專利名稱：：在植物中生產(chǎn)含有保護(hù)性蛋白質(zhì)的免疫球蛋白的方法和應(yīng)用的制作方法在植物中生產(chǎn)含有保護(hù)性蛋白質(zhì)的免疫球蛋白的方法和應(yīng)用本申請(qǐng)是以下申請(qǐng)的分案申請(qǐng)申請(qǐng)日1995年12月27日；申請(qǐng)?zhí)?5197699.0(PCT/US95/16889);發(fā)明名稱"在植物中生產(chǎn)含有保護(hù)性蛋白質(zhì)的免疫球蛋白的方法和應(yīng)用"。本發(fā)明為一九九四年十二月三十日美國專利申請(qǐng)的延續(xù)-檔案編號(hào)為08/367，395。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明系關(guān)于含有保護(hù)性蛋白質(zhì)的免疫球蛋白在植物中的表達(dá)與表達(dá)該免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，同時(shí)包括該免疫球蛋白的治療用途。發(fā)明背景單克隆抗體用于治療疾病具有極大潛力，與常規(guī)藥物相比，單克隆抗體治療具有極大優(yōu)勢。如獨(dú)特的選擇性，多效功能，簡便的分子操作，放射性同位素標(biāo)記與其它類型的交聯(lián)等。大量的耙抗原已用于刺激特異性單克隆抗體的產(chǎn)生，見，"TherapeuticMonoclonalAntibodies"C.A.K.Borrebaeck和丄W丄arrick主編Stockton出版社，NewYork(1990)。"ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies"M.Rosenberg和G.P.Moore主編，Springer-Verlag,Berlin(1994)。單克隆抗體治療應(yīng)用之一是被動(dòng)免疫治療，將外源性免疫球蛋白通過注射和消化吸收直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)。為治療成功，必須給予動(dòng)物適量的免疫球蛋白，因?yàn)楸粍?dòng)免疫并不依賴被治療動(dòng)物本身的免疫反應(yīng)。所用免疫球蛋白必須對(duì)致病原及分子具有特異性，以期達(dá)到治療效果.與正常免疫反應(yīng)相比，被動(dòng)免疫反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)之一是可以加速抗體與抗原的接觸，被動(dòng)免疫也可用于預(yù)防疾病的產(chǎn)生及防止感染。被動(dòng)免疫的主要用途是治療細(xì)菌感染。近來對(duì)抗菌素具有抗性的細(xì)菌的產(chǎn)生使被動(dòng)免疫治療細(xì)菌感染更具發(fā)展前景?？咕刂委焼我徊≡鶗?huì)影響大量正常菌群，此乃不希望發(fā)生的副作用。另一用途為用特異性免疫球蛋白抑制菌群中特異致病菌的功能。因此可用某種特異性的純化的免疫球蛋白去提供防止病原菌侵入的被動(dòng)屏障。除此之外，用于被動(dòng)免疫的免疫球蛋白必須達(dá)到某種要求，如口腔服用的免疫球蛋白，必須l.在極苛刻的環(huán)境下，如胃腸道環(huán)境仍然保持其功能，2.免疫球蛋白必須對(duì)蛋白酶的作用具有抗性，以免在對(duì)抗靶抗原之前被降解。某些類型的鈿胞，如上皮細(xì)胞，肝細(xì)胞，能夠包裝免疫球蛋白分子使其特異性地在嚴(yán)苛環(huán)境中不失功能。這些免疫球蛋白為分泌型免疫球蛋白(slg)，包括分泌型IgA(SIgA)和分泌型IgM(SIgM)。內(nèi)源性分泌型免疫球蛋白具有的保護(hù)作用已被證明。分泌型免疫球蛋白抗細(xì)菌感染的機(jī)制包括直接殺傷，凝集，表面接觸與侵襲的抑制，使酶和毒素失活，調(diào)理，激活補(bǔ)體等。但不僅限于上述幾種。內(nèi)源.性的SIgA暴露于非常嚴(yán)苛的環(huán)境中，在此環(huán)境中大量蛋白酶如腸道和細(xì)菌的蛋白酶具有極高活性，同時(shí)存在變性劑如胃酸等。分泌型免疫球蛋白成份之一，即分泌片可防止上述失活劑對(duì)免疫球蛋白的作用，從而'增加分泌型免疫球蛋白的生物效能。此類分泌型免疫球蛋白，如SIgA和SIgM的合成和裝配機(jī)理非常復(fù)雜。在動(dòng)物細(xì)胞中分泌型免疫球蛋白的裝配涉及不同細(xì)胞類型，每一分泌型免疫球蛋白均由免疫球蛋白重鏈，輕鏈，結(jié)合鏈(J鏈)和分泌片所組成，產(chǎn)生免疫球蛋白的B細(xì)胞制造和裝配免疫球蛋白重鏈，輕鏈，結(jié)合鏈(J鏈)并使其相連形成IgM或IgA的二聚體或多聚體。第二類細(xì)胞，即上皮細(xì)胞或肝細(xì)胞產(chǎn)生分泌片。分泌型免疫球蛋白在此類細(xì)胞中裝配并分泌到細(xì)胞外。這類細(xì)胞裝配和分泌分泌型免疫球蛋白的機(jī)理非常復(fù)雜，需由粘膜組織提供獨(dú)特的^t環(huán)境。這種微環(huán)境將產(chǎn)生多聚免疫球蛋白的B細(xì)胞置于裝配和分泌分泌型免疫球蛋白的細(xì)胞附近，使免疫球蛋白分泌至動(dòng)物的粘膜表面。存在于上皮細(xì)胞的多聚免疫球蛋白受體(PIgR)，可特異性識(shí)別與結(jié)合含有J鏈的多聚免疫球蛋白并將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過上皮細(xì)胞運(yùn)輸出去，表達(dá)于細(xì)胞嗜堿性外表面的PIgR,舍有18個(gè)氨基酸組成的N-末端信號(hào)肽，629個(gè)氨基酸組成細(xì)胞外多聚免疫球蛋白結(jié)合部分，23個(gè)疏水基因組成的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)片段和103個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞質(zhì)尾部。細(xì)胞外部分含有五個(gè)10-1U個(gè)氨基酸組成的類似免疫球蛋白的功能區(qū)構(gòu)成分子的分泌形式。見，Mostov,Ann.Rev.Immol.,12:63-84(1994),多聚免疫球蛋白受體被切斷去產(chǎn)生成熟的分泌部分的位置，目前尚不清楚，在動(dòng)物中，多聚免疫球蛋白受體位于上表皮細(xì)胞的嗜堿性細(xì)胞的表面，產(chǎn)生于B細(xì)胞并含有J鏈的多聚免疫球蛋白與受體結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞，通過上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)最終分泌到軲膜表面，這種穿越上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，利用蛋白分解及磷酸化作用，以產(chǎn)生含有分泌片的成熟SIg.分泌型免疫球蛋白的組合，需由粘膜微環(huán)境中不同細(xì)胞的相互配合，特別是B淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞.在轉(zhuǎn)基因組織中，如在小鼠組織中產(chǎn)生免疫球蛋白十分困難，真菌或植物的轉(zhuǎn)基因組織不含有產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白所需的適宜細(xì)胞類型和粘膜微環(huán)境，在本發(fā)明之前，在轉(zhuǎn)基因組織和培養(yǎng)細(xì)胞中大量生產(chǎn)分泌型免疫球蛋白是不可能的，用轉(zhuǎn)基因和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型免疫球蛋白，必須在B淋巴細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白重鏈，輕鏈，和結(jié)合鏈(J鏈)。去模擬適宜的粘膜微環(huán)境，必須有PIgR受體的細(xì)胞存在于表面，而這種細(xì)胞必須同時(shí)與B淋巴細(xì)胞密切作用才能去組合具有功能的分泌型免疫球蛋白，這種需要分泌型免疫球蛋白自然組合的精細(xì)過程是很難在轉(zhuǎn)基因組織和培養(yǎng)細(xì)胞中重復(fù)出來的，在細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因組織中產(chǎn)生SIg,需在人工系統(tǒng)中將體外產(chǎn)生免疫球蛋白細(xì)胞的功能與上皮細(xì)胞的功能結(jié)合在一起。進(jìn)一步說，如果轉(zhuǎn)基因組織為真菌，細(xì)菌或植物，這種受體介導(dǎo)的細(xì)胞，跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌是不存在的。因?yàn)檫@些組織缺少上皮細(xì)胞和所需的粘膜微環(huán)境，目前為止，在相同細(xì)胞內(nèi)裝配重鏈，輕鏈，結(jié)合鏈(J.鏈)的免疫球蛋白已有報(bào)道，見，CarayannopoulosProc.NatAcad.Sci.,U.S.A.,91:8348-8352(1994),然而，在單一細(xì)胞中裝配具有附加蛋白質(zhì)成份和分泌片的免疫球蛋白尚未見報(bào)道，本發(fā)明闡述一種新的裝配復(fù)合分子的方法。即摒棄在上皮細(xì)胞表面通過多聚免疫球蛋白受體與免疫球蛋白的相互作用，而裝配四聚復(fù)合體。我們裝配由a.J和K免疫球蛋白鏈和源于PIgR的保護(hù)性蛋白所組成的分泌型免疫球蛋白。此發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物能更有效的裝配分泌型免疫球蛋白。本發(fā)明使被動(dòng)免疫治療更經(jīng)濟(jì)可行，發(fā)明概述本發(fā)明意在構(gòu)建一種新型的免疫球蛋白分子。此種蛋白舍有與免疫球蛋白重鏈相關(guān)的保護(hù)性蛋白，而重鏈至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)。另一方面，進(jìn)一步構(gòu)建與免疫球蛋白重鏈相關(guān)的含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的輕鏈。明變性亦具抗力。這種保護(hù)性蛋白加強(qiáng)免疫球蛋白對(duì)環(huán)境的抗力，本發(fā)明的保護(hù)性蛋白由任何種屬多聚免疫球蛋白受體的第1至606氨基酸殘基的片段組成，其它保護(hù)性蛋白包括含有部分PIgR分子的保護(hù)性蛋白。例如；保護(hù)性蛋白可由以下部分或全部序列組威S第l-118氨基酸(兔PIgR第I功能區(qū))第1-223氨基酸(兔PIgR第II和第III功能區(qū))第1-332氨基酸(兔PIgR第I，II和第III功能區(qū))第1-441氨基酸(兔PIgR第I，II,III,IV功能區(qū))第1_552氨基酸(兔PIgR第I,II，III,IV，V功能區(qū))和PIgR的第1至606或第1至627氨基酸，只要不形成功能性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)片段，其余的氨基酸，如PIgR653-755氨基酸或其它來源的PIgR序列均可包括在內(nèi).本發(fā)明的免疫球蛋白另一優(yōu)逸實(shí)例為該蛋白含有的保護(hù)性蛋白的第一氨基酸序列至少部分與兔多聚免疫球蛋白受體的第1至606或627氨基酸殘基相應(yīng)，而第二氨基酸序列與上述第一氨基酸序列相接，但第二氨基酸序列不相應(yīng)與兔多聚免疫球蛋白受體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)片"^殳的序列.進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)例為第二氨基酸序列至少部分與多聚免疫球蛋白受體的第655至755氨基酸殘基相應(yīng)。換言之，第三氨基酸序列至少要含有下例之一多聚免疫球蛋白分子的細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)。免疫球蛋白超家族基因之一的功能區(qū)，一種酶，一種毒素或一種聯(lián)接子，本發(fā)明意在構(gòu)建的保護(hù)性蛋白，不含有與多聚免疫球蛋白受體的跨膜片段相關(guān)的序列，而含有與細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)有關(guān)的氨基酸序列，因而是一種受體的刪除變異體，-本發(fā)明亦構(gòu)建另一種免疫球蛋白，該保護(hù)性蛋白源于與兔多聚免疫球蛋白受體相似的其它種屬的受體，不含有與兔的受體相類似的288-755氨基酸序列，但含有下列至少部分與兔的受體相類似的氨基酸序列或功能區(qū)與兔多聚免疫球蛋白受體，第20-45第1-120第120-230第230-340第340-456第450-550或570第550或570至606—627氨基酸序列相應(yīng)的氨基酸殘基，本發(fā)明的保護(hù)性蛋白可源于許多種屬，包括源于哺乳動(dòng)物，犬類，人類，牛，豬，飛禽，鼠，大鼠，豚鼠，雞或其它鳥類和兔類，本發(fā)明的免疫球蛋白含有兩種或四種免疫球蛋白起源的重鏈，這些重鏈至少含有部分與保護(hù)性蛋白相關(guān)的抗原結(jié)合功能區(qū)。同時(shí)含有兩種或四種免疫球蛋白起源的輕鏈，這些輕鏈至少含有部分與重鏈相結(jié)合的抗原結(jié)合功能區(qū)。本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建的免疫球蛋白含有免疫球蛋白J鏈，此J鏈至少與重鏈之一結(jié)合。本發(fā)明的免疫球蛋白各組成部分通過氫鍵，雙硫鍵，共價(jià)鍵，離子鍵或上述各鍵而結(jié)合在一起。免疫球蛋白中含的保護(hù)性蛋白和/或免疫球蛋白起源的重鏈，輕鏈，J鏈均不含N端連接和/或0-連接的寡糖。本發(fā)明的免疫球蛋白可作為抗粘膜表面致病原抗原的治療性免疫球蛋白。它的優(yōu)化實(shí)例為能夠與S.mutans血清型抗原c,e和f;及結(jié)晶型抗原d和g(原命名為S.mutansa,c,d,e,f,g，h抗原)結(jié)合而防止齲齒的發(fā)生，本發(fā)明亦制備含有本發(fā)明免疫球蛋白的真核細(xì)胞，包括植物細(xì)胞。同時(shí)含有部分抗原結(jié)合功能區(qū))的核苷酸序列的真核細(xì)胞，包括植物細(xì)胞。我們亦制備了含有編碼免疫球蛋白的輕鏈(至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū))的核苷酸序列的真核細(xì)胞，包括植物細(xì)胞，構(gòu)建的含有本發(fā)明所示的編碼免疫球蛋白的核苷酸序列的真核細(xì)胞，包括植物細(xì)胞，能夠與S.mutans的血清型抗原a，c,d,e,f，g,h結(jié)合。為表達(dá)該蛋白，RNA和適當(dāng)?shù)腄NA核苷酸序列已經(jīng)過適當(dāng)重排。本發(fā)明的植物細(xì)胞，包括苜蓿和煙草，只為整個(gè)植物的一部分，我們同時(shí)意在應(yīng)用所有類型的單子葉和雙子葉植物，本發(fā)明旨在構(gòu)建一種含有免疫球蛋白和植物大分子的結(jié)構(gòu)，這些植物大分子可源于一種植物且對(duì)完成免疫球蛋白的功能具有邦助作用。此結(jié)構(gòu)中特別需要含有雙磷酸核酮糖羧化酶，集光復(fù)合體，色素，二級(jí)代謝物或葉綠體。本發(fā)明的免疫球蛋白，理想的成份組合中除水外，免疫球蛋白的濃度應(yīng)在0.001%-99.9%之間(重量比)。更為理想的成份組合中，濃度應(yīng)在0.1%-99%之間，而植物大分子的濃度占1%-99%之間。本發(fā)明制備免疫球蛋白的方法為將含有連與翻譯啟動(dòng)子的編碼保護(hù)性蛋白的核苷酸序列的表達(dá)栽體引入植物細(xì)胞，再將含有連與翻譯啟動(dòng)子的編碼免疫球蛋白的重鏈(至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū))的核苷酸序列的表達(dá)栽體引入相同細(xì)胞。其它方法有將含有連與翻譯啟動(dòng)子的編碼免疫球蛋白的輕鏈(至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū))的核苷酸序例的表達(dá)栽體引入相同細(xì)胞。將含有連與翻譯啟動(dòng)子的編碼免疫球蛋白的J鏈(至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū))的核苷酸序列的表達(dá)栽體引入植物細(xì)胞，將含有免疫球蛋白重鏈(至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū))，輕鏈(至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū))，J鏈和保護(hù)性蛋白的核普酸序列的表達(dá)栽體引入真核細(xì)胞去生產(chǎn)包裝完畢的免疫球蛋白重鏈，輕鏈，J鏈和保護(hù)性蛋白。研究維持真核細(xì)胞生長的條件，使真核細(xì)胞產(chǎn)生并包裝免疫球蛋白重鏈，輕鏈，J鏈和保護(hù)性蛋白，以形成含有保護(hù)性蛋白免疫球蛋白。本發(fā)明意在改造免疫球蛋白的產(chǎn)生方式，使其對(duì)不同的環(huán)境條件及f刻條件更具抗力，即更穩(wěn)定。此方法為連接編碼免疫球蛋白重鏈的抗原結(jié)合區(qū)域的部分核苷酸序列與編碼免疫球蛋白u(yù)或a(IgM或lgA)重鏈的區(qū)域的核苷酸序列，形成編碼嵌合免疫球蛋白重鏈的核苷酸序列，并在真核細(xì)胞中表達(dá)該序列。此表達(dá)序列至少含有以下序列之一保護(hù)性蛋白質(zhì)，至少攜有部分抗原結(jié)合區(qū)的免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白J鏈。更進(jìn)一步的改進(jìn)是允許嵌合免疫球蛋白重鏈與相同細(xì)胞內(nèi)其它分子裝配以形成對(duì)環(huán)境具有抗性的免疫球蛋白，且更穩(wěn)定，本發(fā)明的免疫球蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)是通過種植含有免疫球蛋白的植物進(jìn)而提取該蛋白而完成。具體講，生產(chǎn)治療性免疫球蛋白的步驟包括收集植物的葉，莖，根，管,花，仔，果實(shí)，整個(gè)植物:，碎植物,p，壓處漿。進(jìn)一步分'離液體和固體部分。應(yīng)用纟幾械"S皮碎或酶解方法，釋放液休部分，然后選擇性應(yīng)用離心，沉降，絮凝或過濾的方法完成分離.本發(fā)明的免疫球蛋白為嵌合性的，即含有源于兩種不同免疫球蛋白分子的免疫球蛋白區(qū)域組成，特別是此免疫球蛋白含有IgG,IgM和IgA的組分。本發(fā)明意在構(gòu)建由不同亞型免疫球蛋白來源的區(qū)域構(gòu)成重鏈的免疫球蛋白。具體講，所用的免疫球蛋白區(qū)域至少由小鼠的IgG，IgGl，IgG2a，IgG2b,IgG3，IgA，IgE,IgD的CH1,CH2,CH3或Cvar區(qū)組成。另外，也可由小鼠的IgM的Cul，Cu2，Cu3或Cu4區(qū)組成免疫球蛋白的重鏈。此發(fā)明同時(shí)意在構(gòu)建由人的IgG，IgGl，IgG2，IgG3,IgG4,IgAl,IgA2或IgD的CHl，CH2，或CH3;人的IgM的Cul,Cu2，Cu3，Cu4或Cvar等不同區(qū)域構(gòu)成的重鏈組分的免疫球蛋白。哺乳動(dòng)物，嚙齒類動(dòng)物的任何一種IgG亞型，IgA亞型，IgE，IgM或IgD的不同組分構(gòu)建免疫球蛋白也在計(jì)劃之中，本發(fā)明意在完成四基因轉(zhuǎn)化組織。即該組織由已轉(zhuǎn)入四種不同基因的細(xì)胞組成。每種基因均編碼不同的多肽或復(fù)合肽分子，亦或多肽之一能相互組合形成復(fù)合肽分子。本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因組織中的四種基因可編碼保護(hù)性蛋白，轉(zhuǎn)基因組織中的細(xì)胞表達(dá)的保護(hù)性蛋白能與免疫球蛋白的重鏈組裝以形成免疫球蛋白。轉(zhuǎn)基因組織中的細(xì)胞所表達(dá)的四種基因，有至少舍有部分抗原結(jié)合區(qū)的重鏈，至少含有部分抗原結(jié)合區(qū)的輕鏈，J鏈和保護(hù)性蛋白。在另外的理想轉(zhuǎn)基因組織中，細(xì)胞含有編碼嵌合免疫球蛋白重鏈，IgA重鏈來源的免疫球蛋白重鏈，IgM重鏈來源的免疫球蛋白重鏈，或其它亞型免疫球蛋重鏈的基因。植物是本發(fā)明最理想的轉(zhuǎn)基因組織。我們應(yīng)用了不同類型和不同種屬的植物。另外，本發(fā)明亦重在應(yīng)用哺乳動(dòng)物作為含有不同分子的轉(zhuǎn)基因研究對(duì)象，亦已完成哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因組織，該組織含有編碼不同的多肽的四種基因。插圖簡述首先筒單描述插圖圖1人工合成的寡核苷酸Jl-J5-用于擴(kuò)增構(gòu)建IgG/A重鏈所需的Guy'sl3和a鏈的DNA片段。(加線處表示限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)》圖示每一寡聚核苷酸編碼的相對(duì)位置，同時(shí)表示出組合不同CiNA片段在植物中表達(dá)所產(chǎn)生的重組重鏈，發(fā)明的具體闡述A.定義雙子葉開花植物，胚胎為雙子葉，雙子葉植物有煙草；西紅柿；豆科植物(包括苜蓿)；橡樹；槭樹；玫瑰；薄荷；南瓜；雛菊；胡挑樹；仙人掌；紫羅蘭和金風(fēng)花等。單子葉開花植物，胚胎為單子葉，單子葉植物有百合花；草；玉米；谷物(包括燕麥，小麥和大麥)；蘭花；鴦尾屬植物；洋蔥和棕櫚等。低等植物任何無花植物(包括羊齒植物，針葉樹，馬尾草，茗，活的樹疣，紅色海藻，棕色海藻，綠色海藻等》真核細(xì)胞雜交載體一種能夠?qū)⒕幋a多肽(插入子)的DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的DNA。染色體外核糖體DNA(rDNA):單細(xì)胞真核生物中存在于染色體外的DNA,攜有一種或多種編碼核糖體RNA且能自動(dòng)復(fù)制的基因(獨(dú)立于染色體復(fù)制)?；匚腄NA:具有一個(gè)或多個(gè)對(duì)稱中心的DNA序列。DNA:脫氧核糖核酸，T-DNA:被轉(zhuǎn)移的DNA片段。r掘A:核糖體DNA,RNA:核糖核酸.r-RNA:核糖體RNA。Ti-質(zhì)粒腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒。Ti-DNA:源于Ti-質(zhì)粒的DNA片段，插入子與核糖體DNA異源的DNA序列，由結(jié)構(gòu)基因和選擇性的附加DNA序列組成，結(jié)構(gòu)基因編碼多肽的基因，具有適宜的啟動(dòng)子，終止序列和選擇性的DNA調(diào)節(jié)序列，且有正確的閱讀框架。信號(hào)序列編碼與多肽相連的一段氨基酸的DNA序列，此氨基酸序列將多肽聯(lián)接于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，為蛋白質(zhì)分泌所必需。遺傳標(biāo)志一段編碼表型特征的DNA序列，應(yīng)用此DNA可選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。啟動(dòng)子一^殳或一組DNA序列上的識(shí)別位點(diǎn)，控制基因表達(dá)。RNA聚合酶特異性地與其結(jié)合從而起動(dòng)基因的RNA合成，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子:可被外源刺激物調(diào)節(jié)其RNA聚合酶結(jié)合并起動(dòng)的啟動(dòng)子。這些刺激包括光，熱，缺氧，營養(yǎng)條件改變，增加或去除某種代謝物，加入配體，微生物攻擊，損傷等。病毒啟動(dòng)子具有與病毒基因5'端啟動(dòng)子相似DNA序列的啟動(dòng)子。典型的病毒啟動(dòng)子，存在于MMTV5'端編碼P21蛋白的基因中。見Huang等.，Cell,27:245(1981),另一例子為由Benfey等.，Science,25:959(1990)。發(fā)現(xiàn)于花柳葉锿嵌病毒的35S轉(zhuǎn)錄過程中的啟動(dòng)子。合成啟動(dòng)子化學(xué)合成而非生物起源的啟動(dòng)子，通常合成啟動(dòng)子具有某些序列改變以使RNA聚合酶起動(dòng)效率更高，基本啟動(dòng)子RNA聚合酶結(jié)合和起始速率基本穩(wěn)定，相對(duì)不受外界刺激影響的啟動(dòng)子。如Poszkowski等.，EMBO丄，3:2719(1989)和Odell等.，Nature,313:810(1985)所講過的花柳葉鑲嵌病毒的35S和19S啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)啟動(dòng)子發(fā)育過程中RNA聚合酶結(jié)合與起動(dòng)速率在某一特殊時(shí)期或在某一組織的特殊結(jié)構(gòu)中有所變化的啟動(dòng)子或二者兼具。如chua等.，Science,244:174-181(1989)所述。單鏈抗原結(jié)合蛋白免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)氨基酸序列VL的羧基端通過一多肽與免疫球蛋白重鏈可變區(qū)氨基酸序列VH的氨基端聯(lián)接構(gòu)成的多肽。一般來說，連接多肽將任何重鏈和輕鏈的抗原結(jié)合蛋白連接以形成單一多肽而具有結(jié)合功能區(qū)構(gòu)型均可行，包括VH-多肽_VL,VH-多肽-輕鏈或VL-多肽-Fd。單鏈抗原結(jié)合蛋白編碼基因編碼單鏈抗原結(jié)合蛋白的重組基因。多肽和肽氨基酸基因相互之間通過肽鍵，即a-氨基與相鄰氨基酸殘基的羧基結(jié)合聯(lián)接形成的線性結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)多于50個(gè)氨基酸殘基相互以肽鍵聯(lián)接形成的線性結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白產(chǎn)物至少含有免疫球蛋白重鏈活性部分因而能夠與抗原特異性結(jié)合的多肽或蛋白質(zhì)。如免疫球蛋白重鏈，免疫球蛋白分子，實(shí)際上完整的免疫球蛋白分子，含有互補(bǔ)位的部分免疫球蛋白，包括Fab片段，F(xiàn)ab'片段,F(ab')2片段和FV片段。免疫球蛋白分子免疫球蛋白重鏈與輕鏈的免疫學(xué)活性部分通過共價(jià)鍵聯(lián)接形成的蛋白質(zhì)能夠與抗原特異性結(jié)合，免疫球蛋白起源的重鏈由至少含有部分免疫球蛋白重鏈抗原結(jié)合區(qū)，部分可變區(qū)，部分穩(wěn)定區(qū)形成的多肽，此重鏈具有與免疫球蛋白基因超家族成員的重要部分同源的氨基酸序列。Fab片段的重鏈，即為免疫球蛋白起源的重鏈。免疫球蛋白起源的輕鏈由至少含有部分免疫球蛋白輕鏈抗原結(jié)合區(qū)，部分可變區(qū)，部分穩(wěn)定區(qū)形成的多肽，此輕鏈具有與免疫球蛋白基因超家族成員的重要部分同源的氨基酸序列?？乖Y(jié)合功能區(qū)免疫球蛋白上可特異性與抗原結(jié)合的多肽部分，免疫球蛋白重鏈和輕鏈的抗原結(jié)合結(jié)合功能區(qū)與抗原結(jié)合，此功能區(qū)也可存在于單一多肽鏈上，J鏈與免疫球蛋白聚合和聚合免疫球蛋白通過上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的多肽。見，Immunoglobulinhelper:TheJchaininImmunoglobulinGenes，345頁，AcademicPress(1989)。IgM多聚體和IgA二聚體中含有J鏈，通過二硫鍵相聯(lián)，J鏈的研究限于小鼠與人。Fab片段由部分免疫球蛋白分子組成的蛋白質(zhì)，含有共價(jià)結(jié)合的免疫球蛋白重鏈與輕鏈的活性部分，具有特異性與抗原結(jié)合的能力.用木瓜蛋白酶消化裂解完整的免疫球蛋白分子，產(chǎn)生Fab片段。亦可通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白重鏈和輕鏈制備Fab片段，F(xiàn)V片段免疫球蛋白重鏈與輕鏈的可變區(qū)的活性部分通過共價(jià)鍵結(jié)合形成的蛋白質(zhì)，具有特異性與抗原結(jié)合的能力，通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)，制備FV片段.無性繁殖用切下的葉，莖，根，單一植物細(xì)胞或胼胝再生，整個(gè)植物而產(chǎn)生后代的方式.自花授粉在同一植物上，花粉從雄性花部分傳至雌性花部分，此過程通常產(chǎn)生籽。異花授粉花粉從一植物的雄花部分傳至另一植物的雌花部分，此過程通常產(chǎn)生能繁殖的籽.表位特異性由免疫球蛋白產(chǎn)物所識(shí)別的分子部分，亦稱決定蔟或抗原決定蔟。嵌合免疫球蛋白重鏈:由至少含有源于不同亞型免疫球蛋白重鏈或某些其它肽，多肽，或蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列而組成的免疫球蛋白重鏈。通常，嵌合免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列，源于至少二種不同亞型免疫球蛋白的重鏈。轉(zhuǎn)基因被引入一種動(dòng)物的生殖細(xì)胞系的基因，基因可在早期發(fā)育階段引入動(dòng)物，亦可通過逆轉(zhuǎn)錄病毒在晚期引入動(dòng)物細(xì)胞。復(fù)合分子一種以上的肽或多肽通過化學(xué)鍵連接構(gòu)成的分子.B.含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白本發(fā)明為制備含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白提供了新的方法。免疫球蛋白含有與免疫球蛋白起源的重鏈相關(guān)的保護(hù)性蛋白，而重鏈至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)，本發(fā)明的保護(hù)性蛋白的氨基酸序列部分相應(yīng)或相似于兔多聚免疫球蛋白受體的第1至627以上氨基酸序列。本蛋白起源于兔多聚免疫球蛋白受體的前體蛋白，但不含兔多聚免疫球蛋白受體的第627以上氨基酸序列的核普酸或氨基酸序列的類似物。如由Moston等報(bào)告Nature,308:37(1984)和EMBL/基因庫K01291。兔多聚免疫球蛋白受體的核苷酸序列為SEQIDNo.1和相關(guān)的氨基酸序列為SEQIDNo.2。任何種屬的多聚免疫球蛋白受體均可作為保護(hù)性蛋白的來源，這些蛋白源于前體蛋白，但不含有前體蛋白，而前體蛋白不含有免疫球蛋白第1至627氨基酸序列以外的氨基酸序列或類似物。理想的實(shí)例是保護(hù)性蛋白來源于任何種屬的前體蛋白，至少含有部分與多聚免疫球蛋白受體第l至606氨基酸序列相似的序列，而不含第607至755氨基酸序列類似的序列。人多聚免疫球蛋白受體的序列已確定并報(bào)告。Krajci等.，Eur.丄Immunol.,22:2309-2315(1992)和Krajci等,，Biochem.Biophys.Res.Comm.,158:783-789(1989)和EMBL/基因庫AccessionNo.X73079。人多聚免疫球蛋白受體核苷酸序列為SEQIDNo.3和相關(guān)的氨基酸序列為SEQIDNo.4。人多聚免疫球蛋白受體與兔多聚免疫球蛋白受體具有很大的序列同源性和功能區(qū)結(jié)構(gòu)相似性。見，Kraehenbuhl等.，TrendsinCellBiol.,2:170(1992)。人多聚免疫球蛋白受體與兔多聚免疫球蛋白受體的功能區(qū)與氨基酸序列的相似性見表1,Banting等.，F(xiàn)EBSLett.,254:177-183(1989)和EMBL/基因庫AccessionNo.X15741已確定并報(bào)告了大鼠的多聚免疫球蛋白受體，大鼠多聚免疫球蛋白受體的核苷酸序列為SEQIDNo.9和相關(guān)的氨基酸序列為SEQIDNo.lO,大鼠多聚免疫球蛋白受體與兔多聚免疫球蛋白受體具有序列同源性和功能區(qū)結(jié)構(gòu)相似性，見Knaehenbuhl等.，T.CellBiol.,2:170(1992)。大鼠多聚免疫球蛋白受體與兔多聚免疫球蛋白受體功能區(qū)與氨基酸序列的相似性見表1。牛多聚免疫球蛋白受體的序例已確定并報(bào)告在EMBL/基因庫AccessionNo.X81371。牛多聚免疫球蛋白受體核基酸序列為SEQIDNo.5和相關(guān)的氨基酸序列為SEQIDNo.6。牛多聚免疫球蛋白受體與兔和人多聚免疫球蛋白受體具有序列同源性和功能區(qū)結(jié)構(gòu)相似性。牛多聚免疫球蛋白受體與兔多聚免疫球蛋白受體的功能區(qū)與氨基酸序列的相似性見表1,Piskurich等.，J,Immunol.,150:38(1993)和EMBL/基因庫AccessionNo.U06431已確定并報(bào)告了小鼠的多聚免疫球蛋白受體的序列，小鼠多聚免疫球蛋白受體的核苷酸序列為SEQIDNo.7和相關(guān)的氨基酸序列為SEQIDNo.8。小鼠多聚免疫球蛋白受體與兔多聚免疫球蛋白受體具有序列同源性和功能區(qū)結(jié)構(gòu)相似性。小鼠多聚免疫球蛋白受體與兔多聚免疫球蛋白受體序列和功能區(qū)與氨基酸序列的相似性見表1。本發(fā)明意在應(yīng)用任何種屬的多聚免疫球蛋白受體部分序列，以產(chǎn)生保護(hù)性蛋白。不同種屬的多聚免疫球蛋白受體的功能區(qū)使得可以在不同種屬中選擇相似的氨基酸序列.本發(fā)明就是應(yīng)用從不同種屬的多聚免疫球蛋白受體中選擇相似的氨基酸序列。幾種多聚免疫球蛋白受體的序列中的相似序列已例于表l。表l:幾種多聚免疫球蛋白受體氨基酸序列的相似區(qū)，核苷酸序列大致與分子功能區(qū)的范圍相等。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本發(fā)明的保護(hù)性蛋白，可以僅含有多聚免疫球蛋白受體的部分而不是全部氨基酸序列。在實(shí)際應(yīng)用中，保護(hù)性蛋白至少要含有多聚免疫球蛋白體的第1-606氨基酸的部分序列，與天然多聚免疫球蛋白不同，本發(fā)的保護(hù)性蛋白源于前體蛋白，此前體蛋白源于天然多聚免疫球蛋白受體，但不含有第627氨基酸殘基以上的氨基酸序列，此保護(hù)性蛋白的氨基酸數(shù)目可以多于或少于分泌片，理想的設(shè)計(jì)是本發(fā)明的保護(hù)性蛋白不含有天然兔多聚免疫球蛋白受體中第606氨基酸殘基以上氨基酸序列，而用天然多聚免疫球蛋白部分序列作為保護(hù)性蛋白。在另外的設(shè)計(jì)中，此保護(hù)性蛋白可終止在第606-627氨基酸序列的任一氨基酸殘基，如607，608,609,610,611,612,613，614，615，616，617，618,619,620,621,622,623'624,625,626位。l.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)I的第21-43氨基酸相應(yīng)的氨基酸;2.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)I的第1-H8氨基酸相應(yīng)的氨基酸；3.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)ll的第119-223氨基酸相應(yīng)的氨基酸；4.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)III的第224-332氨基酸相應(yīng)的氨基酸；5.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)IV的第333-441氨基酸相應(yīng)的氨基酸；6.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)V的第442-552氨基酸相應(yīng)的氨基酸；7.與兔多聚免1^球蛋白功能區(qū)VI的第553-606或553-627氨基酸殘基相應(yīng)的氨基酸，但不含與第607-755或628-755氨基酸殘基相應(yīng)的氨基酸，應(yīng)注意到的是在每20個(gè)氨基酸內(nèi)，功能區(qū)的確切界限可能改變，但有經(jīng)驗(yàn)者可清楚功能區(qū)的結(jié)構(gòu)和界限，另外>本發(fā)明構(gòu)建的保護(hù)性蛋白終止氨基酸序列，無論是在兔多聚免疫球蛋白受體或其它種屬中相應(yīng)的氨基酸序列，均為第58-605氨基酸殘基。在另外的優(yōu)選實(shí)例中，保護(hù)性蛋白源于特殊種屬的多聚免疫球蛋白受體，但氨基酸序列相應(yīng)于下例氨基酸序列片段。1.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)I的第21-43氨基酸相應(yīng)的氨基醵；2.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)I的第l-U8氨基酸相應(yīng)的氨基酸；3.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)II的第U9-223氨基酸相應(yīng)的氨基酸；4.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)IH的第224-332氨基酸相應(yīng)的氨基酸；5.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)IV的第333-441氨基酸相應(yīng)的氨基酸；6.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)V的第442-552氨基酸相應(yīng)的氨基酸；7.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)VI的第553-606或553-627氨基酸殘基相應(yīng)的氨基酸，但不含與第607-755或628-755氨基酸殘基相應(yīng)的氨基酸序列，另一優(yōu)選實(shí)例即保護(hù)性蛋白由兔多聚免疫球蛋白受體的功能區(qū)I,IV,V和VI的第550-606或550-627氨基酸殘基組成或由其它種屬的多聚免疫球蛋白受體上與此序列相類似的氨基酸序列組成。另外，本發(fā)明的保護(hù)性蛋白序列源于兔多聚免疫球蛋白受體同源的其它種屬的受體，其中至少部分氨基酸序列與第l-627氨基酸殘基類似。該部分氨基酸序列至少部分相應(yīng)于該種屬的多聚免疫球蛋白受體細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)的氨基酸序列.另一優(yōu)選實(shí)例為保護(hù)性蛋白一種與兔多聚免疫球蛋白受體的氨基酸序列組成，該序列至少部分與兔免疫球蛋白受體的第1-606氨基酸序列相類似。另一選擇是本發(fā)明的保護(hù)性蛋白的氨基酸序列，如不是源于兔多聚免疫球蛋白受體，至少相應(yīng)或相似于下列部分氨基酸序列1.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)I的第21-43氨基酸相應(yīng)的氨基酸；2.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)I的第1-118氨基酸相應(yīng)的氨基酸；3.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)II的第119-223氨基酸相應(yīng)的氨基酸；4.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)III的第224-332氨基酸相應(yīng)的氨基酸；5.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)IV的第333-441氨基酸相應(yīng)的氨基酸；6.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)V的第442-552氨基酸相應(yīng)的氨基酸；7.與兔多聚免疫球蛋白功能區(qū)VI的第553-606或553-627氨基酸殘基相應(yīng)的氨基酸，但不含與第607-755或628-755氨基酸殘基相應(yīng)的氨基酸序列，另一優(yōu)化實(shí)例中，本發(fā)明的保護(hù)性蛋白的第一氨基酸序列相應(yīng)于兔多聚免疫球蛋白受體的第1-606或1-627氨基酸序列；而第二氨基酸序列與上述第一氨基酸序列相聯(lián)，但第二氨基酸序列中不含有與兔多聚免疫球蛋白受體跨膜片段的序例相應(yīng)的序列。更優(yōu)化的實(shí)例為第二氨基酸序列至少部分與兔多聚免疫球蛋白受體的第665-755氨基酸序列相應(yīng)。其它的實(shí)例為第二氨基酸序列由下例一部分或多部分組成多聚免疫球蛋白分子的細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)，免疫球蛋白基因超家族成員的功能區(qū)，一種酶，一種毒素或一種連接體。本發(fā)明的保護(hù)性蛋白不含有與兔多聚免疫球蛋白受體的跨膜片段相應(yīng)的氨基酸序列，但含有與細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)相應(yīng)的氨基酸序列。此蛋白質(zhì)為受體的刪除變異體。本發(fā)明的保護(hù)性蛋白的另一實(shí)例為其氨基酸序列至少部分與一種特殊種屬的多聚免疫球蛋白受體的細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)相應(yīng)。保護(hù)性蛋白的氨基酸序列的部分片段可與一種屬多聚免疫球蛋白受體的細(xì)胞外功能區(qū)的序列相應(yīng)，而其它部分片段可與另一種屬的細(xì)胞外功能區(qū)的序列相應(yīng)。本發(fā)明意在強(qiáng)調(diào)保護(hù)性蛋白的氨基酸序列部分片段相應(yīng)于一種屬多聚免疫球蛋白受體，而在同一功能區(qū)可有第二氨基酸序列相應(yīng)于其它不同種屬的氨基酸序列。這樣，保護(hù)性蛋白單一功能區(qū)或某一功能區(qū)的特殊部分可由與不同種屬的多聚免疫球蛋白相應(yīng)的氨基酸序列組成。另一實(shí)例為保護(hù)性蛋白部分氨基酸序列源于免疫球蛋白超家族成員。見，williams和Barclay，"TheImmunoglobulinSuperfamily"inImmunoglobulinGenes，p.361,AcademicPress(HonjoAlt與Rabbits主編，1989),這些部分可包括編碼免疫球蛋白超家族分子的多肽，功能區(qū)或多功能區(qū)的氨基酸序列。本發(fā)明亦旨在構(gòu)建一種編碼保護(hù)性蛋白的核苷酸序列，第一核苷酸序列編碼至少含部分兔多聚免疫球蛋白受體的第1-606或1-627氨基酸，但此核苷酸序列不含編碼功能性跨膜片段的序例。進(jìn)一步構(gòu)建聯(lián)于第一核苷酸序列3'端的第二核苷酸序列。第二核苷酸序列可編碼不同的分子，包括兔或其它種屬的多聚免疫球蛋白受體的細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)部分或部分免疫球蛋白超家族分子.另外，第二核苷酸序列亦可編碼不同的效應(yīng)分子，酶，毒素及類似物。優(yōu)先考慮的第二核苷酸序列為編碼兔或其它種屬的多聚免疫球蛋白受體的第655至775氨基酸序列相應(yīng)氨基酸殘基的核苷酸序列，本發(fā)明同時(shí)構(gòu)建含有保護(hù)性蛋白的核苷酸序列并適當(dāng)連接的栽體以表達(dá)保護(hù)性蛋白，此表達(dá)載體將核苷酸序列置于啟動(dòng)子序列的3'端，使其在特殊細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。表達(dá)載體亦可含有不同的增強(qiáng)子以增強(qiáng)翻譯的效率。另外，亦可包括終止子，多聚腺普酸位置和其它的3'端加工信號(hào)以增加在特殊細(xì)胞內(nèi)的將被翻譯的核苷酸序列的數(shù)量。保護(hù)性蛋白為免疫球蛋白的一部分且與具有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白重鏈相關(guān)。眾所周知，免疫球蛋白起源的重鏈含有至少部分抗原結(jié)合功能區(qū)。Huse等.，Science246:1275(1989),Lerner和Sorge，PCT應(yīng)用WO90/14430,1990年11月29日出版這些文件的引用均經(jīng)作者同意。另外的實(shí)例中，本發(fā)明的免疫球蛋白含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白起源的重鏈和輕鏈，而輕鏈至少含有部分與重鏈相關(guān)聯(lián)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。眾所周知，免疫球蛋白含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)。見，Early與Hood,GeneticEngineering,Setlow與Holiaender主編，Vol.3,PlenumPublishingCorp.,NEWYORK(198)，157-188頁；Kabot等.，SequencesofImmunologicInterest,NIH,Bethesda,Maryland(1987)，此處引用的所有參考文獻(xiàn)均經(jīng)作者同意。復(fù)合體的免疫球蛋白成份(a,J,K,或入)，可含有全長或部分多肽，這些肽鏈的某部分可用來替代整鏈。例如，全長的免疫球蛋白a-重鏈可由可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)與其它成份裝配的部分穩(wěn)定區(qū)所替代，同時(shí)>切短含有小部分穩(wěn)定區(qū)K或人亦可替代全長的K或人，任何復(fù)合體的基本要求是具有與保護(hù)性蛋白結(jié)合的能力，除了切短的成份外，本發(fā)明亦構(gòu)建了由不同類型免疫球蛋白組合而成的免疫球蛋白。例如，含有IgCHl和CH2的重鏈穩(wěn)定區(qū)與含有IgACHl和CH2區(qū)的片段結(jié)合形成含有保護(hù)性蛋白穩(wěn)定的復(fù)合體，此已為熟知的范例。IgM或IgA重鏈，這樣即可使免疫球蛋白重鏈與J鏈結(jié)合，進(jìn)而與保護(hù)性蛋白結(jié)合，本發(fā)明的免疫球蛋白重鏈可以由IgM或IgA重鏈或其它重鏈亞型的單功能區(qū)組成。免疫球蛋白的功能區(qū)亦可源于非IgM或IgA重鏈，但此重鏈經(jīng)分子加工后，可與J鏈結(jié)合，這種重鏈亦可用于本發(fā)明的免疫球蛋白.免疫球蛋白由功能區(qū)組成，每一功能區(qū)大約含有100-140個(gè)氨基酸殘基，不同的功能區(qū)的結(jié)構(gòu)與界限亦已闡明，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，很容易將抗體分子的單一功能區(qū)移除，而用另一抗體分子的功能代替。功能區(qū)為球狀結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定賴于鏈間的二疏鍵。這使功能區(qū)具有單一形狀，能與其它相似形狀的功能區(qū)互相替代和轉(zhuǎn)換。免疫球蛋白重鏈區(qū)使具有該功能區(qū)的分子具有不同的抗體效應(yīng)功能。這些效應(yīng)功能包括固定補(bǔ)體，穿越胎盤，與葡萄球菌蛋白結(jié)合。結(jié)合鏈球菌G蛋白，與單核細(xì)胞，中性細(xì)胞或肥大細(xì)胞和嗜-威性細(xì)胞結(jié)合。這些效應(yīng)功能與特殊免疫球蛋白亞型與特殊功能區(qū)之間的關(guān)聯(lián)已被闡述清楚，見Immunology,Roitt等.，mosbyStLouis,Missouri(1993)。本發(fā)明的免疫球蛋白除含有保護(hù)性蛋白外，尚含有免疫球蛋白重鏈，輕鏈和重鏈結(jié)合的J鏈。在優(yōu)化實(shí)例中，本發(fā)明的免疫球蛋白由二條或四條免疫球蛋白起源的重鏈，二條或四條輕鏈和一條至少與一條免疫球蛋白起源的重鏈結(jié)合的J鏈所組成，免疫球蛋白的J鏈已闡述清楚。見，MKoshland，TheImmunoglobulinHelper:TheJChain，inImmunoglobulinGenes，AcademicPress，London，Pg.345(1989)和Matsuuchi等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,83:456—460(1986)。本發(fā)明的免疫球蛋白含有保護(hù)性蛋白。保護(hù)性蛋白至少與一條免疫球蛋白起源的重鏈相聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)可通過氫鍵，二硫鍵，共價(jià)鍵，離子鍵或上述各鍵的混合而完成。典型的免疫球蛋白分子的結(jié)合是免疫球蛋白重鏈與輕鏈通過二疏鍵聯(lián)接。保護(hù)性蛋白通過非共價(jià)鍵或二硫鍵與免疫球蛋白相互作用。本發(fā)明的免疫球蛋白所含有的保護(hù)性蛋白，免疫球蛋白重鏈，輕鏈和J鏈?zhǔn)峭ㄟ^氫鍵，二疏鍵，共價(jià)鍵，離子鍵或上述各鍵的混合而聯(lián)接在一起，然后將所需的免疫球蛋白重鏈，輕鏈和J鏈構(gòu)建為單一多肽，使其能夠與抗原和保護(hù)性蛋白結(jié)合，這種蛋白的范例為單鏈抗原結(jié)合蛋白，本發(fā)明裝配多聚免疫球蛋白的方法包括下例步驟將編碼全部或部分免疫球蛋白J鏈的DNA片段引人組織，同時(shí)引人編碼全部或部分免疫球蛋白a鏈的DNA片段，編碼全部或部分免疫球蛋白K鏈或人鏈的DNA片段。在相同的組織中，引人保護(hù)性蛋白序列。上迷保護(hù)性蛋白由兔多聚免疫球蛋白受體(PIgR)的第1至606氨基酸部分序列組成或其它種屬的類似物組成，保護(hù)性蛋白源于前體蛋白，該前體蛋白不含跨膜功能區(qū)和跨膜功能起始部分的氨基酸片段，即多聚免疫球蛋白受體第630-755氨基酸序列。理想的前體蛋白不含有兔多聚免疫球蛋白受體或其它種屬的類似物中第606氨基酸以上的序列。已知跨膜區(qū)域或功能區(qū)跨膜片段由相鄰部分的20-30個(gè)氨基酸組成，這些氨基酸不帶電荷，所有的殘基均為疏水的或非極性的，此片段形成a-螺旋，功能性跨膜片段能夠跨過生物膜，跨膜片段可與帶電荷的殘基結(jié)合。PIgR的跨膜片段是兔多聚免疫球蛋白受體的從第630-755氨基酸序列。構(gòu)成含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白可源于前體蛋白，該前體蛋白的氨基酸末端含有一段信號(hào)序列，每一成份均可合成入膜內(nèi)系統(tǒng)以使裝配完成。除信號(hào)序列外，復(fù)合體的不同組分可能也可能不含N-末端糖苷化或?yàn)槠渌揎椝玫母郊有盘?hào)序列。這些修飾能夠影響復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明之一，在核苷酸序列中不含或在某些部位含有糖基化信號(hào)序列。(即天冬氨酸-絲氨酸或蘇氨酸或0-連接糖基化所用信號(hào)序列)，所產(chǎn)生的抗體將不含糖苷，這在糖基化誘發(fā)免疫反應(yīng)的應(yīng)用中可能有益，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例中，含有免疫球蛋白的保護(hù)性蛋白與免疫球蛋白起源的重鏈相關(guān)且不含N-連接和或O-連接的多糖。眾所周知，如編碼多肽的基因中，含有N-連接的糖基化，(天冬氨酸-X絲氨酸/蘇氨酸，X可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任何氨基酸)的信號(hào)序列，當(dāng)被引人植物細(xì)胞后，其序列中天冬氨酸殘基可被多糖糖基化(N-連接)，有關(guān)具有糖基化信號(hào)功能的多肽序列的闡述，見，Marshall,Ann.Rev.Biochem.，41:673(1972)和Marshall,Biochem.Soc.Symp.，40:17(1974)。這些信號(hào)序列可被哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞識(shí)別。應(yīng)用普通的變異法改變編碼本發(fā)明的保護(hù)性蛋白的DNA序列，可以去除N-連接的糖基化信號(hào)序列，這種變異法通常首先合成去除N-連接的糖基化信號(hào)序列的寡聚核苷酸。然后制備含有該核苷酸序列的DNA鏈。此方法的程序和試劑已成為商品，如Stratagene乂>司生產(chǎn)的此類產(chǎn)品。先后或同時(shí)將編碼各單一多肽的基因?qū)雴我患?xì)胞，通過表達(dá)可以獲得由各單一多肽裝配而成的復(fù)合肽分子(如，免疫球蛋白)。編碼多肽的轉(zhuǎn)化基因可以為單一構(gòu)建的DNA片段，也可以與其它轉(zhuǎn)化基因共同構(gòu)建成DNA片段。各組分的裝配如孟德爾的交換率所述，通過各成份鏈多肽的分離群體集合而成，已證明此為復(fù)合多聚糖裝配和共分離的適宜方法。美國第5202422號(hào)專利已述此方法(已經(jīng)作者同意)，在本發(fā)明中，抗體分子含有少量或不含聚糖。本發(fā)明免疫球蛋白含有保護(hù)性蛋白免疫球蛋白起源的重鏈，選擇性地含有免疫球蛋白起源的輕鏈和J鏈且可不含N-連接的多糖。用于防止動(dòng)物疾病的發(fā)生，優(yōu)化實(shí)例中，本發(fā)明的治療性免疫球蛋白可與粘膜表面的病原體抗原結(jié)合。另一優(yōu)化實(shí)例中，本發(fā)明的治療性免疫球蛋白可防止齲齒。本發(fā)明免疫球蛋白含有保護(hù)性蛋白，其抗原結(jié)合功能區(qū)可與S.mutans血清型抗原a，c,d,e，f,g結(jié)合，這種抗原結(jié)合功能已明確且包括如下文獻(xiàn)所述結(jié)合功能區(qū)美國第5202422號(hào)專利，丄k-c.Ma等.，Clin.Exp.Imm畫1.77:331(1989);和j.k-c.Ma等.，Ear.J.Immunol.24:131-138(1994);美國專利第5352446號(hào)；美國專利第4594244號(hào)；歐洲專利出版物371017B1,這些文獻(xiàn)的應(yīng)用已經(jīng)作者同意。本發(fā)明的免疫球蛋白是在人和動(dòng)物中具有治療活力的免疫球蛋白的一部分。治療性免疫球蛋白的作用是多方面的，然而，我們認(rèn)為最適宜的治療作用莫過于預(yù)防病原體的侵入，而這些病原體是由可食植物經(jīng)口腔直接攝入的.旦提取，免疫球蛋白可通過常規(guī)的方法進(jìn)一步純化。如分子排阻，離子交換或親合層析，轉(zhuǎn)基因組織是可食的植物>復(fù)合物的插入是部分純化后食入。植物分子亦與復(fù)合體一同食入。植物起源的分子和動(dòng)物起源的分子的此例可有變化。特殊的植物蛋白的量如雙磷酸核酮糖羧化酶或葉綠體，可少至除水外的實(shí)重的1%或多至99.9%。本發(fā)明意在直接應(yīng)用帶有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的治療性植物提取物，而無需任何純化。特異性的治療組分，即抗體可用表面應(yīng)用，食入或其它適宜的方法將抗體引至粘膜表面的耙致病原處，這種攝入形式完全不同與以往的直接注射或?qū)⒅委熜灾参锊攀侨∥飳?dǎo)入血液的方法。本發(fā)明意在改變治，性植物提^取物的品味和結(jié)構(gòu)構(gòu)成。加入適量的膠狀物或添加物，以加強(qiáng)直接食入時(shí)抗體與扭致病原之間的接觸。本發(fā)明的免疫球蛋白是用于動(dòng)物的被動(dòng)免疫。應(yīng)用預(yù)先逸擇好的抗原制備含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白，將其導(dǎo)入動(dòng)物祐膜表面后，本發(fā)明抗體能夠與預(yù)先的抗原結(jié)合。被動(dòng)免疫要求抗體量要足夠大，為廣泛應(yīng)用抗體必須價(jià)廉，細(xì)胞中生產(chǎn)。優(yōu)化實(shí)例中，免疫球蛋白分子可以是IgA,IgM,分泌型IgM。分泌型IgA或具有重鏈或輕鏈的嵌合性免疫球蛋白。含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白對(duì)蛋白降解和變性更具抗力，故而在嚴(yán)苛的環(huán)境中適于應(yīng)用。嚴(yán)苛環(huán)境包括酸性環(huán)境，含蛋白酶的環(huán)境，高溫和其它嚴(yán)苛環(huán)境等。例如動(dòng)物的胃腸道因存在蛋白酶和酸，故而是嚴(yán)苛環(huán)境。見，Kobayashi等.，Immunochemistry，10:73(1973)。本發(fā)明的更具抗性的免疫球蛋白對(duì)動(dòng)物的被動(dòng)免疫的實(shí)現(xiàn)是通過含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白與動(dòng)物粘膜表面的接觸。動(dòng)物有不同的粘膜表面。包括肺，消化道，鼻咽腔，泌尿道等。通常這些粘膜表面含有產(chǎn)生不同分泌液的細(xì)胞。包括唾液，淚液，鼻液，氣管支氣管液，胸液，膽汁，子宮頸液等。含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白對(duì)預(yù)選的抗原具有免疫特異性，通常，這些抗原存在于致病原中，并與粘膜表面的疾病的發(fā)生有關(guān).例如壞死性小腸結(jié)腸炎，腹瑪，潰瘍，由腸吸收致癌物所致的癌癥等。見，McNabb和Tomasi,Ann.Revl.Microbiol.,35:477(1981)和Lawrence等.，Science,243:1462(1989)。典型的與粘膜表面疾病相關(guān)的致病原包括細(xì)菌和病毒致病原，如，大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，霍亂弧菌，幽門菌和S細(xì)tans等,見，歐洲專利應(yīng)用484148A1,5/6/92出版(已經(jīng)作者同意)。本發(fā)明的免疫球蛋白能夠與這些致病原結(jié)合以阻止其引發(fā)粘膜相關(guān)性疾病。免疫球蛋白能夠同S.mutans結(jié)合而防止齲齒已在歐洲專利應(yīng)用371017中有述，亦見，美國專利5352440(已經(jīng)作者同意)。本發(fā)明的含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白能有效地抗細(xì)菌感染和抗致癌，是具有治療活力的單克隆抗體。已在美國專利4652448,4443549和5183756號(hào)中有述。本發(fā)明的免疫球蛋白為整個(gè)與動(dòng)物粘膜表面接觸結(jié)構(gòu)的一部分，而整個(gè)結(jié)構(gòu)系由植物成份和能與預(yù)選的抗原結(jié)合的免疫球蛋白而部分組成。植物成份可以是植物細(xì)胞壁，細(xì)胞器，細(xì)月包質(zhì)，完整的植物細(xì)胞及有生命的植物等。植物成份的比例，可由約10000克植物成份比約100納克免疫球蛋白，至IOO納克植物成份比約IO納克免疫球蛋白等變化不一，理想的情況是植物成份與免疫球蛋白比例從10000克1克至100納克，另外，此比例也可由10000克植物成份比約1毫克免疫球蛋白至1毫克植物成份比約500毫克免疫球蛋白。含有本發(fā)明的免疫球蛋白的混合物是一種治療性混合物，混合物中所含有的多肽和蛋白質(zhì)是具有治療作用的活性組分治療性混合物可以是溶液，也可是混懸液?；蛟谑橙肭皩⒒鞈乙褐糜谌芤褐小Ｖ委焺┛梢匀榛?，活性治療成份通常與無機(jī)和或有機(jī)載體混合，這些栽體為藥物治療學(xué)上允許的，且與活性成份相容。通常，載體與生理?xiàng)l件相符，或多或少的由惰性物質(zhì)組成。當(dāng)加入治療成份之中后賦予治療混合物以適當(dāng)?shù)男螤詈统矶?，適宜的栽體如水，鹽，葡聚糖，甘油等或上述的混合物。另外，如需要，混合物中亦可含少量的輔助物。如，濕化或乳化劑和PH緩沖劑，這些可以加強(qiáng)活性成份的效能，治療混合物中亦可含有具有營養(yǎng)價(jià)值的栽體?！隹捎萌魏畏奖愕姆椒▽⒅委熜曰旌衔铮浜瑤в斜Ｗo(hù)性蛋白的免疫球蛋白，用于哺乳動(dòng)物的口腔或牙齒，已知有4艮多方法且為不同目的應(yīng)用不同的物質(zhì)。如，可將混合物直接涂于牙齒表面，也可將混合物置于牙膏，漱口水，口香糖，小藥片或月交中進(jìn)而作用于牙齒.在某些劑型中，可以設(shè)計(jì)時(shí)間延長。;于這;目:的劑型有許多，如將混合物置;用于復(fù)蓋牙齒的牙架上及用于調(diào)整不同牙齒繞頸的牙器上，在實(shí)際應(yīng)用中，涂于牙齒的混合物的確切用量并不關(guān)鍵，因?yàn)檫@種治療數(shù)量在既定間歇內(nèi)重復(fù)，例如，混于牙骨中的混合物，當(dāng)每次用牙骨時(shí)，都將混合物與牙齒作用，通常一天二次。每次應(yīng)用含有本發(fā)明的免疫球蛋白的混合物時(shí)，約有IO-IOO微克的舍保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白作用于每個(gè)牙齒，在不致發(fā)生損傷效應(yīng)的任何條件下，此量不應(yīng)作為界限，在某點(diǎn)上使用較低的免疫球蛋白濃度可能減低此劑型的保護(hù)作用。本發(fā)明的混合物的確切劑型可以依椐應(yīng)用方法和使用頻率而變，一般來說，任何劑型均可使用，只要該劑型的PH適宜且不含有致使含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白失效的物質(zhì)。例如，本發(fā)明的混合物可以作為簡單的水溶液應(yīng)用。其中每100微升含有0.1-10毫克免疫球蛋白，一般來說，這種溶液可在牙齒手術(shù)中應(yīng)用，使用量大約為每個(gè)牙齒l-IO微升。本發(fā)明的混合物劑型可依據(jù)設(shè)計(jì)而變，主要應(yīng)考慮的是應(yīng)用的頻率及是否為特殊用途。含有本發(fā)明免疫球蛋白的混合物由對(duì)致病原抗原有免疫特異性的免疫球蛋白構(gòu)成，致病原是在其它組織中能夠引起疾病的任何有機(jī)體，免疫球蛋白的特殊優(yōu)點(diǎn)是對(duì)粘膜表面的致病原抗原具有免疫特異性，粘膜表面致病原抗原是存在于致病原上，通過粘膜侵入組織，引起粘膜相關(guān)疾病的抗原，粘膜致病原包括肺致病原，鼻腔致病原，腸道致病原，口腔致病原等。有關(guān)致病原總論，包括粘膜致病原，見，Davis等.，microbiology出版，Harper和Row,hagerstown,MD(1980)?？贵w對(duì)致病原的免疫特異性，可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)產(chǎn)生，見，Antibody:Alaboratorymanual,Harlow等編.，ColdSpringHarbar，NY(1988),應(yīng)用鏈聚酶反應(yīng)和選擇合適的引物可以分離編碼輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因。見，Orlandi等^Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.,86:3833(1989)和Huse等.，Science,246:1275(1989)。然后將可變區(qū)插入植物表達(dá)栽體。如Hiatt等所描述的表達(dá)栽體，Nature,342:76-78(簡》在應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明的免疫球蛋白對(duì)腸道致病原抗原具有免疫特異性，特別對(duì)能夠引起胃腸道疾病的細(xì)苗，病毒，寄生蟲等腸道致病原抗原具有免疫特異性，如，大腸桿菌，沙門氏菌，霍亂弧菌，傷寒桿菌，和幽門菌等。另一實(shí)例中，本發(fā)明的含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白對(duì)牙齒病原體，如鏈球菌等具有免疫特異性。特別理想的是由以下雜交瘤對(duì)鏈球菌具有免疫特異性的免疫球蛋白和抗體雜交瘤15B2(ATCCNo.HB8510);貯存于歐洲動(dòng)物細(xì)胞庫的No.86031901號(hào)雜交瘤。Ma等.，Eur.J.Immunol.,24:131(1994)和Smith和lehner,OralMicro,Immunol.,4:153(989)所述的Guy's13單克隆抗體，本發(fā)明意在動(dòng)物，如脊推動(dòng)物等中產(chǎn)生被動(dòng)免疫，此種被動(dòng)免疫可在魚，鳥，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物或昆蟲中產(chǎn)生。另外也可在哺乳動(dòng)物，如人，或家禽，如反縐動(dòng)物，牛，豬，馬，狗，貓等中產(chǎn)生，亦可在成年或未成年哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生被動(dòng)免疫。理想的應(yīng)用是，在剛剛斷乳的哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生被動(dòng)免疫?；旌衔镏泻斜Ｗo(hù)性蛋白的免疫球蛋白對(duì)預(yù)選抗原有免疫特異性。將足夠量的此種混合物，給予動(dòng)物，以在動(dòng)物體內(nèi)達(dá)到預(yù)期的免疫球蛋白濃度，所謂預(yù)期濃度是動(dòng)物體內(nèi)的免疫球蛋白量足以與存在的致病原結(jié)合，以阻止致病原引起可察的疾病，需要達(dá)到預(yù)期濃度的含有本發(fā)明免疫球蛋白混合物量，視下例條件而有所變化動(dòng)物的大小，所存在的致病原的量，特殊免疫球蛋白對(duì)致病原的親合力，免疫球蛋白導(dǎo)入體內(nèi)后在作用部位的有效性等，C.含保護(hù)性蛋白免疫球蛋白的真核細(xì)胞本發(fā)明意在制備含有此發(fā)明的免疫球蛋白的真核細(xì)胞，包括植物細(xì)胞，編碼保;性蛋白，不同免疫球蛋白重鏈,輕鏈和j鏈的核苷酸序列:通常連與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，作為表達(dá)載體的一部分而得到表達(dá)，分離免疫球蛋白的重鏈，輕鏈，j鏈的基因后，將其連與表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上。所選的需表達(dá)的組織成份，可以是獨(dú)立復(fù)制的質(zhì)粒，染色體的固定成份或能夠過渡性地產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄子以編碼所需成份的任何片段DNA,適宜被轉(zhuǎn)化的組織可為原核細(xì)胞，亦可為真核細(xì)胞，復(fù)合物的各成份的導(dǎo)入，可以通過直接DNA轉(zhuǎn)化，即直接將DNA導(dǎo)入組織，或通過另一有機(jī)體將DNA導(dǎo)入。如，通過重組的植物細(xì)菌對(duì)植物細(xì)胞的作用等。在轉(zhuǎn)基因組織中表達(dá)蛋白通常需要導(dǎo)入一個(gè)適宜的啟動(dòng)子和一段多聚腺苷酸信號(hào)序列。本發(fā)明實(shí)例之一，所選啟動(dòng)子具有在植物所有細(xì)胞中結(jié)構(gòu)性表達(dá)各組分的優(yōu)越性。結(jié)構(gòu)性表達(dá)可在部分或所有細(xì)胞中完成，此可佐證各成份的前體存在于相同的細(xì)胞膜內(nèi)系統(tǒng)中，以利所需各組分的裝西己。使用與宿主細(xì)胞相容，特別是植物細(xì)胞相容的表達(dá)栽體，表達(dá)本發(fā)明的基因.有許多典型的用于植物細(xì)胞基因的表達(dá)栽體，包括由Rogers等.，Meth.inenzymol.，153:253-277(1987)所述的源于土壤桿菌植物菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒的載體，但也有許多其它表達(dá)栽體系統(tǒng)適于植物細(xì)胞，如，Verma等.，PCT出版物No.W087/00551;和Cocking和Davey,Science,236:1256-1262(1987)。上述表達(dá)載體含有表達(dá)控制成份，包括啟動(dòng)子。將被表達(dá)的基因連接于表達(dá)栽體上，使啟動(dòng)子序列能夠指導(dǎo)RNA聚合酶的結(jié)合，從而合成所需基因編碼的多肽。啟動(dòng)子在基因表達(dá)中是十分重要的，包括可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，病毒啟動(dòng)子，合成啟動(dòng)子，結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子，和調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，表達(dá)載體的選擇，于所預(yù)計(jì)的功能特點(diǎn)，即蛋白表達(dá)的位置和時(shí)間。被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這些均為組建重組DNA分子時(shí)所需考慮的。然而，用于本發(fā)明的表達(dá)載體，至少應(yīng)能指導(dǎo)復(fù)制，并能表達(dá)與其相連的編碼多肽的DNA片,殳。用于表達(dá)基因的載體應(yīng)含有在植物細(xì)胞中有效的選擇標(biāo)志，理想的是藥物抗性逸擇標(biāo)志，藥物抗性逸擇標(biāo)志是當(dāng)基因表達(dá)后產(chǎn)生卡那霉素抗性，如含有蘭曙紅合成啟動(dòng)子。Tn5新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II和蘭曙紅合成酶3'作翻譯區(qū)的嵌合基因。如Rager等所述MethodsForPlantMolecularBiology>aWeissbach和H.Weissbach編，AcademicPresslnc.,SanDiego>CA(1988)。已成為商品的植物表達(dá)栽體可從藥物公司購得，Piscataway,NJ有關(guān)表達(dá)栽體和啟動(dòng)子在植入中表達(dá)外源基因的應(yīng)用，可見，美國專利5188642,5349124,5352605,和5034322號(hào)(已獲作者同意)，已開發(fā)出很多通過互補(bǔ)黏性末端連接的方法將DNA與載體相接。例如，互補(bǔ)的均聚物片段可加到待插的DNA片段和載體DNA上。這樣，栽體和DNA片段，即通過互補(bǔ)的均聚物尾由氫鍵相聯(lián)以形成重組DNA分子.另一方法，可用合成的含有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)的連接片段將DNA連接于表達(dá)載體，將平端DNA片段與大量合成連接片段，在連接酶存在的條件下培養(yǎng)，使合成的連接片段與平端DNA片段相接這類連接酶，如噬菌體T4DNA聯(lián)接酶，可以催化平端DNA片段分子的連接。反應(yīng)結(jié)果是使DNA片段在尾部接有合成連接片^殳，用適宜的內(nèi)切酶消化DNA片段，用相同的酶消化表達(dá)栽體，使其產(chǎn)生與合成連接片段互補(bǔ)的DNA末端，然后將含有連接片段的DNA與表達(dá)載體連接。許多公司出售含有不同內(nèi)切酶位點(diǎn)的合成連接片段。如NewEnglandBiolabs，Beverly,MA.導(dǎo)入相同的植物細(xì)胞，也可以將各成份分別導(dǎo)入不同植物細(xì)胞，再通過雜交的方法產(chǎn)生最終含有所需全部成份的植物。很多方法可用于將編碼本發(fā)明的免疫球蛋白的核苷酸序列導(dǎo)入真核細(xì)胞。例如，土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化孢粉基因?qū)?，注射入生殖器官和注射入未成熟胚胎等。每一種方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)。這樣，對(duì)一種真核細(xì)胞或植物細(xì)胞有效的基因?qū)敕椒赡軐?duì)其這種真核細(xì)胞和植物細(xì)胞不適宜。土壤桿菌介導(dǎo)的基因?qū)敕ㄊ且环N廣泛用來轉(zhuǎn)導(dǎo)基因入植物細(xì)胞的方法。DNA可以被直接導(dǎo)入整個(gè)植物組織，而略去了從原生質(zhì)體再生完整植物的需要。這種DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法，已廣有報(bào)道。如，由Fruley等所述的方法，Biotechnology,3:629(1985)和Rogers等，MethodsinEnzymology,153:253-277(1987)。進(jìn)一步Ti-DNA的整合是一個(gè)精細(xì)的過程。被導(dǎo)入的DNA片段較長，通常亦可能令將干擾性DNA導(dǎo)入植物基因組，如，Spielmann等.，mol.gen.Genet.'205:34(1986)和Jorgensen等.，Mol.gen.Genet.,207:471(1987)所述?，F(xiàn)在的土壤桿菌轉(zhuǎn)化載體可在大腸桿菌和土壤桿菌復(fù)制，這樣即可允許適宜的修整，Klee等.，inPlantDNAInfectiousAgents,T:Hohn和丄Schell編，Springerverlag,NEWYORK(1985)pp.179-203最近有關(guān)土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)入栽體的技術(shù)發(fā)展，已改進(jìn)了栽體內(nèi)基因和內(nèi)切酶位點(diǎn)的排列，使其更宜被組建為表達(dá)不同多肽編碼基因的表達(dá)栽體，由Rogers等.，methodsinEnzymology,153:253(1987),所述的載體具有方便的多聯(lián)結(jié)合區(qū)且與直接表達(dá)插入多肽編碼基因的啟動(dòng)子和多聚腺香酸位點(diǎn)相連，因而，適宜于本目的。土壤桿菌介導(dǎo)的葉片和其它組織的轉(zhuǎn)化似乎僅限于土壤桿菌能夠自然感染的植物種屬。這樣土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在雙子葉植物中最有效。然而，用土壤桿菌轉(zhuǎn)化天門冬植物也已成功，見，B.ytebier等.，Proc.Natl.Acad.Sci.,84:5345(1987)。在這些土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的有效的植物種屬中，便利和基因轉(zhuǎn)入的限制性質(zhì)決定了方法的選擇。然而，盡管應(yīng)用土壤桿菌載體已產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因的天門冬植物。基本上沒有單子葉植物可作為土壤桿菌的自然宿主。Bytebier等.，Proc.Natl.Acad.sci.U.S.A.,84:5345(1987),所以商業(yè)上很重要的谷物類，如，稻米，玉米和麥必須用其它的方法轉(zhuǎn)化。植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化可用磷酸鈣沉淀，聚乙二醇處理，電導(dǎo)或上述方法的組合來實(shí)現(xiàn)，見，Potrykus等.，Mol.Gen.Genet.，199:183(1985);Lorz等.，Mol.Gen.Genet.,199:178(1985);F誦m等.，Nature,319:791(1986);Uchimiya等.，Mol.Gen.Genet,204:204(1986);Callis等.，GenesandDevelopment,1:U83(1987)和Marcotte等.，Nature,335:454(1988)。這些系統(tǒng)對(duì)不同植物種屬的應(yīng)用依賴于從原生質(zhì)體再生特殊植物的能力。從原生質(zhì)中再生谷物的證明方法見，F(xiàn)ujimura等.，PlantTissuecultureLetters,2:74(1985);Toriyama等.，Theor.Appl.Genet,73:16(1986);Yamada等.，PlantCellRep.,4:85(1986);Abdullah等.，Biotechnology,4:1087(1986)。為成功轉(zhuǎn)化不能從原生質(zhì)再生的植物種屬，其它將DNA導(dǎo)入完整細(xì)胞和組織的方法也可應(yīng)用。例如，從未成熟的胚胎中再生谷物。見，Visil.,Biotechnology,6:397(1988)。另外，也可應(yīng)用"粒子槍"或高速微注射的技術(shù)，應(yīng)用這種方法，DNA附在小的金屬粒子(0.252um)上，以每秒鐘1至幾百米的速度穿過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。Klein等.，Nature327:70(1987);Klein等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:8502(1988)和McCabe等.，Biotechnology6:923(1988)。金屬粒子穿越細(xì)胞各層，使得組織內(nèi)細(xì)胞得以轉(zhuǎn)化。金屬粒子已用來成功地轉(zhuǎn)化了玉米細(xì)胞，使其發(fā)芽，穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化了煙草和宿主植物。這種轉(zhuǎn)化省略了原生質(zhì)體發(fā)育階段，加速了轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)。DNA也可直接導(dǎo)入孢粉，見ZHOU等.，MethodsinEnzymology,101:433(1983);D.Hess.，InternRev.Cytol.,107:367(1987);Luo等.，PlantMol.Biol.Reporter.,6:165(1988),多肽編碼基因的表達(dá)也可通過將DNA注射入植物的生殖器官而獲得，Pena等.，Nature,325:274(1987)。DNA也可直接注射入未成熟的胚胎細(xì)胞或腦干之后再水化的細(xì)胞內(nèi)。Neuhaus等.，Theor.Apl.Genet,75:30(1987);Benbrook等.，inProceedingsBioExpo1986,Butterworth,stoneham,MA,pp.27-54(1986)?？蓮膯我恢参镌|(zhì)體或再植物中再生植物。見，A.Weissbach和H.Weissbach主編.，MethodsforplantmolecularBiology,AcademicPress,Inc.,SanDiego，CA(1988)。這種再生和生長過程。包括，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇與發(fā)芽。植根轉(zhuǎn)化細(xì)胞的芽和植物在土壤中生長等步驟，從葉子已成功地再生了含有由土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化有效的植物，Horsch等,，Science,227:1229-1231(1985)。在此過程中被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在逸擇劑中生長并在誘導(dǎo)再生的培養(yǎng)基中再生植物的芽。Fraley等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:4803(1983),此過程通常為兩到四周內(nèi)產(chǎn)生芽，這些轉(zhuǎn)化的芽轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的適當(dāng)?shù)恼T根培養(yǎng)基中，加入抗菌素以防止細(xì)菌生長，轉(zhuǎn)化的芽在有逸擇性存在的條件下生根，然后移植入土，使根生長，已知依據(jù)不同的植物種屬，這些過程是有變化的。本發(fā)明的免疫球蛋白可以在任何植物細(xì)胞中生產(chǎn)。這些植物細(xì)胞可源于雙子葉，單子葉植物，茄屬植物，苜蓿，豆科植物或煙草。應(yīng)用任何方法均可轉(zhuǎn)化有性繁殖的植物種屬細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。所用的雙子葉植物有煙草，西紅柿，苜蓿，橡樹，槭樹等。單子葉植物有百合花，草，玉米，谷物包括燕麥，小麥和大麥，蘭花，駑尾屬植物，洋蔥和棕櫚。低等植物任何無花植物，包括羊齒植物，針葉樹，馬尾草，茗，活的樹疣，紅色海藻，棕色海藻，綠色海藻。蕨類植物的孢子體。除了保護(hù)性蛋白和免疫球蛋白起源的重鏈以外，本發(fā)明的植物細(xì)胞亦含有編碼免疫球蛋白起源的輕鏈的核苷酸序例，此輕鏈至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)。本發(fā)明的植物細(xì)胞在免疫球蛋白起源的重，輕鏈上含有抗原結(jié)合功能區(qū)，此功能區(qū)能夠與鏈-求菌S，Mutans血清型抗原d,g,c(原命名為S.mutansa，c,d,e,f,g,h抗原)結(jié)合。存在于這些植物細(xì)胞中的抗原結(jié)合功能區(qū)，亦能結(jié)合粘膜致病原以防止齲齒的發(fā)生本發(fā)明的植物細(xì)胞可為植物的一部分，亦可由這些植物細(xì)胞生長組成下列植物。如，單子葉植物，雙子葉植物，茄屬植物，煙草，或其它類的植物。D.含有攜保護(hù)性蛋白的免疫'球蛋白的混合物本發(fā)明旨在制備由本發(fā)明的免疫球蛋白和植物大分子構(gòu)成的混合物，通常，這些植物大分子可源于本發(fā)明所用的任何植物。植物大分子與免疫球蛋白可共存于植物細(xì)胞內(nèi)，植物細(xì)胞提取物或在植物中，與本發(fā)明的免疫球蛋白共存于混^^物中的植物大分子，包括雙磷酸核酮糖羧化酶，集光復(fù)合體，LH6,色素，二級(jí)代謝物或葉綠體.本發(fā)明的免疫球蛋白在混合物中的濃度約占除水體重的1%_99%,另外的混合物中，免疫球蛋白的濃度可在1%-50%之間(重量比)。亦有的混合物含免疫球蛋白的濃度為1%-25%本發(fā)明的混合物所含的植物大分子的濃度約占除水重量的1%-99%，通常，混合物的重量為免疫球蛋白和植物大分子的重量之和，當(dāng)免疫球蛋白的濃度高低有變化，植物大分子的濃度呈現(xiàn)相反變化，理想的情況下，植物大分子的濃度為50%-99°/。之間，更理想的混合物中，植物大分子的濃度為75%-99%之間。本發(fā)明旨在制備的混合物由下面部分或全部構(gòu)成一條IgA重鏈，一條K或鏈，一條J鏈。這些組分組成的復(fù)合體與已述的保護(hù)性蛋白結(jié)合，混合物亦含有植物起源的大分子。通過提取獲得含有功能性抗體和植物大分子的混合物，提取方法包括應(yīng)用剪力(達(dá)因/cm2),破碎含有復(fù)合體的植物原地孢質(zhì)，而釋出上述的復(fù)合體。整個(gè)植物或植物的提取物含有抗體和不同其它的植物大分子，混合物中的植物大分子有雙磷酸核酮糖羧化酶，或雙磷酸核酮糖羧化酶的片段。另一大分子為LHCP,另外亦有葉綠體，剪力是破碎植物的原地胞質(zhì)的有效方法。其它類型的力亦可用于影響剪力而使其更有效。如約1磅/平方英寸的直接壓力可以增加剪力的效應(yīng)。常規(guī)應(yīng)用的勻漿技術(shù)，包括高速打碎和磨碎能破壞所有的植物結(jié)構(gòu)，因而，不適于抗體的提取。本發(fā)明旨在制備由本發(fā)明的免疫球蛋白和植物大分子構(gòu)成的混合物，通常，這些植物大分子可源于單子葉植物，雙子葉植物，如茄屬植物，煙草，或其它類的植物。混合物中的植物分子，可能是雙磷酸核酮糖羧化酶，集光復(fù)合體，LH6，色素，二級(jí)代謝物或葉綠體及其它植物分子，其它提取含免疫^^蛋白混合物的方法，包括用不同的試劑提取或應(yīng)用其它方法。含有免疫球蛋白的i發(fā)明混合物的免疫球蛋白濃度可占除水外重量的1%-99%。植物大分子的濃度亦可在1%_99%之間。含有本發(fā)明免疫球蛋白和植物大分子的治療性混合物的制備，包括在一定壓力下，應(yīng)用剪力制備植物部分的勻漿，此勻漿中含有治療性免疫球蛋白和植物大分子。植物大分子源于舍有液體和固體成份的植物原生質(zhì)和共生質(zhì)。進(jìn)一步加工將植物的固體部分和含有免疫球蛋白的液體部分分離。用于這種加工的原始材料，可包括植物的葉，莖，根，管，籽，果或完整的植物。通常，應(yīng)用特殊的機(jī)械裝置，使液體從植物的原生質(zhì)和共生質(zhì)中釋放出來，然后用離心沉淀，絮凝或過濾的方法，分離植物的固體成份和液體成份，已知用這些分離方法可將固體成份從含有免疫球蛋白的液體成份中分離出來，本發(fā)明的這些方法可生產(chǎn)特殊的免疫球蛋白，其含有保護(hù)性蛋白，和由免疫球蛋白a或r鏈的功能區(qū)組成的免疫球蛋白重鏈。這些方法也可生產(chǎn)含有保護(hù)性蛋白和由K區(qū)或人鏈的功能區(qū)組成的免疫球蛋白輕鏈的免疫球蛋白，本發(fā)明的方法適用于植物細(xì)胞或植物的各部分。這些方法中也可進(jìn)一步包括生長植物的方法。本方法適用于任何植物，包括單子葉植物，雙子葉植物，茄屬植物，煙草，或其它類的植物。本方法可用于從植物的各部分包括葉，莖，根，管，籽，果或完整的植物中提取免疫球蛋白。本方法可用特殊的機(jī)械裝置，剪力作用使液體從植物的原生質(zhì)和原地胞質(zhì)中釋放出來。應(yīng)用下例方法可將本發(fā)明的勻漿中的固體植物成份移除，如離心，沉降，絮集或過濾.E.生產(chǎn)含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的生產(chǎn)含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的方法包括以下步驟1.將含有編碼保護(hù)性蛋白的核苷酸序列與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子相連，并接于表達(dá)栽體，導(dǎo)入植物細(xì)胞。2.將編碼含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)免疫球蛋白起源的重鏈的核苷酸序列與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子相連，并接于表達(dá)載體，導(dǎo)入相同的植物細(xì)胞。本發(fā)明的方法包括導(dǎo)入植物細(xì)胞兩種栽體，一種為編碼保護(hù)性蛋白的序列，另一種是至少部分編碼含有抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白重鏈序列，二者均與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子相連，此方法亦包括導(dǎo)入植物細(xì)胞下例已與啟動(dòng)子相連的序列編碼保護(hù)性蛋白的序列，編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈的序列，和編碼J鏈的序列，這樣即產(chǎn)生了含有與啟動(dòng)子相連的編碼免疫球蛋白重鏈，輕鏈，J鏈和保護(hù)性蛋白序例的細(xì)胞。本發(fā)明的植物細(xì)胞可作為能生長的植物的一部分用于本發(fā)明的植物，包括單子葉植物，雙子葉植物有茄屬植物，煙草，西紅柿或其它類的植物。本發(fā)明的方法，包括在真核細(xì)胞中生產(chǎn)裝配完成的免疫球蛋白重鏈，輕鏈，J鏈和保護(hù)性蛋白。將編碼含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白重鏈序列，含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白的輕鏈序列，免疫球蛋白J鏈序列和保護(hù)性蛋白序列，與表達(dá)栽體相聯(lián)，導(dǎo)入細(xì)胞，從而構(gòu)建此種真核細(xì)胞。這些需表達(dá)的核苷酸序列分別與適宜的啟動(dòng)子相連或單一啟動(dòng)子與多于一種核苷酸序列相連，依次序編碼不同的分子.含有編碼免疫球蛋白重鏈，輕鏈，J鏈和保護(hù)性蛋白序列的真核細(xì)胞，在適宜的條件下培養(yǎng)以使這些分子能夠再生并裝配成為本發(fā)明的含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白.本發(fā)明所用的方法可使特殊的免疫球蛋白或抗原結(jié)合功能對(duì)環(huán)境條件更具抗力，即更穩(wěn)定，這種方法是將編碼至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白重鏈的核苷酸序列與編碼至少含有一個(gè)功能區(qū)的免疫球蛋白a或n鏈的核苷酸相連，形成編碼嵌合免疫球蛋白重鏈。這種編碼嵌合免疫球蛋白重鏈的核苷酸序列在真核細(xì)胞中表達(dá)。這種真核細(xì)胞同時(shí)也含有下例之一的分子保護(hù)性蛋白，至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的輕鏈，免疫球蛋白J鏈。理想的情況是細(xì)胞含有所有的分子，包括免疫球蛋白起源的輕鏈，其輕鏈含有與免疫球蛋白重鏈互補(bǔ)的抗原結(jié)合功能區(qū)。這種方法使嵌合免疫球蛋白重鏈至少與一種其它的分子裝配，如具有互補(bǔ)性抗原結(jié)合功能區(qū)的輕鏈，免疫球蛋白J鏈和保護(hù)性蛋白，以形成含有對(duì)環(huán)境條件有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白.這些免疫球蛋白對(duì)環(huán)境條件具有抗力，即當(dāng)遇到升高或降低溫度，PH高低變化，高，低離子濃度，蛋白酶或其它嚴(yán)守條件使能夠更穩(wěn)定。這樣的嚴(yán)苛條件，通常如自然水源，人體內(nèi)等條件如內(nèi)臟內(nèi)或粘膜表面和動(dòng)物的表面。F.含有保護(hù)性蛋白的嵌合免疫球蛋白。本發(fā)明意在構(gòu)建含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白，構(gòu)成此種免疫球蛋白重鏈和輕鏈的功能區(qū)可源于由不同亞型免疫球蛋白來源的區(qū)域構(gòu)成重鏈或輕鏈的免疫球蛋白.應(yīng)用分子技術(shù)，這些功能區(qū)可由相似的功能區(qū)所取代，這樣即產(chǎn)生了兩種不同免疫球蛋白分子雜交的免疫球蛋白，這種嵌合性免疫球蛋白使構(gòu)建的含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白具有不同免疫球蛋白功能區(qū)所賦予的不同性能.本發(fā)明亦構(gòu)建含有重鏈和輕鏈和J鏈的嵌合免疫球蛋白，但其功能區(qū)并非完整的不同分子的功能區(qū)。應(yīng)用相同的分子技術(shù)，可以構(gòu)建這樣的嵌合性免疫球蛋白。在優(yōu)化實(shí)例中，本發(fā)明的免疫球蛋白至少杏有小鼠IgG,IgGl，IgG2A,IgG2B,IgG3，IgA,IgE，IgD的CHl，CH2,CH3功能區(qū)。另外的實(shí)例中，免疫球蛋白功能區(qū)至少含有小鼠的IgM的Cul,Cu2,Cu3,或Cu4功能區(qū)。另有含有小鼠IgE的Cs2，Cs3,和Cs4功能區(qū)的免疫球蛋白.此發(fā)明同時(shí)構(gòu)建源于人免疫球蛋白的嵌合免疫球蛋白，這些嵌合免疫球蛋白含有兩種人的不同亞型免疫球蛋白功能區(qū)。理想的實(shí)例為免疫球蛋白含有人的IgG,IgGl，IgG2,IgG3,1gG4,IgE,IgAl,IgA2或[gGD;人的IgM的CH1,CH2，或CH3,或Cu4功能區(qū)。本發(fā)明亦組建含有兩種不同哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白亞型來源的功能區(qū)的免疫球蛋白.一般來說，任何哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白均可用于此目的，如下例亞型IgG所有亞型，IgA所有亞型，IgE,IgM或IgD。的穩(wěn)定區(qū)功能區(qū)之一，L、5—、、本發(fā)明亦構(gòu)建源于嚙齒動(dòng)物免疫球蛋白的嵌合蛋白，這些蛋白舍有不同亞型免疫球蛋白功能區(qū)，嚙齒動(dòng)物免疫球蛋白亞型已為人知，本發(fā)明的免疫球蛋白可含有至少下例之一功能區(qū)的免疚球蛋白起源的重鏈，小鼠IgG>IgGl,IgG2a，IgG2b,IgG3,IgAl,IgA2或IgD的CH1,CH2，CH3功能區(qū)。小鼠IgE或IgM的CH1，CH2,CH3，或CH4功能區(qū)，人IgG，IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgAl，IgA2或IgD的CH1,CH2，CH3功能區(qū)。人IgE或IgM的CHl，CH2,CH3或CH4功能區(qū)，哺乳動(dòng)物的IgG，IgA,IgE,IgM或IgD的亞型上的CHl,CH2或CH3功能區(qū)。哺乳動(dòng)物的IgE或IgM的CHl,CH2,或CH3，或CH4功能區(qū)，噴齒類IgG，IgA,IgE,IgM或IgD的亞型上的CH1,CH2，或CH3功能區(qū)。嚙齒類的IgE或IgM的CHl,CH2,或CH3，或CH4功能區(qū)。動(dòng)物IgG亞型，IgA，IgE或IgD亞型的CH1，CH2,CH3功能區(qū)，動(dòng)物IgE或IgM的CHI，CH2,CH3,或CH4功能區(qū)。本發(fā)明亦旨在應(yīng)用免疫球蛋白超家族起源的分子的蛋白功能區(qū)替代相應(yīng)功能區(qū)，屬于免疫球蛋白超家族的分子的氨基酸和核苷酸序列與免疫球蛋白具有同源性，可用氨基酸或核苷酸序列的同源性識(shí)別屬于免疫球蛋白超家族部分的分子。見P361。ImmunoglobulinGenes，AcademicPress(1989),.四重轉(zhuǎn)基因組織本發(fā)明構(gòu)建四重轉(zhuǎn)基因組織，即由已轉(zhuǎn)入四種不同基因，每一基因均編碼不同多肽的細(xì)胞或植物組成。這些轉(zhuǎn)基因是不同的一種轉(zhuǎn)基因的信息RNA和多肽與其它另外幾種轉(zhuǎn)基因的信息RNA和多肽是不同，這樣，拷貝數(shù)。、本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因組織含有四種轉(zhuǎn)基因，并作其它轉(zhuǎn)基因的相同復(fù)制，本發(fā)明并不排除四種轉(zhuǎn)基因中各基因有多拷貝數(shù).的可能性，然后，至少在轉(zhuǎn)基因組織的細(xì)胞中存在四種不同的轉(zhuǎn)化基因。另外，本發(fā)明構(gòu)建四種不同轉(zhuǎn)基因具有關(guān)聯(lián)，即，每一轉(zhuǎn)基因所編碼的多肽均為復(fù)合肽分子的一部分。所以，本發(fā)明認(rèn)為復(fù)合肽分子中的每一多肽存在于轉(zhuǎn)基因組織的單一細(xì)胞內(nèi)，復(fù)合肽分子中的每一多肽的表達(dá)，使得在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不同的多肽相互結(jié)合而形成復(fù)合肽分子。這樣，本發(fā)明單一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)四種基因，而各編碼蛋白的轉(zhuǎn)基園相互無關(guān)聯(lián)的情況，這種相互無關(guān)的多重轉(zhuǎn)基因的例子，可見于的轉(zhuǎn)基因，如卡那霉素或新霉素或腺芬激酶等抗菌素抗性多肽。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化基因編碼以下四種不同基因的多肽保護(hù)性蛋白，含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的重鏈，含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)免疫球蛋白起源的輕鏈，和免疫球蛋白J鏈.另一實(shí)例為轉(zhuǎn)基因組織中的轉(zhuǎn)基因之一為編碼嵌合免疫球蛋白重鏈，輕鏈或J鏈的基因，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因組織中的轉(zhuǎn)化基因之一也可是編碼部分免疫球蛋白重鏈，此被編碼部分是源于IgA或IgM的免疫球蛋白，亦可以是編碼部分氨基酸序列，此部分序列源于IgA或IgM的免疫球蛋白。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因組織，包括哺乳動(dòng)物，植物，嚙齒類動(dòng)物，二棲類動(dòng)物，昆蟲，爬行類動(dòng)物，魚或其它生物。本發(fā)明的理想實(shí)例的轉(zhuǎn)基因組織是植物或哺乳動(dòng)物，這些組織的產(chǎn)生方法已為所知，見U.S專利4736866,4607388，4870009,4873191。(均經(jīng)作者同意)本發(fā)明亦構(gòu)建一種免疫球蛋白，此種免疫球蛋白含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈，但其功能區(qū)已經(jīng)加工使其功能區(qū)在特殊種屬中的免疫源性減低。通常，加工免疫球蛋白分子使其"人類化"，即盡管該分子源于其它不同種屬，但更類似人免疫球蛋白。實(shí)施例以下列的實(shí)例說明本發(fā)明，而這些實(shí)施例并非限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l.構(gòu)建植物中表達(dá)抗體的DNA栽體，a.提取編碼Guy's13免疫球蛋白的核苷酸序列，用Ma等Eur.J.Immunol,24:131(1994)所述的方法克隆，Guy'13抗S.mutans抗體的r和k鏈。簡述之從Guy's13雜交瘤中提取mRNA，用標(biāo)準(zhǔn)程序反轉(zhuǎn)為cDNA,應(yīng)用與r或k的cDNA互補(bǔ)的特異性寡聚核脊酸片段擴(kuò)增cDNA,在PCR中擴(kuò)增如前所述，由Taql聚合酶催化完成。擴(kuò)增后的cDNA經(jīng)適宜的限制性內(nèi)切酶消化后，連與標(biāo)準(zhǔn)的植物表達(dá)栽體的相互酶切位點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)告有許多種此類栽體，本例所用為pBIN19,在相關(guān)的一系列實(shí)驗(yàn)中，將cDNA克隆入細(xì)菌載體，應(yīng)用此結(jié)構(gòu)依Maxam和Gilbert方法，確定r和kcDNAs的序列。用PCR克隆抗體cDNA,構(gòu)建cDNA文庫并將cDNA插入適宜載體等技術(shù)是人們所熟知的常用技術(shù)，b.編碼Guy's13重鏈可變區(qū)，部分r鏈穩(wěn)定區(qū)和部分a鏈穩(wěn)定區(qū)的雜交cDNA,如，Ma等Eur.J.Immunol.24:131(1994)所述的方法克隆，然后如上所述，連入適當(dāng)?shù)闹参锉磉_(dá)載體。最終結(jié)構(gòu)如下Guy's13可變區(qū)-(IgGlCHl)-(IgGlCH2)-(IgACH2)-(IgACH3)，以上作為IgG2A重鏈；Guy'sl3可變區(qū)-(IgGlCH2)-(IgACH2)-(IgACH3),C保護(hù)性蛋白和J鏈克隆的兔多聚免疫球蛋白受體(plgR)cDNA如Mostov,Nature308:37(1984)所述，并示于圖8。保護(hù)性蛋白部分可通過PCR擴(kuò)增編碼pIgR的部分核苷酸序列，并連與適宜的植物表達(dá)栽體而獲得，用于此結(jié)構(gòu)中的plgR的保護(hù)性蛋白部分包括編碼第1個(gè)至第,606氨基酸的密碼子。此方法已廣為所知。所用寡聚核苷酸為plgR的核苷酸序列，d.編碼重鏈穩(wěn)定區(qū)的糖基化衍生物的cDNA按照基因突變的方法，進(jìn)行突變實(shí)驗(yàn)。每種情況(a穩(wěn)定區(qū)或保護(hù)性蛋白)均將天冬氨酸的密碼子作為糖化位點(diǎn)，將其改為組氨酸。實(shí)施例2.表達(dá)治療性抗體的轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)具有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的植物或植物細(xì)胞的生產(chǎn)方法如下a.載體轉(zhuǎn)入土壤桿菌用土壤桿菌完成植物的轉(zhuǎn)化，在能夠提供轉(zhuǎn)入功能的輔助細(xì)胞抹(pRK2013)存在的條件下，攜有重組的pMON530植物表達(dá)栽體的大腸桿菌DH52與土壤桿菌雜交，另一方法是用直接轉(zhuǎn)化的方法將PMON530質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)入土壤桿菌，在此程序中，土壤桿菌細(xì)胞抹首先在YEP培養(yǎng)基中，28度生長過夜，將2ml過夜培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入50ml。YEP培養(yǎng)基中，使其生長至OD600達(dá)1.0。然后將細(xì)胞冷卻至4度，離心沉淀細(xì)胞.將細(xì)胞重新懸浮在lml預(yù)冷的20mMCacl2中。每0.1ml冷卻的細(xì)胞懸浮中加入lugDNA,用液氮或干水酒精浴，快速冷凍細(xì)胞然后，在37度條件下，5分鐘溶解細(xì)胞后，加入lmlYEP培養(yǎng)基。搖動(dòng)培養(yǎng)細(xì)胞2-4小時(shí)，在含有適當(dāng)抗菌素的YEP瓊脂板上分離含有重組載體的單克隆。含有PMON530的土壤桿菌在含有卡那霉素，放線壯觀素和氯霉素的培養(yǎng)基中生長，小片煙葉與土壤桿菌共培養(yǎng)2天后，葉片轉(zhuǎn)入含有羧卞青霉素的培養(yǎng)板上，以殺滅土壤桿菌.轉(zhuǎn)化的葉細(xì)胞再生為完整植物的過程可在卡那霉素存在的條件下進(jìn)行，直至植物能夠在土壤中生長，b.轉(zhuǎn)化的煙草和牽牛花的再生暖房中生長的煙草或牽?；ㄈ~置于2%Chlorox漂白粉和0.1。/。SDS中。在室溫浸于70%酒精后置于滅菌的培養(yǎng)板上干燥，用打孔機(jī)取出約0.5cm直徑大小的葉片，置于含有MS10培養(yǎng)基的瓊脂板上(每升MS10培養(yǎng)基含有4.4克Muroshige和Skoog基本鹽和基本有機(jī)物，30克蔗糖，0.2毫克萘乙酸，2毫克千氨基嘌呤，O.l毫克煙酸，O.l毫克吡嗜素，O.l毫克維生素Bl,IO克瓊脂，用氫氧化鉀調(diào)至PH5.7),將2ml含有土壤桿菌的培養(yǎng)液，(約含1x10的8次方土壤桿菌/ml)加至葉片上。葉片的表面要完全與土壤桿菌接觸，傾倒多余液體。葉片與細(xì)菌在室溫共培養(yǎng)2天。葉片然后轉(zhuǎn)至含有50ug/ml卡那霉素，和25ug/ml羧節(jié)青霉素的MS10培養(yǎng)基(MS10)的瓊脂板上。每周將葉片轉(zhuǎn)至新鮮的MS10，KC培養(yǎng)板上。直至可見體細(xì)胞胚芽，再將胚芽轉(zhuǎn)至含MSIO-KC培養(yǎng)基的瓊脂板上，(每升MS10-KC培養(yǎng)基含有4.4克Muroshige和Skoog基本鹽和基本有機(jī)物。30克蔗糖，l毫克煙酸，l毫克吡。多素，0.1毫克維生素Bl,50ug/ml卡那霉素和25ug/ml羧節(jié)青霉素，10克瓊脂>用氫氧化鉀調(diào)至PH5.7),新芽形成后，將植物移入土壤，生長至成熟，C.轉(zhuǎn)化的苜蓿的再生暖房中生長的苜蓿葉置于20%Chlorox漂白粉和0.1。/oSDS中。在室溫浸泡8分鐘以消毒，然后浸于70%酒精后置于滅菌的培養(yǎng)板上干燥。用消毒剪刀切下1x4厘米直徑大小的葉片，置于含有B5H培養(yǎng)基的瓊脂板上(每升B5H培養(yǎng)基含有3.3克Gamborg's的培養(yǎng)基粉，500毫克硝酸鉀，250毫克7水疏酸鎂，30克蔗糖，500毫克脯氨酸，l毫克2.4二氯苯氧乙酸，IOO維克激動(dòng)素，IOO毫克肌醇，1毫克煙酸，1毫克吡哆素，IO毫克維生素BI,IO克瓊脂，30ml氨基酸貯存波，氫氧化鉀調(diào)至PH5.7)。氨基酸貯存液高壓消毒后.的培養(yǎng)基冷卻至約50度時(shí)，每升中加入26.6克L-谷氨酰胺，3.32克絲氨酸，16.8毫克腺嘌呤，333毫克谷胱甘肽。2ml含有土壤桿菌的培養(yǎng)液(約含1x10的8次方土壤桿菌/ml)葉片的表面要完全與土壤桿菌接觸，傾倒多余液體。葉片與細(xì)菌在室溫共培養(yǎng)2天。葉片然后轉(zhuǎn)至含有25ug/ml卡那霉素，和250ug/ml羧芐青霉素的B5H培養(yǎng)基的瓊脂板上。每周將葉片轉(zhuǎn)至新鮮的B5H-KC培養(yǎng)板上，直至可見再生芽。再將再生芽轉(zhuǎn)至含B5H_KC培養(yǎng)基的瓊脂板上.(每升B5H-KC培養(yǎng)基含有25毫升大分子營養(yǎng)物，IO毫升小分子營養(yǎng)物，25毫升鐵，30克蔗糖，1毫升維生素，1毫升氨基酸混合物，2克酵母提取液，25毫克卡那霉素，250毫克羧千青霉素，IOO毫克肌醇，IO克瓊脂，氮氧化鉀調(diào)至PH5.9)。大分子營養(yǎng)物的40倍貯存液每升含40克KN03，40克NH4N03,13.88克Ca(N03)2-4FUO,14克MgS04-7H20,2.6克KC1,12克KH2P04。維生素100倍貯存液每升含有100毫克鹽酸維生素Bl,500毫克煙酸，ioo毫克鹽酸吡p多素。氨基酸混合物1000倍貯存液每升含2克甘氨酸。小分子營養(yǎng)物的100倍貯存液每升含有580毫克MnSO4-4H20，l550毫克ZnS04-7H20，160克H3B03,80毫克KI。鐵的40倍貯存液為每升含1.28克NaFeEDTA。新芽形成后，將植物移入土壤，生長至成熟。d.轉(zhuǎn)化的西紅柿的再生暖房中生長的7天的西紅柿置于2%Chlorox漂白粉和0.1。/。SDS中。在室溫浸泡8分鐘以消毒。然后浸于70%酒精后置于滅菌的培養(yǎng)板上干燥。用消毒剪刀切下約0.5cm直徑大小的葉片，置于含有用打孔機(jī)取出約0.5cm直徑大小的葉片，置于含有MS4培養(yǎng)基的瓊脂板上(每升MS4培養(yǎng)基含有4.4克Muroshige和skoog基本鹽和基本有機(jī)物。30克蔗糖，2毫克N6-異戊烯腺嘌呤核苷，0.5毫克吡嗜素，0.5毫克維生素B1，5毫克煙酸，lmM乙酰丁香酮，10克瓊脂，氫氧化鉀調(diào)至PH5.7),2ml含有土壤桿菌的培養(yǎng)液(約含1x10的8次方土壤桿菌/ml)加至葉片，葉片的表面要完全與土壤桿菌接觸，傾倒多余液體。葉片與細(xì)菌在室溫共培養(yǎng)2天。葉片然后轉(zhuǎn)至含有50ug/ml卡那霉素，和250ug/ml羧節(jié)青霉素的MS4培養(yǎng)基的瓊脂板上。每周將葉片轉(zhuǎn)至新鮮的MS4-KC培養(yǎng)板上。直至可見再生芽。再將再生芽轉(zhuǎn)至含MSO-KC培養(yǎng)基的瓊脂板上。(每升MSO-KC培養(yǎng)基含有4.4克Murshige和Skoog基本鹽和基本有機(jī)物，30克蔗糖，1毫克煙酸，1毫克吡哆素，IO毫克維生素BI,250ug/ml羧卞青霉素和50ug/ml卡那霉素，IO克瓊脂，氫氧化鉀調(diào)至PH5.7),新芽形成后，將植物移入土壤，生長至成熟。e.轉(zhuǎn)化的Arabidopsis植物的再生在無菌培養(yǎng)中生長的完整的Arabid叩sisthalliana的根插入誘導(dǎo)培養(yǎng)CIM基中，28度避光培養(yǎng)3天。(每升CIM含3.1克Gamborg's培養(yǎng)基粉，30克蔗糖，l毫克2.4二氯苯氧乙酸，IOO微克激動(dòng)素，l毫克肌醇，O.l毫克煙酸，0.1毫克吡噴素，O.l毫克維生素Bl，8克瓊脂，氫氧化鉀調(diào)至PH5.7)。將2ml含有土壤桿菌的培養(yǎng)液(約含1x10的8次方土壤桿菌/ml)加至根上，根的表面要完全與土壤桿菌接觸，傾倒多余液體。將根切成5mm片段，與細(xì)菌在28攝氏度共培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)至含有50ug/ml卡那霉素，和250ug/ml羧千青霉素的SIM培養(yǎng)基的瓊脂板上.(每升SIM培養(yǎng)基含有3.1克Gamborg's培養(yǎng)基粉，30克嚴(yán)糖，5毫克N6-(2-異戊烯基腺噪呤，150微克p引哚-3-乙酸，1毫克肌醇，0.1毫克煙酸，0.1毫克吡嗜素，O.l毫克維生素Bl,8克瓊脂，氫氧化鉀調(diào)至PH5.7)。每周將葉片轉(zhuǎn)至新鮮的SIM培養(yǎng)板上，直至可見再生芽，再將再生芽轉(zhuǎn)至含有EM培養(yǎng)基的瓊脂板上，(MSO-KC每升含4.4克Murshige和Skoog基本鹽和基本有機(jī)物，IO克蔗糖，l毫克"引哚-3-丁酸，l毫克煙酸，0.1毫克吡,素，0.1毫克維生素Bl,250ug/ml羧卞青霉素，8克瓊脂，氬氧化鉀調(diào)至PH5.7)。新芽形成后，將植物移入土壤，生長至成熟。實(shí)施例3.轉(zhuǎn)基因植物的識(shí)別應(yīng)用前述的ELISA方法識(shí)別表達(dá)單一免疫球蛋白鏈的卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體，進(jìn)一步的分析包括用如Maniatis所述的Northernblotting檢驗(yàn)RNA。用Westernblotting查驗(yàn)免疫球蛋白多肽。每一免疫球蛋白鏈，抗原性物質(zhì)，RNA和蛋白均用相應(yīng)的方法檢驗(yàn)，用已認(rèn)證含有高水平免疫球蛋白鏈的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行交叉授粉.實(shí)施例4.通過轉(zhuǎn)化體交叉授粉裝配抗體交叉授粉的目的是為了獲得能夠共表達(dá)所設(shè)計(jì)抗體的不同成份的植物，.這些交叉授粉后產(chǎn)生的苜蓿，西紅柿，煙草和Arabidopsis含有下列已裝配的成份，所有成份均含有Guy's13抗原結(jié)合功能區(qū)，抗體類型1.2.4Gl重鏈G2/A重鏈G2/A重鏈Gl/A重鏈Gl/A重鏈免疫球蛋白組分k輕鏈k輕鏈k輕鏈J鏈k輕鏈J鏈k輕鏈保護(hù)性蛋白實(shí)施例5.從轉(zhuǎn)基因植物中提取和檢驗(yàn)Guy's131，2,3,4型抗體a.提取和富集葉子所含抗體將葉子剪碎成約lcm2大小，置于冷卻約4攝氏度的瓷臼中，加入含有10ug/mlle叩印tin的冷TBS溶液(每克葉加入lmlTBS),研磨碎片至植物液體釋出，繼續(xù)研磨直至碎片形成均勻的漿狀(約研磨3分鐘)，用50,000克4攝氏度離心沉降均漿，取出上清液。另一方法是使均漿通過100目孔徑的塑料網(wǎng)過濾。依據(jù)特殊植物中抗體的滴度，上清液可直接或富集至一定濃度后與抗原結(jié)合以控制抗體濃度，粗提物中IgGl和IgG/A的產(chǎn)率通常低于10ug/ml，平均為5ug/ml。用于粘膜表面的Guy'sl3抗體的濃度為1-4毫克/ml，對(duì)于1，2，3型結(jié)構(gòu)，Guy'sl3抗體需10-40倍濃縮以達(dá)到所需濃度。濃縮方法包括應(yīng)用親和吸收，(用蛋白A或蛋白G)或冰凍干燥，亦可用分子排除層析濃縮抗體，但此方法需要首先分離粗提物。用ELISA測試和聚丙酰胺凝膠電泳方法得知，1和2型的共表達(dá)且裝配完成的復(fù)合體分子量約為180-200千道爾頓，而3型則為400千道爾頓.常規(guī)得到的粗提物約含5-10ug/ml抗體，當(dāng)保護(hù)性蛋白與含3型抗體的植物雜交以產(chǎn)生含有4型抗體的植物時(shí)，抗體的濃度明顯增加，用ELISE測試和聚丙酰胺凝膠電泳方法，這種表達(dá)且裝配完成的復(fù)合體分子量約為400千道爾頓.常規(guī)粗提物的含量超過200ug/ml。平均約為25ug/ml。故而Guy's13抗體的SIgA結(jié)構(gòu)僅需少倍數(shù)濃縮即可達(dá)到所需濃度?？捎蒙厦缘募夹g(shù)完成濃縮。另外，已發(fā)現(xiàn)用分子量為200000道爾頓的超濾膜，超過濾可以很容易地將抗體與大部分植物大分子分離.、b.Guy's13.4型抗體的功能用ELISE測試抗體功能。所有表達(dá)抗體輕鏈和重鏈的植物可裝配成功能性抗體>功能性抗體具有與鏈球菌抗(SAI/II)特異結(jié)合的性質(zhì)。結(jié)合水平和滴度曲線與小鼠雜交瘤上清的滴度曲線和結(jié)合水平相似。僅表達(dá)J鏈或保護(hù)性蛋白的植物檢測不到與SAI/II的結(jié)合，同時(shí)不表達(dá)免疫球蛋白的野生型植物亦沒有可檢測到的結(jié)合，相同實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用抗分泌組分的抗血清，可檢測到抗體與固定的純化鏈球菌抗原或細(xì)菌細(xì)胞表面的原始抗原的結(jié)合。在這些測試中，只有4型抗體可測到結(jié)合。功能性的l,2,3,型抗體并不與抗分泌組分抗血清結(jié)合，這些結(jié)果證明了保護(hù)性蛋白在植物中裝配形成4型抗體結(jié)構(gòu)，但不影響與抗原的結(jié)合。實(shí)施例6.嵌合抗體的表達(dá)編碼小鼠單克隆抗體(mAbGuy's13)的重鏈和輕鏈的基因已克隆并在煙草中表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植物可被再生并分泌全長的Guy's13抗體通過處理重鏈基因序列，導(dǎo)入源于免疫球蛋白a重鏈的穩(wěn)定功能區(qū)，使植物分泌具有嵌合的a/r重鏈的Guy's13抗體。對(duì)每一植物抗體均用Westernblotting分析重鏈和輕鏈，應(yīng)用抗原結(jié)合測試方法，驗(yàn)證抗體裝配的忠實(shí)性和功能的完全性。進(jìn)一步，植物抗體保持了凝集鏈球菌的功能，此證明全長抗體的二價(jià)抗原結(jié)合能力是完整的。a.克隆重鋒和輕鏈基因應(yīng)用胍乙啶鹽酸/酚/氯仿提取法。從Guy，s13和小鼠IgA(M0PC315)雜交瘤細(xì)胞系中純化信息RNA。用小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶制備互補(bǔ)DNA。應(yīng)用PCR擴(kuò)增編碼Guy's13r和k鏈的DNA,PCR中所用的變性寡聚核苷酸，設(shè)計(jì)為擴(kuò)增的DNA片段5'端含有xhol位點(diǎn)，3'端含有ECoRI位點(diǎn)。經(jīng)內(nèi)切酶消化后。免疫球蛋白編碼DNA接入植物表達(dá)載體(pMON530)。該栽體中克隆位點(diǎn)上游，含有小鼠免疫球蛋白導(dǎo)引序列，將重組的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5-a，GibcoBRL)以放射性同位素標(biāo)記原始PCR產(chǎn)物作為探針，應(yīng)用SouthernBlotting篩逸轉(zhuǎn)化體。純化陽性轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA并導(dǎo)入土壤桿菌。應(yīng)用相同的方法構(gòu)建兩種雜交的Guy's13重鏈，圖1中所示的合成寡聚核苷酸用于PCR以擴(kuò)增以下功能區(qū)(a)Guy's13信號(hào)序列至CT1的3'端。(Jl-J5)'(b)Guy's13信號(hào)序列至CJ2功能區(qū)的3'端(J1-J2)。(C)Ca2功能區(qū)的5'端至MOPC315雜交瘤DNA的3'端(J3-J4),純化片段(Genecleanll,Bio101,LaJolla,CA)在37C用HindIII消化1小時(shí)，經(jīng)T4DNA連接酶催化。在16攝氏度作用16小時(shí)，連接Guy'sl3片段與MOPC315片段。用Guy'sl3的5'端和MOPC3153'端的寡聚核苷酸為引物。以上迷反應(yīng)的混合物為模板DNA,作進(jìn)一步的PCR,純化擴(kuò)增的DNA片段。如上所述，接入PMON530載體，本程序中所用的載體不含先前所述的插入的小鼠導(dǎo)引序列，此種情況下，在PCR擴(kuò)增過程中，已包括了編碼原始Guy's13導(dǎo)引序列的DNA。b.植物轉(zhuǎn)化和再生將經(jīng)表面消毒的煙草葉(Nicotianatabacum.var.xanthii)剪成6mm直徑大小葉片在28攝氏度與含有免疫球蛋白cDNA插入子重組土壤桿菌共培養(yǎng)過夜，將葉片轉(zhuǎn)至培養(yǎng)板中，其中的培養(yǎng)基含有200mg/l卡那霉素和500mg/1羧卞青霉素。并可誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，根出現(xiàn)后，立即將幼植物移植入土壤中。用下述方法篩選免疫球蛋白鏈的表達(dá)。通過交又授粉將表達(dá)重鏈的植物與表達(dá)輕鏈的植物雜交。所產(chǎn)生的籽種入土壤使其發(fā)芽，通過EUSE確定共有22個(gè)含有重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物再生。分泌重鏈和輕鏈的植物的雜交產(chǎn)生了3/10的植物表達(dá)k和r鏈的Fl子代植物，4/17的植物表達(dá)k鏈和Gl/A重鏈，3/8的植物表達(dá)k鏈和G2A重鏈。有三種不同形式的Guy's13單克隆抗體在植物中表達(dá)，所有均含相同的輕(K)鏈但含不同的重鏈。本報(bào)告中所用縮號(hào)例于下圖(圖1):植物G13:Guy's13IgGl與原始的r重鏈，植物G2/A:Guy's13IgGl與含var-rl-r2-a2-a3功能區(qū)的IgG/IgA雜交重鏈，小鼠Guy's13:作為陽性對(duì)照的Guy's13雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液。陰性對(duì)照植物為PMON530載體轉(zhuǎn)化的植物。其栽體含有編碼無關(guān)小鼠蛋白的插入子。C.抗體鏈的檢測應(yīng)用ELISA方法檢測r.k.或r/a雜交鏈的產(chǎn)生。用含有羊抗鼠重鏈或輕鏈IgG的TBS(150mMNacl20mMtris-HCl,PH8)溶液包被微滴度板，用含有5%無脂肪干牛奶的TBS在4攝氏度過夜阻斷。含有Leupeptin(10ug/ml)TBS中勻漿植物葉，將上清液經(jīng)二倍連續(xù)稀釋加入微滴度板，40攝氏度過夜孵育，用含有0.05%Tween-20的TBS洗涂后，在37攝氏度2小時(shí)，檢測試劑為2,2'-連氮基-雙-(3-乙基磺化苯噻唑啉)(Boehringer，F(xiàn)RG)，用連有辣根過氧化酶的羊抗鼠重鏈或輕鏈的特異性抗體檢測結(jié)合的免疫球蛋白鏈，應(yīng)用同樣的方法確定小鼠和植物Guy's13抗體的濃度。用已知濃度的小鼠IgGlmAB(M0PC21)和小鼠的IgAmAb(TEPc21)作為對(duì)照。用抗小鼠K鏈抗血清包被ELISA板，經(jīng)阻斷后，用連有辣根過氧化酶標(biāo)記的抗鼠r或a抗血清檢測結(jié)合的抗體。用每一抗體的結(jié)果曲線為對(duì)照，確定抗體濃度。同樣應(yīng)用ELISA的方法檢測抗體與SAI/II的結(jié)合。ELISA方法如上所述用完整細(xì)胞檢測抗體與Smutans或大腸桿菌的結(jié)合能力，細(xì)胞的制備如下將使完整細(xì)胞在37攝氏度Guy's13C細(xì)胞抹和大腸桿菌DH-2生長18小時(shí)至線性生長期，用10%福爾馬林固定備用，所有抗體溶液的濃度調(diào)至1.5ug/ml，再作二倍系列稀釋。用此方法檢測單獨(dú)表達(dá)Guy's13重鏈或輕鏈的植物提取物，以確定是否單一免疫球蛋白鏈呈現(xiàn)抗原結(jié)合能力，用辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠輕鏈或重鏈抗血清(NordicPharmaceuticals)檢測與細(xì)胞或純化，SAI/II結(jié)合的抗體.實(shí)驗(yàn)重復(fù)三遍，以平均數(shù)-+標(biāo)準(zhǔn)誤表示結(jié)果。.用上迷的純化SAI/II包被做滴度板進(jìn)行竟?fàn)幮訣LISA測試，1.5ug/ml濃度的Guy'sl3雜交瘤上清液和連續(xù)二倍稀釋的濃度與培養(yǎng)板在37攝氏度。將育1小時(shí)或在4攝氏度過夜。洗滌后，加入125I標(biāo)記的小鼠Guy'sl3然后在37攝氏度孵育2小時(shí)。再洗一次培養(yǎng)板后，用r計(jì)數(shù)器(Hydragamma，16,Innotec，GB)計(jì)數(shù)結(jié)合的放射性同位素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一標(biāo)記的小鼠Guy'sl3結(jié)合抑制百分比表示，其百分之后表示未加阻斷劑的孔內(nèi)的放射性同位素的計(jì)數(shù)。d.WestemBlot分析IO微升，件下煮沸，同樣在10%聚丙酰胺膠上電泳，然后將膠轉(zhuǎn)入至乙酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)印膜在含有0.05。/。Tween-20和1%無脂肪干牛奶中孵育16小時(shí)，然后加入羊抗鼠IgGlK或a鏈的特異性抗血清，在37攝氏度孵育2小時(shí)，洗滌之后，加入第二抗體，即堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，在37攝氏度條件下孵宵2小時(shí)，用300ug/ml氮蘭四唑和15pug/ml5-溴-4氯-3碘磷檢測抗體的結(jié)合，e.DNA序列分析每一.克隆過程中沒有突變發(fā)生，HindIII位點(diǎn)導(dǎo)入人/r雜交重鏈導(dǎo)致預(yù)期的結(jié)果。即在植物G2/A的Cr2和Ca2功能區(qū)之間加入了胱氨酸。植物G2/A中的附加的Cr2功能區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)計(jì)可增加重鏈長度約141個(gè)氨基酸殘基(約12000道爾頓)。Gl/A重鏈與原始Guy's13重鏈相比，預(yù)計(jì)可輕微增加約33個(gè)氨基酸殘基(約3000道爾頓)。對(duì)從大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化體中純化的質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列分析。將免疫球蛋白基因插入子剪斷，并克隆入Bluescript(StratagereUSA)。用雙脫氧終止法進(jìn)行DNA序列分析(S叫uenase,USB,USA)。f.裝配抗體的表達(dá)三個(gè)代表性的Fl子代植物的提取物的Westernblot分析結(jié)果見Ma等，圖2,Eur.J.Immunol.,24:131-138(1994),在還原條件下電泳樣品的結(jié)果證明在小鼠Guy'sl3三個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中存在約25Kd的輕鏈(K鏈)，但在對(duì)照植物中不存在，在植物Guy's13中亦存在約57Kd的Guy'sl3重鏈(r鏈)，但在對(duì)照植物中不存在。不象在產(chǎn)生Guy's13抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，轉(zhuǎn)基因植物中可檢測到單一蛋白種屬，并可持續(xù)檢測到二種蛋白，小鼠重鏈的分子量的差別可能是由于轉(zhuǎn)因j的不同此結(jié)果提示，在植物中，兩重鏈可以相同方式被糖基化，用抗a鏈抗血清檢測植物Gl/A和G2/A中的重鏈，與小鼠G13重鏈(約57Kd)相比，植物Gl/A的重鏈的分子量稍大(約60Kd),而植物G2/A的重鏈分子量較大(約70Kd),這與序列分析所預(yù)測的分子量相符。在轉(zhuǎn)基因植物的提取物中，同時(shí)檢測到幾種其它種類的蛋白質(zhì)。這些很可能是重鏈/輕鏈復(fù)合體或重鏈的降解片段，而在對(duì)照植物的提取物中，沒有發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)?？筧鏈抗血清與僅含有r鏈的小鼠Guy'sl3抗體沒有交叉反應(yīng)。以在非還原條件下電泳樣品證明重鏈和輕鏈裝配為免疫球蛋白分子的結(jié)果，見于Ma等的圖3。Eur.J.Immunol，24:131-138(1994)。用標(biāo)記的抗K鏈抗血清檢測，所有三個(gè)轉(zhuǎn)基因植物均含裝配的免疫球蛋白，其全長抗體的分子量大于150Kd。植物G13抗體的分子量與小鼠G13抗體相似，但植物G2/A和植物G1/A的抗體，如所預(yù)計(jì)，分子量較大。同時(shí)亦檢測到幾種較小的降解片段，與先前的發(fā)現(xiàn)相符，同時(shí)說明在抗體提取過程中植物釋放某些種類蛋白酶，在對(duì)照植物的提取物中未見這些蛋白質(zhì)，證明了這些蛋白質(zhì)屬抗體片段。g.抗原結(jié)合加工10抹含免疫球蛋白的植物。植物提取物中免疫球蛋白的濃度從1—10ug/ml變化不等(平均4.5ug/ml)。用ELISE方法估算本研究中所用的小鼠抗體和代表性植物中的抗體的濃度小鼠lgG-15.4ug/ml,植物IgG-7.7ug/ml,植物G1/A-1.5ug/ml，植物G2/A-2.1ug/ml。對(duì)含有雜交重鏈的植物抗體的濃度估算可能低于實(shí)際濃度。因?yàn)榕c標(biāo)準(zhǔn)的inAblgA比較，這些抗體并不含有所有的穩(wěn)定區(qū)決定簇。三個(gè)代表性轉(zhuǎn)基因植物提取物與SAI/II結(jié)合的滴度曲線見于Ma等的圖4。Eur丄Immunol.，24:131-138(1994)。在三種轉(zhuǎn)基因植物提取物中可檢測到特異性抗體，其滴度曲線在相同濃度下，與小鼠雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液的滴度曲線相似，盡管滴度曲線相似，但植物Gl/A抗體的結(jié)合力與其它抗體相比較低。在陰性對(duì)照植物中，沒有檢測到SAI/II的結(jié)合活性，這些發(fā)現(xiàn)證明表達(dá)輕鏈和重鏈的轉(zhuǎn)基因植物能夠正確地裝配抗體分子以形成功能性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，而單一的輕鏈或重鏈均不能與抗原結(jié)合，植物抗體也能夠識(shí)別鏈球菌細(xì)胞表面的原始抗原，見Ma等的圖5。Eur丄Immunol.，24:131-138(1994),這進(jìn)一步證明抗原結(jié)合位點(diǎn)在植物抗體中的整合。不同抗體的結(jié)合沒有顯著差異，對(duì)照植物的提取物和所表達(dá)重鏈或輕鏈的植物提取物均不能與S.mutans細(xì)胞結(jié)合。在1.0和0.5ug/ml濃度下，任何抗體^:取物均不能與大腸桿菌細(xì)胞結(jié)合。植物抗體與小鼠的原始Guy's13mAb竟?fàn)幗Y(jié)合SAI/II,植物抗體已證明能夠抑制1251標(biāo)記的小鼠Guy's13mAb與SAI/II的結(jié)合達(dá)85%,見圖6。Ma等Eur丄Immunol.，24:131-138(1994),如前小鼠Guy's13抗體與植物抗體的抑制滴度曲線相似，但對(duì)照植物的提取物沒有抑制作用，h.S.mutans的凝集植物產(chǎn)生的免疫球蛋白含有Guy's13抗原結(jié)合區(qū)，其對(duì)細(xì)菌的作用的報(bào)告見圖7。ma等Eur丄Immunol.，24:131-138(1994)。用0.22um孔徑的過濾器，過濾消毒植物提取物。用ToddHewitt液稀釋10倍。將0.05體積的過夜培養(yǎng)的S.mutans接種于樣品中，并在37攝氏度過夜培養(yǎng)。格蘭氏染色樣品并在油鏡下觀察。在小鼠Guy's13,植物Guy's13。植物Gl/A或植物G2/A存在的條件下，S.mutans被凝集并可見細(xì)胞成簇，然而，對(duì)照植物的提取物對(duì)S.mutans的生長沒有影響。通過8，12,16小時(shí)培養(yǎng)，任何植物mAb對(duì)S.mutans的生長均沒有影響.此結(jié)果證明不僅植物抗體具有裝配正確的抗原結(jié)合區(qū)，而且抗體分子與抗原是二價(jià)結(jié)合。實(shí)施例7.含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的生產(chǎn)構(gòu)建四種轉(zhuǎn)基因的煙草植物以表達(dá)1.具有Guy's13輕鏈的抗原結(jié)合位點(diǎn)的小鼠單克隆免疫球蛋白K鏈。2.含有Cr和Ca鏈功能區(qū)和Guy'sl3重鏈抗原結(jié)合位點(diǎn)的雜交IgA/G小鼠免疫球蛋白重鏈。3.小鼠J鏈4.匈多聚iJl球蛋白受體的第1-606個(gè)氨基酸，但不含第627-675氨基酸所組成的保護(hù)性蛋白。見例1。連續(xù)的有性雜交這些植物以產(chǎn)生同時(shí)表迖所有四衧妄白鏈的子代植物。在某些情況下，應(yīng)用回交以生產(chǎn)均一性植物。四種重鏈多肽裝配成含有保護(hù)性蛋白的功能性的大分子免疫球蛋白。其分子量約為470000Kd。保護(hù)性蛋白與免疫球蛋白的裝配依賴千.1鏈存在。當(dāng)單獨(dú)表達(dá)抗體的植物與表迅保護(hù)性蛋白的植物雜交時(shí)，開未見保護(hù)性蛋白的裝配對(duì)表達(dá)含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的植物進(jìn)行顯微分析證明，保護(hù)性蛋白與免疫球蛋白重鏈在單一細(xì)胞內(nèi)是共同表達(dá)的。在轉(zhuǎn)基因植物中，單細(xì)胞能夠產(chǎn)生具有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白，而在哺乳動(dòng)物中則需二個(gè)細(xì)胞來產(chǎn)生自然的分泌型免疫球蛋白，結(jié)果證明.'表達(dá)重疫球蛋白的大i模生產(chǎn)是適宜的,、同時(shí)亦可用于表達(dá)其它復(fù)合蛋白質(zhì)分子.含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白具有源于Guy'sl3單克隆抗^^的重鏈和輕鏈抗原結(jié)合功能區(qū)，可以特異性識(shí)別口腔鏈球菌的細(xì)胞表面縣附分子SAI/II,見Smith，R.&Lehner,T.OralMicrobiol.Immunol.4，153-158(1989),已在煙草植物中產(chǎn)生了這種只含有重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白。見例6，用與小鼠J鏈N端MKTHLL和C端SCYPD相互的合成寡聚核苷酸引物，成功地?cái)U(kuò)增了含有編碼全長cDNA的小鼠J鏈結(jié)構(gòu)，見matsauchi,L.，Cann,G.M.&Koshland,ME.PNA83，456-460(1986)。此擴(kuò)增的核普酸序列連入植物表達(dá)栽體PMON530,此栽體含有花柳葉鑲嵌病毒的35S啟動(dòng)子。見Rogers,S.G.,klee,H丄，Horsch,R.B.Fraley,R.T.meth.Enzymol.153，253-276(1987)。如前所述，可應(yīng)用含有重組質(zhì)粒的土壤桿菌轉(zhuǎn)化煙草葉組織，篩選含有編碼J鏈mRNA的再生植物，陽性轉(zhuǎn)化體自我傳代以產(chǎn)生同一的子代。J鏈表達(dá)植物與表達(dá)嵌合免疫球蛋白重鏈和K鏈的植物雜交。在還原條件下，用抗K鏈抗血清做WesternBlot以檢測植物提取物中的嵌合免疫球蛋白重鏈，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)分子量約為210Kd。與原始的IgGl抗體比較，此結(jié)果符合預(yù)期，即嵌合免疫球蛋白重鏈上含有額外的牆定功能區(qū)。表達(dá)免疫球蛋白和表達(dá)J鏈的植物雜交所產(chǎn)生的子代植物，所產(chǎn)生的主要免疫球蛋白的分子量大約為400Kd,約為相關(guān)分子的兩倍。此結(jié)果證明，3個(gè)多肽裝配形成了二聚體免疫球蛋白(dlgA/G)。用與兔多聚免疫球蛋白受體N端MALFLL和C端第601-606氨基酸處AVQSAE相應(yīng)的合成寡聚核苷酸作為引物，擴(kuò)增編碼全長cDNA的保護(hù)性蛋白結(jié)構(gòu)。兔多聚免疫球蛋白受體的核脊酸序列已由Mostov,K.E.,friedknder,M.&Blobel,G.Nature308,37-43(1984)。如上所迷，在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生保護(hù)性蛋白，并用WesternBlot方法識(shí)別表達(dá)保護(hù)性蛋白的陽性轉(zhuǎn)化體。表達(dá)J鏈并與具有IgA/G重鏈的免疫球蛋白裝配而形成二聚體的植物與表達(dá)保護(hù)性蛋白的植物雜交，在還原條件下進(jìn)行WesternBlot結(jié)果顯示，子代植物產(chǎn)生含保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白，其分子量約為470Kd。此分子量與所預(yù)期的含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白分子量相符，用特異性識(shí)別保護(hù)性蛋白的抗血清進(jìn)行westernblot證明此大分子蛋白中含有保護(hù)性蛋白4用抗K鏈抗體，而不用保護(hù)性蛋白抗血清檢測，植物提取物中亦含有與二聚體IgA/G相應(yīng)的約400Kd的蛋白質(zhì)和與具有嵌合重鏈相應(yīng)的21OKd的蛋白質(zhì)，在非還原條件下，對(duì)只生產(chǎn)保護(hù)性蛋白的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行Westernblot分析，并未檢測到大分子蛋白質(zhì)。說明保護(hù)性蛋白并不與內(nèi)源性植物蛋白裝配或形成多聚體。Westernblot分析證明表達(dá)免疫球蛋白重鏈的植物提取物(IgA/G,二聚體IgA/G和含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白)具有相同的免疫球蛋白起源的重鏈和輕鏈，而只含保護(hù)性蛋白，J鏈或野生型植物的提取物中則未見。應(yīng)用特異性保護(hù)性蛋白的抗血清，只能在含保護(hù)性蛋白的植物和具有保護(hù)性蛋白的含IgG/A免疫球蛋白的植物中，檢測到此類蛋白質(zhì)在野生型對(duì)照植物中未見交叉反應(yīng)蛋白質(zhì)。在哺乳動(dòng)物中，分泌片與免疫球蛋白的裝配需要J鏈的存在，見Brandtzaeg，P.&Prydz,H.Nature.311,71-73(1984)。將表達(dá)含有嵌合重鏈(IgA/G)免疫球蛋白的植物與表達(dá)保護(hù)性蛋白的植物雜交。在所產(chǎn)生的子代植物中，僅表達(dá)免疫球蛋白和保護(hù)性蛋白，但沒有J鏈的四抹植物不能產(chǎn)生裝配復(fù)合體。而其表達(dá)J鏈的IO抹植物中，則可見含有保護(hù)性蛋白的分子量為470Kd的免疫球蛋白。這證明了如在哺乳動(dòng)物中，保護(hù)性蛋白與免疫球蛋白的裝配需要J鏈。用抗K鏈抗血清檢測21OKd單聚體的免疫球蛋白，與保護(hù)性蛋白特異結(jié)合的抗血清。僅識(shí)別抗性而不與免疫球蛋白重鏈或輕鏈結(jié)合。應(yīng)用ELISA方法，對(duì)5抹產(chǎn)生免疫球蛋白的植物進(jìn)行功能研究。所有表達(dá)免疫球蛋白重鏈和輕鏈的植物，均能裝配完成功能性免疫球蛋白。這些免疫球蛋白能特異性地識(shí)別鏈球菌SAI/II抗原。結(jié)合水平和滴度曲線與小鼠雜交瘤細(xì)胞上清液相似.只表達(dá)J鏈或保護(hù)性蛋白的植物和野生型植物，不能識(shí)別SAI/H抗原。用特異性與保護(hù)性蛋白結(jié)合的抗血清，可以檢測到免疫球蛋白與純化的鏈球菌蛋白或原始的細(xì)菌細(xì)胞表面抗原的結(jié)合。在這些測試中，可特異性地檢測含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白與鏈球菌抗原的結(jié)合。這些結(jié)果證明，保護(hù)性蛋白與免疫球蛋白的裝配并不影響抗原結(jié)合能力。重鏈和輕鏈裝配成功能性免疫球蛋白分子的效率非常高，見Hiatt,A.C.,cafferkey,R.&Bawdish,K.Nature342，76-78(1989)。在重鏈和輕鏈的結(jié)構(gòu)中必須有一段信號(hào)肽存在，以引導(dǎo)重組蛋白質(zhì)在植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中裝配。見Hiatt，A.C.，Cafferkey，R&Broadish，k.Nature342，76-78(1989)。此研究證明了免疫球蛋白裝配的忠實(shí)性，包括在植物中，由J鏈將單聚體抗體裝配成二聚體，這些結(jié)果it明，在植物中雙聚體免疫球蛋白占抗體量的大部分(約57%),結(jié)果也證明裝配完畢的含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白可以象原始小鼠單克隆抗體一樣，與相應(yīng)的抗原結(jié)合。這些具有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白占總抗體量的大部分約45%,白的:能性免疫球蛋白裝配成功，用同樣的PMON530表達(dá)栽體和導(dǎo)引序列。將這種復(fù)合體的所有四種轉(zhuǎn)基因?qū)胫参?，這種栽體含有源于花柳葉鑲嵌病毒35S轉(zhuǎn)錄子的啟動(dòng)子序列，可引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在大部分植物的不同細(xì)胞中的表達(dá)，見Benfey，P.R&Chua,N-H.Science250,959-966(1990);Barnes,W.M.PNVAS87,9183-9187(1990)。所有四種基因由相同的啟動(dòng)子指導(dǎo)表達(dá)，使其在普通的植物細(xì)胞中能夠同表達(dá)。對(duì)表達(dá)含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的植物的顯微鏡觀察顯示葉片的許多類型細(xì)胞中含有制備免疫球蛋白的單一蛋白成份，這些蛋白質(zhì)在未鞘細(xì)胞中濃度最高，存在于細(xì)胞壁內(nèi).在細(xì)胞間質(zhì)腔中未見。大分子免疫球蛋白成份保護(hù)性蛋白和嵌合免疫球蛋白重鏈，均被限制存在于單一細(xì)胞的原生質(zhì)和原地胞質(zhì)之間。這即將分泌性免疫球蛋白的裝配限于合成備組成成份的細(xì)胞內(nèi)。裝配的亞細(xì)胞位置和機(jī)理仍有待研究，但已知在植物中裝配多源多聚體IgG需要各裝配成份與內(nèi)源膜系統(tǒng)結(jié)合，見，Hiatt,A.C.,Cafferkey,R.&Bowdish，K.Nature342,76-78(1989);andHein,MB.,Tang,y.,Mclead,d.A.Janda，K.D.&Matt,A.C.BiotechnolProg.7,455-461(1991),另外，我們已證明除了膜整合透過細(xì)胞及蛋白質(zhì)降解的信號(hào)源于成熟分泌片的保護(hù)性蛋白，能夠與含有r和a蛋白質(zhì)功能區(qū)的嵌合免疫球蛋白重鏈裝配。這些結(jié)果證明，二聚體免疫球蛋白與保護(hù)性蛋白結(jié)合，仍保有IgG穩(wěn)定區(qū)的功能。結(jié)合蛋白A，固定補(bǔ)體，F(xiàn)c受體活力。這些附加能力可以增加用于被動(dòng)免疫的免疫球蛋白的功能，同時(shí)使用于被動(dòng)免疫的含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的功能更為增強(qiáng)。含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的高水平表達(dá)和擴(kuò)大生產(chǎn)使此種單克隆抗體的生產(chǎn)更為經(jīng)濟(jì)，方法下例方法用于制備和分析本例的免疫球蛋白,i)以抗體在轉(zhuǎn)基因的煙草中的裝配在含有10ug/mlLe叩eptin的150mMNacl20mMtris-Hcl(PH8)(TBS)的溶液中將植物葉片勻漿，將提取物煮沸3分鐘。加入75mMTrisHC1(PH6.8)和2%SDS*非還原條件下，在4%聚丙酰胺凝膠中電泳，將凝膠轉(zhuǎn)印至乙酸纖維素膜上，將轉(zhuǎn)印膜置于含0.05%Tween-20和1%無脂肪干奶中孵育2小時(shí)，然后加入適宜的抗血清，在37攝氏度孵育2小時(shí)，經(jīng)沖洗后，連有堿性磷酸酶的第二抗體與轉(zhuǎn)印膜在37攝氏度共孵育2-3小時(shí)。用與300mg/ml的氮蘭四唑和150mg/ml5-渙-4-氯-3-碘磷溶液共孵育來檢測抗體的結(jié)合，用抗K鏈抗血清和特異性識(shí)別保護(hù)性蛋白的抗血清，分析非還原條件下植物提取物的Westernblots,以確定提取物中是否免疫球蛋白分子組裝為免疫球蛋白。將植物中產(chǎn)生的免疫球秉白與單克隆的IgGlGuy'sl3免疫球蛋白比較，Smith,R&lehner,T.Oralmicrobiol.Immuno1.4,153-158(1989)。ii)Western分析在還原條件下對(duì)每一植物提取物進(jìn)行Western分析以確定免疫球蛋白的各蛋白質(zhì)組成組分。不同植物提取物樣品的制備如前所述，但加入5°/。二疏基乙醇，在10%的聚丙酰胺凝膠上電泳，并將凝膠轉(zhuǎn)印至乙酸纖維素膜上。用抗小鼠rl重鏈(sigmaUK),抗小鼠K鏈(bradsureUK)或特異性識(shí)別保護(hù)性蛋白的抗血清作第一抗體，適宜的堿性磷酸酶連接的抗體為第二抗體，檢測各單一蛋白質(zhì)，iii)Western分析以呈現(xiàn)具有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的產(chǎn)生。轉(zhuǎn)基因植物的Western分析方法如前所述，表達(dá)含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的植物提取物在還原和非還原條件下。在聚丙酰胺凝膠上電泳，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至乙酸纖維素膜上。用抗K鏈抗血清或特異性識(shí)別保護(hù)性蛋白的抗血清，適宜的堿性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，檢測免疫球蛋白組分。達(dá)。為確定植物產(chǎn)生抗原特異性的免疫球蛋白，應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗K鏈抗血清，檢測植物提取物與純化的鏈球菌SAI/II抗原的結(jié)合.用對(duì)保護(hù)性蛋白具有免疫特異性的抗血清，和堿性磷酸酶標(biāo)記的猴抗羊的第二抗體檢測植物提取物與純化的鏈球菌SAI/II抗原和鏈球菌細(xì)胞的結(jié)合，已經(jīng)證明，抗原特異性的免疫球蛋白中舍有保護(hù)性蛋白，抗原特異性免疫球蛋白的檢測在微滴度板上進(jìn)行。首先，將溶于TBS中(2ug/ml)的純化的SAI/II或處于對(duì)數(shù)生長期的鏈球菌(NCTC10449)包被于培養(yǎng)板上。用含有5%無脂肪干牛奶的TBS在室溫下阻斷2小時(shí)，植物葉含有在Leupeptin(衡g/ml)的TBS中勻漿，用小鼠Guy's13雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為陽性對(duì)照。將上清液經(jīng)二倍連續(xù)稀釋加入微滴度板，室溫孵育2小時(shí)，用含有0.05%Tween-20洗滌后，分別用連有辣根過氧化酶的羊抗鼠輕鏈或羊抗SC抗血清和堿性磷酸酶標(biāo)記的猴抗羊抗體作為二抗，在室溫下將育2小時(shí)檢測結(jié)合的免疫球蛋白鏈。辣根過氧化酶標(biāo)記的抗體以2，2'-連氮基-雙-3苯丙塞唑啉硫酸脂，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體以磷酸賄基笨酚二鈉為顯色劑檢測免疫球蛋白。v)植物中免疫球蛋白組分的定位應(yīng)用免疫金檢測小鼠a鏈的方法，對(duì)表達(dá)含保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因和對(duì)照煙葉做顯微攝影，簡言之將植物葉切成2mmx.l0mm大小置于固定液中。固定液為3。/。仲甲醛(W/V),0.50/0戊二醛，5%蔗糖，100mM磷酸鈉PH7.4鋒酒精脫水后，二曱笨溶液石蠟包埋，切成3mm切片.置于玻片上進(jìn)行免疫化學(xué)染色。植物葉片與第一抗體，即親和純化的兔抗小鼠a鏈(與A/G雜交重鏈結(jié)合)或羊抗兔SC，然后與第二抗體，即羊抗兔-10mn金，或兔抗羊-10mn金共醉育，用銀加強(qiáng)免疫金信號(hào)的強(qiáng)度。對(duì)相同的葉片切片進(jìn)行光鏡和相差顯維鏡觀察。保護(hù)性蛋白在系列切片中的免疫定位用于表示作為免疫球蛋白的重鏈的相同的位置。已對(duì)下列細(xì)胞和細(xì)胞池進(jìn)行了分析海綿狀葉內(nèi)細(xì)胞，表皮細(xì)胞，細(xì)胞間隙，柵欄狀實(shí)質(zhì)細(xì)胞和維管束。進(jìn)一步分析免疫球蛋白組分的確切定位是通過應(yīng)用免疫球蛋白各組分的免疫金檢測以分析轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草的維管束的連續(xù)切片完成的，表達(dá)分泌性免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的連續(xù)切片與特異性識(shí)別保護(hù)性蛋白的抗體或抗IgA的抗體孵育，再與相應(yīng)的金標(biāo)記的第二抗體孵育，不含有任何免疫球蛋白編碼序列的對(duì)照植物的切片同時(shí)與抗IgA抗體繼而與金標(biāo)記的笫二抗體賻育，或單獨(dú)與金標(biāo)記的第二抗體孵育以驗(yàn)證染色的特異性。應(yīng)用光鏡和相差顯微鏡觀察微小維管束中保護(hù)性蛋白的免疫金定位，維管束連續(xù)切片的光鏡觀察證明了免疫球蛋白重鏈與保護(hù)性蛋白的免疫金定位是相同的。實(shí)施例8.含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的植物提取物的生產(chǎn)，含有保護(hù)性蛋白免疫球蛋白的植物各部(葉，莖，花，根或混合各部分)，與勻漿緩沖液混合(每克植物組織的2ml緩沖液。勻漿緩沖液150mMNaCl，20mMTris-HCl,PH7.5)，用組織粉碎器將其制成勻漿，10000xg離心以去除碎片，在室溫下，上清液與等量的HPLC級(jí)的乙酸乙脂混合搖晃后10000xg離心，將水相移至另一容器，真空抽干留下的乙酸乙脂。產(chǎn)生的粗提物每毫升含有100ug的保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白。此方法適于任何含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的植物的提取。包括研磨等方法均可用來勻漿，勻漿過程可在冷卻也可在室溫條件下完成》可通過用hexane或其它有機(jī)溶劑的萃取，脫脂而進(jìn)一步純化才是取物。脫脂對(duì)從植物才是取物中萃取有效成份，并非必須，但對(duì)需最終純化含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白卻是十分有益。在很多情.況下，粗提物不需進(jìn)一步純化或濃度即可含有足夠量的攜保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白(100ug/ml),在口腔應(yīng)用時(shí)，提取物應(yīng)與添加劑和穩(wěn)定劑混合，在牙齒應(yīng)用時(shí)，提取物應(yīng)另外與膠質(zhì)混合以保持提取物與牙齒的有效接觸。對(duì)胃腸應(yīng)用時(shí)，混合物可直接吞咽.實(shí)施例9.保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的穩(wěn)定性。按上述方法制備二種植物粗提物。第一種提取物源于表達(dá)IgG抗體的植物，而另一種提取物則源于表達(dá)含保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白.這些植物提取物中含有很多種蛋白酶，延長提取物在室溫或37攝氏度的孵育時(shí)間會(huì)導(dǎo)致蛋白降解。'應(yīng)用ELISA方法，測定二種提取物中r-k復(fù)合體的量作為在室溫和37攝氏度下的時(shí)間功能曲線的指標(biāo)。在這些測定中，用抗K鏈抗體包被培養(yǎng)氏度下孵育1小時(shí).用辣根過氧化酶標(biāo)記的抗r鏈抗體，檢測植物起源的免疫球蛋白，植物提取物中的攜保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的量，以提取后即測定的量為100%。室溫3小時(shí)后，IgG140%而攜保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白仍余>95%;6小時(shí)后IgGl余20%，而含保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白仍余>95%;12小時(shí)后，未能檢到IgGl，而含保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白仍余約90%,提取后48小時(shí)，保護(hù)性蛋白的抗體仍未見顯著性減少(70。/。)實(shí)施例10.表達(dá)攜保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白真核四重轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，構(gòu)成含保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的四種肽鏈均可在其它類型細(xì)胞體外(細(xì)胞培養(yǎng))或體內(nèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)。見ManipulatingtheMouseEmbryo,ALaboratoryManual,B.Hogan.ColdSpringHarborLaboratory(1986)。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，純化制備的適宜的載體DNA在10mMtris,0.2mMEDTAPH7.4溶液中調(diào)至2ng/ul的濃度。對(duì)同系動(dòng)物的受精卵細(xì)胞注射栽體DNA，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法，將注射后的卵細(xì)胞轉(zhuǎn)入假孕動(dòng)物體內(nèi)。應(yīng)用PCR和ELISA等方法篩選新生動(dòng)物中轉(zhuǎn)基因的存在，雜交表達(dá)含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白各不同組分的同系動(dòng)物以產(chǎn)生具有多轉(zhuǎn)化基因的動(dòng)物，篩選雜交后代以確定其表達(dá)所有四種肽鏈，根據(jù)用于受精卵注射的栽體類型不同，在裝配含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白各組分的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，可檢測到不同類型細(xì)胞表達(dá)裝配免疫球蛋白。這些栽體DNA由特異的啟動(dòng)子組成.故可在特殊細(xì)胞或組織中轉(zhuǎn)錄基因。每一栽體可表達(dá)保護(hù)性抗體的單一組分(IgG/A，J鏈，保護(hù)性蛋白，或K鏈)或表達(dá)一種以上的成份。在這種情況下，載體可含有適當(dāng)數(shù)量的啟動(dòng)子和酶切點(diǎn)以利每種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄.應(yīng)用可分別起動(dòng)每一種成份的DNA栽體。可以在單一細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)所有四種肽鏈。這需在相同的栽體DNA上含有四種表達(dá)裝置(含啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)和多聚腺苷酸序列)，另一種方法是只要每一栽體提供細(xì)胞系選擇性抗性，可用表達(dá)單一肽鏈的各栽體依次轉(zhuǎn)染單一細(xì)胞系。常用的栽體，如PMAMneo即適于多表達(dá)系統(tǒng)。又適于作為表達(dá)獨(dú)特選擇性標(biāo)志的系列栽體之一，用常規(guī)技術(shù)可轉(zhuǎn)染任何真核細(xì)胞如成纖維細(xì)胞。簡言之，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天以1:20稀釋傳代，在約30%融合的情況下，以每5ugDNA/10cm培養(yǎng)板，在125mMCaC12,140mMNaCl,25mMHepes,0.75mMNaHP04，PH7.5的溶液轉(zhuǎn)染，DNA與細(xì)胞孵育6小時(shí)后。用10%DMSO休克細(xì)胞3分鐘轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞在含有抗菌素或其它細(xì)胞因子的培養(yǎng)基生長以完成逸擇，所產(chǎn)生的細(xì)胞可以產(chǎn)生攜保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白的所有成份。這些成份可經(jīng)適當(dāng)裝配形成含有保護(hù)性蛋白的功能性免疫球蛋白。實(shí)施例ll.兔多聚免疫球蛋白受體的部分細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)與保護(hù)性蛋白的融合工程，編碼兔多聚免疫球蛋白受體部分細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)和編碼保護(hù)性蛋白的DNA片段結(jié)構(gòu)的融合如前所述。編碼從信號(hào)序列第一個(gè)氨基酸(MET-18)到GLU606的保護(hù)性蛋白cDNA以Bglll-Xhol片段形成，連入任何植物表達(dá)栽體如pMON530栽體(用BglII和Xhol消化)。用含有BglII或Xhol識(shí)別序列，且與編碼兔多聚免疫球蛋白受體的-18至_13和601至606氨基酸堿基DNA互補(bǔ)的適宜的寡聚核苷酸引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得保護(hù)性蛋白的衍生物。用相同的方法，獲得編碼從MET-18至八LA628的保護(hù)性蛋白的cDNA。所用含有Xho位點(diǎn)的寡聚核苷酸與編碼623至628氨基酸的保護(hù)性蛋白cDNA互補(bǔ)?？捎猛瑯臃椒▽⒕幋a兔多聚免疫球蛋白受體細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)片段的cDNA,作為Xhol片段通過PCR擴(kuò)增獲得，所用寡聚核苷酸與編碼舍有Xhol識(shí)別序列的ARG653至ALA755DNA互補(bǔ)。此片段連入已含有上述保護(hù)性蛋白cDNA的pMON530載體內(nèi)。可通過限制性內(nèi)切酶消化或?qū)D(zhuǎn)化后的細(xì)菌克隆的質(zhì)粒的序列分析，確定細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)cDNA的定位。用于PCR擴(kuò)增的寡聚核苷酸含有適當(dāng)數(shù)量的核苷酸，以保證所產(chǎn)生的cDNA在框架之內(nèi)，并能被翻譯為含有保護(hù)性蛋白和細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)的融合蛋白質(zhì)，所產(chǎn)生的適宜定位的DNA結(jié)構(gòu)，能編碼直接與兔多聚免疫球蛋白受體的細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)融合的保護(hù)性蛋白，但無穿透細(xì)胞膜片段的功能。此結(jié)構(gòu)與DNA片段(啟動(dòng)子)連接以保證在植物細(xì)胞中的表達(dá)。此結(jié)構(gòu)編碼二個(gè)附加氨基酸(SER^TRP),二者源于XhoI位點(diǎn)的引入，并作為保護(hù)性蛋白與細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)之間的連接物。本載體如前所述，用于轉(zhuǎn)化土壤桿菌，然后轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，用上述實(shí)例中所述的相同技術(shù)，生產(chǎn)表達(dá)此種蛋白質(zhì)的植物。(2)SEQIDNO:1的資料(i)序列特征:(A)長度類鏈構(gòu)名(ix)(B)(C)(D)稱特征:(A)關(guān)(B)位型型兔多鍵名置序列表3517堿基對(duì)核苷酸單線聚124鏈性.免疫球蛋白受體編碼."2445序列(xi)序歹i〗名稱SEQIDNO:1:GGCCGGGGTTACGGGCTGGCCAGCAGGCTGTGCCCCCGAGTCCGGTCAGCAGGAGGGGAAGAAGTGGCCTAAAATCTCTCCCGCflTCGGCAGCCCAGGCCTAGTGCCCTACCAGCCACCAGCCATGGCTCTCTTCTTGCTCACCTGCCTGCTGGCTGTCTTTTCAGCGMetAlaLeuPheLeuLeuThCysLeuLeuAlaValPheSerAla15101560120168GCCACGGCACAAAGCTCCTTATTGGGTCCCAGCTCCATATTTGGTCCCAlaThrAlaGinSerSerLeuLeuGlyProSerSerliePheGlyPro202530216GGGGlyGAGGluGTGAATAsn35GITValTTGI>euGAAGluGGCGlyGACAsp40TCGSerGTGTCCATCValSerlieACATCCThirCys45TAC264TACTyrCCAProACA50ACCTtirTCCSerGTCValACCThrCGGArg55CACHisAGCSerCGGAAGTTCArgLysPheSOTGGTGCCysCGGArg312GAAGAGGAGAGCGGCCGCTGCGTGACGCTTGCCTCGACCGGCTACACG360GluGiuGluSerGlyArgCysVaJLThrLeuAlaSerThrGlyTyrTht657075TCCCAGGAATACTCCGGGAGAGGCAAGCTCACCGACTTC.CCTGJVTAAA408SerGinGluTyrSerGlyArgGlyLysLeuThrAspPheProAspLys80859095GGGGAGTTTGTGGTGACTGTTGACCAACTCACCCAGAACGACTCAGlyGiuPheValVaiThrValAspGinLeuThrGinAsnAspSer100105110GGGGly456AGCTACAAGTGTGGCGTGGGAGTCMCGGCCGTGGCCTGGACTTCGGT50"!SerTyrLysCysGiyValGlyValAsnGlyArgGlyLeuAspE^heGlyU5120''125GTCAACGTGCTGGTCAGCCAGMGCCAGAGCCTGATGACGTTGTTTAC552ValAsnValLeuValSerGinLysProGluProAspAspVaJLVaiTjr130135"0AAACMTATGAGAGTTATACA.GTAACCATCACCTGCCCTTTCACATATS00LysGJLnTyi:GluSerTyrThrValThrlieThrCysProPheThrTyr"5150155GCGACTAGGCAACTAAAGAAGTCCTTTTACMGGTGGAAGACGGGGMAlaThrArgGinLeuLysLys160165SerPheTyr乙ysVa丄GlunoAspGlyGlu175648CTTGTACTCATCATTGATTCCLeuValLeulielieAspSer180AGCAGTAAGGAGSerSerLysGlu185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lyAlaAsnGlyTyrCys50'5560.AlaThrLeulieSerSerAsnGlyTyrLeuSerI<ysGLuTyrSerGlyS5707580ArgAlaSerLeulieAsnPheProGluAsnSerThrPheVallieAsn859095lieAlaHisLeuThrGinGJLuAspThrGlySerTyrLysCysGlyLeu100105110■GlyThrThrAsnAcgGlyLeuPhePheAspValSerLeuGluValSer115120125GinValProGluPheProAsnAspThrHisValTyrThrLysAsplie130135140GlyArgThrValThrlieGluCysArgPheLysGluGlyAsnAlaHis"5150155160SerLysLysSerLeuCysLysLysArgGlyGluAlaCysGluValVal165170U75lieAspSerThrGluTyrValAspProSerTyrLysAspArgAlalie180185190LeuPheMetLysGlyThrSerArgAspliePheTyrValAsnlieSer195200205HisLeulie.210'ProSerAspAlaGly一215LeuTyxValCysGin220AlaGlyGluGlyProSer225AlaAspLysAsnAsn230AlaAsp乙euGin235ValI/euGliiPco240GiuProGluLeuLeuTyrLysAsp245'LeuArgSer250SerValThrPheGlu.255CysAspI/euGlyArgGluValAla260AsnAspAla265IysTyrLeuCys■270LysAsnLysGluThrCysAspVallie.lieAsnThrLeuGiy'Lys275280285ArgAspProAlaPheGluGlyArglieLeuLeuThrProArg290295300GlyArgPheSerValLeulieThrGlyLeuArgLys305310315GluAspAspAspAlaAsnGly320HisTyrGinCysGlyAlaHisSerSerGiyLeu325330ProGinGluGlyTrp335ProValGinAlaTrp340GinLeuPheValAsn345GluGluSerThrUe350ProAsnSerArgSerVal355ValLySGlyValThrGlyGlySerVal360365AlalieValCysProTyrAsn370HisTrpGluAlaAsp385GinAlaLeuValGin405PropysGiuSerSerSerLeuLys';75380TyrTrpCysGluAsn390GiyAxgCysGluGlyTyrGluProVal395GlyArgLeu410TrpLeuVslGlyAlaLeuThr400PheAsp415GinProGlySerGlyAlaTyr420ThrVallieLeuAsn425GinLeuThrThr"0GinAspSerGlyPheTyrTip435CysLeuThrAspGly440AspSerArgTrp445ArgThrThrlieGluLeuGinValAlaGluAlaThrLysLysProAsp450455460LeuGluValThrProGinAsnAlaThrAlaVallieGlyGluThrPhe"5470475480ThrlieSerCysHisTycProCysLysPheTyrSerGinGluLysTyr485TrpCysLysTrpSerAsn500GluGlyAlaArgGinSer515ValSerMetThrLeuAsn530490AspGlyCysHis505SerVaiSer520ProValLys535Ti:pCys545GlyValLysGluGlyGinVai550CysLysTyrlieLeuProSerHis510495AspAspGinSerSerGinlie525GluAspGluGlyTrpTyz:540GlyGlu555ThrThrMatlie560TyrValAlaValGiuGluArgThrArgGlySerPro565570ThrAspAlaAsnAlaArgAlaLysAspAlaProGlu580585HislieAsnPro575GluGluAla590MetGluSerSerValArg595GluAspGluAsn600LysAlaAsn乙euAspProS05'lieuPhe610GluAsn625AlaAspGluArgAlaSerArgGlulie.Gin615AlaGlyAsp620GinAlaGinGlyAsn630MaGlySerAlaGly635SerSerLysValLeuPheSerThrLeuValPro645650AlaValAsnValGlyAsp690AlaThr705GlyAlaValAspArgMet675PheArgAsnProAspThrAlaVallieTrpValAla665SerSer680SerArgGinGlq710TyrAspLeuGlyArgArgGlyValThrGlyGinSerGlyLeuGlyLeuGly"0655HisArg。0I*ysAsplie685SerMetAsnAsp700AsnMetGlyThrLeuGluGlyLys715G丄uThrThrThrGluCysThrThrGUi725ProGlu^luSer730AspGlulie720LysAla735LysArgSerSerLysGluGlu740AlaAspMetAlaTyrSer745A丄aPheIeu750PheGinSerSerThrlieAla755AlaGinValHisAspGlyProGinGlu760765Ala(2)SEQIDNO:II的資料:(i)序列特征(A)長度322堿基對(duì)(B)類型核苷酸(c)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性名稱Guy's13Kappa(ix)特征(A)關(guān)鍵名編碼序列(B)位置8....320(xi)序列名稱:SEQ〖DNO:11:CTCGAGCGACATTAsplieGTGValATGMetACCThrGinTCTSerCCAGCAATCProA丄alie10ATGMetTCTGCASerAlaTCTSer49CCAPro15GGGGAGG丄uAAGI/ysGTCValACCThr20ATAlieACCThrTGCCysAGTGCCAGCSerAlaSer25TCASerAGTGTASerValAGTSer3097TACTynATGMetCACHisTGGTrpTTCPhe35CAGGinCAGGinAAGLysCCAProGGCACTTCTGlyThrSer40CCCProAMCTCTGGLysI>euTrp45145CTTLeuTATTyrAGCSerACAThr50TCCSecAACAsnCTGLeuGCTAlaTCTSet55GGAGTCCCTGlyValProGCTMaCGCTTCArgPhe60AGTSer193GGCGlyAGTSerGGAGly65TCTSerGGGGlyACCThrTCTSerTACTyr70TCTSerCTCACAATCThrlieAGCCGAATGGAGSerArgMetGlu75241GCTAlaGAAGlu80GATAspGCTAlaGCCAlaACTThrTATTyr85TACTyrTGCCysCATCMAGGHisGinArg90ACTAGTTACThrSerTyrCCGPro289TACTyr95ACGThrTTCPheGGAGlyGGGGlyGGGGly100ACCThrAAGIiysCTGLeuGAAATAGlulie1053:(2)SEQIDNO:12的資料:(0序列特征(A)長度105氨,(B)類型氨基酸(c)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性名稱Guy's13Kappa(xi)序列名稱SEQIDNO:12:AsplieValMetThrGinSerProAlalieMetSerAlaSerProGly151015GluLysValThrlieThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMet2025.30HisTrpPheGinGinLysProGlyThrSerProLysLeuTrpLeuTyr354045SerThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProAlaArgPheSerGlySer5055'50■GlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGJluAlaGlu65707580AspAlaAlaThrTyrTyrCysHisGinArgThrSei:TyrProtyrThr8590PheGlyGlyGlyThrLys.LeuGlulie95100105402堿基對(duì)(2)SEQIDNO:13資料:(i)序列特征(A)長度(B)類型(C)鏈型(D)構(gòu)型名稱Guy's13Gamma1(ix)特征(A)關(guān)鍵名編碼序列(B)位置7....402(xi)序歹'j名稱SEQIDNO:13:CTCGAGATGGAATGGACCTGGGTTTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACT48MetGluTrpThrTrpValPheLeuPheLeuLeuSerGlyThr1510'酸苷鏈性核單線GCAGGCGTCCACTCTGGGGTCCAGCTTCAGCAGTCAGGACCTGACi—TG'、AlaGlyValHisSerGlyValGinLeuGinGinSerGlyProAspLeu15202530GTGAAA.CCTGGGGCCTCAGTGPAGATATCCTGCMGGCTTCTGGATAC.1"ValLysProGlyAlaSeeValLyslieSecCysLysAlaSeeGlyTyr.35'4045ACATTCACTGACTACAACATACACTGGGTGAAGCAGAGCCGTGGAAAG192ThrPheThrAspTyrAsnlieHisTrpValLysGinSerArgGlyLys5(i5S60AGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGGTAATACTTAC240SerLeuGluTrplieGlyTyrlieTyrProTyrAsnGlyAsnThrTyr65"''7.5TACAACCAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACA'TTGACTGTAGACAATTCC288TyrAsnGinLysPheLysAsnLysAlaThr'LeuThrValAspAsnSer8085,90TCCACCTCAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTSerThrSerAlaTyrMetGluLeuArgSerLeuThrSerGluAspSer9510010511033SGCAGTCTATTACTGTGCAACCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCAlaValTyrTyrCysAlaThrTyrPtieAspTyrTipGlyGinGlyThr115120125384ACTCTCACJVGTCTCCTCAThrUuThrVaiSecSer130402132氨基酸(2)SEQIDNO:14的資料(i)序列特征(A)長度(B)類型(C)鏈型(D)構(gòu)型名稱Guy's13Gamma1(xi)序列名稱SEOIDNO:14:MetGluTrpThrTrpValPheLeuPheLeuLeuSerGl_yThrAlaGly151015ValHisSerGlyValGinLeuGinGinGlyProAspLeuVa丄Lys202530酸基鏈性氨單線ProGlyAlaSerVaiLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPhe—-354045ThrAspTyrAsnlieHisTrpValLysGinSerArgGlyLysSerLeu505560GluTrplieGlyTyrlieTyrProTy:AsnGlyAsnThrTyrTyrAsn，65707580GinLysPheLysAsnLysAliThrLeuThrValAspAsnSerSerThr859095SerAlaTyrMetGluLeuArgSerLeuThrSerGluAspSerAlaVal100105110TyrTyrCysAlaThi:.TyrPheAspTyrTrpGJLyGinGlyThrThrLeu115120125ThrValSerSer130(2)SEQIDNO:15的資料(i)序列特征(A)長度:31堿基對(duì)(B)類型:核香酸(C)鏈型:單鏈(D)構(gòu)型線性(xi)序列名稱:SEQIDNO:15ACCAGATCTATGGMTGGACCTGGGTTTTTC(2)SEQIDNO:16的資料(i)序列特征(A)長度30堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(xi)序列名稱SEQIDNO:16:CCCAAGCTTGGTTTTGGAGATGGTTTTCTC(2)SEQIDNO:17的資料(i)序列特征:(A)長度:31堿基對(duì)(B)類型核普酸(c)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(xi)序列名稱:SEQIDNO:17:GATAAGCTTGGTCCTACTCCTCCTCCTCCTA31(2)SEQIDNO:18的資料(i)序列特征(A)長度30堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(xi)序列名稱:SEQIDNO:18AATCTCGAGTCAGTAGCAGATGCCATCTCC(2)SEQIDNO:19的資料(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)構(gòu)型線性(xi)序列名稱:SEQIDNOGGAAAGCTTTGTACATATGCAAGGCTTACA30權(quán)利要求1.由保護(hù)性蛋白與免疫球蛋白起源的重鏈結(jié)合而構(gòu)成的免疫球蛋白，其中重鏈至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)。2.權(quán)利要求1中所述免疫球蛋白，它進(jìn)一步包含免疫球蛋白起源的輕鏈，所述輕鏈至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)且與上述免疫球蛋白起源的重鏈相連.3.權(quán)利要求1或2中所述免疫球蛋白，它進(jìn)一步包含第二條免疫球蛋白起源的重鏈，所述重鏈至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)且與上述保護(hù)性蛋白相連.4.權(quán)利要求3中所述的免疫球蛋白，它進(jìn)一步包含第二條免疫球蛋白起源的輕鏈，輕鏈至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)且與上述第二條免疫球蛋白起源的重鏈相連。5.權(quán)利要求1-4中所述免疫球蛋白，它進(jìn)一步包舍免疫球蛋白J鏈，所述J鏈至少與上述免疫球蛋白起源的重鏈之一相結(jié)合。6.權(quán)利要求1-5中所述的免疫球蛋白，它是治療性免疫球蛋白。7.權(quán)利要求6中所述的免疫球蛋白，它能夠與粘膜表面致病原抗原結(jié)合。8.權(quán)利要求7中所述的免疫球蛋白，它能夠防止齲齒。9.權(quán)利要求1-8中所述的免疫球蛋白，其中抗原結(jié)合功能區(qū)能夠與鏈球菌S.mutans的血清型抗原c.e和f或鏈球菌S.sobrimis血清型抗原d和g結(jié)合。10.權(quán)利要求1中所述免疫球蛋白，其中保護(hù)性蛋白的氨基酸序列實(shí)際上至少與兔多聚免疫球蛋白受體的第1至第627氨基酸序列部分相應(yīng)，但不含與兔免疫球蛋白受體的第628-755氨基酸殘基序列相應(yīng)的氨基酸序列，11.權(quán)利要求l中所述免疫球蛋白，其中保護(hù)性蛋白的氨基酸序列實(shí)際上至少與兔多聚免疫球蛋白受體的第1至第606氨基酸序列部分相應(yīng)，但不含與兔多聚免疫球蛋白受體的第628-755氨基酸殘基序列相應(yīng)的氨基酸序列。12.權(quán)利要求10或H中所述的免疫球蛋白，其中保護(hù)性蛋白的氨基酸序列不含有相應(yīng)于兔多聚免疫球蛋白受體第628-775氨基酸序列相應(yīng)的序列；但含有與下列氨基酸片段之一或一個(gè)以上的片段相應(yīng)的氨基酸序列a)與兔多聚免疫球蛋白受體第21-43氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；b)與兔多聚免疫球蛋白受體第1-118氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；c)與兔多聚免疫球蛋白受體第119-223氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；d)與兔多聚免疫球蛋白受體第224-332氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；e)與兔多聚免疫球蛋白受體第333-441氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；f)與兔多聚免疫球蛋白受體第442-552氨基酸相應(yīng)的氳基酸序列；g)與兔多聚免疫球蛋白受體第553-606或553-627氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列。13.權(quán)利要求l中所述免疫球蛋白，其中保護(hù)性蛋白的氨基酸序列不含有與兔多聚免疫球蛋白受體的第628-775氨基酸序列相類似的另一種屬的多聚免疫球蛋白受體氨基酸殘基序列，但含有與下列氨基酸片段之一，或一個(gè)以上的片段相類似的另一種屬免疫球蛋白受體的氨基酸序列a)與兔多聚免疫球蛋白受體第21-43氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；b)與兔多聚免疫球蛋白受體第1-U8氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；c)與兔多聚免疫球蛋白受體第119-223氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；d)與兔多聚免疫球蛋白受體第224-332氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；e)與兔多聚免疫球蛋白受體第333-441氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；f)與兔多聚免疫球蛋白受體第442-552氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列；g)與兔多聚免疫球蛋白受體第553-606或553-627氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列。14.權(quán)利要求13中所述的免疫球蛋白，它是人類免疫球蛋白，15.權(quán)利要求l中所述的免疫球蛋白，其中保護(hù)性蛋白至少包括以下兔多聚免疫球蛋白受體功能區(qū)之一的氨基酸序列功能區(qū)I,功能區(qū)II，功能區(qū)III,功能區(qū)IV,功能區(qū)V,功能區(qū)VI的從第553至627氨基酸序列，而不含相應(yīng)于笫628_755的氨基酸的序列。16.權(quán)利要求l中所述的免疫球蛋白，其中保護(hù)性蛋白不含任何與兔多聚免疫球蛋白受體第628-755的氨基酸序列相應(yīng)或相似的氨基酸序列；但含有a)至少一個(gè)功能區(qū)，它源于第一動(dòng)物的多聚免疫球蛋白受體且至少與下列兔多聚免疫球蛋白受體的氨基酸片段部分相類似功能區(qū)I,功能區(qū)II,功能區(qū)III，功能區(qū)IV,功能區(qū)V,功能區(qū)VI的第553至627氨基酸序列；b)至少一個(gè)功能區(qū)，它源于第二動(dòng)物的多聚免疫球蛋白受體且至少與下列兔多聚免疫球蛋白受體的氨基酸片跌部分相類似功能區(qū)I,功能區(qū)II，功能區(qū)m,功能區(qū)IV,功能區(qū)V,功能區(qū)VI的第553至627氨基酸序列.17，權(quán)利要求1中所述的免疫球蛋白，其中保護(hù)性蛋白不含任何與兔多聚免疫球蛋白受體第628-755的氨基酸序列相應(yīng)或相似的氨基酸序列；但含有a)至少一個(gè)氨基酸片段，它源于第一動(dòng)物的多聚免疫球蛋白受體且至少與下列兔多聚免疫球蛋白受體的氨基酸片段部分相類似功能區(qū)I，功能區(qū)II，功能區(qū)III,功能區(qū)IV，功能區(qū)V,功能區(qū)VI的第553至627氨基酸序列；b)至少一個(gè)氨基酸片段，它源于第二動(dòng)物的多聚免疫球蛋白受體且至少與下列兔多聚免疫球蛋白受體的氨基酸片段部分相類似功能區(qū)I，功能區(qū)II,功能區(qū)III,功能區(qū)IV，功能區(qū)V,功能區(qū)VI的第553至627氨基酸序列18.權(quán)利要求16中所述的第一動(dòng)物，它是哺乳動(dòng)物；第二動(dòng)物，它是兔19.權(quán)利要求16中所述的第一動(dòng)物，它是人；第二動(dòng)物，它是兔，20.權(quán)利要求l中所述免疫球蛋白，其中免疫球蛋白起源的重鏈至少含有任何亞型的IgA或IgM重鏈的一部分，21.權(quán)利要求1中所述免疫球蛋白，其中免疫球蛋白起源的重鏈由兩種不同同種型免疫球蛋白功能區(qū)所構(gòu)成。22.權(quán)利要求21中所述的免疫球蛋白功能區(qū)，它由下列各組中選出a)小鼠IgGl的CH1和小鼠IgA的CH2和CH3;和b)小鼠IgGl的CH1和CH2和小鼠IgA的CH2和CH3。23.權(quán)利要求1中所述的抗原結(jié)合功能區(qū)，它實(shí)質(zhì)上相應(yīng)于Guy's13重鏈可變區(qū)。24.權(quán)利要求2中所迷的抗原結(jié)合功能區(qū)，它實(shí)質(zhì)上相應(yīng)于Guy's13重鏈可變區(qū)。25.權(quán)利要求l中所述免疫球蛋白，其中保護(hù)性蛋白的第一序列實(shí)質(zhì)上相應(yīng)于兔多聚免疫球蛋白受體的第1-606或1-627氨基酸的部分序列，而第二序列與第一序列相鄰且不含與兔多聚免疫球蛋白受體的功能性跨膜片段的氨基酸殘基序列相應(yīng)的氨基酸序列。26.權(quán)利要求25中所述的第二氨基酸序列，它具有與多聚免疫球蛋白受體的第665-755氨基酸相應(yīng)的氨基酸序列'27.權(quán)利要求25中所述的第二氨基酸序列，它為下列組分之一或多于一種組分多聚免疫球蛋白分子的細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)，免疫球蛋白基因超家族成員之一的功能區(qū)，一種酶，一種毒素或一種連接片段。28.—種真核細(xì)胞，它含有權(quán)利要求l-24所述的免疫球蛋白。29.權(quán)利要求28所述的真核細(xì)胞，它是一種植物細(xì)胞。30.權(quán)利要求29所述的植物細(xì)胞，它是一種植物的部分組織。31.—種舍有編碼保護(hù)性蛋白核苷酸序列的真核細(xì)胞，32.權(quán)利要求31所述的真核細(xì)胞>它亦含有編碼至少下列所選分子之一的第二核香酸序列一條至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的重鏈，一條至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的輕鏈，或一條免疫球蛋白的J鏈。33.權(quán)利要求32中所述的真核細(xì)胞，它除含有編碼免疫球蛋白重鏈的第二核苷酸序列外亦含有編碼至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源輕鏈的第三核苷酸序列。34.權(quán)利要求33中所述的真核細(xì)胞，它亦含編碼免疫球蛋白J鏈的第四核苷酸序列。35.權(quán)利要求31-34中所述的真核細(xì)胞，它是一種植物細(xì)胞。36.—種植物細(xì)胞，它含有編碼保護(hù)性蛋白的核苷酸序列，亦含有編碼至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的重鏈的核苷酸序列。37.—種含有保護(hù)性蛋白的真核細(xì)胞。38.權(quán)利要求37中所述的真核細(xì)胞，它亦至少含有下列之一的附加分子一條至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的重鏈，一條至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的輕鏈或一條免疫球蛋白J鏈。39.權(quán)利要求38中所述的附加分子，它是至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的重鏈，亦含有免疫球蛋白起源的輕鏈，輕鏈上至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)。40.權(quán)利要求37中所述的真核細(xì)胞，它亦含免疫球蛋白J鏈。41.權(quán)利要求37-40所述的真核細(xì)胞，它是一種植物細(xì)胞，42.權(quán)利要求29,35，36,41中所述的植物細(xì)胞，它源于雙子葉或單子葉植物。43.權(quán)利要求29，35,36,41中所述的植物細(xì)胞，它源于茄科植物。44.權(quán)利要求29，35,36，41中所述的植物細(xì)胞，它源于苜蓿植物。45.權(quán)利要求29,35，36，41中所述的植物細(xì)胞，它源于煙草植物。46.權(quán)利要求29,35,36,41中所速的植物細(xì)胞，它是植物的部分組織。47.—種由權(quán)利要求l-24所述免疫球蛋白和植物大分子構(gòu)成的混合物。48.權(quán)利要求47中所述的混合物，其中植物分子源于單子葉，雙子葉，茄科，苜?；驘煵葜参?。49.權(quán)利要求47中所述的混合物，其中植物分子是二磷酸核酮糖羧化酶，集光復(fù)合物，色素，二級(jí)代謝物或葉綠體。50.權(quán)利要求47中所述的混合物，其中免疫球蛋白濃度為除水外重量的0.001%到99%。51.權(quán)利要求47中所述的混合物，其中植物大分子濃度為除水外重量的1%到99%。52.生產(chǎn)權(quán)利要求l-24中所述的免疫球蛋白的方法，它由下列步驟組成a)將編碼保護(hù)性蛋白的核苷酸序列與適宜的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子連接后接入表達(dá)載體，導(dǎo)入植物細(xì)胞；b)將編碼至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白的核苷酸序列與適宜的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子連接后，接入表達(dá)栽體導(dǎo)入上述的植物細(xì)胞。53.權(quán)利要求52所述方法，它進(jìn)一步包括如下步驟C)將編碼至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白的核苷酸序列與適宜的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子連接后，接入表達(dá)載體導(dǎo)入上述的植物細(xì)胞。54.權(quán)利要求52,53所述方法，它進(jìn)一步包括將舍有編碼免疫球蛋白J鏈的核苷酸序列與適宜的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子連接后，接入表達(dá)栽體導(dǎo)入上述的植物細(xì)胞。55.權(quán)利要求52-54所述方法，其中免疫球蛋白起源的重鏈?zhǔn)敲庖咔虻鞍譨鏈，免疫球蛋白起源的輕鏈?zhǔn)敲庖咔虻鞍譑或人鏈，56.權(quán)利要求52-54所述方法，其中免疫球蛋白起源的重鏈?zhǔn)怯刹糠置庖咔虻鞍譨鏈和X鏈的構(gòu)成的。57.權(quán)利要求52-54所述方法，其中植物細(xì)胞是一種植物的部分組織。58.權(quán)利要求56中所述方法，其進(jìn)一步包括所述植物的生長，59.權(quán)利要求56或57中所述植物，它是一種單子葉，雙子葉，茄科，豆科，苜?；驘煵葜参?。60.權(quán)利要求52-59中所述的免疫球蛋白起源的重鏈，它是一種嵌合性免疫球蛋白重鏈。61.—種生產(chǎn)含有植物大分子的治療性免疫球蛋白的方法，此方法包括在壓力下剪力處理權(quán)利要求30或46中所述的植物的部分，制備含有治療性免疫球蛋白和植物大分子的勻漿，含植物大分子的液體源于所述植物的原生質(zhì)體或原地胞質(zhì)和固體植物起源的物質(zhì)。62.權(quán)利要求61所述的方法，它進(jìn)一步包括將所述的固體物與液體分離開。63.權(quán)利要求61或62的方法，其中植物的部分是葉，莖，根，管，果或全纟直物。64.權(quán)利要求61所述的方法，其中所述的剪力是應(yīng)用機(jī)械裝置達(dá)到的，可使液體從所述植物的原生質(zhì)或原地胞質(zhì)中釋出，65.權(quán)利要求62中所述的方法，其中分離是通過離心，沉降，漿凝或過濾而達(dá)到的。66.—種生產(chǎn)由重鏈，輕鏈，J鏈和保護(hù)性蛋白裝配而成的免疫球蛋白分子的方法，其步驟包括a)將編碼以下成份的核苷酸序列導(dǎo)入真核細(xì)胞；i)一條至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)免疫球蛋白起源的重鏈；ii)一條至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)免疫球蛋白起源的輕鏈；iii)一條免疫球蛋白J鏈；iv)保護(hù)性蛋白；b)在一定條件下維持所迷細(xì)胞的生長，使其生產(chǎn)所述的免疫球蛋白重鏈，輕鏈，J鏈和保護(hù)性蛋白并裝配成為的免疫球蛋白分子。67.在允許蛋白產(chǎn)生和免疫球蛋白裝配的條件下，維持真核細(xì)胞產(chǎn)生裝配完畢的具有重鏈，輕鏈，J鏈和保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白分子，此真核細(xì)胞含有適宜于表達(dá)而連接后編碼以下組分的核苷酸序列i)一條至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)免疫球蛋白起源的重鏈；ii)一條至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)免疫球蛋白起源的輕鏈；叫一條免疫球蛋白J鏈；iv)保護(hù)性蛋白。68.權(quán)利要求66-67中所述的真核細(xì)胞，它是一種植物細(xì)胞。69.制備對(duì)環(huán)境條件具有抗性的免疫球蛋白的方法，它包括下列步驟a)將編碼至少舍有部分免疫球蛋白重鏈的抗原結(jié)合功能區(qū)的核苷酸序列與編碼至少含有免疫球蛋白a重鏈的功能區(qū)的核苷酸序列相連接形成編碼嵌合免疫球蛋白重鏈的核苷酸序列；b)在真核細(xì)胞中表達(dá)上述編碼嵌合免疫球蛋白重鏈的核苷酸序列以產(chǎn)生嵌合免疫球蛋白重鏈。其真核細(xì)胞已含有至少一種下述其它分子保護(hù)性蛋白，至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的輕鏈和免疫球蛋白J鏈；嵌合免疫球蛋白重鏈與所述的至少一種其它分子裝配形成對(duì)環(huán)境條件具有抗性的免疫球蛋白。70.權(quán)利要求69中所述其它分子，它們?yōu)楸Ｗo(hù)性蛋白，所說的真核細(xì)胞含有一條至少攜有部分抗原結(jié)合功能的免疫球蛋白起源的輕鏈和一條免疫球蛋白J鏈.71.在允許蛋白產(chǎn)生和免疫球蛋白裝配的條件下，生產(chǎn)對(duì)環(huán)境條件有抗性的免疫球蛋白的細(xì)胞，其含有a)編碼嵌合免疫球蛋白重鏈的核苷酸序列，此序列為編碼至少部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白重鏈的核苷酸序列與編碼至少一個(gè)免疫球蛋白a重鏈功能區(qū)的核脊酸序列，二序列相互連接，和b)至少一種下列的其它蛋白保護(hù)性蛋白，一條至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的輕鏈和免疫球蛋白J鏈，故而允許嵌合免疫球蛋白重鏈與所說的至少一種其它分子裝配形成對(duì)環(huán)境條件具有抗性的免疫球蛋白。72.權(quán)利要求50-52中所述的真核細(xì)胞，它是一種植物細(xì)胞。73.—種四重轉(zhuǎn)基因組織，它是由含有四種不同的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞組成的，每一種基因均編碼復(fù)合多肽分子中的一個(gè)不同多肽，而每一不同多肽均與所說的復(fù)合肽相聯(lián)，74.權(quán)利要求73中所述轉(zhuǎn)基因組織，其中四種轉(zhuǎn)基因之一是編碼保護(hù)性蛋白的轉(zhuǎn)基因，75.權(quán)利要求73中所述轉(zhuǎn)基因組織，其中四種轉(zhuǎn)基因之一是編碼至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的重鏈的轉(zhuǎn)基因。76.權(quán)利要求73中所述轉(zhuǎn)基因組織，其中四種轉(zhuǎn)基因之一是編碼至少含有部分抗原結(jié)合功能區(qū)的免疫球蛋白起源的輕鏈的轉(zhuǎn)基因。77.權(quán)利要求73中所述轉(zhuǎn)基因組織，其中四種轉(zhuǎn)基因之一是編碼J鏈的轉(zhuǎn)基因。78.權(quán)利要求73中所述轉(zhuǎn)基因組織，其中四種轉(zhuǎn)基因之一是編碼一種嵌合性免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因。79.權(quán)利要求73中所述轉(zhuǎn)基因組織，它是一種植物，80.權(quán)利要求73中所述轉(zhuǎn)基因組織，它是一種哺乳動(dòng)物組織。81.權(quán)利要求1中所述的嵌合性免疫球蛋白重鏈，它含有下列免疫球蛋白重鏈之一的免疫球蛋白功能區(qū)IgG,IgA,IgM,IgE,IgD,同時(shí)含有IgA或IgM的保護(hù)性蛋白結(jié)合功能區(qū)。82.權(quán)列要求81中所述的免疫球蛋白重鏈，它是人，嚙齒類動(dòng)物，兔，牛，綿羊，山羊，家禽，犬，豬或靈長目的免疫球蛋白重鏈，83.權(quán)利要求81中所述的保護(hù)性蛋白結(jié)合功能區(qū)，它是源于人，嚙齒類動(dòng)物，兔，牛，綿羊，山羊，家禽，犬，豬或靈長目的lgA。84.權(quán)利要求81中所述的嵌合性免疫球蛋白重鏈，它是由小鼠IgGl的免疫球蛋白重鏈組成的，所說的保護(hù)性蛋白結(jié)合功能區(qū)源于小鼠IgA或IgM。85.權(quán)利要求81中所述的嵌合性免疫球蛋白重鏈，它是由人IgG,IgM，IgD或IgE的免疫球蛋白功能區(qū)構(gòu)成的，而所述抗原結(jié)合功能區(qū)源于人IgA或IgM。全文摘要本發(fā)明的免疫球蛋白是針對(duì)粘膜表面致病原(例如S.mutans)的有用的治療性免疫球蛋白。該免疫球蛋白含有一種保護(hù)性蛋白，該保護(hù)性蛋白在粘膜環(huán)境中保護(hù)該免疫球蛋白。本發(fā)明也包括在植物中生產(chǎn)免疫球蛋白的極大地改進(jìn)了的方法，該方法是通過在植物細(xì)胞中生產(chǎn)作為免疫球蛋白其他成分的保護(hù)性蛋白而完成的。免疫球蛋白的成分以極大地提高了效率裝配在一起。本發(fā)明也試圖在不同細(xì)胞中生產(chǎn)含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白，所述細(xì)胞包括植物細(xì)胞，這可被選作有用的額外特性。含有保護(hù)性蛋白的免疫球蛋白作為針對(duì)粘膜表面和其他致病原的治療性抗體的應(yīng)用也是本發(fā)明所期望的。文檔編號(hào)C07K14/705GK101429246SQ20081009078公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期1995年12月27日優(yōu)先權(quán)日1994年12月30日發(fā)明者A·C·希爾特,J·K·C·馬,T·勒內(nèi)爾申請(qǐng)人:行星生物技術(shù)有限公司;倫敦國王學(xué)院