專利名稱：：無(wú)水極性非質(zhì)子性肽制劑的制作方法無(wú)水極性非質(zhì)子性肽制劑無(wú)水極性非質(zhì)子性肽制劑交叉參考的相關(guān)申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.119(e)的規(guī)定，本申請(qǐng)要求1996年7月3日提交的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)60/022,699的優(yōu)先權(quán)，此處引用該申請(qǐng)作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及肽化合物的穩(wěn)定的無(wú)水極性非質(zhì)子性制劑，更特別是高濃度的肽化合物制劑。發(fā)明背景參考文獻(xiàn)本說(shuō)明書(shū)中相關(guān)部分括號(hào)([)中的數(shù)字引用的是下列文獻(xiàn)I.Zoladex(醋酸戈舍瑞林植入劑)，內(nèi)科醫(yī)生手冊(cè)(Physician'sDeskReference),第五十版，2858—2861(1996)。2-美國(guó)專利No.3,914,412，公開(kāi)于1975年10月21日。3.美國(guó)專利No.4,547,370,公開(kāi)于1985年10月15日。4.美國(guó)專利No.4,661,472，公開(kāi)于1987年4月28日。5.美國(guó)專利No.4,689,396,公開(kāi)于1987年8月25日。6.美國(guó)專利No.4,851,385,公開(kāi)于1989年7月25日。7.美國(guó)專利No.5,198,533，公開(kāi)于1993年3月30日。8.美國(guó)專利No.5，480，868，公開(kāi)于1996年1月2日。9.WO92/20711,公開(kāi)于1992年11月26日。10.WO95/00168，公開(kāi)于1995年1月5日。II.WO95/04540，公開(kāi)于1995年2月16日。12."戈那瑞林(Gonadorelin)和曲普瑞林(Triptorelin)在水溶液中的穩(wěn)定性"，V.J.Helm，B.W.Muller,藥物研究(PharmaceuticalResearch),7/12，1253-1256(1990)。13."Des-GlyW-NH2-LH-RH-乙酰胺(Fertirdin)在水溶液中的新的降解產(chǎn)物"，J.Okada，T.Seo，F(xiàn).Kasahara，K.Takeda，S.Kondo，藥物科學(xué)雜志(J.ofPharmaceuticalSciences),80/2，167-170(1991)。14."一種促性腺激素釋放激素(LHRH)激動(dòng)劑，組氨瑞林的溶液降解產(chǎn)物的鑒定"，A.R.Oyler，RE.Naldi，J.R.Lloyd,D.A.Graden，C.J.Shaw，M丄.Cotter，藥物科學(xué)雜志，(J.ofPharmaceuticalSciences),80/3，271-275(1991)。15."非腸道給藥的肽制劑天然促黃體激素釋放激素(LHRH)及其疏水性類似物在水溶液中的理化性質(zhì)"，M.F.Powell,L.M.Sanders,A.Rogerson，V.Si,藥物研究，8/101258-1263(1991)。16."LHRH類似物醋酸納發(fā)瑞林在水溶液中的降解"，D.M.Johnson,R.A.Pritchard,W.F.Taylor,D.Conky，G.Zuniga，K.G.McGreevy,國(guó)際藥學(xué)雜志(Intl.J.ofPharmaceutics)31，125-129(1986)。17."亮丙瑞林的經(jīng)皮吸收的促進(jìn)"M.Y.Fulu,D丄ee，G.S.Rao，藥物研究(PharmaceuticalResearch),9/121575-1576(1992)。18.Lutrepulse(靜脈內(nèi)注射用的醋酸戈那瑞林)，內(nèi)科醫(yī)生手冊(cè)，(Physician'sDeskReference),第五十版980—982(1996)。19.Factrel(皮下或靜脈內(nèi)注射用的鹽酸戈那瑞林)，內(nèi)科醫(yī)生手冊(cè)(Physician'sDeskReference),第五十版，2877-2878(1996)。20.Lupron(皮下注射用的醋酸亮丙瑞林)，內(nèi)科醫(yī)生手冊(cè)(Physician'sDeskReference),第五十版，2555-2556(1996)。21.Luprondepot(醋酸亮丙瑞林混懸劑)，內(nèi)科醫(yī)生手冊(cè)(Physician'sDeskReference),第五十版2556-2562(1996)。22."改善臨床性能的醋酸亮丙瑞林的藥學(xué)控制方法"H.Toguchi，國(guó)際醫(yī)學(xué)研究雜志(丄ofIntl.MedicalResearch),18,35-41(1990)。23."體外生物分析和液相色譜法評(píng)估促黃體激素釋放激素水溶液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性"，Y.F.Shi，R丄Sherins，D.Brightwell,丄F,Gallelli,D.C.Chatterji，藥物科學(xué)雜志(J.ofPharmaceuticalSciences),73/6,819-821(1984)。24."肽液晶在水溶液中動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性的呈反相關(guān)關(guān)系"，M.F.Powell，丄Fleitman，L.M.Sanders,V.C.Si，藥物研究，(PharmaceuticalResearch),11/91352-1354(1994)。25."通過(guò)圓二色譜測(cè)定的一種LHRH激動(dòng)劑醋酸亮丙瑞林的溶液行為"，M.E.Powers,A.Adejei，M.Y.Fulu，M.C.Manning,國(guó)際藥學(xué)雜志(Intl.J.ofPharmaceutics),10849-55(1994)。26."用生物可降解的聚合物制備醋酸亮丙瑞林的可貯存三個(gè)月的可注射微球體"，藥物研究(PharmaceuticalResearch),11/8，1143-1147(1994)。通過(guò)在相同程度上參考上述各個(gè)公開(kāi)文本、專利或?qū)＠暾?qǐng)所公開(kāi)的內(nèi)容全文引入作為參考，就象各個(gè)獨(dú)立的出版物，專利或?qū)＠暾?qǐng)的語(yǔ)言由參考文獻(xiàn)特別地和獨(dú)立地引入本文一樣。促黃體激素釋放激素(LHRH)，也已知為促性腺激素釋放激素(GnRH),是一個(gè)具有以下結(jié)構(gòu)的十肽pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2其由下丘腦分泌，與垂體上的受體結(jié)合，釋放促黃體生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)的分泌。LH和FSH刺激性腺合成類固醇激素。目前，已知大量的LHRH類似物，包括與用作激動(dòng)劑和拮抗劑的LHRH相關(guān)的肽。1-151已知的LHRH類似物可用于治療激素依賴性疾病，如前列腺癌、良性前列腺肥大、子宮內(nèi)膜異位、子宮肌瘤、子宮纖維瘤、青春期早熟、乳腺癌以及作為避孕藥。[8]對(duì)重復(fù)施用后可以減少有效受體的數(shù)量，從而抑制類固醇激素產(chǎn)生的LHRH相關(guān)化合物激動(dòng)劑以及長(zhǎng)期服用可持久抑制內(nèi)源性LHRH的LHRH相關(guān)的拮抗劑，優(yōu)選為持續(xù)釋放給藥。[8藥物，特別是肽類藥物的非腸道持續(xù)給藥具有很多的優(yōu)點(diǎn)?？芍踩胙b置用于多種藥物或其它有益物質(zhì)的持續(xù)遞送為本領(lǐng)域所周知。典型的裝置如美國(guó)專利No.5，034，229;5,057,318和5,110,596中所述。此處引入這些專利作為參考。一般地，肽類，包括LHRH相關(guān)化合物的口服生物利用度低[16-171。目前，市場(chǎng)上的LHRH、LHRH類似物和相關(guān)化合物的制劑都是用于非腸道注射的水溶液制劑，其含有相對(duì)較低濃度(0.05-5mg/ml)的LHRH相關(guān)化合物，也含有如甘露醇或乳糖等賦形劑。[18-20這些LHRH相關(guān)化合物制劑必須冷藏或在室溫下短期貯存。用于在體內(nèi)持續(xù)釋放1-3個(gè)月的LHRH相關(guān)化合物的可得埋植制劑包括一種制劑，其含有分散在D,L-乳酸和羥基乙酸共聚物基質(zhì)中制成的用于皮下注射圓柱體中的15。/。LHRH相關(guān)化合物[1和含有由LHRH相關(guān)化合物與明膠組成核外包一層D，L-乳酸和幾基乙酸共聚物外殼的微粒制劑。這些微粒懸浮在用作皮下或肌肉注射的稀釋劑中。21，26這些產(chǎn)物必須在室溫或更低的溫度下貯存。已知LHRH相關(guān)化合物的水溶液制劑具有化學(xué)和物理不穩(wěn)定性，且光照后易降解[12-16，22-251。已表明非常低濃度(25Pg/ml)水的緩沖液(10mM，離子強(qiáng)度0.15)制劑在不高于室溫(25X:)下儲(chǔ)存比較穩(wěn)定(t9o約五年)。[151因此，需要穩(wěn)定的肽制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了肽化合物在極性非質(zhì)子性溶劑中的溶液的穩(wěn)定的無(wú)水性制劑。特別的，肽化合物以至少約10%的濃度制成。這些穩(wěn)定的制劑可在較高的溫度下(如37X:)長(zhǎng)期貯存且特別用于長(zhǎng)時(shí)間遞送(如，1-12個(gè)月或更長(zhǎng))藥物的可植入遞送裝置中。一方面，本發(fā)明提供了肽化合物穩(wěn)定的無(wú)水性制劑，該制劑在至少一種極性非質(zhì)子性溶劑中含至少一種肽化合物。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中制劑含有至少約10V。(w/w)肽化合物。另一方面，本發(fā)明提供了制備一種肽化合物穩(wěn)定的無(wú)水性制劑的方法，該方法包括在至少一種極性非質(zhì)子性溶劑中溶解至少一種肽化合物。優(yōu)選的制劑含有至少約10。/。(w/w)肽化合物。另一方面，本發(fā)明提供了治療一種病癥的方法，即通過(guò)施用一種肽化合物以減輕患者病情，該方法包括向該患者施用在至少一種極性非質(zhì)子性溶劑中含有至少一種肽化合物的有效量的一種穩(wěn)定的無(wú)水性制劑。附圖簡(jiǎn)述圖1說(shuō)明用反相HPLC(RP-HPLC)測(cè)定的80t:兩個(gè)月后二甲亞砜(甲基亞砜或DMSO)中40。/o醋酸亮丙瑞林溶液(w/w)的穩(wěn)定性。圖2顯示與圖1同樣的樣品用體積排阻色譜(SEC)測(cè)定結(jié)果。此圖顯示存在極輕微的聚集現(xiàn)象，聚集物由二聚體和三聚體組成，沒(méi)有更高級(jí)的圖3表示40。/o醋酸亮丙瑞林的二甲亞砜(DMSO)溶液中亮丙瑞^失的阿侖尼烏斯(Airhenius)曲線。圖4說(shuō)明40%亮丙瑞林的DMSO溶液80t:六個(gè)月后的物理化學(xué)穩(wěn)定性。圖5說(shuō)明分別在37t:、50X:、65"C或80C六個(gè)月期間40%醋酸亮丙瑞林DMSO溶液中亮丙瑞林的損失。圖6說(shuō)明400%醋酸亮丙瑞林DMSO溶液在37"九個(gè)月期間的化學(xué)穩(wěn)定性。圖7說(shuō)明在80"亮丙瑞林DMSO溶液隨濃度升高而增加穩(wěn)定性。圖8說(shuō)明在80C40V。亮丙瑞林-DMSO制劑隨水分含量升高而降4氐穩(wěn)定性。圖9說(shuō)明圖8中所示的制劑中化學(xué)降解產(chǎn)物隨水分含量增加而增加。發(fā)明詳述本發(fā)明出人意料地發(fā)現(xiàn)在無(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑中溶解肽化合物形成穩(wěn)定的制劑。先前已知，肽化合物制劑都是含賦形劑如EDTA或抗壞血酸的稀的緩沖水溶液，其必須在低溫(4-25"C)下貯存，其可利用如^/堿催化的水解、去酰胺化、外消旋化和氧化等途徑形成降解產(chǎn)物。相反，本權(quán)利要求的制劑在高溫(如371C到80C)和高濃度(如至少約10%)下能使肽化合物穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)的肽和蛋白質(zhì)制劑是由稀的水溶液組成。一般通過(guò)改變以下的一種或幾種條件pH、緩沖液類型、離子強(qiáng)度、賦形劑(EDTA,抗壞血酸等)而使藥物穩(wěn)定。對(duì)于這些制劑，不能完全穩(wěn)定需要水的降解途徑(水解、去酰胺化作用、外消旋化)。相反，在本發(fā)明中，肽制成于無(wú)水溶液，如二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)溶液中的肽，其化學(xué)和物理穩(wěn)定性都比水溶液制劑高。DMSO和DMF均是極性非質(zhì)子性溶劑。因其缺乏給降解反應(yīng)提供質(zhì)子的能力，所以期望非質(zhì)子性溶劑能降低降解速率。相反地，極性比水強(qiáng)(如，水的偶極矩為1.85，DMF為3.82，DMSO為3.96)的溶劑由于能輔助穩(wěn)定限速步驟和增加降解速率，因而期望能增加降解速率。然而，我們發(fā)現(xiàn)，極性非質(zhì)子性溶劑的總體效果一般地是穩(wěn)定肽溶液。本發(fā)明包含用無(wú)水非質(zhì)子性溶劑如DMSO或DMF對(duì)抗物理和化學(xué)降解以穩(wěn)定肽制劑。此發(fā)現(xiàn)包含利用DMSO或DMF提高在廣泛的制劑條件下(包括高濃度和高溫)肽的穩(wěn)定性，使否則沒(méi)有其它可行辦法的在長(zhǎng)期可植入裝置中的肽的遞送成為可能。A.定義如此處所用下列術(shù)語(yǔ)的意思如下"化學(xué)穩(wěn)定性"一詞是指通過(guò)如氧化或水解的化學(xué)途徑生產(chǎn)，形成可接受的百分比例的降解產(chǎn)物。特別的，一種制劑如果在37x:經(jīng)過(guò)兩個(gè)月后形成不超過(guò)約20%的降解產(chǎn)物，可視為化學(xué)穩(wěn)定。"物理穩(wěn)定性"一詞指形成可接受百分比的聚集體(如二聚體、三聚體和更大的聚集體)。特別的，一種制劑如果在371C經(jīng)過(guò)兩個(gè)月后形成不超過(guò)約15%的聚集體可視為物理穩(wěn)定。"穩(wěn)定的制劑"一詞指在37x:(或相同條件在高溫條件下)兩個(gè)月后至少保留有約65%化學(xué)和物理穩(wěn)定的肽化合物。特別優(yōu)選的制劑指在這些條件下至少保留有約80%化學(xué)和物理穩(wěn)定的肽。特別優(yōu)選的穩(wěn)定制劑指經(jīng)過(guò)輻射滅菌(如，Y射線、P射線或電子束)后沒(méi)有顯示降解的制劑。"肽"和/或"肽化合物"一詞指多至約五十個(gè)氨基酸殘基通過(guò)酰胺鍵(CONH)連接在一起的聚合物。該詞也包括它們的類似物、衍生物、激動(dòng)劑、拮抗劑和上述任一種的藥學(xué)可接受的鹽，該詞還包括在D或L構(gòu)型和/或作為其結(jié)構(gòu)一部分的擬胨(peptomimetic)單位中含有D型氨基酸、修飾過(guò)的、衍生的或非天然氨基酸。"LHRH相關(guān)化合物"一詞指促黃體生成激素釋放激素(LHRH)和其類似物及其藥學(xué)可接受的鹽。八肽、九肽和十肽LHRH激動(dòng)劑和拮抗劑和天然LHRH—樣均包括在LHRH相關(guān)化合物一詞中。特別優(yōu)選的LHRH相關(guān)化合物包括LHRH、亮丙瑞林、戈舍瑞林、納發(fā)瑞林及其它已知的活性激動(dòng)劑和拮抗劑。[l-21J"高濃度"一詞指至少約10y。(wAv)和多至特定肽的最大溶解度。"賦形劑"一詞指制劑中一種相對(duì)不活潑的物質(zhì)，其作為一種稀釋劑或載體或者使制劑成型或具有一定密度而加入。賦形劑不同于制劑中用于溶解藥物的溶劑如乙醇和用于增加藥物溶解度的非離子型表面活性劑如吐溫-20以及用來(lái)阻止和抑制微生物生長(zhǎng)的防腐劑如苯甲醇或?qū)αu苯甲酸甲酯或?qū)τ罕郊姿岜ァ?極性非質(zhì)子性溶劑"一詞指一種不含酸性氳以及不能作為氫鍵供體的極性溶劑。極性非質(zhì)子性溶劑的例子為二甲亞鞏(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)，六甲基蜂酰三胺(HMPT)和N-甲基吡咯烷酮。"無(wú)水質(zhì)子性溶劑"一詞指一種含有連接在氧或氮上的氫以使形成氫鍵或提供一個(gè)質(zhì)子的非極性溶劑。非極性質(zhì)子性溶劑的例子有聚乙二醇類(PEG),丙二醇(PG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，甲氧基丙二醇(MPEG),甘油和糖糠搭(glycofurol)。B.制劑的制備本發(fā)明是關(guān)于極性非質(zhì)子性溶劑中的肽化合物的無(wú)水制劑，它能在較高的溫度下穩(wěn)定更長(zhǎng)的期限。標(biāo)準(zhǔn)的稀的肽和蛋白質(zhì)的水溶液制劑需調(diào)整緩沖液類型、離子強(qiáng)度、pH和賦形劑(如EDTA和抗壞血酸)以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。相反，本發(fā)明所要求的制劑是通過(guò)無(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑的使用實(shí)現(xiàn)肽化合物的穩(wěn)定。特別的，本發(fā)明的制劑提供了高濃度(至少約10%,w/w)化合物的穩(wěn)定性。于治療某種疾病或其它病理狀況的肽。它們包括但不局限于以下這些肽促腎上腺皮質(zhì)激素、血管緊張肽i和n、心房肽、鈴蟾肽、緩激肽、降鈣素、小腦肽、強(qiáng)啡肽A、a和P內(nèi)啡肽、內(nèi)皮素、腦啡肽、表皮生長(zhǎng)因子、FertireHn、卵泡促性腺激素釋放肽、galanin、胰高血糖素、戈那瑞林、促性腺激素、戈舍瑞林、生長(zhǎng)激素釋放肽、組氨瑞林、胰島素、亮丙瑞林、LHRH、促胃動(dòng)素、納發(fā)瑞林、神經(jīng)降壓素、催產(chǎn)素、促生長(zhǎng)抑制素、P物質(zhì)、腫瘤壞死因子、色氨瑞林和血管升壓素。以上物質(zhì)的類似物、衍生物、拮抗劑、激動(dòng)劑和上述的藥學(xué)可接受的鹽類也可用于此。本發(fā)明的制劑和方法中使用的肽和肽化合物可采用鹽的形式，優(yōu)選的是一種藥學(xué)可接受的鹽?？捎玫柠}類包括與無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)喊或有機(jī)堿所形成的鹽，其為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所周知。優(yōu)選的是醋酸鹽。在本發(fā)明中優(yōu)選的采用易溶解在無(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑中的肽及肽化合物。根據(jù)化合物的溶解度，即化合物溶在特定無(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑中至少能達(dá)到一種可接受的量，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可方便地決定采用何種化合物。優(yōu)選的溶解度至少約10%(w/w)。特別優(yōu)選的肽化合物是LHRH相關(guān)化合物，包括亮丙瑞林和醋酸亮丙瑞林。肽的比例可依據(jù)所用化合物、所治療的狀況、化合物的溶解度、預(yù)期的劑量及用藥持續(xù)時(shí)間而變化。(參見(jiàn)如臨床藥理學(xué)基礎(chǔ)(ThePharmacologicalBazisofTherapeutics)Gilman等，第七版(1985)和藥物^(PharmaceuticalSciences)Remington，第十八版(1990),此處引入這些公開(kāi)作為參考)。高濃度肽制劑的濃度范圍從至少約10。/。(w/w)到該化合物的最大溶解度。優(yōu)選的范圍是從約20。/o到約6()o/o(w/w)。目前優(yōu)選的范圍從約30%到約50%(w/w),最優(yōu)選的范圍是從約35%到約45%(w/w)。出人意料地發(fā)現(xiàn)，增加溶解于無(wú)水極性質(zhì)子性溶劑中的肽濃度能增加肽制劑的穩(wěn)定性。比如，如圖7中可見(jiàn)，當(dāng)5%、10%、20%和40%的亮丙瑞林的DMSO溶液在80X:貯存8周，定期取樣，分析測(cè)定亮丙瑞林的殘余百分比例，發(fā)現(xiàn)含較高濃度亮丙瑞林的制劑比較低濃度亮丙瑞林制劑更穩(wěn)定。一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的穩(wěn)定的制劑優(yōu)選的通過(guò)簡(jiǎn)單溶解所需要的治療有效劑量的肽化合物于所選擇的無(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑中而制備。優(yōu)選的極性非質(zhì)子性溶劑包括DMSO和DMF。如圖8所示，增加本發(fā)明涉及的肽制劑中的水含量增加了肽的降解。降解的增加似乎主要是增加了化學(xué)降解產(chǎn)物，而聚集物的量相對(duì)保持穩(wěn)定(圖9)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)諸如PEG、PG和PVP等無(wú)水的非質(zhì)子性溶劑也可以任選地加入到所要求的制劑中。C.方法學(xué)我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的無(wú)水肽化合物制劑可通過(guò)將肽化合物溶于無(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑而制成。通過(guò)將其經(jīng)過(guò)高溫下加速老化處理及測(cè)定制劑的化學(xué)和物理穩(wěn)定性我們考察了這些肽化合物制劑，特別是LHRH相關(guān)化合物亮丙瑞林的穩(wěn)定性。這些研究結(jié)果證明(參見(jiàn)如表n和圖1、2、4及6)這些制劑在37C接近或一年以上的貯存期內(nèi)是穩(wěn)定的。我們也考察了如上所述制備的肽化合物制劑經(jīng)過(guò)2.5兆拉德Y-射線照射后的穩(wěn)定性。結(jié)果如表m所示，表明這些制劑經(jīng)這樣的照射后仍然保持化學(xué)和物理穩(wěn)定。如表I所示，我們考察了多種肽制劑，特別是亮丙瑞林、戈舍瑞林、LHRH、血管緊張肽I、緩激肽、降鈣素、腦啡肽、胰島素、神經(jīng)降壓肽、P物質(zhì)、胰蛋白酶原和血管升壓素的穩(wěn)定性，這是通過(guò)將它們?nèi)芙?或試圖溶解)在無(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑DMSO中，然后進(jìn)行高溫加速老化處理進(jìn)行的。測(cè)定制劑的穩(wěn)定性。結(jié)果列于表1，371C的半衰期，假定Ea=22.2kcal/mol。大部分被考察的肽可溶于DMSO中，在考察的條件下保持穩(wěn)定。特定的肽在特定的無(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑中的溶解度和所得溶液的穩(wěn)定性用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法很容易測(cè)定。表I:配制在DMSO溶中的肽的穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>40%肽的DMSO制劑在37t:、50"C、65C和80匸^:存六個(gè)月，通過(guò)測(cè)定其肽從溶液中總損失情況呈現(xiàn)非線性阿侖尼烏斯動(dòng)力學(xué)關(guān)系，顯示了這些制劑在高溫下的穩(wěn)定性。分析在37t:收集的數(shù)據(jù)得到t卯為14.4個(gè)月，說(shuō)明在37C穩(wěn)定性仍然非常好。溫度似乎影響本發(fā)明涉及的制劑的降解速率和降解產(chǎn)物的比例。研究亮丙瑞林DMSO制劑表明在651C和80"C下氧化似乎是主要的化學(xué)降解途徑。而在37t:和50x:時(shí)水解和異構(gòu)化似乎是這些制劑的主要降解途徑。我們也無(wú)意中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的特定肽制劑是抑菌的(即抑制細(xì)菌生長(zhǎng))、殺菌的(即引起細(xì)菌死亡)和殺芽孢的(即殺死芽孢)。特別是，50-400mg/ml亮丙瑞林制劑呈現(xiàn)抑菌、殺菌和殺芽孢活性。樣品的穩(wěn)定性不受細(xì)菌侵蝕的影響，說(shuō)明從死亡的和被裂解的細(xì)菌中釋放的酶對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性不造成負(fù)面影響。這證明這些制劑不助長(zhǎng)酶的活性。已知某些肽如降釣素和亮丙瑞林當(dāng)配制在水溶液中是物理不穩(wěn)定的，易聚集、膠凝化和纖維化。改善物理穩(wěn)定性可增加生物利用度，減少致敏作用和免疫反應(yīng)，能便于進(jìn)行非腸道給藥，包括通過(guò)可植入藥物遞送裝置給藥。我們意外地發(fā)現(xiàn)特定的肽如亮丙瑞林、戈舍瑞林和降鈣素制成本發(fā)明的無(wú)水極性非質(zhì)子性溶液制劑不發(fā)生膠凝。甚至在37X:經(jīng)過(guò)12個(gè)月也不發(fā)生膠凝。這顯然是因?yàn)闊o(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑使肽形成無(wú)規(guī)則巻曲/ot-螺旋構(gòu)象而不折疊成P-折疊結(jié)構(gòu)，因此不膠凝。所以，這些溶劑具有抗膠凝劑的效果。本發(fā)明的一個(gè)主要方面是極性非質(zhì)子性溶劑中含肽化合物的無(wú)水極性溶液在高溫下長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)都是化學(xué)和物理穩(wěn)定的。這種制劑甚至在采用高濃度時(shí)也穩(wěn)定。因此，這些制劑有助于在室溫或高于室溫條件下長(zhǎng)期運(yùn)輸和貯存。它們也適合于用于可植入遞送裝置。本發(fā)明實(shí)施例的公開(kāi)下面的方法用于完成下列實(shí)施例中的研究。1.醋酸亮丙瑞林溶液的制備醋酸亮丙瑞林(如從Mallinckrodt，St.Louis,Missouri獲得)稱重，然后以適當(dāng)?shù)臐舛扔脭嚢杌螂x心的方法將其溶于載體(DMSO,DMF，DMSO/PEG，DMSO/PG，或DMSO/PVP)中。干燥DMSO—詞指DMSO制劑在低濕度環(huán)境下制備(即，干的氮?dú)猸h(huán)境)。除非另外說(shuō)明，亮丙瑞林游離堿含量是根據(jù)37t:游離堿的潛在值的分析標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算的。除非另外指出，這是指的40%的醋酸亮丙瑞林。2.儲(chǔ)藥室的制備可植入藥物遞送裝置(見(jiàn)如美國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?8/595,761的公開(kāi)，此處引入作為參考。)的儲(chǔ)藥室用適當(dāng)?shù)拇姿崃帘鹆秩芤撼錆M。將亮丙瑞林制劑注入用聚合物塞子堵住每一頭的鈦或聚合物儲(chǔ)液室中。然后將儲(chǔ)液室密封在多層鋁箔袋中放入穩(wěn)定性測(cè)試烘箱中。應(yīng)該說(shuō)明的是在這些設(shè)備的儲(chǔ)藥室中的制劑是完全與外界環(huán)境隔絕的。3.反相HPLC(RP-HPLC)全部穩(wěn)定性樣品均使用帶有冷藏自動(dòng)取樣器的梯度洗脫反相HPLC分析亮丙瑞林的濃度和峰面積百分?jǐn)?shù)。分析在4t:條件下進(jìn)行以減少樣品的降解。所用色諳條件如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4到6個(gè)不同濃度水平的亮丙瑞林標(biāo)準(zhǔn)(水中)，通常為0.1-1.2mg/ml之間，隨穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣品一同進(jìn)樣。樣品分析過(guò)程中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，兩次校正之間分析樣品不超過(guò)40個(gè)。對(duì)空柱體積至泳動(dòng)45分鐘之間所有的峰的峰面積積分。作出標(biāo)準(zhǔn)亮丙瑞林溶液的積分峰面積與濃度的函數(shù)圖。根據(jù)該線性回歸曲線計(jì)算亮丙瑞林的濃度以測(cè)定樣品穩(wěn)定性。記錄亮丙瑞林峰的峰面積百分?jǐn)?shù)和在亮丙瑞林之前洗脫下來(lái)的所有峰(標(biāo)為"其它")的峰面積百分?jǐn)?shù)之和以及在亮丙瑞林之后洗脫下來(lái)的所有峰(標(biāo)為"聚集物")的峰面積百分?jǐn)?shù)之和，然后作出相對(duì)于各個(gè)樣品時(shí)間點(diǎn)的函數(shù)圖。4.體積排阻色譜(SEC)用無(wú)梯度溶液SEC分析所選穩(wěn)定性樣品的峰面積百分?jǐn)?shù)和分子量，使用帶冷藏自動(dòng)取樣器(4x:)。所用色譜條件列表如下SEC色譜條件說(shuō)明參數(shù)柱PharmaciaPeptide,HH10/30，10x300mm流速0.5mlmiiT1進(jìn)樣量20H1檢測(cè)波長(zhǎng)210nm亮丙瑞林保留時(shí)間約25分鐘流動(dòng)相l(xiāng)OOmM磷酸銨，pH2.0，200mM氯化鈉，30%乙腈測(cè)定分子量需用到體積排阻柱的空柱體積和總體積。用BioRad的高分子量標(biāo)準(zhǔn)和0.1%的丙酮分別測(cè)定空柱體積和總體積。記錄BioRad分子量標(biāo)準(zhǔn)的第一個(gè)峰和丙酮峰的保留時(shí)間，用下面的公式換算成體積單位因?yàn)檫@些量對(duì)于特定的SEC柱和HPLC裝置恒定，所以更換SEC柱或改變HPLC裝置要重新測(cè)定空柱體積和總體積。分子量標(biāo)準(zhǔn)的分析進(jìn)行之后進(jìn)行穩(wěn)定性樣品分析。標(biāo)準(zhǔn)混合物約含有大約0.2mg/ml的下列肽法氏嚢肽(MW=449)，WLFR肽(MW=619)，血管緊張肽(MW=1181),GRF(MW-5108)和細(xì)胞色素C(MW-12394)。選擇這些標(biāo)準(zhǔn)是因?yàn)樗鼈兏采w了亮丙瑞林的分子量且都具有與亮丙瑞林相近的堿性等電點(diǎn)pl(9.8-11.0)。記錄所有峰的面積百分?jǐn)?shù)。用下面公式計(jì)算各分離物質(zhì)的分子量。Vs-流速(ml/min)X樣品峰保留時(shí)間(分鐘)V^流速(ml/min)X空柱體積峰的保留時(shí)間(分鐘)V產(chǎn)流速(ml/min)X總體積峰的保留時(shí)間(分鐘)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中V尸標(biāo)準(zhǔn)或樣品體積V。-空柱體積V產(chǎn)總體積計(jì)算每個(gè)肽標(biāo)準(zhǔn)峰的Vs。然后用先前測(cè)出的Vt和V。值計(jì)算各肽的Kd。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣品各峰的分子量用以LogMW對(duì)K/所作的線性回歸直線確定。另外，記錄穩(wěn)定性樣品的峰面積百分?jǐn)?shù)。5.儀器和材料用于RP-HPLC和SEC的儀器和材料如下WatersMillenniumHPLC裝置包括717自動(dòng)取樣器，626泵，6000S控制器，900二極管陣列檢測(cè)器和414折光指數(shù)檢測(cè)器(WatersChromatography,Milford，MA)。HPLC小瓶，48孔和96孔(WatersChromatography,Miford，MA)。HaiSUC18，120A,5nm4.6x250mmHPLC柱(HigginsAnalytial，MountainView,CA)PharmaciaPeptide,HR10/30SEC柱(PharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)下面的實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但并不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1醋酸亮丙瑞林制劑的加速穩(wěn)定性研究如上述制備40V。(wAv)溶于載體中的醋酸亮丙瑞林制劑(相當(dāng)于約37%亮丙瑞林游離堿)并如上述將其注入可植入藥物遞送裝置的儲(chǔ)藥室。全部的儲(chǔ)藥室均用鈦制成。通過(guò)將已注滿的儲(chǔ)藥室放入溫箱(PredsionScientific或Thelco)中，在高溫(80t:)下放置七天進(jìn)行加速老化。這相當(dāng)于在37t:放置約1.5年或室溫(25t:)下放置約4年,，樣品如上述用RP-HPLC和SEC分析，測(cè)定已老化的制劑的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。結(jié)果列于表n,說(shuō)明這些制劑能保持LHRH相關(guān)化合物亮丙瑞林的穩(wěn)定性。在每個(gè)制劑中，至少保留了65%亮丙瑞林。表n在80"C經(jīng)過(guò)七天鈦儲(chǔ)藥室中醋酸亮丙瑞林極性非質(zhì)子性制劑的穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例2經(jīng)輻照的醋酸亮丙瑞林制劑的穩(wěn)定性研究如上述制備的40Vo(w/w)醋酸亮丙瑞林DMSO制劑，并如上述將其注入藥物遞送裝置的儲(chǔ)藥室。全部?jī)?chǔ)藥室均用鈦制成。已充滿的儲(chǔ)藥室送到Sterigenics(Tusin，California),在那兒的Sterigenics'TusinMainCell，用鈷60,三級(jí)"搬運(yùn)箱"照射，使它們受到2.5兆拉德Y射線的照射。在表ffl中，標(biāo)有"冷"的樣品是保存在干水上進(jìn)行運(yùn)輸和照射的。然后將這些樣品按實(shí)施例1的方法加速老化。分別在第零天和第七天取樣，用如上述的RP-HPLC和SEC分析，測(cè)定經(jīng)輻照的制劑的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。結(jié)果列于表ni，說(shuō)明這些醋酸亮丙瑞林制劑照射后穩(wěn)定。在每個(gè)制劑中至少保留有65%亮丙瑞林，且形成聚集的水平低。表ffl40。/。(w/w)醋酸亮丙瑞林極性非質(zhì)子性制劑在鈦儲(chǔ)藥室中經(jīng)過(guò)2.5兆拉德Y-射線照射后的穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例3醋酸亮丙瑞林制劑的加速長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究制備40o/。(w/w)醋酸亮丙瑞林DMSO溶液，注入儲(chǔ)藥室，在80"C下貯存兩個(gè)月，按上文所述方法分析。結(jié)果見(jiàn)圖l(RP-HPLC)和圖2(SEC)，表明可回收到81.1%亮丙瑞林，只有14.6%的化學(xué)降解和5.1%的物理聚集。制備醋酸亮丙瑞林溶液，灌裝，在80n貯存六個(gè)月，按上文的方法分析.圖4是亮丙瑞林及其物理和化學(xué)降解產(chǎn)物經(jīng)六個(gè)月期間后的回收?qǐng)D，表明我們可解釋起始的全部肽物質(zhì)和這些肽制劑在80C表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。這三個(gè)部分的總和仍保持質(zhì)量平衡。圖5是這些數(shù)據(jù)的自然對(duì)數(shù)，表明這些制劑在整個(gè)測(cè)試溫度范圍內(nèi)呈線性動(dòng)力學(xué)關(guān)系。如上述制備和分析的40%醋酸亮丙瑞林溶液的化學(xué)穩(wěn)定性示于圖6。在37"C九個(gè)月后，出現(xiàn)90%以上(93.5%)的亮丙瑞林，形成了少于5%(2.9%)的化學(xué)降解產(chǎn)物(圖中標(biāo)為"較早")和少于5%(2.3%)物理降解產(chǎn)物(圖中標(biāo)為"晚期"，且基于反相HPLC色諳曲線，與SEC色譜行為符合)。制備40。/。醋酸亮丙瑞林(w/w)DMSO溶液，灌^v儲(chǔ)藥室中，分別在37X:、50X:、65C或80"C下貯存，如上述用RP-HPLC分析。結(jié)果按物理藥學(xué)藥物學(xué)中的物理化學(xué)原理，第三版，Martin等，第14章(1983)中所述方法計(jì)算，表明亮丙瑞林從DMSO制劑中的損失是非線性的。數(shù)據(jù)如下所示，阿侖尼烏斯曲線見(jiàn)圖3。因?yàn)镈MSO制劑貯存于80t:的阿侖尼烏斯曲線顯示亮丙瑞林的損失是非線性的，在37x:收集的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)用于計(jì)算在37x:這些制劑的t90為14.4個(gè)月》<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>Ea-非線性實(shí)施例4在DMSO/水中的醋酸亮丙瑞林制劑的穩(wěn)定性研究如上述制備在DMSO、DMSO/水(95:5，90:10,70:30，50:50和30:70)和水溶液中的40。/o醋酸亮丙瑞林(w/w)制劑，在80"粹育7天。在第零天和第七天進(jìn)行傅立葉變換紅外光譜(FTIR)分析。結(jié)果顯示，所有考察的制劑經(jīng)加速老化后亮丙瑞林的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化非常小。一般來(lái)說(shuō)，在DMSO制劑中肽的結(jié)構(gòu)主要是無(wú)規(guī)則巻曲或ct-螺旋，而在水溶液制劑中肽的結(jié)構(gòu)主要是P-折疊。對(duì)于遵照本發(fā)明的精神的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，可對(duì)本發(fā)明的多種實(shí)施方案的上述模式進(jìn)行修飾是顯而易見(jiàn)的。上述這些實(shí)施例只是為了本發(fā)明的舉例，而不是限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍由下迷權(quán)利要求限定。權(quán)利要求1.一種肽化合物的穩(wěn)定的無(wú)水制劑，其包括a)至少一種肽化合物；和b)至少一種極性非質(zhì)子性溶劑。2.權(quán)利要求1的制劑，其包含至少約10。/。(w/w)的肽化合物。3.權(quán)利要求l的制劑，其包含至少約30。/o(w/w)的肽化合物。4.權(quán)利要求l的制劑，其中該肽化合物是一種LHRH相關(guān)化合物。5.權(quán)利要求4的制劑，其中該肽化合物選自亮丙瑞林、LHRH、納發(fā)瑞林和戈舍瑞林。6.權(quán)利要求l的制劑，其在80t至少穩(wěn)定兩個(gè)月。7.權(quán)利要求l的制劑，其在37t:至少穩(wěn)定三個(gè)月。8.權(quán)利要求l的制劑，其在37t:至少穩(wěn)定一年。9.權(quán)利要求l的制劑，其適合用于一種可植入藥物遞送裝置。10.權(quán)利要求l的制劑，其還包含一種無(wú)水質(zhì)子性溶劑。11.權(quán)利要求1的制劑，其中該極性非質(zhì)子性溶劑選自DMSO和DMF。12.權(quán)利要求l的制劑，其中該極性非質(zhì)子性溶劑具有抗膠凝劑作用。13.權(quán)利要求1的制劑，其基本上由溶于DMSO中的約30%到約50%0￥/\￥)的LHRH相關(guān)化合物醋酸亮丙瑞林組成。14.權(quán)利要求1的制劑，其基本上由亮丙瑞林和DMSO按370mg亮丙瑞林溶于lmlDMSO中的比例組成。15.權(quán)利要求l的制劑，其經(jīng)輻照后穩(wěn)定。16.制備權(quán)利要求1的穩(wěn)定的無(wú)水制劑的一種方法，其包括在至少一種極性非質(zhì)子性溶劑中溶解至少一種肽化合物。17.權(quán)利要求16的方法，其中至少溶解了約10。/。(w/w)肽化合物。18.權(quán)利要求16的方法，其中至少溶解了約30。/。(w/w)肽化合物。19.權(quán)利要求16的方法，其中該肽化合物是一種LHRH相關(guān)化合物。20.權(quán)利要求19的方法，其中該肽化合物選自亮丙瑞林、LHRH、納發(fā)瑞林和戈舍瑞林。21.權(quán)利要求16的方法，其還包含加入一種無(wú)水質(zhì)子性溶劑的步驟。22.權(quán)利要求16的方法，其中約30%到約50%(\￥細(xì))的LHRH相關(guān)化合物醋酸亮丙瑞林溶于DMSO中。23.權(quán)利要求16的方法，其中370mg亮丙瑞林溶于lmlDMSO中。24.通過(guò)施用一種肽化合物可以減輕病情的治療病癥的一種方法，其包括給該患者施用有效劑量的權(quán)利要求1的制劑。25.權(quán)利要求24的方法，其中給藥是非腸道給藥。26.權(quán)利要求24的方法，其中給藥是長(zhǎng)期連續(xù)給藥。27.權(quán)利要求26的方法，其中給藥是使用可植入藥物遞送裝置來(lái)完成的。28.權(quán)利要求24的方法，其中所述病癥是前列腺癌且所述的肽化合物是亮丙瑞林。29.權(quán)利要求28的方法，其中每天至少給藥約80毫克亮丙瑞林。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的每天給藥持續(xù)的時(shí)間選自3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的每天給藥的時(shí)間是通過(guò)一種可植入藥物遞送裝置來(lái)完成連續(xù)給藥的。32.權(quán)利要求24的方法，其中所述的病癥是前列腺癌且所述的肽化合物是一種LHRH拮抗劑。全文摘要本發(fā)明涉及肽化合物的穩(wěn)定的無(wú)水極性非質(zhì)子性制劑。這些穩(wěn)定的制劑包含無(wú)水極性非質(zhì)子性溶劑中的肽化合物。它們能在高溫下長(zhǎng)期貯存，特別適用于長(zhǎng)時(shí)期遞送藥物的可植入遞送裝置。文檔編號(hào)C07K7/23GK101239179SQ200810087659公開(kāi)日2008年8月13日申請(qǐng)日期1997年7月1日優(yōu)先權(quán)日1996年7月3日發(fā)明者C·L·斯蒂威森,S·J·普里斯特雷斯基申請(qǐng)人:阿爾薩公司