專利名稱：一種抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗白色念珠菌抗菌肽的制取方法，尤其是一種抗白 色念珠菌抗菌肽的生化制取方法。
技術(shù)背景-
抗菌肽(antibacterialpeptides, ABP)是由生物體基因編碼、相對(duì)分 子質(zhì)量小，具有抗菌活性的肽類物質(zhì)的總稱。它是宿主產(chǎn)生的一類抵抗 外界病原體感染的小分子多肽，廣泛存在于昆蟲、植物、動(dòng)物和人體 內(nèi)，除有抗細(xì)菌、真菌和病毒等病原體作用外，還具有抗腫瘤細(xì)胞作 用。因此，抗菌肽又稱為肽抗生素(peptide antibiotics)。它是機(jī)體非特 異性免疫的重要組成部分，是生物體抗感染免疫的古老機(jī)制，所以又叫 做"第二防御體系"。研究表明，抗菌肽具有抗菌活性強(qiáng)、廣譜抗菌、熱 穩(wěn)定性及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)還有高效的抗真菌和(或)抗病毒 和(或)原蟲和(或)抗腫瘤活性。在臨床感染菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素耐藥性日益 嚴(yán)重的今天，人們希望抗菌肽成為繼傳統(tǒng)抗生素之后的又一類新型抗感 染藥物。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，抗菌肽已成為近年來分子免疫學(xué) 和分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。研究的內(nèi)容包括抗菌肽的分離與純化，氨 基酸序列的分析；蛋白質(zhì)構(gòu)型與功能的關(guān)系，抗菌肽的作用機(jī)理；應(yīng)用 基因工程技術(shù)克隆和表達(dá)抗菌肽基因；改造合成抗菌肽基因以及動(dòng)植物 的轉(zhuǎn)抗菌肽基因工程等。
近年來，隨著抗生素的應(yīng)用和濫用，耐藥菌株不斷增加，向抗感染 治療提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。根據(jù)美國《新聞周刊》報(bào)道，早在1992年全美 國就有13300名患者死于抗生素耐藥性細(xì)菌感染?，F(xiàn)在已有抗所有抗生 素的耐藥菌株出現(xiàn)。為了解決這一問題，人們一方面對(duì)傳統(tǒng)抗生素進(jìn)行 結(jié)構(gòu)改造以對(duì)付細(xì)菌的耐藥性，另一方面，人們研究和開發(fā)新型的藥 物?？咕呐c傳統(tǒng)抗生素相比，其不同點(diǎn)在于抗菌肽的作用靶位點(diǎn)是病 原體細(xì)胞膜，因此不易產(chǎn)生耐藥性，尤其是抗菌肽能特異性的抑制腫瘤 細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞沒有毒害作用，這給抗癌藥物的開發(fā)帶來了新的希 望。美國、英國皇家醫(yī)學(xué)會(huì)將抗菌肽列為21世紀(jì)抗癌首選藥物。另外， 抗真菌肽的發(fā)現(xiàn)，對(duì)人們棘手的真菌病治療提供了新的思路。
目前，許多抗菌肽都被開發(fā)成藥物，但天然抗菌肽的產(chǎn)量非常有 限，合成肽價(jià)格非常昂貴，這將成為開發(fā)新藥的一個(gè)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法。
本發(fā)明的特征在于由以下方法來實(shí)現(xiàn)；
一、 樣品處理
將100-200g綿羊生殖道剪碎成0.5-1.2cm2的小塊，9000-12000r/min離 心5-20min，零下10-2(TC凍融3-4次，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，按 1:1.5-3體比加入濃度為5-30%乙酸，在3-5。C攪拌浸提20-26h，然后在3-5 。C時(shí)，將浸提混合物在高速冷凍離心機(jī)上用10000-15000r/min離心20-30min，收集上清透析，測定蛋白濃度，冷凍干燥，零下10-2(TC低溫保 存，取0.1-lmg重新溶解在濃度為0.01-0.05M乙酸中用于檢測活性；(本
文中涉及的百分比濃度，除另加說明外均指體積百分比)
二、 抗菌肽初級(jí)分離；
用凝膠過濾色譜方法進(jìn)行初級(jí)分離在室溫下將48-53.0g交聯(lián)葡聚 糖凝膠G-50(Sephadex G-50)，溶解于480.0-530.0 11^去離子水中澎脹20-26h，采用真空泵脫除凝膠中氣體后，進(jìn)行裝柱使其成4) lcmx 15-100cm柱，先用0.15-0.25N氫氧化鈉清洗液沖洗2-4h，再用濃度為0.1-0. 05mol/L， pH值為5-7乙酸銨洗脫液平衡柱子，將樣品重懸在上述洗脫液 中，以9000-U000r/min離心10J0min，取上清上樣，洗脫流速18-20 mL/ h，收集目的峰，整個(gè)洗脫過程在O-l(TC環(huán)境中進(jìn)行，用吸光值200-300nm檢測洗脫峰，收集后冷凍干燥，重新溶解在濃度為0.01-0.05%乙 酸中，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性；
三、 抗菌肽的精分離
用反相高效液相色譜方法進(jìn)行精分離將凝膠過濾色譜有抗菌部分 進(jìn)行第二步分離純化，將樣品重懸在濃度為0.01-0.05%乙酸洗脫液中， 在0-10。C時(shí)以9000-12000 r/min離心10-20min，取上清上樣于反相高效液 相色譜柱(Hypersil BDS C18 RP-HPLC column),柱長為0.2-0.5c m X 20-100 cm ，用含濃度為0.08-0.11%三氟乙酸的水和含濃度為0.08-0.11%三 氟乙酸的乙腈按990-999:l-10的體積比構(gòu)成的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，吸光 值2卵-3卯nm檢測洗脫峰，收集冷凍干燥，測定蛋白濃度、檢測抗菌活 性；
四、 綿羊抗菌肽的抗菌活性檢測
采用肉湯稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)菌株在滅菌MH肉湯瓊脂平板上過夜培養(yǎng)，挑取菌落接種于MH肉湯培養(yǎng)基中，用搖床過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180-200r/min、溫度為35-38。C，將培養(yǎng)后的菌液稀釋至2X 105CFU/ml，在 無菌酶標(biāo)板上第l孔中加80-90ul， MH肉湯培養(yǎng)基，第2-ll孔中各加入 50ulMH肉湯培養(yǎng)基，第一孔再加入10-20ul，經(jīng)孔經(jīng)為0.01-0.22 um濾 膜過濾后的溶解于濃度為0.05-0.01%乙酸的綿羊抗菌肽樣品，充分混勻 后取50ul再加入第2孔，依次倍比稀釋，從第10孔中吸出50ul棄去，第ll 孔加50ul培養(yǎng)后的菌液作為掃描對(duì)照，再向第12孔中加50ulMH肉湯培 養(yǎng)基，混勻后在35-38 。C時(shí)在搖床上以150-200 r/min培養(yǎng)18-24h，用酶標(biāo) 儀在600 nm波長處對(duì)平板進(jìn)行掃描，抗菌肽的MIC的確定按照比對(duì)照孔 11孔的渾濁程度低50%以上的最小質(zhì)量濃度計(jì)算，結(jié)果如下表顯示-綿羊生殖道提取物最小抑菌濃度；
菌株 MlC50(ug/ml) 大腸桿菌ATCC25922 12 金黃色葡萄球菌ATCC2592 10 鏈球菌ATCC55121 24 白色念珠菌ATCC2002 4
或采用薄層瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法每毫升含IO .細(xì)菌或孢子的菌液均 勻涂布于固體LB培養(yǎng)基表面，將經(jīng)過滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培 養(yǎng)基表面，滴加6-10u啲待測樣品溶液，于35-38"C下培養(yǎng)18-20小時(shí)，觀 察抑菌圈形成與否，有抑菌圈形成的表明有抗菌活性；
五、 綿羊抗菌肽的溶血活性檢測
釆兔血，將兔血與阿氏液，按l:l體積比混合置于離心管中，離心轉(zhuǎn) 速1500-2000r/min，離心5-10min ，用生理鹽水洗滌至上清液不再呈紅色 為止，將上述洗滌好的紅細(xì)胞加生理鹽水稀釋成107_ 108濃度的懸浮
液，上述稀釋好的懸浮液與溶解于生理鹽水中的不同濃度的抗菌肽樣 品，在35-38 。C時(shí)，保溫20-30min，再離心1500-2000r/min， 5國10min，上 清液于540nm波長處測吸收值，陰性對(duì)照使用生理鹽水，陽性對(duì)照使用T ritonX-IOO，結(jié)果顯示綿羊生殖道抗菌肽具有7.6%的溶血活性；
六、 綿羊抗菌肽純度鑒定
分離純化得到純品采用HPLC和MALDI-TOF-MS鑒定，首先用HPLC
對(duì)分離純化得到的綿羊抗菌肽進(jìn)行純度鑒定，將綿羊抗菌肽溶解在濃度 為0.08-0.11%三氟乙酸水溶液中，在0-4。C時(shí)以9000-12000r/min，離心IO
-20min，取上清上樣10-15ul上C18柱，用含有濃度為0.08-0.11 %的三氟乙酸的水和含有濃度為0.08-0.11%的乙腈按999:1體積比構(gòu)成的洗脫液，
反復(fù)沖洗柱子，保證柱子中的雜質(zhì)及吸附的蛋白質(zhì)被徹底的清洗，并以 18-20mL/h進(jìn)行洗脫分離，得到的抗菌肽純品，如圖3，再利用MALDI-TOF-MS做進(jìn)一步鑒定，將純品稀釋成104'611101/1的水溶液，吸取10-15ul 置于小塑料管中，加入10-15ul芥子酸混勻，取l-2ul此溶液滴在進(jìn)樣伸頭 上，調(diào)整真空度為1.3XlO-4Pa時(shí)，抽空除去溶劑，使樣品與基質(zhì)混合液 在探頭上形成均勻的結(jié)晶，在電壓為15-30kv，激光波長為377nm時(shí)，在 儀器上直接測定樣品的純度和分子量。如圖4，最終結(jié)果顯示，該抗菌 肽是一種單鏈的多肽，其分子量是4820.47Da，等電點(diǎn)為6.96，呈酸
性；
七、保存；在零下20-8(TC的低溫下保存。 上述的吸光值最好為215-285nm。
上述的反相高效液相色譜柱，柱長最好為0.4-0.5cm X 20-50 cm 。
本發(fā)明制取的抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高，耐受蛋白酶水解的能力，可 有效抑制革蘭氏陽性、陰性和真菌的生長，且具有分離提純工藝快速、 高效，回收率高等特點(diǎn)，可廣泛用于獸藥、防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品等領(lǐng)域。


圖1為凝膠過濾層析分離純化綿羊生殖道抗菌肽結(jié)果。 圖2為有活性的目的峰進(jìn)一步利用反相C18高效液相色譜柱分離結(jié)果。
圖3為綿羊生殖道抗菌肽質(zhì)譜鑒定。 圖4為綿羊生殖道抗菌肽純度鑒定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:
一、 樣品處理；
將100g綿羊生殖道剪碎成0.5-1.2cm2的小塊，9000r/min離心10min，
零下10X:凍融3次，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，按1:2體積比加入濃 度為5。/。乙酸在4'C攪拌浸提24h，然后將浸提混合物在高速冷凍離心機(jī)上 10000r/min，在4。C時(shí)，離心25min，收集上清透析，測定蛋白濃度，冷 凍干燥，零下10。C低溫保存，取少量重新溶解在濃度為0.01%乙酸中用 于檢測活性。
二、 抗菌肽初級(jí)分離；
用凝膠過濾色譜方法進(jìn)行初級(jí)分離在室溫下將48g交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50溶解于480mL去離子水中澎脹20h，采用真空泵脫除凝膠中氣體 后，進(jìn)行裝柱使其成4) lcmX 15cm柱，先用0.15N氫氧化鈉清洗液沖洗 2h，再用濃度為0.1mol/L ， pH值為5乙酸銨洗脫液平衡柱子，將樣品重 懸在上述洗脫液中，以9000r/min離心10min，取上清上樣，洗脫流速18 mL/h，收集目的峰，整個(gè)洗脫過程在4r環(huán)境中進(jìn)行，用吸光值200nm 檢測洗脫峰，收集后冷凍干燥，重新溶解在濃度為0.01%乙酸中，測定 蛋白濃度、檢測抗菌活性。
三、 抗菌肽的精分離；
用反相高效液相色譜方法進(jìn)行精分離將凝膠過濾色譜有抗菌部分 進(jìn)行第二步分離純化，將樣品重懸在濃度為0.01%乙酸洗脫液中，在4。C 以9000r/min離心10min，取上清上樣于反相C18高效液相色譜柱，柱長 為0,2cmx 20cm，用含濃度為0.0.8%三氟乙酸的水和含濃度為0.08 。％ 三氟乙酸的乙腈按999:1的體積比構(gòu)成的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，吸光值 200nm檢測洗脫峰，收集冷凍干燥，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性。
四、 綿羊抗菌肽的抗菌活性檢測；
采用微量肉湯稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)菌株在滅菌MH肉湯瓊脂平板上過夜 培養(yǎng)，挑取菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，用搖床過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180r/ min、溫度為35t:，將培養(yǎng)后的菌液稀釋至2x 105 CFU/ml，在96孔無菌 酶標(biāo)板上第一孔中加90 ul MH液體培養(yǎng)基，第2-11孔中加入50 vil MH液 體培養(yǎng)基，第一孔再加入10ul經(jīng)孔徑為0.22n m濾膜過濾后的溶解于濃度 為0.01%乙酸的綿羊抗菌肽樣品，充分混勻后取50ul加入第2孔，依次倍 比稀釋，自第10孔吸出50ul棄去，第ll孔加50ul菌液(不加抗菌肽)作 為掃描對(duì)照，再向第12孔中加50ulMH肉湯，混勻后放置35'C時(shí)，在搖 床上以150r/min培養(yǎng)18h，于600nm波長處測定吸光值，用酶標(biāo)儀在600 nm下對(duì)平板進(jìn)行掃描,肽的MIC的確定按照比對(duì)照孔(l l孔)的渾濁程度低 50%以上的最小質(zhì)量濃度計(jì)算。
或采用薄層瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法每毫升含105細(xì)菌或孢子的菌液均勻 涂布于固體LB培養(yǎng)基表面，將經(jīng)過滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng) 基表面，滴加10ul的待測樣品溶液，于35。C培養(yǎng)18小時(shí)，觀察抑菌圈形 成與否，有抑菌圈形成的表明有抗菌活性。
五、 綿羊抗菌肽的溶血活性檢測
采兔血，將兔血與阿氏液，按l:l體積比混合置于離心管中，用轉(zhuǎn) 速為2000r/min離心，5min，用生理鹽水洗滌至上清液不再呈紅色為止，將上述洗滌好的紅細(xì)胞加生理鹽水稀釋成io濃度的懸浮液，上述稀釋好 的懸浮液與溶解于生理鹽水的不同濃度的樣品在38 "C時(shí)，保溫30min， 再離心SOOOr/min， 10min，上清液于540nm波長處測吸收值。陰性對(duì)照使 用生理鹽水，陽性對(duì)照使用TritonX-lOO，結(jié)果顯示綿羊生殖道抗菌肽具 有7.6%的溶血活性。
六、 綿羊抗菌肽純度鑒定；
分離純化得到純品采用HPLC和MALDI-TOF-MS鑒定，首先用HPLC
對(duì)分離純化得到的綿羊抗菌肽進(jìn)行純度鑒定，將綿羊抗菌肽溶解在濃度 為0.08-%三氟乙酸水溶液中，在4t:時(shí)以9000r/min，離心10min，取上清
上樣10ul上C18柱，用含有濃度為0,08%的三氟乙酸和含有濃度為0.08% 的乙腈按999:1的體積比構(gòu)成的洗脫液進(jìn)行洗脫，反復(fù)沖洗柱子，保證柱 子中的雜質(zhì)及吸附的蛋白質(zhì)被徹底的清洗，并以18mL/h進(jìn)行洗脫分離,得 到的抗菌肽純品，再利用MALDI-TOF-MS做迸一步鑒定，將純品稀釋成 10611101/1的水溶液，吸取10ul置于小塑料管中，加入15ul芥子酸混勻，取 lul此溶液滴在進(jìn)樣伸頭上，調(diào)整真空度為1.3x4Pa時(shí)，抽空除去溶劑， 使樣品與基質(zhì)混合液在探頭上形成均勻的結(jié)晶，在電壓為15kv，激光波 長為377nm時(shí)，在儀器上直接測定樣品的純度和分子量。最終結(jié)果顯 示，該抗菌肽是一種單鏈的多肽，其分子量是4820.47 Da，等電點(diǎn)為6. 96，呈酸性；
七、 保存；在零下2(TC的低溫下保存。 實(shí)施例2:
一、 樣品處理；
將20(^綿羊生殖道剪碎成0.5-1.20112的小塊，12000r/min離心5min， 零下1(TC凍融3次，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，按1:3體積比加入濃 度為5M乙酸在3t:攪拌浸提26h，然后將浸提混合物在高速冷凍離心機(jī)上 15000r/min，在3。C時(shí)，離心30min，收集上清透析，測定蛋白濃度，冷 凍干燥，零下20。C低溫保存，取lmg重新溶解在濃度為0.01。/c)乙酸中用 于檢測活性。
二、 抗菌肽初級(jí)分離；
用凝膠過濾色譜方法進(jìn)行初級(jí)分離在室溫下將53g交聯(lián)葡聚糖凝 膠G-50溶解于530 mL去離子水中澎脹26 h，采用真空泵脫除凝膠中氣體 后，進(jìn)行裝柱使其成小lcmx 100cm柱，先用0.25N氫氧化鈉清洗液沖 洗4h，再用濃度為0.05mol/L ， pH值為7乙酸銨洗脫液平衡柱子，將樣品重懸在上述洗脫液中，以12000r/min離心20min，取上清上樣，洗脫流 速20mL/h，收集目的峰，整個(gè)洗脫過程在1(TC環(huán)境中進(jìn)行，用吸光值 285nm檢測洗脫峰，收集后冷凍干燥，重新溶解在濃度為0.05%乙酸 中，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性。
三、 抗菌肽的精分離；
用反相高效液相色譜方法進(jìn)行精分離將凝膠過濾色譜有抗菌部分 進(jìn)行第二步分離純化，將樣品重懸在濃度為0.05%乙酸洗脫液中，在IO 。C以12000 r/min離心20min，取上清上樣于反相C18高效液相色譜柱，柱 長為0.5 cm X 100cm ， 0.1%，用含濃度為0.11%三氟乙酸的水和含濃度 為0.11%三氟乙酸的乙腈按990:10體積比構(gòu)成的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，吸 光值285nm檢測洗脫峰，收集冷凍干燥，測定蛋白濃度、檢測抗菌活 性。
四、 綿羊抗菌肽的抗菌活性檢測；
采用微量肉湯稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)菌株在滅菌MH肉湯瓊脂平板上過夜 培養(yǎng)，挑取菌落接種于滅菌試管的MH肉湯中，用搖床過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 200r/min、溫度為38。C，將培養(yǎng)后的菌液稀釋至2 X 105 CFU/ml，在96孔 無菌酶標(biāo)板上第一孔中加80ulMH液體培養(yǎng)基，第2-ll孔中加入50ul MH液體培養(yǎng)基，第一孔再加入20ul經(jīng)孔徑為0.01 u m濾膜過濾后的溶解 于濃度為0.05%乙酸的綿羊抗菌肽樣品，充分混勻后取50ul加入第2孔， 依次倍比稀釋，自第10孔吸出50ul棄去，第ll孔加50ul菌液(不加抗菌 肽)作為掃描對(duì)照，再向第12孔中加50ulMH肉湯，混勻后放置38t: 時(shí)，在搖床上以200r/min培養(yǎng)24h，于600nm波長處測定吸光值，用酶標(biāo) 儀在600 nm下對(duì)平板進(jìn)行掃描，肽的MIC的確定按照比對(duì)照孔(11孔)的渾 濁程度低50。/。以上的最小質(zhì)量濃度計(jì)算。
或采用薄層瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法每毫升含106細(xì)菌或孢子的菌液均勻 涂布于固體LB培養(yǎng)基表面，將經(jīng)過滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng) 基表面，滴加6ul的待測樣品溶液，于38'C培養(yǎng)20小時(shí)，觀察抑菌圈形成 與否，有抑菌圈形成的表明有抗菌活性，進(jìn)一步利用微量肉湯稀釋法進(jìn) 行最小抑菌濃度的測定。
五、 綿羊抗菌肽的溶血活性檢測
采兔血，將兔血與阿氏液，按l:l體積比混合置于離心管中，用轉(zhuǎn) 速為1500r/min離心，10min，生理鹽水洗滌至上清液不再呈紅色為止， 將上述洗漆好的紅細(xì)胞加生理鹽水稀釋成107濃度的懸浮液，上述稀釋好的懸浮液與溶解于生理鹽水的不同濃度的樣品在35"C時(shí)，保溫20min， 再離心1500r/min， 5min，上清液于540nm波長處測吸收值。陰性對(duì)照使 用生理鹽水，陽性對(duì)照使用TritonX-lOO，結(jié)果顯示綿羊生殖道抗菌肽具 有7.6%的溶血活性。
六、 綿羊抗菌肽純度鑒定；
分離純化得到純品采用HPLC和MALDI-TOF-MS鑒定，首先用HPLC
對(duì)分離純化得到的綿羊抗菌肽進(jìn)行純度鑒定，將綿羊抗菌肽溶解在濃度 為0.11%三氟乙酸水溶液中，在0。C時(shí)以12000 r/min，離心20min，取上 清上樣15ul上C18柱，用含有濃度為0.11%的三氟乙酸和含有濃度為0. 011%的乙腈按990:10的體積比構(gòu)成的洗脫液進(jìn)行洗脫，反復(fù)沖洗柱子， 保證柱子中的雜質(zhì)及吸附的蛋白質(zhì)被徹底的清洗，并以20mL/h進(jìn)行洗脫 分離，得到的抗菌肽純品，再利用MALDI-TOF-MS做進(jìn)一步鑒定，將純 品稀釋成104mol/l的水溶液，吸取15ul置于小塑料管中，加入10ul芥子酸 混勻，取lul此溶液滴在進(jìn)樣伸頭上，調(diào)整真空度為1.3xlOPa時(shí)，抽空
除去溶劑，使樣品與基質(zhì)混合液在探頭上形成均勻的結(jié)晶，在電壓為 30kv，激光波長為377nm時(shí)，在儀器上直接測定樣品的純度和分子量。 最終結(jié)果顯示，該抗菌肽是一種單鏈的多肽，其分子量是4820.47 Da， 等電點(diǎn)為6.96，呈酸性；
七、 保存；在零下8(TC的低溫下保存。
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權(quán)利要求
1、一種抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法，其特征在于由以下方法來實(shí)現(xiàn)；樣品處理將100-200g綿羊生殖道剪碎成0.5-1.2cm2的小塊，9000-12000r/min離心5-20min，零下10-20℃凍融3-4次，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，按1∶1.5-3體積比加入濃度為5-30％乙酸，在3-5℃攪拌浸提20-26h，然后在3-5℃時(shí)，將浸提混合物在高速冷凍離心機(jī)上用10000-15000r/min離心20-30min，收集上清透析，測定蛋白濃度，冷凍干燥，零下10-20℃低溫保存，取0.1-1mg重新溶解在濃度為0.01-0.05％乙酸中用于檢測活性；抗菌肽初級(jí)分離用凝膠過濾色譜方法進(jìn)行初級(jí)分離在室溫下將48-53.0g交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50溶解于480.0-530.0mL去離子水中澎脹20-26h，采用真空泵脫除凝膠中氣體后，進(jìn)行裝柱使其成φ1cm×15-100cm柱，先用0.15-0.25N氫氧化鈉清洗液沖洗2-4h，再用濃度為0.1-0.05mol/L，pH值為5-7的乙酸銨洗脫液平衡柱子，將樣品重懸在上述洗脫液中，以9000-12000r/min離心10-20min，取上清上樣，洗脫流速18-20mL/h，收集目的峰，整個(gè)洗脫過程在0-10℃環(huán)境中進(jìn)行，用吸光值200-300nm檢測洗脫峰，收集后冷凍干燥，重新溶解在濃度為0.01-0.05％乙酸中，測定蛋白濃度、檢測抗菌活性；抗菌肽的精分離用反相高效液相色譜方法進(jìn)行精分離將凝膠過濾色譜有抗菌部分進(jìn)行第二步分離純化，將樣品重懸在濃度為0.01-0.05％乙酸洗脫液中，在0-10℃以9000-12000r/min離心10-20min，取上清上樣于反相高效液相色譜柱，柱長為0.2-0.5cm×20-100cm，用含濃度為0.08-0.11％三氟乙酸的水和含濃度為0.08-0.11％三氟乙酸的乙腈按990～999∶1～10的體積比構(gòu)成的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，吸光值200-300nm檢測洗脫峰，收集冷凍干燥。
2、 如權(quán)利要求1所說的一種抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方 法，其特征在于上述的吸光值為215-285nm。
3、 如權(quán)利要求1或2所說的一種抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方 法，其特征在于上述的反相高效液相色譜柱，柱長為0.4-0.5cmX 20-50 cm o
全文摘要
一種抗白色念珠菌抗菌肽的生化制取方法，本發(fā)明利用生化的方法提供了一種綿羊抗菌肽的分離、提純方法，該抗菌肽是一種單鏈的多肽，其分子量是4820.47Da。等電點(diǎn)為6.96，呈酸性。本發(fā)明制取的抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高，耐受蛋白酶水解的能力，可有效抑制革蘭氏陽性、陰性和真菌的生長，且具有分離提純工藝快速、高效，回收率高等特點(diǎn)，可廣泛用于獸藥、防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C07K1/16GK101602789SQ20081007302
公開日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2008年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日
發(fā)明者庫朝鋒, 薄新文, 琛 陳 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院