專利名稱：：病原微生物dna的提取方法病原微生物DNA的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種病原微生物DNA的提取方法，屬微生物化學中分離DNA的
技術(shù)領(lǐng)域：

背景技術(shù)：
分子生物學技術(shù)的廣泛應用有力促進了微生物快速診斷技術(shù)的發(fā)展，改變了傳統(tǒng)病原微生物鑒定需經(jīng)過分離培養(yǎng)、生化反應與血清疑集等一系列操作復雜耗時長久的實驗，傳統(tǒng)方法已遠遠不能適應突發(fā)公共衛(wèi)生事件應急處理要求。在病原微生物各種快速鑒定技術(shù)中，實時熒光PCR技術(shù)是目前國際上公認的最靈敏、特異、重復性最好的核酸定性、定量檢測方法，已廣泛應用于突發(fā)公共衛(wèi)生應急處理中病原微生物的檢測。但現(xiàn)有的實時熒光PCR模板制備即病原微生物DNA提取方法所需時間都在30分鐘以上，其中目前最先進的柱式核酸提取法用于細菌與病毒DNA提取需10個步驟共計40~60分鐘時間；經(jīng)典的煮沸裂解法用于細菌DNA^是取需菌液濃縮、裂解與分離3個步驟，需30~35分鐘，用于病毒DNA提取可省去濃縮，需20~25分鐘。所以如何」提高病原微生物DNA提取速度是當前急需解決的技術(shù)問題。
發(fā)明內(nèi)容針對上述不足，本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出一種新的快速的病原微生物DNA的提取方法。本發(fā)明提供的病原微生物DNA的提取方法，用于細菌DNA提取時，先取樣品懸浮液上清lml放入1.5ml的微量離心管中在15000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心lmin,然后倒去上清后加入5(M提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中7K浴2min,再在15000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心lmin，最后移取上清即為病原孩￡生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9%的NaCl、重量體積百分比為0.01%的SDS、體積百分比為0.1%的P-巰基乙醇、其余為水構(gòu)成。SDS為十二烷基硫酸鈉的縮寫。本發(fā)明提供的病原微生物DNA的提取方法，用于病毒DNA提取時，先取樣品懸浮液上清5(W放入1.5ml的微量離心管中，然后加入5(Vl提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中水浴2min,再在15000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心lmin,最后移取上清即為病原微生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9°/。的NaCl、重量體積百分比為0.01%的SDS、體積百分比為0.1%的|3-巰基乙醇、其余為水構(gòu)成。以上方法中提取細菌DNA或病毒DNA的第一步的不同是因為對于細菌來說，離心可以使它們濃縮，而對于病毒來講，離心方法尚不能使它們濃縮，所以在提取病毒DNA時不用濃縮一步而直接采用樣品上清進行提取。本發(fā)明提供的病原微生物DNA的提取方法，用于細菌DNA提取需45分鐘，用于病毒DNA提取需3~4分鐘。使提取時間從現(xiàn)有技術(shù)需要30分鐘以上縮短至5分鐘以內(nèi)。與實時熒光PCR技術(shù)配合可在15~30分鐘內(nèi)完成病原菌的診斷檢測。經(jīng)實際試用，本發(fā)明方法的效果不低于現(xiàn)有技術(shù)的煮沸裂解法、柱式核酸提取試劑盒的效果，并略勝于某些品牌的柱式核酸提取試劑盒的效果，而且操作十分簡便、成本低廉。本發(fā)明提供的病原微生物DNA的提取方法，使實時熒光PCR的檢測速度有了質(zhì)的飛越，對今后食物中毒、傳染病爆發(fā)等突發(fā)公共衛(wèi)生事件的病原菌快速診斷具有重要的應用價值，為正確制訂突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處置方案、及時采取針對性控制措施、臨床病人搶救治療及預后評估提供科學依據(jù)。具體實施方式以糞便為樣品的實時熒光PCR模板制作，即糞侵_樣品病原微生物DNA的提取過程是1、取糞便懸浮液上清lml放入1.5ml的微量離心管中，在離心機中以15000r/min的轉(zhuǎn)速離心lmin;2、倒去上清加入50jnl以9gNaCl、0.1gSDS、lmlP畫巰基乙醇配制成1000ml水溶液為提取劑混勻，置沸水中進行水浴2min;3、在離心才幾中以15000r/min的轉(zhuǎn)速離心lmin，移取上清即為該糞4更樣品中病原孩i:生物的DNA溶液。以上共用時不足5min。以本發(fā)明方法提取的病原微生物DNA與其他方法提取的病原微生物DNA經(jīng)實時熒光PCR后用結(jié)果比較其效果，比較時按上例重復三次獲得三管DNA溶液一、比較用病原微生物進行病原微生物DNA的提取以金黃色葡萄球菌(ATCC26112)、副溶血弧菌(ATCC17802)、腸出血型大腸埃希菌(0157:H7)(DEL933)、乙型肝炎病毒(HBV)與白斑綜合癥病毒(WSSV)為樣品，提取過程按本發(fā)明方法進行。每個樣品重復三次各得三管DNA溶液。二、用比較方法對同一樣品進行病原孩i生物DNA的提取柱式核酸提取試劑盒分別采用QIAGEN公司生產(chǎn)的MiniKit(批號74104)、日本Takara公司生產(chǎn)的DV801A、DV818并按試劑盒說明書對上述樣品進行操作。每個樣品重復三次各得三管DNA溶液。煮沸裂解法提取劑選用上海之江生物科技有限公司產(chǎn)品并按其說明書對上述樣品進行操作。每個樣品重復三次各得三管DNA溶液。三、DNA實時熒光PCR法測定吸每管DNA溶液2nl進行實時熒光PCR,取實時熒光PCR的ct值(每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定閥值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))作為提取效果的評價指標。DNA實時熒光PCR基礎試劑盒為日本Takara公司生產(chǎn)DRR039s、特異性引物與Taqman探針由大連寶生物工程有限公司制作，LightCycler實時熒光PCR儀購自瑞士羅氏公司。實時熒光PCR反應條件:按試劑盒DRR039s說明書要求進行95。C預變性10s，然后95。C5s,60°C20s擴增40個循環(huán)，共計25分鐘。四、三種方法的提取效果比較1、對用QIAGEN柱式核酸提取試劑盒法、煮沸裂解法與本發(fā)明方法提取的白斑綜合癥病毒的DNA提耳又液和副溶血弧菌的DNA提取液進行實時熒光PCR,取ct值作比較參數(shù)，結(jié)果顯示三種方法對同一種病原菌的擴增曲線形態(tài)、靈敏度與重復性均高度一致，詳見表l、表2。表l:白斑綜合癥病毒(拷貝數(shù)5x107/ml)的三種方法提取效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2:副溶血弧菌(菌落數(shù)5xl03/ml)的三種方法提取效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>2、對用本發(fā)明方法與用TaKaRa柱式核酸提取試劑盒提取的白斑綜合癥病毒的DNA提取液與0157:H7的DNA提取液進行實時熒光PCR,結(jié)果顯示前法略優(yōu)于后法，詳見表3、表4。表3:白斑綜合癥病毒(拷貝數(shù)5x107/ml)的兩種方法提取效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表4:0157:H7(菌落數(shù)5x107/ml)的兩種方法提取效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>3、對用本發(fā)明方法與煮沸裂解法提取的金黃色葡萄球菌的DNA提取液、0157:H7的DNA提取液以及HBV的DNA提耳又液進行實時熒光PCR,經(jīng)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示兩種方法的擴增曲線形態(tài)一致，說明本發(fā)明方法對不同結(jié)構(gòu)的病原微生物DNA的提取效果與經(jīng)典的煮;弗裂解法具有相同效果。詳見表5、表6、表7。表5:金黃色葡萄球菌(菌落數(shù)5x108/ml)的兩種方法提取效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表6:0157:H7(菌落數(shù)5xl07/ml)的兩種方法提取效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種病原微生物DNA的提取方法，其特征是用于細菌DNA提取時，先取樣品懸浮液上清1ml放入1.5ml的微量離心管中在15000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心1min，然后倒去上清后加入50μl提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中水浴2min，再在15000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心1min，最后移取上清即為病原微生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9％的NaCl、重量體積百分比為0.01％的SDS、體積百分比為0.1％的β-巰基乙醇、其余為水構(gòu)成。2、一種病原微生物DNA的提取方法，其特征是用于病毒DNA提取時，先取樣品懸浮液上清50nl放入1.5ml的微量離心管中，然后加入5(Vl提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中水浴2min,再在15000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心lmin，最后移取上清即為病原微生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9%的NaCl、重量體積百分比為0.01%的SDS、體積百分比為0.1%的P-巰基乙醇、其余為水構(gòu)成。全文摘要本發(fā)明提供的病原微生物DNA的提取方法，先取樣品濃縮液加入50μl提取劑混勻，再將微量離心管置沸水中水浴2min，再在15000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心1min，最后移取上清即為病原微生物DNA溶液；所說提取劑由重量體積百分比為0.9％的NaCl、重量體積百分比為0.01％的SDS、體積百分比為0.1％的β-巰基乙醇、其余為水構(gòu)成。本發(fā)明提供的病原微生物DNA的提取方法，提取DNA時間僅需3～5分鐘。使提取時間從現(xiàn)有技術(shù)需要30分鐘以上縮短至5分鐘以內(nèi)。經(jīng)實際試用，本發(fā)明方法的效果不低于現(xiàn)有技術(shù)且略有勝出，而且操作十分簡便、成本低廉。文檔編號C07H21/04GK101402663SQ20081012131公開日2009年4月8日申請日期2008年10月6日優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日發(fā)明者王建躍,王忠發(fā),薛超波申請人:舟山市疾病預防控制中心