專利名稱：一種從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素的方法。
背景技術(shù)：
番茄紅素屬于一種開鏈?zhǔn)讲伙柡椭緹N，是一種非常重要的類胡蘿卜素。目前研究 發(fā)現(xiàn)番茄紅素主要有以下三個(gè)方面的醫(yī)藥價(jià)值1)具有抗氧化作用，可以減緩低密度 脂蛋白的氧化，從而防止動(dòng)脈硬化及冠心??；2)具有抗癌、防癌作用；對(duì)預(yù)防消化道 癌，宮頸癌，皮膚癌，乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，肺癌，卵巢癌有明顯效果3)增強(qiáng) 機(jī)體免疫功能和抗衰老的重要作用。另外，番茄紅素作為高價(jià)值的純天然色素，可以廣 泛應(yīng)用于食品著色、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)中。目前番茄紅素的價(jià)格昂貴，其國(guó)內(nèi)市場(chǎng)年 需求達(dá)20 30噸，但生產(chǎn)能力不足5噸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需要，因此具有 廣闊的市場(chǎng)潛力。
目前，雖然番茄紅素的化學(xué)合成技術(shù)已取得成功，但研究發(fā)現(xiàn)以煤焦油系為主要成 分的合成色素具有致癌性，因此天然色素的開發(fā)勢(shì)在必然。天然番茄紅素主要從番茄中 提取，生產(chǎn)工藝是首先將番茄壓榨、干燥，然后采用乙酸乙酯提取和蒸餾后獲得。此外， 國(guó)內(nèi)外學(xué)者在從番茄中提取番茄紅素的有機(jī)試劑種類方面進(jìn)行了比較深入的研究，在單 一有機(jī)溶劑提取番茄紅素方面發(fā)現(xiàn)石油醚、氯仿、四氫呋喃、二氯甲垸、乙酸乙酯、丙 酮和乙醇提取效果較好。在混合有機(jī)溶劑提取番茄紅素方面，發(fā)現(xiàn)正己垸一丙酮 一 乙醇、 石油醚一丙酮和正己垸一丙酮提取效率較高。
因?yàn)榉焉L(zhǎng)周期長(zhǎng)，受季節(jié)和環(huán)境影響較大，因此研究生長(zhǎng)速度快和番茄紅素含 量高的其它生物物種來取代番茄作為生產(chǎn)番茄紅素的生物資源已經(jīng)成為一個(gè)非常重要 的研究課題。我們研究發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌細(xì)胞中番茄紅素含量是番茄干渣中番茄紅素含量的
7倍。特別是在發(fā)酵培養(yǎng)超高細(xì)胞濃度光合細(xì)菌的技術(shù)已經(jīng)成熟，可以快速培養(yǎng)出大量
的光合細(xì)菌后，采用光合細(xì)菌作為一種生產(chǎn)番茄紅素的生物資源以替代番茄是完全可能 的。
因?yàn)槟軌虍a(chǎn)生番茄紅素不同生物類型的細(xì)胞大小和結(jié)構(gòu)存在差異，因此從中提取番3茄紅素的溶劑類型也應(yīng)該有所不同。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者在從番茄中提取番茄紅素的優(yōu)化控 制方法方面進(jìn)行了大量的研究，但在從光合細(xì)菌中如何高效提取出番茄紅素方面比較系 統(tǒng)的研究卻沒有文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素的方法，采用一種小分 子量的極性有機(jī)溶劑甲醇和一種非極性試劑正己垸進(jìn)行混合作為提取劑，可以高效地從 光合細(xì)菌細(xì)胞中提取出番茄紅素，為實(shí)現(xiàn)采用光合細(xì)菌生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定 重要基礎(chǔ)。
本發(fā)明的具體實(shí)施步驟是用50 500ml離心管離心收獲沉降于底部的光合細(xì)菌 細(xì)胞，倒凈上清液后分別加入5.0 50ml由甲醇和正己垸組成的體積比為1: 2 2: 1 的混合溶劑，在室溫下浸提0.5 1.0小時(shí)，然后采用離心機(jī)在8000 15000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn) 速下離心20 30分鐘，提取溶劑正己垸相中含有從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取出的番茄紅素。
菌種是購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的典型光合細(xì)菌菌種沼澤紅假單胞菌，經(jīng)過6 天的光照厭氧培養(yǎng)后，通過離心(10000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘)收獲菌細(xì)胞于50ml離心 管底部，倒去上清液后，將沉降于離心管底部的菌細(xì)胞用50 mmol磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)重新懸浮，再次離心倒去上清液，重復(fù)2次清洗菌細(xì)胞后，再次離心收獲菌細(xì)胞， 使保留在每個(gè)離心管底部的菌細(xì)胞干重為33 —37mg，得到培養(yǎng)好的光合細(xì)菌細(xì)胞。
提取甲醇和正己烷混合溶劑上清液直接在高壓液相色譜上測(cè)定番茄紅素濃度，得到 番茄紅素濃度在10.0mg/L以上，而用二氯甲垸作為提取試劑時(shí)，提取液中番茄紅素濃 度是3.1mg/L，無論是正己垸相中的番茄紅素濃度，還是提取番茄紅素總量都高于采用 二氯甲烷作為番茄紅素提取溶劑的水平。
本發(fā)明采用甲醇與正己垸混合溶劑從光合細(xì)菌中提取番茄紅素，具有如下特點(diǎn)
1、 番茄紅素的分子結(jié)構(gòu)既包括含有11個(gè)共軛雙鍵的非極性碳鏈，也包括了在2 個(gè)非共軛雙鍵，因此使番茄紅素可以溶解于非極性或極性有機(jī)溶劑。但總體上來說，番 茄紅素整個(gè)分子傾向于非極性結(jié)構(gòu)，因此導(dǎo)致在甲醇和正己烷作為互不相溶的混合提取 溶劑時(shí)，番茄紅素幾乎全部分配到正己垸相，而在甲醇相中幾乎檢測(cè)不到番茄紅素的存 在。
2、 在甲醇和正己烷作為混合溶劑從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素時(shí)，兩種互不相 溶的溶劑各自發(fā)揮不同的作用。甲醇分子量小，容易進(jìn)入菌體細(xì)胞，從而可以將菌細(xì)胞中的番茄紅素溶解并提取出來。但與甲醇相比，番茄紅素更容易溶解于正己垸中，使從 菌細(xì)胞提取出來的番茄紅素立即分配到甲醇與正己烷混合溶劑中的正己烷相中。因此甲 醇主要負(fù)責(zé)將菌細(xì)胞中的番茄紅素提取出來，而正己垸主要負(fù)責(zé)番茄紅素的溶解，保證 了甲醇與正己垸混合溶劑能夠從光合細(xì)菌細(xì)胞中高效提取出番茄紅素，在采用光合細(xì)菌 生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方面具有重要的價(jià)值。


圖1為本發(fā)明采用甲醇與正己烷混合溶劑從光合細(xì)菌中提取番茄紅素的效果。橫坐 標(biāo)為甲醇、正己垸、甲醇與正己垸按不同體積比例混合、單一試劑提取番茄紅素效果最
好的二氯甲垸，縱坐標(biāo)為溶劑中的番茄紅素濃度mg/L或溶劑中提取番茄紅素總量Mg。
具體實(shí)施例方式
1、 光合細(xì)菌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料本發(fā)明實(shí)驗(yàn)所用光合細(xì)菌是購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研 究所的典型光合細(xì)菌菌種沼澤紅假單胞菌，經(jīng)過6天的光照厭氧培養(yǎng)后，通過離心 (10000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘)收獲菌細(xì)胞于50ml離心管中，倒去上清液后，將沉降于離 心管底部的菌細(xì)胞用50 mmol磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)重新懸浮，再次離心倒去上 清液，重復(fù)2次清洗菌細(xì)胞后，再次離心收獲菌細(xì)胞，使保留在每個(gè)離心管底部的菌細(xì) 胞干重都為35 mg左右。
2、 從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素在離心管中分別加入5.0 ml由甲醇與正己
垸組成的混合溶劑，混合溶劑的體積比例分別為1: 2、 1: 1、 2: 1，在室溫下浸提0.5
小時(shí)后通過離心(10000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘)分別測(cè)定混合試劑上清液中甲醇與正己垸 中的番茄紅素，發(fā)現(xiàn)只在正己垸相中含有番茄紅素。
3、 提取劑中的番茄紅素測(cè)定實(shí)驗(yàn)前用正己烷配制番茄紅素濃度分別為10、 20、 30、 40和50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次在高壓液相色譜上進(jìn)行測(cè)定，得到番茄紅素峰高
(y)與番茄紅素濃度(x)的一元線性回歸方程(y:0.1859x誦0.0772， R2=0.9992)。 實(shí)驗(yàn)通過離心提取劑后取上清液，在HPLC上直接測(cè)定番茄紅素濃度。測(cè)定條件是 高效液相色譜儀(島津LC-10ATvp泵，SPD-M10Avp 二極管陣列檢測(cè)器)，Zorbax SB-C18 (4.6mmx25cm)分離柱，流動(dòng)相是乙腈-甲醇-氯仿(體積比45:45:10)，流速為 1毫升/分鐘，進(jìn)樣量20ijL，檢測(cè)波長(zhǎng)為473nm。
圖1所示，甲醇與正己垸按照體積比從1: 2到2: 1作為混合溶劑，同時(shí)采用文 獻(xiàn)報(bào)道的從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素效果最好的單一溶劑二氯甲烷進(jìn)行比較。由圖1可知，無論是正己烷相中的番茄紅素濃度，還是提取番茄紅素總量都明顯高于采用二 氯甲烷作為番茄紅素提取溶劑的水平，其中采用甲醇與正己烷按照體積比1: 1作為混
合溶劑提取率最高，與二氯甲垸比較提取率提高了62.8%。因此采用極性溶劑甲醇與
非極性溶劑正己烷按照體積比從1: 2到2: 1范圍混合作為提取溶劑，可以從光合細(xì) 菌細(xì)胞中高效提取出番茄紅素，為采用光合細(xì)菌生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了非常 重要的基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1、一種從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素的方法，其特征在于，用50～500ml離心管離心收獲培養(yǎng)好的光合細(xì)菌細(xì)胞，倒凈上清液后分別加入5.0～50ml由甲醇和正己烷組成的體積比為1∶2～2∶1的混合溶劑，在室溫下浸提0.5～1.0小時(shí)，然后采用離心機(jī)在8000～15000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心20～30分鐘，提取溶劑正己烷相中從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取出的番茄紅素量。
2、 如權(quán)利要求1所述的從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素的方法，其特征在于，所 述培養(yǎng)好的光合細(xì)菌細(xì)胞是將沼澤紅假單胞菌，經(jīng)過6天的光照厭氧培養(yǎng)后，通過10000 轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，收獲菌細(xì)胞于50 ml離心管中，倒去上清液后，將沉降于離心 管底部的菌細(xì)胞用50 mmol磷酸鹽緩沖溶液重新懸浮，保持pH 7.0，再次離心倒去上 清液，重復(fù)2次清洗菌細(xì)胞后，再次離心收獲菌細(xì)胞，使保留在每個(gè)離心管底部的菌細(xì) 胞干重都為33 — 37 mg。
全文摘要
一種從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，采取極性溶劑甲醇與非極性溶劑正己烷的混合溶劑從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取番茄紅素，具體實(shí)施步驟是用50～500ml離心管離心收獲培養(yǎng)好的光合細(xì)菌細(xì)胞，倒凈上清液后分別加入5.0～50ml由甲醇和正己烷組成的體積比為1∶2～2∶1的混合溶劑，在室溫下浸提0.5～1.0小時(shí)，然后采用離心機(jī)在8000～15000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心20～30分鐘，提取溶劑上清液正己烷相中從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取出的番茄紅素量。本發(fā)明采用一種小分子量的極性有機(jī)溶劑甲醇和一種非極性試劑正己烷進(jìn)行混合作為提取劑，可以高效地從光合細(xì)菌細(xì)胞中提取出番茄紅素，為實(shí)現(xiàn)采用光合細(xì)菌生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定重要基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07C7/10GK101314555SQ20081011566
公開日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2008年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者包有霞, 孫旭東, 許倩倩, 海 閆 申請(qǐng)人:北京科技大學(xué)