專利名稱：：蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、以及基因工程領(lǐng)域。特別是一種在蝶蛹金小蜂中表達(dá)的抗菌蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列。
背景技術(shù)：
：近年來，由于藥物的濫用，藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等問題日漸嚴(yán)重，現(xiàn)有的抗生素藥物正在失去原來的療效，從而引發(fā)了人們對(duì)食品安全的關(guān)注，越來越多的國家開始呼吁禁用抗生素，而抗菌肽(antibacterialp印tides)因其獨(dú)特的生物活性以及不同于傳統(tǒng)抗生素的特殊作用機(jī)理，已引起人們的極大的研究興趣，成為分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。各國的研究人員已經(jīng)從哺乳動(dòng)物及昆蟲、兩棲動(dòng)物等中發(fā)現(xiàn)了幾百種抗菌肽，其中有些已經(jīng)分離提取了出來，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、抗菌活性等作了許多的研究，發(fā)現(xiàn)其抗菌活性高效、廣譜，并且本身無毒、無害，對(duì)細(xì)菌、病毒、某些原蟲、真菌及腫瘤細(xì)胞等具有選擇性殺傷作用。自1980年瑞典斯德哥爾摩大學(xué)Boman研究小組，首次由大腸桿菌注射誘導(dǎo)處理的惜古比天蠶蛾滯育蛹血淋巴中提純得抗菌肽以來，國內(nèi)外許多學(xué)者就昆蟲源的抗菌蛋白/肽已做了大量的篩選、活性測(cè)定、基因克隆與表達(dá)等工作，且明確昆蟲抗菌蛋白/肽可分成天蠶素(cecropins)、防衛(wèi)素(defensins)、富含脯氨酸的抗菌肽(prolin-richantibacterialpeptides)和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-richantibacterialpeptides)(Brey&Hultmark,1998)。作為地球上種類最多的生物，昆蟲具有繁殖快、適應(yīng)性廣的特點(diǎn)；除海洋外，所有生態(tài)環(huán)境都有昆蟲的分布。自19世紀(jì)起，昆蟲就被作為免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的研究對(duì)象。尚存于地球上的昆蟲都是在劇烈的生存競(jìng)爭(zhēng)中取得勝利后才生存下來的，它們?cè)谶M(jìn)化的過程中增強(qiáng)了抵抗各種病原菌侵染的能力，這就為我們篩選具有抗菌作用的昆蟲抗菌蛋白/肽及其目的基因提供了豐富的基因資源庫。眾多研究人員從不同的昆蟲中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種抗菌蛋白，但尚未有任何文獻(xiàn)報(bào)道從蝶蛹金小蜂中分離得到的抗菌肽。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有抗菌性能的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序列，其所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3活性的多肽核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者該核苷酸序列能在40-55"C條件下與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。作為本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列的改進(jìn)該序列具有SEQIDNO:l中第767-871位的核苷酸序列。作為本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列的進(jìn)一步改進(jìn)該序列中包含8106個(gè)連續(xù)核苷酸。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3的改進(jìn)蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽為多肽、其保守性變異多肽、其活性片段或其活性衍生物。本發(fā)明所提供的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列，使其能夠應(yīng)用在蝶蛹金小蜂中表達(dá)的新的抗菌蛋白、編碼序列及其在開發(fā)成有應(yīng)用價(jià)值的食品添加劑和藥物并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和食品衛(wèi)生等多個(gè)領(lǐng)域。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明通過基于cDNA表達(dá)性文庫的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白/肽基因的構(gòu)建及高效克隆篩選方法，以蝶蛹金小蜂為實(shí)驗(yàn)材料，篩選其體內(nèi)表達(dá)的抗菌蛋白。該方法鑒于潛在抗菌蛋白/肽目的表達(dá)物能致死本身宿主菌的特點(diǎn)，將潛在抗菌蛋白/肽的蝶蛹金小蜂的基因的表達(dá)與表達(dá)物抗菌活性初步測(cè)定緊密相合，進(jìn)行篩選。當(dāng)篩選到表達(dá)物能使宿主菌死亡的克隆時(shí)，也就獲得了相應(yīng)的源于蝶蛹金小蜂的插入之文庫中的目的基因。具有抗菌作用基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入SOLR菌后，在誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-b-d-硫代半乳糖苷)的誘導(dǎo)下基因表達(dá)后產(chǎn)生抗菌的蛋白/肽，致使菌體的細(xì)胞膜收到破壞，從而允許染料分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，發(fā)生顯色反應(yīng)，即觀察發(fā)現(xiàn)藍(lán)色的克隆。所以，這些被染成藍(lán)色的克隆就是含有抗菌基因的克隆。將它們挑出后測(cè)序，就可得到相應(yīng)的基因序列及其編碼的相應(yīng)的抗菌蛋白。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55攝氏度條件下與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。較佳的，所述的序列編碼具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列。本發(fā)明分離出的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3包括具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO:2序列的多肽。本發(fā)明DNA分子包含所述的DNA分子中8-106個(gè)連續(xù)核苷酸。本發(fā)明DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核苷酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3(或多肽)編碼的核酸序列指編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO:1中第767-871位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO:1序列編碼框第767-871位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼的簡并性，所以與SEQIDNO:1中第767-871位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO:1所述的序列。還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQIDNO:1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。還包括能編碼具有天然的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3相同功能的蛋白的SEQIDNO:1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5'和域3'端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3或多肽指具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的SEQIDNO:2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3相同功能的、SEQIDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地以5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又別如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的活性片段和活性衍生物。在本發(fā)明中蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3保守性變異多肽指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>Thr(T)SerSerTrp(W)Tyr;PheTyrTyr(Y)Trp;Phe;Thr;SerPheVal(V)lie;Leu;Met;Phe;AlaLeu發(fā)明還包括蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3或多肽的類似物。這些類似物與天然抗菌多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可以通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L一氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y—氮基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3多肽時(shí)，可以將蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3表達(dá)載體。如本發(fā)明所用的"可操作地連于"指這樣一種情況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能夠翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞指得是大腸桿菌細(xì)胞。還可用Northern印跡法技術(shù)分析蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸編碼序列的8—106個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的核酸分子。本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中是否存在蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個(gè)核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸序列和氦基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3同源基因或同源蛋白。為了得到與蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3基因相關(guān)的蝶蛹金小蜂cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選蝶蛹金小蜂cDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用"P對(duì)蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自蝶蛹金小蜂的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另夕卜，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clonetech，Stratagene，PaloAlto......，這種篩選方法也可以識(shí)別與蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;Merrifield丄(1963)丄AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接產(chǎn)生全長的分子。利用本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或抗拮劑等。本發(fā)明在抗性試驗(yàn)中具有明顯的作用，對(duì)抑制細(xì)菌的生長有明顯效果。我國擁有眾多昆蟲種類，卻很少從其體內(nèi)發(fā)現(xiàn)新的抗菌蛋白，本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3正是具備抗菌作用的新的蛋白，因此，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序列，可按照以下方法獲得(1)蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3服基因的cDNA(互補(bǔ)脫氧核糖核酸)，表達(dá)性文庫的構(gòu)建自蝶蛹金小蜂分離總RNA，提取poly(A)+RNA,克隆構(gòu)建得蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3/肽基因的cDNA表達(dá)性文庫；(2)cDNA表達(dá)性文庫的篩選a、制備SOLR菌液；b、將原噬茵體文庫轉(zhuǎn)化入制備好的SOLR菌液中并測(cè)定效價(jià)；c、制備LB/Amp+濾膜平板；d、取已轉(zhuǎn)化的SOLR菌液鋪板，先在0.45毫米的瓊脂糖/氨芐青霉素微孔濾膜平板上涂板，37攝氏度倒置培養(yǎng)15小時(shí)左右至膜上有較小的菌落形成；再轉(zhuǎn)移至瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷培養(yǎng)基，37攝氏度倒置培養(yǎng)34小時(shí)，至菌落生長到正常大小(1毫米左右)，轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基，染色10分鐘左右；同時(shí)與未經(jīng)異丙基-b-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)的作對(duì)照；挑取藍(lán)色菌落，于100微升含20%甘油的瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，零下70攝氏度貯存，得蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3服基因。上述步驟(1)中總RNA自昆蟲的整體或特定器官分離得到，采用純化mRNA試劑盒獲得poly(A)+RNA，采用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA⑧合成試劑盒和ZAP-cDNA⑤GigapackIII克隆試劑盒(由美國clontech公司Takana代理處購得，無中文名稱)構(gòu)建得cDNA表達(dá)性文庫。上述步驟(2)的d中染色瓊脂培養(yǎng)基按XX百分比傲照如下百分比配制)苔酚藍(lán)0.0005%(0.005%)，溴酚藍(lán)0.0005%(0.005%)，瓊脂0.4%(稱取0.5g苔酚藍(lán)和0.5g溴酚藍(lán)，分別溶解于9.5克水中，從而分別配成5%的苔酚藍(lán)母液和溴酚藍(lán)母液。另稱取4克瓊脂溶于^IL水中，加熱使其徹底溶解；加入1毫升苔酚藍(lán)母液和1毫升溴酚藍(lán)母液，使得兩種染料的終濃度為0.005%,混勻后放置半小時(shí)使其冷卻凝固即可。)。SOLR菌液cDNA合成試劑盒中自帶該SOLR菌液。步驟(2)的原噬菌體文庫是步驟(1)中所構(gòu)建的cDNA表達(dá)性文庫?？砂凑障铝信浞脚渲骗傊?氨芐青霉素濾膜平板瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水1升。120攝氏度高溫高壓滅菌后冷卻至50攝氏度左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素(Amp)母液(自配)1毫升，搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的微孔濾膜(孔徑為0.45微米，購于河北省保定市萬科實(shí)驗(yàn)儀器貿(mào)易有限公司)，此即瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板。可按照下列配方配制瓊脂糖魔芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水1升。120攝氏度高溫高壓滅菌后冷卻至50攝氏度左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素(Amp)母液(自配)1毫升，0.5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)母液(自配)1毫升，搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后即瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷培養(yǎng)基。本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分別如下(1)序列特征(A)長度915bp(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述浙江大學(xué)蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼序列915DNA蝶蟲甬金小蜂(Pterama/uspwparum)GGGAACAAsAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCC6QGGGCTGCAGGAATTCGGCACGAGGCCGAACAATTGTATCCTCCGGTTGGCTCTCTTGTGT12〇GGATACTTATATATATATATATATACCGATCTCGATACCGGTCAAAGTTTTTTTTTTTGT180TTTCGTTTCGAACTTACTGTGACAAATTCCGTTGCTGAAAAAGAAGAAAAGAAGATACAT240CATGGCTCACGGAACAACCCTTGCGCTTGTAATTTGCGCTACTATCGCTTGCAGCTTCGC300CATAGAATTGCCCGACTTCATCCACGTCTGCAAGCGTAACGATCCTCAGATCGAGTCGTG360CATCAAAAAGAGTGTCGAAGATCTACGACCAAAACTGATGACAGGTGTCCCCGAATACAA420TATCCCATCGTTGGAACCACTTCTGTTGAAGGAACTGGTAGCAGCTGAAGGTGCCGGTGG480ACTCAAGATCACGGCCAAGGATGTCCATGCCTACGGTGCCAGTGACTTTGTTGTTCAGAA540GCTCAGAGTCGACGTTTCGCAGCTGCGTTTCGCCCTGGACATCCTCCTACCTCACCTGTA600CATCGAGGGTCAGTACGAGATCGATGGACGTGTCCTCCTGCTGCCAATCCGTGGTAACGG660CCCAATGACCGGTAACTTCACCGATGCGACTGGTTCGGTCAAGATCCAGGCAACTTTGTT720CAAGGATGACCAGGGCAACGATCACCTCAAGCTCAGCGAGTTCCGCATGCGTATTTCC778MetArg工leSerATCCGTAAAGGTTCTCTCAAATTGGACAACCTTTTCGGTGGTGACCCAACC829lieArgLysGlySerLeuLysLeuAspAsnLeuPheGlyGlyAspProThr51〇1520CTTGGGCAATGTTGTCAACAACGCCATCAACACCAACTTTGACGCTTTTATC881LeuGlyGinCysCcyGinGinArgHisGinHisGinLeuStop2530AAGGAACTTCAACCTCTTMCGAGAAGGCTTTGT91下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖l是本發(fā)明的基于cDNA(互補(bǔ)DNA)表達(dá)性文庫的昆蟲源抗菌蛋白/肽基因的高效克隆篩選技術(shù)方案示意圖；圖2為本發(fā)明的篩選時(shí)濾膜上的SOLR菌菌落圖；注在大量白色菌落中有形狀較小的藍(lán)色菌落，即是包含具潛在抗菌活性的目的基因；圖3為本發(fā)明的用紙片法測(cè)試合成的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3對(duì)SOLR菌的抑制效果圖；圖中"《)"代表0.1%乙酸，"2"代表1m摩爾樣品。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1:(參照?qǐng)D1:)1、蝶蛹金小蜂cDNA(互補(bǔ)DNA)表達(dá)性文庫的構(gòu)建蝶蛹金小蜂來源于浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所昆蟲生理生化實(shí)驗(yàn)室。a、自蝶蛹金小蜂的整體分離總RNA，以純化mRNA試劑盒獲得poly(A)+RNA，再采用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA⑧合成試劑盒和ZAP-cDNA⑧GigapacklII克隆試劑盒(由美國dontech公司Takana代理處購得，無中文名稱)構(gòu)建得cDNA(互補(bǔ)DNA)表達(dá)性文庫。b、根據(jù)，參照試劑盒操作說明進(jìn)行各步操作，即構(gòu)建得cDNA(互補(bǔ)DNA)表達(dá)性文庫。2、蝶蛹金小蜂cDNA(互補(bǔ)DNA)表達(dá)性文庫的篩選a、制備SOLR(大腸桿菌的一種，無中文名)菌液接菌環(huán)在酒精燈上灼燒至紅，冷卻后蘸取少量大腸桿菌SOLR甘油菌(菌液和甘油的混合物，甘油的體積比約為20%，有利于菌液在低溫下保存而不影響其正常活性)于含卡那霉素的瓊脂糖培養(yǎng)基上劃線，37攝氏度培養(yǎng)12小時(shí)。挑取單菌落于50毫升的瓊脂糖豐富培養(yǎng)基(LB營養(yǎng)瓊脂)中，37攝氏度，200轉(zhuǎn)/分(rpm)培養(yǎng)12小時(shí)左右。轉(zhuǎn)移至50毫升離心管中，1000轉(zhuǎn)/分，4攝氏度離心10分鐘。去上清液，再用10毫摩爾的硫酸鎂溶液懸浮沉淀，調(diào)解OD600值為1.0。b、制備瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板制備含100微克/毫升的氨芐青霉素的瓊脂糖平板若干。LB/A卿+濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水l升；均勻混合后，12(TC高溫高壓(0.4Mpa)滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素母液l毫升；搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的孔徑為0.45微米的微孔濾膜，即得LB/Amp+濾膜平板；即取已滅菌的濾膜(孔徑0.45pm)鋪于LB/Amp+平板上，注意膜與平板之間無氣泡。c、將原噬箇體文庫(即步驟1所構(gòu)建的cDNA表達(dá)性文庫)轉(zhuǎn)化入制備好的SOLR菌液中并測(cè)定效價(jià)將原噬菌體文庫加雙蒸水稀釋50倍，分別取稀釋過的菌液1微升于步驟(a)所得的200微升SOLR菌液中，37攝氏度溫育15分鐘，取100微升在瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板上涂板，用在酒精燈上灼燒并冷卻過的三角棒涂開，正面向上放置20分鐘后37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時(shí)。查看細(xì)菌生長情況，從而決定轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中原噬粒文庫的稀釋倍數(shù)，由于稀釋50倍及100倍后轉(zhuǎn)化效果不好，使得生長濃度較低(每塊培養(yǎng)基上應(yīng)該生長數(shù)千個(gè)克隆)從而不稀釋。取1OO微升的蝶蛹金小蜂噬粒(即我們自己構(gòu)建的蝶蛹金小蜂的cDNA表達(dá)性文庫)于2毫升步驟(a)所得的SOLR菌液中，37攝氏度溫育15分鐘，取100微升在瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板上涂板，用在酒精燈上灼燒并冷卻好的三角棒涂開，正面向上放置20分鐘后37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時(shí)，査看結(jié)合效果。將上步所得的蝶蛹金小蜂噬粒與SOLR的結(jié)合產(chǎn)物2毫升置于50毫升瓊脂糖豐富培養(yǎng)液(LB營養(yǎng)液)中，37攝氏度，200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4~5小時(shí)，至稠，再取100微升在瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板上涂板，37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時(shí)，測(cè)定效價(jià)。將上步所得的50毫升菌液按20%比例加入甘油，搖勻后分裝成1毫升/管，于零下70攝氏度貯存?zhèn)溆?。?00倍、1000倍和10000倍的比例稀釋上述菌液后，各取100微升在瓊脂糖/氨芐青霉素濾膜平板上涂板，正面向上放置20分鐘后37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時(shí)。觀察膜上菌落生長情況以找出最佳倍數(shù)。通過測(cè)定效價(jià)和最佳稀釋倍數(shù)。找出最佳反應(yīng)菌液體積，即100微升/板，培養(yǎng)后每塊LB濾膜平板上有幾千個(gè)菌落。d、鋪板、染色取零下70攝氏度C存的已轉(zhuǎn)化的SOLR菌液100微升在瓊脂糖/氨節(jié)青霉素濾膜平板上涂板，正面向上放置20分鐘后，于37攝氏度倒置培養(yǎng)15小時(shí)左右至膜上有較小(一般為0.10.5mm)的菌落形成。再轉(zhuǎn)移至瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷培養(yǎng)基(1^/八1^+/1丁0+培養(yǎng)基)，37攝氏度倒置培養(yǎng)3~4小時(shí)，至菌落生長到正常大小，轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基，染色10分鐘左右，參見圖2，仔細(xì)觀察后用滅菌牙簽挑取藍(lán)色菌落，于100微升含20%甘油的瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，并記錄挑取的菌落大小及染色深淺情況，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標(biāo)上相同的號(hào)碼，如PP1a，零下70攝氏度貯存。上述染色瓊脂培養(yǎng)基的制作方法如下稱取0.5g苔酚藍(lán)和0.5g溴酚藍(lán)，分別溶解于9.5克水中，從而分別配成5%的苔酚藍(lán)母液和溴酚藍(lán)母液；另稱取4克瓊脂溶于1L水中，加熱使其徹底溶解，再加入1毫升苔酚藍(lán)母液和1毫升溴酚藍(lán)母液，混勻后放置半小時(shí)使其冷卻凝固即可。即所得染色瓊脂培養(yǎng)基為苔酚藍(lán)0.0005%，溴酚藍(lán)0.0005%，瓊脂0.4%。上述LB/Amp7lPTG+培養(yǎng)基的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水l升；均勻混合后，12(TC高溫高壓滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素母液l毫升，0.5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷母液1亳升，搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后，即得18^1^+/116+培養(yǎng)基。e、涂板法驗(yàn)證取出上述d步驟保存的PP1a菌液樣品，置于冰上。吸取5微升涂于LB/Amp+ZIPTG—及LB/Amp+7IPTG+濾膜平板，正面向上放置10分鐘后37攝氏度倒置培養(yǎng)12小時(shí)。LB/Amp7lPTG—濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水l升；均勻混合后，12(TC高溫0.4Mpa滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素母液1毫升；搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的孔徑為0.45微米的微孔濾膜，即得LB/Amp7lPTG—濾膜平板。LB/Amp7lPTG+濾膜平板的制備方法如下按照下列配方配制LB培養(yǎng)基瓊脂20克、氯化鈉10克、蛋白胨10克、酵母提取物5克、蒸餾水l升；均勻混合后，12(TC高溫高壓滅菌后冷卻至5(TC左右，加入100毫克/毫升的氨芐青霉素母液1毫升，0.5摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷母液1毫升，搖勻后倒于培養(yǎng)皿中，等其冷卻凝固后在培養(yǎng)基表面放上高溫滅菌過的孔徑為0.45微米的微孔濾膜，即得LB/Amp7lPTG+濾膜平板。將膜取下置于染色瓊脂培養(yǎng)基上染色，比較膜上同一樣品菌落生長的大小、密度、著色度及在LB/Amp7lPTG+濾膜平板上的菌落是否呈現(xiàn)統(tǒng)一顏色的情況，將詳細(xì)情況進(jìn)行記錄。將新挑出的菌落(PP化)保存于100微升含20。/。甘油的瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標(biāo)上與原樣品相同的號(hào)碼，如PP1b，b表示是涂板法驗(yàn)證后重新挑取的菌液樣品，零下70攝氏度貯存。根據(jù)染色的不同情況，作出不同的處理:①如果兩張膜上的菌落均不被染成藍(lán)色，則說明此樣品不含殺菌作用的基因，可丟棄該樣品。②如果菌落在LB/Amp7lPTG+濾膜上被部分染成藍(lán)色，而在LB/Amp7lPTG—不染色，說明挑取的樣品具有殺菌作用的基因，但此樣品混合了其他不含殺菌作用基因的克隆，則挑取LB/Amp7lPTG+濾膜上被染成藍(lán)色的單菌落于100微升含20Q/。甘油的瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標(biāo)上與原樣品相同的號(hào)碼，如PP化，b表示是劃線法驗(yàn)證后重新挑取的菌液樣品，零下70攝氏度貯存。③如果菌落在LB/Arap7lPTG+濾膜上被全部染成藍(lán)色，而在1^^1^+/0^&上不染色，說明挑取的樣品具有殺菌作用的基因，且此樣品只含有該種克隆，則挑取在LB/Amp7lPTG—上的無色單菌落于含20。/。甘油的100微升瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液中，渦旋振蕩混勻后分成兩管，在兩管上標(biāo)上與原樣品相同的號(hào)碼，如PP2b，零下70攝氏度貯存。④如果菌落在LB/Amp7lPTG+濾膜上被部分染成藍(lán)色，而在LB/A卿7lPTG—膜上也有部分被染成藍(lán)色，說明挑取的樣品含有殺菌作用的基因，且該基因在沒有異丙基-b-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)的情況下也能表達(dá)從而產(chǎn)生殺菌效果；但此樣品混合了其他不含殺菌作用基因的克隆，處理方法同②。如果菌落在13^11^+/1丁0+及LB/AmpVlPTG—兩張濾膜上全部被染成藍(lán)色，說明挑取的樣品含有殺菌作用的基因，且該基因在沒有異丙基-b-d-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)的情況下也能表達(dá)從而產(chǎn)生殺菌效果，且此樣品只含有該種克隆，因此只需保存原先保存的樣品，不用再挑取新的菌落。對(duì)于還沒有純化的樣品如情況②和④還需進(jìn)行再次涂板，直至在LB/Amp+7IPTG+濾膜平板上呈現(xiàn)統(tǒng)一的藍(lán)色為止。藍(lán)色是因?yàn)樵摼渲欣ハx源基因表達(dá)的蛋白/肽能使SOLR菌死亡，死亡的細(xì)胞被苔酚蘭染色成藍(lán)色，否則為白色。3、抗菌活性的初步驗(yàn)證液體抑菌實(shí)驗(yàn)a、取保存的菌液樣品(經(jīng)上述步驟⑤驗(yàn)證后保存的菌液)涂于1^/八11^+/1丁0-及LB/Amp+7IPTG+濾膜平板，培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)至染色瓊脂培養(yǎng)基染色，如果LB/AmpVlPTG+板上的克隆全部染色，則挑取LB/AmpVlPTG-板上白克隆510個(gè)；如果LB/Amp+ZIPTG+板上的克隆不是全部染色的話，說明菌樣在保存后經(jīng)過多次操作，可能已經(jīng)不純，則挑取LB/AmpVlPTG+板上的染色克隆510個(gè)。b、將挑取的克隆接入5豪升LB/Amp+培養(yǎng)液，37°C、200rpm震蕩培養(yǎng)10h左右，使細(xì)菌的OD600達(dá)到1.0左右。c、取上述菌液(SPOD60()達(dá)到1.0左右的菌液)30iJl于3ml瓊脂糖/氨芐青霉素培養(yǎng)液(氨芐青霉素新鮮加入)中，(每個(gè)樣品接4管，2管LB/AmpVlPTG+，2管LB/Amp+ZIPTG—)。分別培養(yǎng)2，3，4小時(shí)后測(cè)OD600(經(jīng)常觀察，當(dāng)瓊脂糖/氨芐青霉素的菌液的OD600值大致在0.5左右時(shí)測(cè)其值)。通過觀察發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷的菌液與瓊脂糖/氨芐青霉素的菌液相比較為澄清，或者有沉淀出現(xiàn)，而瓊脂糖/氨芐青霉素的菌液則呈現(xiàn)出絮狀的菌絲；通過分光光度計(jì)的測(cè)定，瓊脂糖/氨芐青霉素/異丙基-b-d-硫代半乳糖苷的菌液的OD600值明顯小于瓊脂糖/氨芐青霉素的菌液，說明在異丙基-b-d-硫代半乳糖苷的誘導(dǎo)下抗菌肽基因表達(dá)，從而對(duì)細(xì)菌生長產(chǎn)生抑制作用。4、測(cè)序篩選所得并經(jīng)過驗(yàn)證的含抗菌蛋白/肽的質(zhì)粒的菌液樣品送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序；詳細(xì)序列見SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。本發(fā)明新的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3全長cDNA的長度為915bp，其中開放閱讀框位于767-871位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的氨基酸序列，共34個(gè)氨基酸殘基，分子量3747.30kD，P値9.29。將蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用Genebank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST沐AMP數(shù)據(jù)庫(http:〃aps.unmc.edu/AP/main.php;http:〃reseach.izr.astar.edu.sg/Templar/DB/ANTIMIC)進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)相似物和同源物的檢索。通過序列比對(duì)判斷所篩選的基因是新基因，與目前已發(fā)現(xiàn)的各類抗菌蛋白/多肽在基因和蛋白水品上沒有明顯的同源性。5、蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3的人工合成(由上海波泰生物科技有限公司完成)a、試齊U芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸為美國SIAM公司產(chǎn)品；PyBOP、Wang樹脂為美國SIAM公司產(chǎn)品；六氫吡啶、二甲基吡啶為Merck公司產(chǎn)品；二甲基甲酰胺(DMF)為日本進(jìn)口(使用前先經(jīng)茚三酮浸泡和3A分子篩脫水，并測(cè)定無游離氨基)；二氯甲烷(DCM)為中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品(使用前用無水碳酸鉀浸泡處理)；三氟乙酸(TFA)為GEELBELGIUM公司產(chǎn)品；甲醇為上海振興化工一廠產(chǎn)品；HPLC甲醇為Merck公司產(chǎn)品；四氫呋喃為上海化學(xué)試劑站中心化工廠產(chǎn)品。b、儀器431A型多肽合成儀為Appliedbiosystems產(chǎn)品,高效液相色譜為安捷倫1100色譜儀；冷凍干燥機(jī)(FREEZEDRYER18)為LABC0NC0產(chǎn)品；質(zhì)譜儀為FinniganLCQ。c、方法合成序列RISIRKGSLKLDNLFGGDPTLGQCCQQRHQHQL肽鏈的合成肽鏈的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc的脫帽用30。/o六氫吡啶的DMF溶液。肽鏈從樹脂上的切落用切肽試劑(三氟乙酸/結(jié)晶苯酚/7jC/乙二硫醇/甲乙硫醚/=81.5/5/5/5/2.5/1)。稱取100mgFmoc-lie-wangresin,依次按各種Fmoc-氨基酸每步接肽反應(yīng)加入PyBOP--------Mwt:520.30----------------1123.9[mg/coupling]HOBt+H20—Mwt:153.10----------------4320[micro-L/coupling]NMM----------109.95[mL/mol]-------------3240[micro-L/coupling脫帽反應(yīng)加入六氫吡P定-----------30%------------------------9000x2[micro-L/coupling]洗滌時(shí)用DMF----------------------------------------------9000x5[micro-L/coupling]接肽在431A自動(dòng)合成儀上進(jìn)行，接完的樹脂全部轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，加入事先配好并預(yù)冷的切肽試劑5ml。25。C下攪拌反應(yīng)2小時(shí)。過濾，收集濾液。樹脂用少量三氟乙酸洗3次。將洗滌液與濾液合并，濃縮后冷卻，然后加入10ml冷乙醚使多肽沉淀。離心收集，真空干燥。得粗品約60mg。純化先用分析柱確定目標(biāo)肽方法是使用C18反相柱子，條件為A相為95。/o的水(甲醇配比)，B相為95。/。的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1y。的TFA，常規(guī)條件從A相到B相為20分鐘梯度。檢測(cè)波長:220納米，流速1毫升/分鐘，先用A溶液平衡柱子，上樣后，從A到B溶液梯度洗脫20分鐘，收集目標(biāo)肽，然后做質(zhì)譜鑒定。制備(使用儀器Waters600E)使用C化反相制備柱子，條件為A相為95。/。的水(甲醇配比)，B相為95。/。的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1Q/。的TFA，常規(guī)條件從A相到B相為30分鐘梯度。檢測(cè)波長:220納米，流速10毫升/分鐘，先用A溶液平衡柱子，上樣后，從A到B溶液梯度洗脫30分鐘，收集目標(biāo)肽洗脫液，凍干。6、合成肽抗菌活性的測(cè)定a、制備合成肽溶液將30mg合成肽溶解于140ul0.1X的乙酸溶液中配成100mM的母液，分裝成10管存于一2crc備用。b、制備試驗(yàn)菌液為了排除抑菌作用由AMP引起的可能性，應(yīng)使用帶質(zhì)粒的SOLR菌；將菌液培養(yǎng)到OD值為0.5左右時(shí)放置于4"C保存。c、制備濾紙片取新華1號(hào)定性濾紙，用打孔機(jī)打成6mm的小紙片，滅菌烘干備用。d、按照瓊脂1%w/v、蛋白胨1。/。w/v、酵母提取物0.5。/。w/v、氯化鈉0.05%w/v配置瓊脂糖培養(yǎng)基，將pH調(diào)至7.0后滅菌，倒板等其冷卻后，取用LB液體培養(yǎng)基稀釋100倍的上述試驗(yàn)菌液200微升均勻涂板，等菌液吸收10分鐘后將三層濾紙片放置于培養(yǎng)基上。放三層紙片可以增大加樣量。然后將合成肽溶液5微升加在濾紙片上，用卡那霉素做陽性對(duì)照，正面向上吸收完全后倒置培養(yǎng)過夜。觀察抑菌圈(參見圖3)，測(cè)其大小。觀察抑菌圈實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)濾紙周圍沒有細(xì)菌生長，因此呈現(xiàn)出明亮的抑菌圈。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表SEQIDNO:1ggg33C3333sgctggsgctccsccgcggtggcggccgctctsgnsctsgtggstccccc60gggctgc3gg3sttcggcscgsggccgsacasttgtstcctccggttggctctcttgtgt120ggstactteitataLtststataitatsccgstctcgstaccggtcassgtttttttttttgt180tttcgtttcg33cttsctgtgscai35ittccgttgctgaei33a1ga3g3333gssgstscst240catggctcacggaacaacccttgcgcttgtaatttgcgctactatcgcttgcagcttcgc300cstsgasttgcccgscttcstccscgtctgc33gcgt33cgatcctcsgstcgsgtcgtg360catcaaaaagagtgtcgaagatctacgaccaaaactgatgacaggtgtccccgaatacaa420tstcccatcgttgg33cc3cttctgttgsagg33ctggt3gcsgctgssggtgccggtgg480actcaagatcacggccaaggatgtccatgcctacggtgccagtgactttgttgttcagas540gctcsgsgtcgscgtttcgc3gctgcgtttcgccctggscaitcctcctscctcscctgta600catcgagggtcagtacgagatcgatggacgtgtcctcctgctgccastccgtggtsacgg660cccaatgaccggtaacttcaccgatgcgactggttcggtcaagatccaggcaactttgtt720caaggatgaccagggcaacgatcacctcaagctcagcgagttccgcatgcgtatttccat780ccgtaaaggttctctcaaattggacaaccttttcggtggtgscccaacccttgggcaatg840ttgtcai3C3￡icgcc3tc33csccssctttgscgcttttstc33gg33cttcsscctctts900tcgag33ggctttgt915SEQIDNO:2MetArglieSerlieArgLysGlySerLeuLysLeuAspAsnLeuPheGlyGlyAspPjroThrLeuGlyGinCysCcyGinGinArgHis202530GinHisGin!Leu權(quán)利要求1、一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序列，其特征在于所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQIDNO1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列，其特征在于該序列具有SEQIDNO:l中第767-871位的核苷酸序列。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列，其特征在于該序列中包含8106個(gè)連續(xù)核苷酸。4、一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3，其特征在于具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3，其特征在于所述蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽為多肽、其保守性變異多肽、其活性片段或其活性衍生物。全文摘要本發(fā)明公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序列，所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQIDNO1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者該核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQIDNO1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明還同時(shí)公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp-AP3，其具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3具有抗菌性能。文檔編號(hào)C07K14/435GK101328481SQ20081012014公開日2008年12月24日申請(qǐng)日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日發(fā)明者葉恭銀,慎小晶,成雄鷹,萃胡申請(qǐng)人:浙江大學(xué)