專利名稱：一種適合雙向電泳的棗蛋白質(zhì)提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適合蛋白質(zhì)雙向電泳分析的棗蛋白質(zhì)提取方法。
技術(shù)背景隨著蛋白質(zhì)組這一概念的提出，蛋白質(zhì)組在生物學界得到了充分關(guān)注。雙向電泳技術(shù) (two-dimensional electrophoresis, 2-DE)作為蛋白質(zhì)組研究的三大關(guān)鍵核心技術(shù)之一 (另兩 種是質(zhì)譜技術(shù)和計算機圖像數(shù)據(jù)處理與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫即蛋白質(zhì)組信息技術(shù))，是分離蛋白質(zhì) 的重要手段，是目前唯一可以在一塊膠上同時分離數(shù)千乃至上萬個蛋白質(zhì)的方法，且分離得 到的蛋白質(zhì)組分純度可以達到90%以上。因此，對于植物蛋白質(zhì)組的研究，雙向電泳技術(shù)的 應(yīng)用越來越受到人們的廣泛關(guān)注。雙向電泳是指利用蛋白質(zhì)的帶電性和分子量大小的差異，通過兩次凝膠電泳達到分離蛋 白質(zhì)群的技術(shù)。雙向電泳技術(shù)包括蛋白樣品制備、干膠條水合、等電聚焦、在平衡液中平衡 膠條和SDS-PAGE電泳等步驟。隨著此項技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛，技術(shù)體系也越來越成熟，只 要能保證提取蛋白的質(zhì)量，利用成熟的后續(xù)步驟就可獲得高質(zhì)量的電泳圖譜。所以，對一種 新的植物材料，獲得理想的雙向電泳圖譜的關(guān)鍵就是必須提取得到高質(zhì)量的蛋白樣品。棗樹是原產(chǎn)我國的特色優(yōu)勢果樹，資源非常豐富。棗樹的組織器官因為富含糖類等雜質(zhì)， 提取高質(zhì)量的蛋白比較困難。本發(fā)明利用田間的棗樹試材(包括葉、花及枝皮)，通過蛋白提 取步驟的大量摸索，最終建立了一套適合棗雙向電泳的蛋白提取技術(shù)體系。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明建立了一套成熟、實用的適合雙向電泳的棗蛋白質(zhì)提取方法，為棗的蛋白質(zhì)組學 研究提供了技術(shù)保障。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是以棗樹葉片、枝皮和花等為試材，通過研 磨，丙酮、三氯乙酸及苯酚和SDS等一系列試劑的抽提離心過程，最終去除雜質(zhì)，獲得高質(zhì) 量的蛋白樣品。雙向電泳結(jié)果表明，用此提取方法獲得的蛋白質(zhì)可以完全滿足后續(xù)的雙向電 泳分析要求。本發(fā)明的具體內(nèi)容，即蛋白質(zhì)提取的具體方法如下(1) 取新鮮枝皮或-70'C凍存的枝皮、花或葉片0.2g，在液氮中研磨后，轉(zhuǎn)移到10mL 離心管中；(2) 力卩-20。C凍存的丙酮5.0mL，充分渦旋30s， 4'C10000g離心5min，棄上清，取沉淀；(3) 沉淀加-20。C凍存的丙酮5.0mL，充分渦旋30s， 4。Cl0000g離心5min，棄上清，取沉淀；(4) 用-20。C凍存的10%三氯乙酸(丙酮配制)洗沉淀4次，直至無色，每次均充分渦旋30s， 4。C10000g離心5min，棄上清，取沉淀；(5) 用10%三氯乙酸水溶液(常溫)洗沉淀2次，每次均充分渦旋30s， 4"10000g離 心5min，棄上清，取沉淀；(6) 用-20。C凍存的丙酮洗沉淀2次，每次均充分渦旋30s， 4'C10000g離心5min，棄上 清，取沉淀；(7) 室溫干燥沉淀30min,得到蛋白粗提干粉；(8) 稱量步驟(7)所得干粉0.05-0.1g，溶于lmL苯酚(Tris配制pH8.0)禾tllmLSDS 溶液(30%蔗糖，2%SDS, 0.1MTris-HClpH8.0， 5%卩-巰基乙醇)，于10mL離心管中；(9) 充分渦旋30s， 10000g離心5min，苯酚相被分開；吸出上層的苯酚相，置于新的 離心管中，加至少5倍體積-2(rC凍存的甲醇與0.1M醋酸銨混合液到苯酚相，置于-2(TC30min;(10) 10000g離心5min,再用-20。C凍存的甲醇與0.1M醋酸銨混合液洗沉淀2次；(11) 加-2(TC凍存的丙酮洗沉淀2次，將洗凈的沉淀在室溫干燥30min，即獲得高質(zhì)量 的蛋白質(zhì)粉末。本發(fā)明專利的有益效果是，在將樣品充分研磨后，通過丙酮、三氯乙酸及苯酚和SDS等 一系列試劑的抽提離心過程，最終去除了色素、酚及糖類雜質(zhì)，獲得了高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品， 進行雙向電泳分析獲得了重復性好、分辨率高的電泳圖譜。從而建立了一套適合雙向電泳分 析的棗蛋白質(zhì)提取方法，為棗的蛋白質(zhì)組學研究提供了技術(shù)支撐。


圖1是利用本發(fā)明提取的棗枝皮韌皮部蛋白質(zhì)獲得的雙向電泳圖譜。 圖2是利用本發(fā)明提取的棗葉片蛋白質(zhì)獲得的雙向電泳圖譜。 圖3是利用本發(fā)明提取的棗花蛋白質(zhì)獲得的雙向電泳圖譜。
具體實施方式
以棗樹葉片、枝皮或花為試材，取0,2g，在液氮中充分研磨后，轉(zhuǎn)移到10mL離心管； 加-2(TC凍存的丙酮清洗樣品粉末2次，4'Cl0000g離心5min，棄上清，取沉淀；再用-2(TC 凍存10%三氯乙酸(丙酮配制)洗沉淀4次，直至無色；用常溫10%三氯乙酸水溶液再洗沉 淀2次，取沉淀；用-2(TC凍存的丙酮洗沉淀2次，取沉淀；室溫干燥30min，得到蛋白粗提 干粉，稱取干粉0.05-0.1g，溶于lmL苯酚和lmLSDS buffer中，充分渦旋30s， 10000g離心 5min，將上層酚相吸出，至于新的離心管中，加至少5倍體積的-2(TC凍存的冷甲醇與0.1M 醋酸銨混合液到苯酚相，置于-2(TC30min，離心后，沉淀再用-20'C凍存的冷甲醇與0.1M醋 酸銨混合液洗2次；加-2(TC凍存的丙酮洗沉淀2次，沉淀室溫干燥30min，即可獲得高質(zhì)量 的蛋白粉末，滿足后續(xù)的雙向電泳分析要求。
權(quán)利要求
1. 一種適合雙向電泳的棗蛋白質(zhì)提取方法，其特征在于用液氮研磨破碎細胞、丙酮和三氯乙酸多次抽提去除色素、苯酚和SDS抽提去除糖類雜質(zhì)等一系列步驟，最終獲得高質(zhì)量的蛋白樣品，可滿足雙向電泳分析要求。
2. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟-(1) 取新鮮枝皮或-70'C凍存的枝皮、花或葉片0.2g，在液氮中研磨后，轉(zhuǎn)移到10mL 離心管中；(2) 力卩-20。C凍存的丙酮5.0mL,充分渦旋30s， 4'C10000g離心5min，棄上清，取沉淀；(3) 沉淀加-20'C凍存的丙酮5.0mL，充分渦旋30s， 4°C 10000g離心5min，棄上清，取沉淀；(4) 用-20。C凍存的10%三氯乙酸(丙酮配制)洗沉淀4次，直至無色，每次均充分渦 旋30s， 4。C10000g離心5min，棄上清，取沉淀；(5) 用10%三氯乙酸水溶液(常溫)洗沉淀2次，每次均充分渦旋30s， 4。C10000g離 心5min，棄上清，取沉淀；(6) 用-20。C凍存的丙酮洗沉淀2次，每次均充分渦旋30s， 4'C10000g離心5min，棄上 清，取沉淀；(7) 室溫干燥沉淀30min,得到蛋白粗提干粉；(8) 稱量步驟(7)所得干粉0.05-0.1g，溶于lmL苯酚(Tris配制pH8.0)和lmLSDS 溶液(30%蔗糖，2%SDS， 0.1MTris-HClpH8.0， 5。/。p-巰基乙醇)，于10mL離心管中；(9) 充分渦旋30s, 10000g離心5min，苯酚相被分開；吸出上層的苯酚相，置于新的 離心管中，加至少5倍體積-20'C凍存的甲醇與0.1M醋酸銨混合液到苯酚相，置于-20'C30min;(10) 10000g離心5min，再用-20'C凍存的甲醇與0.1M醋酸銨混合液洗沉淀2次；(11) 加-2(TC凍存的丙酮洗沉淀2次，將洗凈的沉淀在室溫干燥30min,即獲得高質(zhì)量 的蛋白質(zhì)粉末。
全文摘要
一種適合雙向電泳的棗蛋白質(zhì)提取方法，以0.2g棗樹葉片、枝皮或花為試材，在液氮中充分研磨后，轉(zhuǎn)移到10mL離心管；加-20℃凍存的丙酮清洗樣品粉末2次，4℃10000g離心5min，取沉淀；再用-20℃凍存的10％三氯乙酸(丙酮配制)洗沉淀4次至無色；用常溫10％三氯乙酸水溶液和-20℃凍存的丙酮分別洗沉淀2次，沉淀室溫干燥30min，得到蛋白粗提干粉，稱干粉0.05-0.1g，溶于苯酚和SDS溶液中，充分渦旋30s，10000g離心5min，將上層酚相吸出，置于新離心管中，加5倍體積的-20℃凍存的冷甲醇與0.1M醋酸銨混合液到苯酚相，置于-20℃30min，離心后，用-20℃凍存的冷甲醇與0.1M醋酸銨混合液洗沉淀2次，-20℃凍存的丙酮洗沉淀2次，沉淀室溫干燥30min，即可獲得高質(zhì)量的蛋白粉末，完全能滿足后續(xù)雙向電泳分析的要求。
文檔編號C07K1/14GK101280002SQ20081011073
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日
發(fā)明者劉孟軍, 申永鋒, 錦 趙 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學