專利名稱：一種鼠李糖乳桿菌Pr2肽及其編碼基因、分離方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種鼠李糖乳桿菌Pr2肽及其 編碼基因、分離方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在調(diào)控T細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用。Tregs能夠在胸腺內(nèi)外 產(chǎn)生。這種細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、 CD4、 CD25，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因 子受體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4。有活性的Tregs的抑制功能至少部分依賴于它 們表達(dá)的TGF-P、 IL-IO、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4或FasL。這些分子能夠通過 誘導(dǎo)凋亡的途徑使靶細(xì)胞死亡。在遺傳性過敏癥中，認(rèn)為過敏原特異性Tregs功能的 失常與過敏原特異性Th2反應(yīng)和過敏性炎癥相關(guān)。大量研究報道也顯示Tregs在防止 自身免疫性疾病和調(diào)節(jié)機(jī)體過激的免疫反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。然而，誘導(dǎo)Tregs 產(chǎn)生的機(jī)制，特別是胸腺外抗原特異性Tregs細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制仍未明了。
已經(jīng)有報道嘗試了一些用于產(chǎn)生治療目的Tregs的方法在高濃度的IL-2培養(yǎng)
條件下擴(kuò)增胸腺來源的Tregs被認(rèn)為是一種簡便易行的方法，然而，這種細(xì)胞增殖能
力差的特性限制了這種方法的運用；雷怕霉素一種抗生素，用于增殖天然的Tregs， 然而其結(jié)果還存在爭議。
DCs在抗原呈遞、初始T細(xì)胞活化和Thl或Th2細(xì)胞分化中具有關(guān)鍵作用，從 而在啟動抗原特異性免疫反應(yīng)或耐受[11]中起重要作用。最近研究進(jìn)展顯示共培養(yǎng) 初始T細(xì)胞和耐受性DCs能夠顯著增加Tregs的增殖，這項研究有望提供一個產(chǎn)生 Tregs的方法。然而，耐受性DCs的產(chǎn)生機(jī)制和它怎樣確切的誘導(dǎo)Tregs產(chǎn)生機(jī)制仍 未被闡明， 一些生長因子包括IL-IO、轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF-(3)、粒細(xì)胞克隆刺激因 子、血管活性腸肽被認(rèn)為起重要作用[14]。這些研究不僅顯示在實驗條件下產(chǎn)生和應(yīng) 用耐受性或調(diào)節(jié)性DCs,可作為一種新的免疫抑制性治療策略應(yīng)用于免疫調(diào)控，而 且，還顯示DCs在胸腺外抗原特異性Tregs發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
腸道共生微生物菌群通過調(diào)節(jié)新陳代謝、局部和整體的免疫功能、防止病原微 生物繁殖，從而給機(jī)體帶來明顯益處。大量研究資料也表明腸道微生物菌群改變與 一些免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)，包括炎癥性腸病(IBD)、過敏性疾病、關(guān)節(jié)炎。這些研究表明除了它們的己知功能外，腸道微生物還具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能?；谝陨涎芯拷Y(jié)果， 一些共生的益生菌株如乳酸菌、雙歧桿菌已經(jīng)在臨床和實驗條件下用于抑制免疫功能紊亂性疾病。研究顯示益生菌治療作用要求用活的細(xì)菌有機(jī)體，這意味著起治療作用的微生物分子只能由活的益生菌株產(chǎn)生。不幸的是，盡管在這方面已取得一些進(jìn)展，但益生菌中起免疫調(diào)節(jié)作用成分的性質(zhì)仍未了解，對益生菌免疫抑制作用的細(xì)胞和分子機(jī)制了解甚少。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的發(fā)明人鑒定了一種鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)上清液來源的肽-Pr2，能夠使骨髓來源的DCs轉(zhuǎn)化為免疫耐受表型，并使之產(chǎn)生IL-IO。這種Pr2刺激產(chǎn)生的003具有在體外誘導(dǎo)胸腺外抗原特異性？(^ 3+ Tregs產(chǎn)生的能力。此外，我們還證明了這種Tregs或純化的Pr2能夠在體內(nèi)抑制腸道抗原特異性過敏反應(yīng)。本發(fā)明的目的之一是提供一種鼠李糖乳桿菌Pr2肽。本發(fā)明的再一 目的是提供編碼上述鼠李糖乳桿菌Pr2肽的基因。本發(fā)明的再一 目的是提供一種分離上述鼠李糖乳桿菌Pr2肽的方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述鼠李糖乳桿菌Pr2肽在制備用于治療免疫功能紊亂性疾病的藥物中應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌Pr2肽，其具有如SEQNo.l所示的氨基酸序列。SEQ No.l:
60
ENEAFA 66
本發(fā)明還提供了編碼上述鼠李糖乳桿菌Pr2肽的基因。該基因可以具有如SEQ
No.2所示的核苷酸序列。SEQ No.2:
gcgatttttccgtggctggtggtggatggccagggcagccgcctgccgagcgcgaacgtgatgaacctgctgaccaccattcagatgctgtatgtggaacgctttccgcgcgaagtgggcgcggtgaccgattatgatgtg幼atatgaaatgtttggcgcgaaaattcgcggcaccaaagaaaacgaagcgtttgcg
本發(fā)明還提供了分離上述鼠李糖乳桿菌Pr2肽的方法，包括以下步驟
1) 鼠李糖乳桿菌aacto6ac/〃^i to w2omy)在MLR肉湯培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24h，洗滌后，細(xì)胞進(jìn)一步在MLR9中培養(yǎng)96h;
2) 離心去除細(xì)胞，疏水作用色譜法純化上清液中蛋白，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，陽離子交換色譜法收集蛋白；
3) 收集的蛋白部分經(jīng)SepPakC18反相柱脫鹽后，經(jīng)高壓液相色譜法純化；以及
4)收集有功能的部分。
本發(fā)明還提供了上述鼠李糖乳桿菌Pr2肽在制備用于治療免疫功能紊亂性疾病的藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明證實一種純化的鼠李糖乳桿菌Pr2肽具有增加抗原特異性Tregs產(chǎn)生的能力。當(dāng)再次暴露于特異性抗原時，產(chǎn)生的Tregs被激活并釋放出功能性分子IL-lO、TGF-P和Fasl。通過過繼轉(zhuǎn)移抗原特異性Tregs和直接給予致敏小鼠Pr2和特異性抗原一樣，都能夠有效抑制機(jī)體內(nèi)抗原特異性的Th2反應(yīng)和超敏反應(yīng)。
Tregs最初被認(rèn)為在胸腺內(nèi)產(chǎn)生，但越來越多的證據(jù)顯示，在外周T細(xì)胞中也可誘導(dǎo)出Tregs。這一發(fā)現(xiàn)給Tregs的研究帶來了新的希望，因為Tregs在克服免疫功能紊亂性疾病中具有治療潛能。然而，要得到大量用于治療目的的Tregs還存在障礙。本發(fā)明結(jié)果顯示一種純化的鼠李糖乳桿菌Pr2肽具有提高外周初始CD4+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3，并產(chǎn)生Tregs的能力。在這一發(fā)現(xiàn)和以往的研究中，Tregs能夠從初始CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的研究結(jié)果相一致。因為本發(fā)明己經(jīng)分析了 Pr2的氨基酸序列，這就意味著不僅可以從培養(yǎng)上清液中純化Pr2，也可以根據(jù)其氨基酸序列人工合成Pr2，因此，本發(fā)明提供了一條應(yīng)用Tregs治療免疫功能紊亂性疾病的新方法。
從外周T細(xì)胞中產(chǎn)生Tregs的機(jī)制還未被完全闡明。有報道稱不同的分子參與了Tregs的產(chǎn)生，如IL-IO、 TGF- e 、雷怕霉素等[22，23]。本發(fā)明也揭示Pr2刺激后的DCs能夠增加IL-10的表達(dá)，與這些DCs共培養(yǎng)時能夠使初始的CD4+CD25T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成Foxp3+T細(xì)胞。而且這種轉(zhuǎn)化能夠被抗IL-10受體抗體預(yù)處理后而被阻止。本發(fā)明證實IL-10在經(jīng)Pr2刺激產(chǎn)生Tregs過程中起重要作用，IL-10是該過程中的調(diào)控因子。盡管也有研究顯示可能TGF-P也是Tregs產(chǎn)生中的重要因子，但我們并未檢測到經(jīng)Pr2刺激后的BMDCs中TGF- 0的增加，事實表明TGF- 0在Pr2誘導(dǎo)的Tregs轉(zhuǎn)化中不起作用。
Stat3是IL-10表達(dá)的所需的轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明也檢測到了 Stat3在經(jīng)Pr2刺激的BMDCs中的表達(dá)。盡管Stat3表達(dá)水平?jīng)]有變化，但磷酸Stat3在給予Pr2后顯著增加，而且經(jīng)RNA干擾使Stat3基因沉默能夠阻止Pr2誘導(dǎo)后的BMDCs中IL-10的表達(dá)，并消除對隨后的Tregs的誘導(dǎo)作用。這一事實表明Stat3在Pr2刺激的BMDCs表達(dá)IL-IO中是一個獨立因素。Fo鄧3表達(dá)作為Tregs產(chǎn)生的指標(biāo)，本發(fā)明觀察了 Pr2刺激后的BMDCs使初始CD4+CD25T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Foxp3+T細(xì)胞，但共培養(yǎng)的第一周期中只有20%的細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，延長培養(yǎng)時間并不能提高Foxp3+T細(xì)胞的比率。微生物產(chǎn)物具有通過加強Fas/FasL途徑使DCs細(xì)胞死亡的能力[24]，本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)在與CD4+CD25T細(xì)胞共培養(yǎng)后Fas在BMDCs中表達(dá)增加。這一發(fā)現(xiàn)顯示DCs細(xì)胞凋亡可能會削弱初始CD4+CD25T細(xì)胞向Tregs的轉(zhuǎn)化，加入新的DCs后能夠加強向Tregs的轉(zhuǎn)化。確實在隨后的實驗中也證實了我們的推測，F(xiàn)oxp3+T細(xì)胞呈共培養(yǎng)周期數(shù)依賴性方式增加，因而多重的與Pr2刺激后的DCs共培養(yǎng)周期是體外產(chǎn)生Tregs所必需的。
本發(fā)明另一個新的發(fā)現(xiàn)是同時暴露于Pr2和特異性抗原能夠進(jìn)一步提高T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)。其機(jī)制可能是暴露于抗原OVA能增加BMDCs中T細(xì)胞受體誘導(dǎo)的共刺激受體配體(ICOSL)的表達(dá)，與抗誘導(dǎo)的共刺激受體(ICOS)抗體預(yù)處理后可阻止這種效應(yīng)的發(fā)生。因活化的ICOS能增強效應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)[25]，本發(fā)明中的這一發(fā)現(xiàn)表明ICOS/ICOSL間的相互作用能夠上調(diào)Tregs的產(chǎn)生。
有報道稱灌胃方式給予OVA能有效增加Peyer's斑中Tregs的數(shù)量，因此本發(fā)明試圖從體外分離的免疫細(xì)胞中得到Tregs.，然而單獨暴露于抗原OVA時并不能提高Tregs的產(chǎn)生，而同時暴露于OVA和Pr2時則能夠增加Tregs的產(chǎn)生。值得注意的是產(chǎn)生的Tregs是抗原特異性的。作為對OVA抗原刺激的反應(yīng)，OVA-iTregs可釋放IL-IO、 TGF-e和FasL，而單獨用Pr2刺激時則無明顯變化。本發(fā)明顯示抗原特異性的Tregs能夠經(jīng)暴露于特異性抗原而被激活。這種活化能夠通過凋亡途徑誘導(dǎo)抗原特異性效應(yīng)性T細(xì)胞死亡。因抗原特異性效應(yīng)性T細(xì)胞也能夠同時被激活，抗原特異性Tregs來源的IL-10、TGF- P和FasL在Tregs活化后誘導(dǎo)的T細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用。
Tregs在抑制過激的免疫反應(yīng)中起重要作用，所以本發(fā)明旨在通過產(chǎn)生抗原特異性Tregs來抑制過激的Th2反應(yīng)和過敏性疾病。體內(nèi)外的實驗結(jié)果表明過繼轉(zhuǎn)移給致敏后小鼠抗原特異性Tregs和給予Pr2/OVA —樣對過敏性疾病都具有治療作用，因為經(jīng)上述處理后腸道內(nèi)的Th2反應(yīng)和超敏反應(yīng)能夠明顯減輕或消除。
總之，鼠李糖乳桿菌來源的肽Pr2具有體外刺激產(chǎn)生Tregs的能力。同時暴露于Pr2和抗原能夠產(chǎn)生抗原特異性Tregs，這種抗原特異性Tregs能夠在再次暴露于特異性抗原時被激活。激活后的抗原特異性Tregs釋放功能性分子IL-10、TGF-P和FasL。過繼轉(zhuǎn)移抗原特異性Tregs或給予致敏小鼠Pr2和特異性抗原能夠明顯抑制機(jī)體中抗原特異性Th2反應(yīng)和過敏反應(yīng)，從而這種方法在治療過敏性疾病中具有潛在的應(yīng)用價值。


圖1表示Pr2增加BMDCs中IL-10的表達(dá)，A, BMDCs中IL-10 mRNA的表達(dá)；B，培養(yǎng)液中IL-10水平；C， BMDCs中IL-10和TGF-卩蛋白表達(dá)量；D， Pr2的氨基酸序列；E，為BMDCs對Pr2劑量反應(yīng)研究中，IL-10 mRNA的表達(dá)；F，為BMDCs對Pr2劑量反應(yīng)研究中，IL-10蛋白的表達(dá)；QBMDCs經(jīng)Pr2刺激后，IL-10表達(dá)的
時間過程。
圖2表示Pr2增加BMDCs中IL-10的表達(dá)，BMDCs經(jīng)Pr2刺激后，提取總蛋白質(zhì)，分別用抗Stat3和抗phosphorStat3抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，A， Stat3免疫印跡；B， phosphor Stat3免疫印跡；C，乙?；M蛋白H3印跡；D， IL-10啟動子激活的PCR結(jié)果，*，p<0.01， si:表示經(jīng)Stat3RNA干擾后在暴露于Pr2; E-J,流式細(xì)胞儀檢測CDlle+細(xì)胞中IL-10的表達(dá)。
圖3表示Pr2刺激BMDC使初始CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞A，表示Foxp3mRNA表達(dá)量，*表示？<0.05，與"0"組比較，B，表示Foxp3蛋白質(zhì)表達(dá)量，I帶表示Pr2沖擊的BMDC共培養(yǎng)，II帶表示先與抗IL-10受體抗體處理，在與Pr2沖擊的BMDC共培養(yǎng)，m為e-actin， C-H,不同周期數(shù)時，F(xiàn)oxp3+T細(xì)胞量。
圖4表示再次暴露于OVA時，OVA特異性Treg細(xì)胞表達(dá)高水平IL-IO,TGF- B和FasL， A，表示IL-10水平，B，表示FasL水平，C，表示IL-IO,TGF- B和FasL mRNA表達(dá)，D，表示IL-IO，TGF- B和FasL蛋白質(zhì)表達(dá)，E，表示TGF- B和FasL在OVA-iTreg細(xì)胞表面的表達(dá)。
圖5表示產(chǎn)生的Treg能夠表達(dá)CCR9 A表示CCR9蛋白質(zhì)表達(dá)，B表示固有層內(nèi)CFSE陽性細(xì)胞，C表示對照組。
圖6表示鼠李糖乳桿菌上清液來源的肽Pr2抑制腸道內(nèi)OVA特異性過敏反應(yīng)
A， OVA特異性IgE水平，B，血清中IL-4和IFN^水平，C，分離的腸道CD4+T細(xì)
胞經(jīng)OVA刺激后與^H]胸苷結(jié)合水平，D，肥大細(xì)胞脫顆粒計數(shù)，*，p<0.05， naive:
未處理小鼠，OVA1:只給以O(shè)VA小鼠組，OVA2，給以O(shè)VA+明磯組，OVA3，給
以O(shè)VA+明砜后再給以Pr2+OVA。
圖7 Pr2/OVA對腸道內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量的調(diào)控，A-H陽性細(xì)胞呈棕色，陽性細(xì)胞被設(shè)計省去一抗(D)，或被同種型抗體染色(E)， I表示陽性染色細(xì)胞數(shù)量，*表示？<0.05，與未致敏組相比。
具體實施方式
試劑
磁珠抗體(Miltenyi Biotec， Auburn， CA, USA)， iScriptTMcDNA合成試劑盒(Bio-Rad， Mississauga, ON, Canada), Superscript III Platinum SYBR Green Two-StepqPCR Kit (Invitrogen, , ON, Canada), Oligo Fectamine and siRNAs (Invitrogen， Burlington, ON, Canada), ELISA kits (R&D Systems, Burlington, ON, Canada), Anti-IL-4、 anti-IFN-y、 anti-TGF陽卩、anti-IL-10 (BD Bioscience, Mississauga, ON, Canada), [3H] thymidine (GE Healthcare, Piscataway, NJ， US A) ， ProteoExtract subcellular proteome extraction kit (Calbiochem， San Diego， CA)，本發(fā)明中的其它試劑均購自 Sigma Aldrich (Oakville, ON, Canada)。 小鼠
6-8周齡的Balb/c小鼠購自Charles River Canada (St. Constant, QC， Canada),飼 養(yǎng)在無菌的環(huán)境中。
實施例l鼠李糖乳桿菌Pr2肽的純化
1、 累積證據(jù)表明益生菌的應(yīng)用對免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，例如，修復(fù)失衡的 Thl/Th2功能，提高Tregs的產(chǎn)生等。因為活的細(xì)菌是獲得治療作用所必須的，本發(fā) 明的發(fā)明人推測在益生菌培養(yǎng)上清液中的一種成分可能起調(diào)控DCs功能的作用，并 進(jìn)一步調(diào)控免疫反應(yīng)。本發(fā)明的發(fā)明人用骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDCs)作為評價 體系，用鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)上清液沉淀物用來刺激BMDCs的生長。既然DCs來源 的IL-IO和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-(3)在Tregs產(chǎn)生中具有關(guān)鍵作用，因此，本發(fā)明的 發(fā)明人對經(jīng)鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)上清液沉淀物刺激后的BMDCs培養(yǎng)過程中這兩種分 子進(jìn)行了評價。
鼠李糖乳桿菌(X. i /^mmw叫'ATCC; Manassas, VA, USA，為本領(lǐng)域公知公用的標(biāo) 準(zhǔn)菌株)在MLR肉湯培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24 h，洗滌后，細(xì)胞進(jìn)一步在MLR9中培 養(yǎng)96h。離心去除細(xì)胞，疏水作用色譜法純化上清液中蛋白，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，陽離子 交換色譜法收集蛋白，然后，細(xì)菌素部分經(jīng)SepPakC18反相柱脫鹽后，經(jīng)高壓液相 色譜法純化，收集峰值物質(zhì)分成幾個部分。
參照文獻(xiàn)報道分離獲得BMDCs;培養(yǎng)第7天，通過磁珠分選技術(shù)(MACS)分 離0011^細(xì)胞(純度>95%);根據(jù)不同分組分別加入不同濃度的上述獲得的上清液 沉淀物(兔IgG設(shè)為對照)，37°C培養(yǎng)48小時。結(jié)果顯示初始BMDCs表達(dá)少量IL-IO。 上清液沉淀物在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均使BMDC表達(dá)IL-10增加，而且呈劑量 依賴性(圖，1 A-C)。在細(xì)胞提取液中可檢測到TGF-P，其表達(dá)水平在經(jīng)上清液沉 淀物刺激后無變化(圖，1C)。把上清液沉淀物分成幾組成分，再分別用這些成分刺 激BMDCs生長，最終， 一種肽-Pr2被鑒定為是刺激BMDCs增加IL-10表達(dá)的主要 因子，其氨基酸序列見圖1D。
2、 鼠李糖乳桿菌Pr2肽的純化
8鼠李糖乳桿菌在MLR肉湯培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12 h，洗滌后，細(xì)胞進(jìn)一步在 MLR9中培養(yǎng)96h。離心去除細(xì)胞，疏水作用色譜法純化上清液中蛋白，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 后，陽離子交換色譜法收集蛋白，然后，細(xì)菌素部分經(jīng)SepPakC18反相柱脫鹽后， 經(jīng)高壓液相色譜法純化，收集峰值物質(zhì)分成幾個部分。
分離獲得BMDCs;培養(yǎng)第7天，通過磁珠分選技術(shù)(MACS)分離0011^細(xì) 胞(純度>95%);根據(jù)不同分組分別加入不同濃度的上述獲得的上清液沉淀物(兔 IgG設(shè)為對照)，37。C培養(yǎng)48小時。結(jié)果顯示初始BMDCs表達(dá)少量IL-lO。上清液 沉淀物在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均使BMDC表達(dá)IL-10增加，而且呈劑量依賴性。 把上清液沉淀物分成幾組成分，再分別用這些成分刺激BMDCs生長，鑒定出一種肽 -Pr2是剌激BMDCs增加IL-10表達(dá)的主要因子。 3、鼠李糖乳桿菌Pr2肽的純化
鼠李糖乳桿菌在MLR肉湯培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)48 h，洗滌后，細(xì)胞進(jìn)一步在 MLR9中培養(yǎng)96h。離心去除細(xì)胞，疏水作用色譜法純化上清液中蛋白，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 后，陽離子交換色譜法收集蛋白，然后，細(xì)菌素部分經(jīng)SepPakC18反相柱脫鹽后， 經(jīng)高壓液相色譜法純化，收集峰值物質(zhì)分成幾個部分。
分離獲得BMDCs;培養(yǎng)第7天，通過磁珠分選技術(shù)(MACS)分離001化+細(xì) 胞(純度>95%);根據(jù)不同分組分別加入不同濃度的上述獲得的上清液沉淀物(兔 IgG設(shè)為對照)，37。C培養(yǎng)48小時。結(jié)果顯示初始BMDCs表達(dá)少量IL-lO。上清液 沉淀物在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均使BMDC表達(dá)IL-10增加，而且呈劑量依賴性。 把上清液沉淀物分成幾組成分，再分別用這些成分刺激BMDCs生長，鑒定出一種肽 -Pr2是刺激BMDCs增加IL-10表達(dá)的主要因子。
實施例2鼠李糖乳桿菌Pr2肽的功能檢測
1、 Pr2在增加BMDCs表達(dá)IL-lO中的作用。
經(jīng)Pr2刺激后，培養(yǎng)液和BMDCs細(xì)胞提取液中的IL-10表達(dá)水平比經(jīng)上清液沉 淀物刺激后的表達(dá)水平明顯增加(圖，1A， B)，且呈劑量依賴性(圖1 E， F)。對 BMDCs中IL-10表達(dá)進(jìn)行動態(tài)觀測，連續(xù)觀察研究顯示Pr2增加IL-10的表達(dá)在第 12小時達(dá)高峰，并且保持高水平于觀察全程(96小時)(圖1G)。
2、在上述Pr2介導(dǎo)的BMDCs表達(dá)IL-10過程中是否有Stat3的參與
有研究顯示Stat3可能在IL-10表達(dá)中起重要作用。本發(fā)明的發(fā)明人也研究了在 上述Pr2介導(dǎo)的BMDCs表達(dá)IL-10過程中是否有Stat3的參與。BMDCs與不同劑量 等級的Pr2共培養(yǎng)24h，核提取物中均可檢測出Stat3和磷酸Stat3。經(jīng)Pr2刺激后，Stat3的水平改變無意義(圖2A)，而磷酸Stat3表達(dá)水平呈劑量依賴性方式增加(圖 2B)。結(jié)果表明Pr2能夠增加BMDCs中Stat3的磷酸化。而且，通過染色質(zhì)免疫沉淀 法測定(ChIP)顯示，經(jīng)Pr2處理后，能夠增加IL-10基因的轉(zhuǎn)錄(圖2C, 2D)。為確定 Stat3在經(jīng)Pr2刺激后的BMDCs表達(dá)IL-10中的作用，通過RNA干擾技術(shù)，使一組 BMDCs中的Stat3基因沉默，Stat3基因沉默后，Pr2刺激BMDCs表達(dá)IL-10增加 的作用消失(圖2C, 2D)。 DCs來源的IL-10在Tregs產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用，結(jié)果顯示Pr2 刺激DCs產(chǎn)生的是"耐受性的"DCs且是有潛在的Tregs誘導(dǎo)劑。
3、 Pr2具有在體外促進(jìn)耐受性的DCs產(chǎn)生的功能 本發(fā)明的發(fā)明人證明了 Pr2具有在體外促進(jìn)耐受性的DCs產(chǎn)生的功能，是否
Pr2在體內(nèi)也有同樣的作用？通過腹腔注射(i.p，2mg/kg)或灌胃(4mg/kg)的方式 給予Balb/c小鼠Pr2，每天1次，共5天，最后一次給予后3天后，處死小鼠。在脾 和腸組織中，純化的CDllc+中IL-10+細(xì)胞的比率與對照組未處理鼠相比明顯提高， 見圖2E-J。
4、 與Pr2沖擊的DCs共培養(yǎng)可增加CD4+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3 通過試劑盒從鼠的脾臟中分離CD4+CD25T細(xì)胞(純度>95%);在IL-2存在的
情況下把這種初始的T細(xì)胞和Pr2刺激后的BMDC共同培養(yǎng)0-4周期(1周期表示 共同培養(yǎng)72h， CD4+T細(xì)胞通過MACS被純化，然后，加入新鮮的Pr2沖擊的BMDCs 共同培養(yǎng))。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示該處理明顯增加CD4+CD25+T細(xì)胞中Foxp3 表達(dá)，并呈一種處理周期數(shù)相關(guān)性(圖3A，和B)。在培養(yǎng)2周期后Foxp3表達(dá)量明 顯增加；4個周期后后，超過60%的細(xì)胞表達(dá)Foxp3 (圖3C-G)。結(jié)果表明Pr2沖擊 的BMDCs具有使初始CD4+CD25T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+ Foxp3+Treg的功能。在 另一個獨立的實驗中，CD4+CD25T細(xì)胞加入到Pr2和OVA共同沖擊后的BMDCs 中共同培養(yǎng)4輪， 一個有代表性的試驗結(jié)果是純化的CD4+CD25+T細(xì)胞中，有95.6% 的Foxp3+T細(xì)胞(圖3H)。在Pr2沖擊的BMDCs增加CD4+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3過程 中，IL-10可能是主要的因子， 一組CD4+CD25T細(xì)胞用抗IL-10受體抗體預(yù)處理后， 再和Pr2沖擊的BMDCs共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示未出現(xiàn)Foxp3的表達(dá)增加(圖3B 11)。 我們用流式細(xì)胞儀也檢測了這些細(xì)胞中IL-4和INF-Y的表達(dá)量，結(jié)果顯示，和初始 CD4+CD25T細(xì)胞相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
5、 重新暴露于特異性抗原OVA時，OVA特異性誘導(dǎo)的Treg (OVA-iTreg)中 IL-10 、 TGF- e和Fasl表達(dá)量增加。把產(chǎn)生的OVA-iTreg (比率〉95%)暴露于不同劑量梯度的OVA中。ELISA結(jié) 果顯示上清液中的IL-10高表達(dá)(圖4A)和Fasl高表達(dá)(圖4B)， TGF-e未能檢測 出。然而，qRT-PCR結(jié)果顯示IL-IO、 TGF-e和FaslmRNA表達(dá)水平在分離的 OVA-iTreg中表達(dá)量增加，呈OVA劑量依賴性(圖4C)。 western blot測定顯示IL-IO、 TGF-e和Fasl在細(xì)胞提取液中蛋白質(zhì)表達(dá)量增加(圖4D)。流式細(xì)胞計數(shù)顯示TGF-e和Fasl在OVA-iTreg細(xì)胞表面的表達(dá)情況(圖4E-F)。結(jié)果表明重新暴露于特異 性抗原時，IL-IO、 TGF-p和FasL在Tregs中的表達(dá)是增加的，IL-IO、 FasL可被釋 放到微環(huán)境中，而TGF-(3只能表達(dá)在Tregs表面。
6、 產(chǎn)生的Tregs具有腸道歸巢特性。
western blot結(jié)果顯示產(chǎn)生的Tregs細(xì)胞表達(dá)CCR9分子(圖5 A)， CCR9在Tregs
腸道歸巢中是一個染色質(zhì)受體標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn)這種Tregs具有腸道歸巢特性，我們用 CFSE對這種Tregs進(jìn)行染色，并把它通過尾靜脈注射入未致敏的小鼠體內(nèi)。 一天后 處死小鼠，腸道組織通過共聚焦顯微鏡觀察，CFSE染色標(biāo)記過的細(xì)胞位于腸道固有 層組織內(nèi)(圖5B)，這一結(jié)果表明轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)的Tregs能夠在一天內(nèi)歸巢到小腸組 織內(nèi)。
7、 活化的抗原特異性的Tregs能夠抑制腸道內(nèi)的超敏反應(yīng)
如圖4描述，OVA-iTregs中IL-IO、 TGF-P和Fasl表達(dá)增加。體外研究表明， 可能活化的抗原特異性Tregs具有抑制機(jī)體內(nèi)過激的Th2反應(yīng)能力。為驗證這一推測， 建立了OVA抗原特異性的腸道過敏小鼠模型。血液樣本經(jīng)面靜脈穿刺取得。血清中 OVA特異性IgE^ 100 ng/ml的Balb/c小鼠經(jīng)尾靜脈將被過繼轉(zhuǎn)移入OVA-iTreg (4x 108/kg)。轉(zhuǎn)入一天后，小鼠將被灌胃給OVA(2g/kg)，每天1次，共5次。最后一次 灌胃一天后處死小鼠。血清OVA特異性IgE水平(圖6A) 、 IL-4/IFN-y水平(圖6B) 和OVA特異性腸道CD4+T細(xì)胞增殖(圖7C)、肥大細(xì)胞脫顆粒(圖.6D-G)、腸道內(nèi) IL-4+和Foxp3+細(xì)胞數(shù)量(圖7)，將作為過敏參數(shù)來評價其治療作用。結(jié)果顯示 OVA-iTregs能夠顯著抑制腸道內(nèi)過敏反應(yīng)。Pr2單獨刺激后的BMDCs組顯示能夠削 弱腸道內(nèi)過敏反應(yīng)，未處理組小鼠和OVA單獨刺激后組對腸道內(nèi)過敏反應(yīng)無抑制作 用。
為闡明是否Pr2在體內(nèi)能夠提高Tregs的產(chǎn)生，Pr2(2mg/kg)和/或OVA (0.8 mg/kg)將同過腹腔注射或灌胃的方式給予OVA致敏的Balb/c小鼠(血清中OVA特 異性IgE^100ng/m)，每天1次，共5次。最后一次處理后，小鼠將給予OVA(2g/kg)
11共3天。結(jié)果顯示致敏小鼠腸道中的過敏反應(yīng)(參數(shù)包括OVA特異性IgE、 IL-4、 IFN-Y、 OVA特異性T細(xì)胞反應(yīng)和肥大細(xì)胞活性))經(jīng)給予Pr2和OVA后消除，致 敏小鼠腸道中的過敏反應(yīng)在單獨給予Pr2后減輕，而單獨給予OVA后致敏小鼠腸道 中的過敏反應(yīng)未減輕。序列表
<110>鄭鵬遠(yuǎn)楊平常
<120> —種鼠李糖乳桿菌Pr2肽及其編碼基因、分離方法和應(yīng)用 <160>2
<210>1
<211>66
<212>PRT
<213>鼠李糖乳桿菌(L. Rhamnosus) <400> 1
AIFPWLVVDG QGSRLPSANV廳LLTTIQML YVERFPREVG AVTDYDVKYE MFGA道GTK 60
ENEAFA 66 <210>2 <211>198 <212>DNA
<213>鼠李糖乳桿菌(L.Rhamnosus) <400> 2
gcgatttttc cgtggctggt ggtggatggc cagggcagcc gcctgccgag cgcgaacgtg 60 atgaacctgc. tgaccaccat tcagatgctg tatgtggaac gctttccgcg cgaagtgggc 120
gcggtgaccg attatgatgt gaaatatgaa atgtttggcg cgaaaattcg cggcaccaaa 180
gaaaacgaag cgtttgcg 98
權(quán)利要求
1、一種鼠李糖乳桿菌Pr2肽，其特征在于，具有如SEQ No.1所示的氨基酸序列。
2、 編碼權(quán)利要求1所述鼠李糖乳桿菌Pr2肽的基因。
3、 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，具有如SEQ Na2所示的核苷酸序列。
4、 分離權(quán)利要求l所述鼠李糖乳桿菌Pr2肽的方法，其特征在于，包括以下步驟1) 鼠李糖乳桿菌在MLR肉湯培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12—48h，洗滌后，細(xì)胞進(jìn) 一步在MLR9中培養(yǎng)96h;2) 離心去除細(xì)胞，疏水作用色譜法純化上清液中蛋白，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，陽離子 交換色譜法收集蛋白；3) 收集的蛋白部分經(jīng)SepPakC18反相柱脫鹽后，經(jīng)高壓液相色譜法純化；以及4) 收集有功能的部分。
5、 權(quán)利要求1所述的鼠李糖乳桿菌Pr2肽在制備用于治療食物過敏性疾病的藥 物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種鼠李糖乳桿菌Pr2肽及其編碼基因、分離方法和應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌Pr2肽，其具有如SEQ No.1所示的氨基酸序列。鼠李糖乳桿菌來源的Pr2肽具有體外刺激產(chǎn)生Tregs的能力。同時暴露于Pr2和抗原能夠產(chǎn)生抗原特異性Tregs，這種抗原特異性Tregs能夠在再次暴露于特異性抗原時被激活。激活后的抗原特異性Tregs釋放功能性分子IL-10、TGF-β和FasL。過繼轉(zhuǎn)移抗原特異性Tregs或給予致敏小鼠Pr2和特異性抗原能夠明顯抑制機(jī)體中抗原特異性Th2反應(yīng)和過敏反應(yīng)，從而這種方法在治療食物過敏性疾病中具有潛在的應(yīng)用價值。
文檔編號C07K14/195GK101456904SQ20081011095
公開日2009年6月17日 申請日期2008年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日
發(fā)明者楊平常, 鄭鵬遠(yuǎn) 申請人:鄭鵬遠(yuǎn);楊平常