專利名稱：針對奶牛y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用的制作方法
針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用 本發(fā)明涉及一種通過分離奶牛的X、 Y精子進行奶牛性別控制的方法，特別涉及一種通 過針對奶牛Y精子特異性單克隆抗體的制備，分離奶牛X、 Y精子，從而實現(xiàn)奶牛性別控制 的方法。
背景技術：
奶牛為單胎動物，與其他畜種相比，繁殖力低，而在自然條件下，奶牛產雌雄比例接近 1-1。飼養(yǎng)奶牛主要的目的是產奶，所以每一位飼養(yǎng)者都希望母牛產雌性牛犢，以增加經濟 效益。通過性別控制技術提高母牛比例，可以提高良種奶牛的繁殖效率，從而增加良種奶牛 數(shù)量，提高奶牛生產水平?？梢哉f，實現(xiàn)奶牛性別控制是奶牛養(yǎng)殖者多年的愿望。使奶牛多 生母犢，可快速增加良種奶牛數(shù)量的同時，也提高了牛群的質量，促進我國奶牛業(yè)向質量型 的方向發(fā)展。此外，我國目前90%左右的奶牛集中在農戶和集體養(yǎng)殖場飼養(yǎng)，通過奶牛性別 控制實現(xiàn)多生雌性牛犢，可明顯提高其經濟效益。
性別控制技術已有數(shù)千年的研究歷史，相繼誕生了許多方法，目前，常見的牛性別控制 方法有早期胚胎性別鑒定法和流式細胞儀X、 Y精子分離法兩種。
早期胚胎性別鑒定法是在胚胎移植時，對移植前胚胎進行性別鑒定，人為地選擇某一性 別的胚胎移植給受體，如經典的核型分析，現(xiàn)代的聚合酶鏈反應法(PCR)、 DNA探針法等， 但這些方法只能應用于胚胎移植，且移植胚胎成活率低，還會造成胚胎浪費，從成本角度考 慮，此法不適合規(guī)?；B(yǎng)殖。
流式細胞儀精子分離法是根據(jù)X、 Y精子在DNA含量上的差異來分離精子，這種性別 控制方法準確率較高，但存在分離速度慢、技術成本過高、有些分離步驟會對精子產生損害 等缺點，不適宜大規(guī)模推廣使用。
免疫法分離精子是根據(jù)在精子的整個進化過程中保留著H-Y抗原，并且，只有Y精子才 能表達H-Y抗原，因而，利用精子質膜上存在的H-Y抗原與H-Y特異性單克隆抗體結合， 通過免疫分離方法分離X精子和Y精子。
公開專利200610023640.X基于H-Y抗原分選奶牛X精子的免疫磁珠負篩選法，該專利 公開的免疫磁珠篩選奶牛X精子方法是利用基因重組方法表達蛋白，將融合蛋白免疫圈養(yǎng)雞， 獲得多克隆抗H-Y抗原的雞IgY抗體并用納米級磁珠標記。
本發(fā)明用奶牛精原細胞免疫篩選，制備出針對Y精子特異性強的配對單克隆抗體，采用 直接輸入法、免疫磁珠技術、離心法、免疫親和層析柱法將奶牛X、 Y精子分離，從而實現(xiàn)奶 牛性別控制。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供了針對奶牛Y精子特異性強、效價高的配 對單克隆抗體的制備方法，并通過免疫分離手段進行精子分離。
為解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的
針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用，采用奶牛精原細胞直接免疫
Balb/c小鼠誘導出抗體，通過配對篩選，獲得針對H—Y抗原的不同決定簇的效價高、特異 性強的配對單抗I、 II ，經檢測兩株抗體對X精子均無結合力，基于免疫學原理，抗體I、 抗體II分別與Y精子特異性結合后，形成抗原-抗體復合物，再采用一定免疫精子分離法將奶 牛X、 Y精子分離。
采用高劑量60ug/ml的睪丸組織勻漿免疫小鼠，獲得針對Y精子表面H-Y抗原不同決定 簇的兩種單克隆抗體I、 II。
免疫精子分離法可以是直接輸入法、免疫磁珠技術、離心法、免疫親和層析柱法。 直接輸入法是將抗體I、抗體II以一定比例混入奶牛鮮精中，輸精時直接將此混合精液 輸入母牛體內，由于Y精子與抗體形成抗體I-Y-抗體II復合物，Y精子活動受限，增加X精
子受孕幾率。
免疫磁珠技術是將抗體I 、抗體II分別與磁性粒子相連，形成免疫磁珠I 、免疫磁珠II ， 以l: 1比例加入奶牛鮮精中充分搖勻反應，磁珠標記的抗體I、抗體II可共同與H—Y抗原 連接，給予外加磁場，未被吸附的精子即為X精子，從而得以分離。
離心法是將抗體I、抗體II分別與磁性粒子相連，形成免疫磁珠I、免疫磁珠II，以l: 1比例在奶牛鮮精中充分搖勻反應，磁珠標記的抗體I、抗體II可共同與H—Y抗原連接，經 過離心，Y精子隨沉降物被固定，X精子存在上清液中，從而得以分離。
免疫親和層析柱法是將抗H-Y抗體I或抗體II與特殊分子混合制成固相吸附劑放置在層 析柱中，當奶牛新鮮精子通過層析柱時，與吸附劑具有親和力的Y精子就會被吸附而滯留在 層析柱中，與吸附劑無親和力的X精子由于不被吸附，直接流出，從而將奶牛X、 Y精子分 離。
由于采用上述技術方案，本發(fā)明提供的用奶牛精原細胞免疫篩選出配對的針對奶牛Y精 子特異性單克隆抗體可通過多種方式分離奶牛精子，具有高效、安全、成本低廉的優(yōu)點，適 合大規(guī)模用于奶牛雌性優(yōu)種繁育且具有較高經濟效益。具體實施例
通過以下具體實施方式
對本發(fā)明進一步說明。 實施例一
抗h—y抗原的配對單克隆抗體的制備
1) 采用高劑量60ug/ml的睪丸組織勻槳免疫小鼠，用SP20細胞融合建立瘤株進行篩選，取 瘤細胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水。
2) 提取小鼠腹水純化篩選，獲得能同時與H—Y抗原結合的兩種單克隆抗體I、 II。 實施例二
將過量的抗體I、抗體II混入奶牛鮮精中，輸精時直接將此混合精液輸入母牛體內，由 于Y精子與抗體形成抗體I-Y-抗體II復合物，Y精子活動受限，增加X精子受孕幾率。 實施例三
免疫磁珠技術是將抗體I 、抗體II分別與磁性粒子相連，形成免疫磁珠I 、免疫磁珠II，
以l: 1比例加入奶牛鮮精中充分搖勻反應，磁珠標記的抗體I、抗體II可共同與H—Y抗原
連接，給予外加磁場，未被吸附的精子即為x精子，從而得以分離。 實施例四
離心法是將抗體I、抗體II分別與磁性粒子相連，形成免疫磁珠I、免疫磁珠II，以l: 1比例在奶牛鮮精中充分搖勻反應，磁珠標記的抗體I、抗體II可共同與H—Y抗原連接，經 過離心，Y精子隨沉降物被固定，X精子存在上清液中，從而得以分離。 實施例五
免疫親和層析柱法是將抗h-y抗體i或抗體n與特殊分子混合制成固相吸附劑放置在層
析柱中，將奶牛新鮮精子通過層析柱，與吸附劑具有親和力的y精子就會被吸附而滯留在層 析柱中，與吸附劑無親和力的x精子由于不被吸附，直接流出，從而將奶牛x、 y精子分離。
權利要求
1.針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用，其特征在于是采用奶牛精原細胞直接免疫Balb/c小鼠誘導出抗體，通過配對篩選，獲得針對H-Y抗原的不同決定簇的效價高、特異性強的配對單抗I、II，經檢測兩株抗體對X精子均無結合力，基于免疫學原理，抗體I、抗體II分別與Y精子特異性結合后，形成抗原-抗體復合物，再采用一定免疫精子分離法將奶牛X、Y精子分離。
2. 根據(jù)權利要求1所述的針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用，其特征 在于采用高劑量60ug/ml的睪丸組織勻漿免疫小鼠，獲得針對Y精子表面H-Y抗原不同決 定簇的兩種單克隆抗體I、 II 。
3. 根據(jù)權利要求1所述的針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用，其特征 在于所述的免疫精子分離法可以是直接輸入法、免疫磁珠技術、離心法、免疫親和層析柱 法。
4. 根據(jù)權利要求1或3所述的針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用，其 特征在于直接輸入法是將抗體I 、抗體II以一定比例混入奶牛鮮精中，輸精時直接將此混 合精液輸入母牛體內，由于Y精子與抗體形成抗體I-Y-抗體II復合物，Y精子活動受限， 增加X精子受孕幾率。 .
5. 根據(jù)權利要求1或3所述的針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用，其 特征在于免疫磁珠技術是將抗體I 、抗體II分別與磁性粒子相連，形成免疫磁珠I 、免疫 磁珠II，以l: 1比例加入奶牛鮮精中充分搖勻反應，磁珠標記的抗體I、抗體II可共同 與H—Y抗原連接，給予外加磁場，未被吸附的精子即為X精子，從而得以分離。
6. 根據(jù)權利要求1或3所述的針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用，其 特征在于離心法是將抗體I 、抗體II分別與磁性粒子相連，形成免疫磁珠I 、免疫磁珠II ， 以1: 1比例在奶牛鮮精中充分搖勻反應，磁珠標記的抗體I 、抗體II可共同與H—Y抗原 連接，經過離心，Y精子隨沉降物被固定，X精子存在上清液中，從而得以分離。
7. 根據(jù)權利要求1或3所述的針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用，其 特征在于免疫親和層析柱法是將抗H-Y抗體I或抗體II與特殊分子混合制成固相吸附劑 放置在層析柱中，當奶牛新鮮精子通過層析柱時，與吸附劑具有親和力的Y精子就會被 吸附而滯留在層析柱中，與吸附劑無親和力的X精子由于不被吸附，直接流出，從而將 奶牛X、 Y精子分離。
全文摘要
針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體的制備及其應用，采用奶牛精原細胞直接免疫Balb/c小鼠，融合后建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射于小鼠腹腔使其產生腹水，提取小鼠腹水純化篩選，獲得針對奶牛Y精子特異的配對單克隆抗體，該配對單抗分別針對H-Y抗原的不同抗原決定簇。獲得的配對單抗效價高、特異性強，經檢測對X精子無結合力，基于免疫學原理，抗H-Y抗體可與Y精子特異性結合，形成抗原-抗體復合物，可直接再采用直接輸入法、免疫磁珠技術、離心法、免疫親和層析柱法將奶牛X、Y精子分離，從而實現(xiàn)奶牛性別控制。本發(fā)明具有高效、安全、成本低廉的優(yōu)點，適合大規(guī)模優(yōu)種雌性繁育且具有較高經濟效益。
文檔編號C07K16/18GK101591394SQ20081011336
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月29日 優(yōu)先權日2008年5月29日
發(fā)明者萬積成 申請人:萬積成