的ZYZ20-2多肽的質(zhì)譜圖。圖4是ZYZ20-2多肽質(zhì)譜鑒定圖。圖5是ZYZ20-2多肽對(duì)反復(fù)凍融條件下乳酸脫氫酶(LDH)活性 的保護(hù)作用結(jié)果圖。圖6是ZYZ20-2多肽與海藻糖對(duì)高溫條件下乳酸脫氫酶(LDH) 活性的協(xié)同保護(hù)作用結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例一ZYZ20-2多肽的原核表達(dá)載體和重組菌株的構(gòu)建
提取大豆白農(nóng)6號(hào)未成熟種子的總RNA，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶合成
cDNA。根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的大豆胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白
l組蛋白(LEA1 )序列設(shè)計(jì)引物如下 5， - ATGGGCGCATCTCGTCMAA _3， 5， - CTTATCCTGGTCTTCGTTCT -3，。
以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到分子量約為300bp的條帶，與預(yù)期結(jié) 果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara)回收該片段。將該回收 片段與pGEM-T Easy (Promega)連接，參照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞， 根據(jù)pGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，得到 含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子 序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增到的大豆胚 胎發(fā)育晚期豐富蛋白1組蛋白(LEA1)基因由318個(gè)脫氧核糖核苷酸 組成，將含有該核苷酸序列的重組質(zhì)粒命名為pGEM-LEA1。
根據(jù)大豆胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白1組蛋白中20氨基酸核苷酸序 列即序列表中SEQ ID N0:4所述的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物 5， -AGCGCTAGC GGAGGGCAMCAAGGAAGGA -3， 5， - TTTGCGTCCCATTTCCTGGTACTAGTTAAAAGCTTAGC -3，。 以pGEM-LEA1為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)，得到分子量約為80bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Takara)回收該片段。將該回收片段與pET-28a連接，插入位點(diǎn)為Nhe I和HindIII，參照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài) 細(xì)胞，根據(jù)pET-28a載體上的卡那霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，得到 含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7啟動(dòng)子序列為 引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明為大豆胚胎發(fā)育晚期豐 富蛋白1組蛋白(LEA1)20氨基酸的核苷酸序列，其開(kāi)放閱讀框(ORF) 為序列表中SEQ ID NO. 4的自5'末端第1至60位脫氧核糖核苷酸， 編碼的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1的第1至20位氨基酸。
重復(fù)上述過(guò)程將20氨基酸核苷酸序列再次插入上面構(gòu)建好的重 組載體中，片斷酶切位點(diǎn)為Nhe I和HindIII，載體酶切位點(diǎn)為Spe I 和HindIII，獲得可以表達(dá)2個(gè)20氨基酸序列的重組載體，其開(kāi)放閱 讀框(ORF)為序列表中SEQ ID NO. 5的自5'末端第1至126位脫氧 核糖核苷酸，編碼的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 2的多肽，即 ZYZ20-2多肽。重復(fù)以上方法還可獲得含有3-8個(gè)20氨基酸序列的 重組載體，例如含有SEQ ID NO. 3所述多肽的重組載體。
將含有序列表中SEQ ID NO. 5所述脫氧核糖核苷酸序列的重組載 體命名為pET-ZK22^-么參見(jiàn)附圖1 。
將重組載體P^T-ZK^/9-2轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 STAR,獲得重組 菌株BL21/ZYZ20-2。
實(shí)施例二 ZYZ20-2多肽的表達(dá)
接種BL21/ZYZ20-2單克隆于少量培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)至吸光度 值(OD,)為O. 8時(shí)，補(bǔ)加IPTG至0. 2mM， 37。C誘導(dǎo)4h， 4000g離心收 集菌體，2X樣品緩沖液重懸，IO(TC水浴處理5min， 10000g離心10分鐘，取上清進(jìn)行12% SDS-PAGE,染色，觀察結(jié)果。同實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 BL21/pET-28a比較，BL21/ZYZ20-2出現(xiàn)一條特異的蛋白條帶，與 ZYZ20-2多肽預(yù)期分子量7. 3kDa接近，見(jiàn)附圖2。
實(shí)施例三ZYZ20-2多肽的質(zhì)譜鑒定
從SDS-PAGE膠上將表達(dá)的目標(biāo)蛋白切下，用胰蛋白酶進(jìn)行消化， 用于質(zhì)譜(Waters MALDI Q-tof Premier)鑒定。MALDI所用基質(zhì)為 CHCA，與樣品按l:l進(jìn)行混合，取lul點(diǎn)樣，使用氮?dú)饧す馄?，?yáng)離 子V模式，激光能量為220。 MALDI-Q-TOF質(zhì)譜檢測(cè)到多肽片段為 ZYZ20-2多肽的片斷，在質(zhì)譜圖中用*號(hào)標(biāo)出，見(jiàn)附圖3。
實(shí)施例四ZYZ20-2多肽的純化
接種單克隆于少量培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過(guò)夜；按1: 100比例轉(zhuǎn) 入1000ml LB液體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)至吸光度值(0D6。。)為0.8，補(bǔ)加 異丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至0.2mM， 37°。誘導(dǎo)4h， 4000g 離心收集菌體，重懸于PBS中，冰浴超聲破碎，4°C， 20000g離心10 分鐘，收集上清，參照金屬螯合親和層析介質(zhì)使用說(shuō)明，使用 Chelating S印harose Fast Flow柱純化融合蛋白，獲得的初步純化 蛋白用S叩erdex 30 PG預(yù)裝柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾，收集目標(biāo)蛋白，并進(jìn) 行12% SDS-PAGE。結(jié)果表明在預(yù)期分子量處有一條特異條帶，而其 余蛋白條帶基本消失，獲得了純度較高的ZYZ20-2多肽，見(jiàn)附圖4。
實(shí)施例五ZYZ20-2多肽對(duì)反復(fù)凍融條件下乳酸脫氫酶(LDH)活性 的保護(hù)作用按ZYZ20-2多肽與乳酸脫氫酶的質(zhì)量比為0:1、 1:10、 5:1、 3:1、 1:1、 5:1和10:1，將一定量的ZYZ20-2多肽與乳酸脫氫酶(終濃度 為62.5ng/ml)溶液混合后，分成兩組。 一組用于直接測(cè)定乳酸脫氫 酶的活性。另一組放入液氨中速凍1分鐘，在5(TC恒溫混勻器上完 全融化，反復(fù)處理10次，測(cè)定乳酸脫氫酶的殘留酶活性，分析ZYZ20-2 多肽對(duì)乳酸脫氫酶活性在反復(fù)凍融下的保護(hù)作用。以加入同樣量的血 清蛋白BSA作為對(duì)照組。
結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融后，沒(méi)有加入保護(hù)劑的乳酸脫氫酶活性 幾乎完全消失，酶活僅為處理前的0.6%。隨著所加入ZYZ20-2多肽 的增加，乳酸脫氫酶殘留酶活升高，在質(zhì)量濃度比為5: 1時(shí)，LDH 的殘留酶活達(dá)到最高，為處理前的95%。對(duì)照組加入BSA，可提高乳 酸脫氫酶的殘留酶活，但比ZYZ20-2多肽顯著低，見(jiàn)附圖5。實(shí)驗(yàn)表 明ZYZ20-2多肽對(duì)反復(fù)凍融條件下乳酸脫氫酶活性具有良好的保護(hù) 作用。
實(shí)施例六ZYZ20-2多肽與海藻糖對(duì)高溫條件下乳酸脫氫酶(LDH) 活性的協(xié)同保護(hù)作用
按ZYZ20-2多肽與乳酸脫氫酶的質(zhì)量比為0:1 、 1:1 、 15:1和30:1 ， 將一定量的ZYZ20-2多肽與乳酸脫氫酶(終濃度為62.5ng/ml)混合 后，分成兩組。 一組用于直接測(cè)定乳酸脫氫酶活性。另一組在63°C 恒溫混勻器上保持5分鐘后，測(cè)定乳酸脫氫酶活性，比較加入ZYZ20-2 多肽前后的乳酸脫氫酶活性，分析ZYZ20-2多肽對(duì)乳酸脫氫酶在高溫 下的保護(hù)作用。以加入同樣量的血清蛋白BSA作為對(duì)照組。
在以上實(shí)驗(yàn)體系中同時(shí)加入終濃度為250ng/ml的海藻糖，經(jīng)過(guò)上述同樣過(guò)程處理后，測(cè)定乳酸脫氫酶的活性。
結(jié)果表明，乳酸脫氫酶在高溫處理后，沒(méi)有加入保護(hù)劑的乳酸脫
氫酶活性?xún)H為6%。在加入同樣質(zhì)量的ZYZ20-2多肽和BSA后，在蛋 白與LDH酶的質(zhì)量比例達(dá)到15:1后，前者中的乳酸脫氫酶活性高于 后者。實(shí)驗(yàn)體系中均加入50mM海藻糖后，在加入同樣質(zhì)量的ZYZ20-2 多肽和BSA時(shí)，在蛋白與LDH酶的質(zhì)量比例達(dá)到15:1后，前者中的 乳酸脫氫酶活性同樣高于BSA，并且ZYZ20-2多肽和海藻糖共同存在 時(shí)乳酸脫氫酶的活性高于ZYZ20-2多肽和海藻糖單獨(dú)存在的乳酸脫 氫酶活性的兩者之和，見(jiàn)附圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZYZ20-2多肽對(duì)高溫 下的乳酸脫氫酶活性具有一定的保護(hù)作用，在與海藻糖同時(shí)存在的情 況下，可發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)作用提高對(duì)乳酸脫氫酶活性的保護(hù)作用。
參照上述實(shí)施例的過(guò)程和方法可獲得由3-8個(gè)ZYZ20多肽首尾串 聯(lián)而成的多肽，如SEQ ID NO. 3所述的ZYZ20-4多肽。對(duì)ZYZ20-4多 肽同樣進(jìn)行了反復(fù)凍融處理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在ZYZ20-4多肽與 LDH酶的質(zhì)量比為1: l時(shí)，經(jīng)過(guò)10次反復(fù)凍融處理后，LDH酶殘留 活性比ZYZ20-2多肽提高20% ，表明與ZYZ20-2多肽相比ZYZ20-4 多肽對(duì)LDH酶活性具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及理論推測(cè)， 其它串聯(lián)數(shù)目的ZYZ20系列多肽對(duì)LDH酶均具有保護(hù)作用，并且隨著 ZYZ20串聯(lián)數(shù)目的增加，在加入同樣質(zhì)量的ZYZ20系列多肽的條件下， ZYZ20系列多肽對(duì)LDH酶的保護(hù)作用效果也相應(yīng)提高。<formula>formula see original document page 14</formula><formula>formula see original document page 15</formula><210> 4 <211> 60 <212> DNA<213〉 大豆屬大豆(Glycine max ( L.)) 〈400> 4ggagggc38ia c幼ggaagga acagctgggt 3C3gaeigggt dccaggaaat gggacgcaaa 60<210> 5 〈211〉 126 〈212> DNA 〈213〉人工序列 <400> 5ggagggc333 ca^gg33gga acagctgggt aceigaagggt eiccaggaaat gggacgcaaa 60 actagcggag ggc犯aca^g gaaggaacag ctgggt3C8ig aagggtacca ggaaatggga 120 cgcaaa 126〈210〉 6 <211> 258 〈212〉 DNA <213>人工序列 〈400〉 6ggagggcaaa caaggaagga acagctgggt acagaagggt accaggaaat gggacgcaaa 60 actagcggag ggcaaacaag gaaggaacag ctgggtacag aagggtacca ggaaatggga 120 cgcaaaacta gcggagggca aacaaggaag gaacagctgg gtacagaagg gtaccaggaa 180atgggacgca犯actagcgg agggcaaaca aggaaggaac agctgggtac ag肪gggtac 240 caggaaatgg gacgcaaa 258
權(quán)利要求
1. 一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽，為如下(a)或(b)或(c)所述的多肽(a)ZYZ20多肽，它為序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；(b)由2-8個(gè)ZYZ20多肽首尾串聯(lián)而成的多肽，ZYZ20多肽之間由2-5個(gè)氨基酸連接起來(lái)；(c)將(a)或(b)所述的多肽經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而成的具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性保護(hù)功能的由(a)或(b)衍生的多肽，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在ZYZ20多肽序列的結(jié)構(gòu)域內(nèi)進(jìn)行的取代和/或缺失和/或添加。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽，其 特征在于為序列表中SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽，其 特征在于為序列表中SEQ ID N0.3所述的氨基酸序列。
4. 一種DNA序列，為如下(a)或(b)所述的DNA序列(a) 編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽的DNA序列；(b) 在嚴(yán)格條件下可與(a)所述DNA序列雜交的DNA序列；所 述嚴(yán)格條件為在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后 用2XSSC， 0. 1% SDS和1XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA序列，其特征在于為序列表中SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA序列，其特征在于為序列表中 SEQ ID N0.5所述的核苷酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA序列，其特征在于為序列表中 SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列。
8. —種重組表達(dá)載體，包含有權(quán)利要求4所述的任何一種DNA 序列。
9. 一種表達(dá)菌，包含有權(quán)利要求8所述的任何一種重組表達(dá)載 體或權(quán)利要求4所述的任何一種DNA序列。
10. 權(quán)利要求1或2或3所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多 肽在蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)劑上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽及其編碼基因、重組表達(dá)載體、表達(dá)菌及應(yīng)用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與生物活性保護(hù)多肽為如下(a)或(b)或(c)所述的多肽(a)ZYZ20多肽，它為序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；(b)由2-8個(gè)ZYZ20多肽首尾串聯(lián)而成的多肽，ZYZ20多肽之間由2-5個(gè)氨基酸連接起來(lái)；(c)將上述多肽經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而成的具有蛋白質(zhì)穩(wěn)定與活性保護(hù)功能的由(a)或(b)衍生的多肽。本發(fā)明的多肽可保持蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性，保護(hù)蛋白質(zhì)制劑的生物活性，應(yīng)用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定與蛋白質(zhì)生物活性保護(hù)劑。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101280003SQ200810067238
公開(kāi)日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日
發(fā)明者鄒永東, 鄭易之 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)