專利名稱：一種β-內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種3 -內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
6-氨基青霉烷酸，英文名6-aminopenicillanic acid (6陽APA)， CAS號 551-16-6，分子式為C8H12N203S。 P-內(nèi)酰胺類抗生素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有P-內(nèi) 酰胺環(huán)的一類抗生素，主要包括青霉素類和頭孢菌素類，其作用特點是能夠抑 制細(xì)菌黏肽轉(zhuǎn)肽酶的活性，從而阻止細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，呈現(xiàn)殺菌活性。在畜類 動物飼養(yǎng)中，3-內(nèi)酰胺類抗生素廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動物尿道、 胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等原因， 均可造成它在畜產(chǎn)品中的殘留，給人類健康帶來嚴(yán)重危害，如產(chǎn)生過敏反應(yīng)、 破壞胃腸道菌群平衡和增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性導(dǎo)致免疫力下降及給動物源性食品生產(chǎn) 加工帶來不可估計的損失。其中青霉素類抗生素由于具有抗菌譜廣等優(yōu)點被廣 泛用于人畜疾病的防治。尤其該類抗生素在乳制品中的殘留引起了國內(nèi)外的高 度重視。青霉素類抗生素種類繁多，現(xiàn)有的微生物檢測法和儀器檢測法很難實 現(xiàn)對所有青霉素類抗生素進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，有必要研究快速、便攜的免 疫檢測技術(shù)——膠體金免疫技術(shù)。這就需要合成能產(chǎn)生簇特異性抗體的免疫原。 目前為止，國內(nèi)尚沒有針對青霉素類抗生素的膠體金免疫檢測方法的報道，為 了彌補(bǔ)這一空白，設(shè)計合成了以青霉素類抗生素的中間體6-氨基青霉烷酸為半 抗原的用于青霉素類抗生素檢測的完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種P -內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法。所制 備的產(chǎn)品用于青霉素類抗生素的免疫分析方法研究，為今后人們的研究提供了 必需的人工抗原。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種e-內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法，以6-
氨基青霉烷酸6-APA為半抗原，用N-(m-馬來酰亞胺基苯甲酰氧基)琥珀酰亞胺 MBS法將其與載體蛋白牛血清蛋白BSA偶聯(lián)，合成青霉素類抗生素中間體6-氨基青霉烷酸人工抗原6-APA-BSA，用凝膠電泳法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。 其反應(yīng)方程式為青霉素類通用人工抗原
工藝步驟為
(1) 6-氨基青霉垸酸的?；?br> 取70iimo1 6-APA溶于3mL PBS(0.05 mol/L， pH7.0)，加入到含有70pmo1 MBS (22mg)、 2mL四氫呋喃的25mL燒杯中?；旌弦涸?7。C下反應(yīng)3小時， 冷凍干燥，得到白色固體，用乙醚和二氯甲垸(2:1)洗滌五次，洗去未反應(yīng)的 MBS。
MBS的監(jiān)領(lǐng)^硅膠薄層板的制作，稱取硅膠12g，溶解在40mL 0.5°/。質(zhì)量 濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩珊隣睿暡ㄕ袷巐分鐘， 均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105'C的烘箱中活化lh， 最后放入干燥箱中備用。
薄層層析法檢測硅膠薄板下端lcm處作一水平線，吸取反應(yīng)液lpL點于 線上，點樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為乙醚:二氯甲垸體積比 為2:1，展開至薄板3/4處，取板，吹干溶劑。將薄板置于紫外分析儀中，在254nm 波長觀察，在Rf為0.95處觀察不到顯色點作為洗滌終點。
(2) 牛血清蛋白的巰基化
稱2-亞氨基硫烷13.6mg溶于lmL的0.05mol/L PBS (pH8.0,含有0.01 mol/L EDTA)中，加入到5mL含有67mg牛血清蛋白的0.05mol/L的PBS (pH8.0， 含有0.01mol/LEDTA)溶液中，在室溫下反應(yīng)1小時。
(3) 6-氨基青霉垸酸與牛血清蛋白的偶聯(lián)
制備A液巰基化的蛋白質(zhì)溶液用0.2 mol/LNaH2P04調(diào)pH至7.2，低溫保存。 制備B液酰化后6-氨基青霉垸酸溶于2mL的0.05mol/L PBS (pH7.2)中，低溫保存。
A液加入到B液中室溫反應(yīng)2小時，即得人工抗原混合液。
透析袋前處理取15cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min， 保存在4"C去離子水中備用。
將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的PBS溶液透析3天。 最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到通用人工抗原6-APA-BSA。 (4) 6-氨基青霉垸酸通用人工抗原的鑒定人工抗原采用凝膠電泳法鑒定 其偶聯(lián)結(jié)果，利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算其偶聯(lián)比。
偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方 法，雖然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量 (或相對含量)的原理建立起來的。凝膠電泳法是依據(jù)合成的人工抗原的分子 量比載體蛋白的增加來確定偶聯(lián)比的。
偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200嗎'mr1 的牛血清蛋白溶液1.5ml，加入5ml考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30。C水浴溫 熱5分鐘，每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制牛血清蛋白濃度與 吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的 吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本實驗計算得抗原溶液的 蛋白濃度為5.5438mg.mr1。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明成功合成了6-APA的人工抗原，合成步驟簡潔， 有效，可完全用于免疫分析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以 滿足國內(nèi)對其研究的需要。


圖l低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Mark、牛血清蛋白BSA及其偶聯(lián)物的電泳圖。 A:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Mark, B: BSA， C:巰基化的BSA， D、 E人工抗原。
圖2電泳標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(lgMW-Rf圖)。
具體實施例方式
實施例1 (1) 6-氨基青霉垸酸的?；?br> 取70umol6-APA溶于3mlPBS(0.05mol/L,pH7.0)，加入到含有70umolMBS (22mg)、 2ml四氫呋喃的25ml燒杯中。混合液在37。C下反應(yīng)三小時，冷凍干 燥，得到白色固體，用乙醚和二氯甲烷(2: 1)洗滌五次，洗去未反應(yīng)的MBS。
MBS的監(jiān)測硅膠薄層板的制作，稱取硅膠12g，溶解在40ml0.5。/。質(zhì)量濃 度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩珊隣睿暡ㄕ袷?分鐘， 均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105。C的烘箱中活化lh， 最后放入干燥箱中備用。薄層層析法檢測硅膠薄板下端lcm處作一水平線，吸取反應(yīng)液lul點于
線上，點樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為乙醚二氯甲烷，體 積比為2: 1，展開至薄板3/4處，取板，吹干溶劑。將薄板置于紫外分析儀中，
在254nm波長觀察，在Rf為0.95處觀察不到顯色點作為洗滌終點。
(2) 牛血清蛋白的巰基化
稱2-亞氨基硫烷13.6mg溶于lml的0.05mol/L PBS (pH8.0,含有0.01 mol/LEDTA)中，加入到5ml含有67mg牛血清蛋白的0.05mol/L的PBS(pH8.0， 含有0.01 mol/LEDTA)溶液中，在室溫下反應(yīng)1小時。
(3) 6-氨基青霉垸酸與牛血清蛋白的偶聯(lián)
制備A液巰基化的蛋白質(zhì)溶液用0.2mol/LNaH2P04調(diào)pH7.2，低溫保存。 制備B液;?；?-氨基青霉垸酸溶于2ml的0.05mol/L PBS (pH7.2)中， 低溫保存。
A液加入到B液中室溫反應(yīng)2小時，即得人工抗原混合液。 透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離
子水沖洗3min，保存在4'C去離子水中備用。
將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的PBS溶液透析3天。
最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到通用人工抗原。
(4) 6-氨基青霉垸酸通用人工抗原的鑒定人工抗原采用凝膠電泳法鑒定 其偶聯(lián)結(jié)果，利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算其偶聯(lián)比。
偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方 法，雖然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量 (或相對含量)的原理建立起來的.凝膠電泳法是依據(jù)合成的人工抗原的分子 量比載體蛋白分子量的增加來確定偶聯(lián)比的。本實驗利用FR980生物電泳圖像 分析系統(tǒng)得出偶聯(lián)比為18，完全符合免疫要求。
偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200嗎'mr1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30'C水浴 溫?zé)?分鐘，每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制牛血清蛋白濃度 與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液 的吸光值，從曲線上得到抗原偶聯(lián)物蛋白溶液中的蛋白濃度。本實驗計算得抗 原溶液的蛋白濃度為5.5438mg-mr1。
權(quán)利要求
1、一種β-內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法，其特征是以6-氨基青霉烷酸6-APA為半抗原，用N-(m-馬來酰亞胺基苯甲酰氧基)琥珀酰亞胺MBS法將其與載體蛋白牛血清蛋白BSA偶聯(lián)，合成青霉素類抗生素中間體6-氨基青霉烷酸人工抗原6-APA-BSA，用凝膠電泳法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比；工藝步驟為(1)6-氨基青霉烷酸的酰化取70μmol 6-APA溶于3mL pH7.0、0.05mol/L磷酸鹽緩沖液中，加入到含有70μmol 22mg MBS、2mL四氫呋喃的25mL燒杯中，混合液在37℃下反應(yīng)3小時，冷凍干燥，得到白色固體，用乙醚和二氯甲烷V/V＝2∶1混合溶液洗滌五次，洗去未反應(yīng)的MBS；MBS的監(jiān)測硅膠薄層板的制作，稱取硅膠12g，溶解在40mL 0.5％質(zhì)量濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩珊隣睿暡ㄕ袷?分鐘，均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中備用；薄層層析法檢測硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應(yīng)液1μL點于線上，點樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為乙醚和二氯甲烷V/V＝2∶1混合溶液，展開至薄板3/4處，取板，吹干溶劑；將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.95處觀察不到顯色點作為洗滌終點；(2)牛血清蛋白的巰基化稱2-亞氨基硫烷13.6mg溶于1mL的pH 8.0，含有0.01mol/L乙二胺四乙酸EDTA的0.05mol/L PBS中，加入到5mL含有67mg牛血清蛋白的pH 8.0、含有0.01mol/L EDTA的0.05mol/L PBS溶液中，在室溫下反應(yīng)1小時；(3)6-氨基青霉烷酸與牛血清蛋白的偶聯(lián)制備A液巰基化的蛋白質(zhì)溶液用0.2mol/L NaH2PO4調(diào)pH至7.2，低溫保存；制備B液?；?-氨基青霉烷酸溶于2mL的pH7.2、0.05mol/L PBS中，低溫保存；A液加入到B液中室溫反應(yīng)2小時，即得人工抗原混合液；透析袋前處理取15cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液透析3天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到6-氨基青霉烷酸人工抗原6-APA-BSA；(4)人工抗原的鑒定人工抗原采用凝膠電泳法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算其偶聯(lián)比。
全文摘要
一種β-內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以6-氨基青霉烷酸為半抗原，用N-(m-馬來酰亞胺基苯甲酰氧基)琥珀酰亞胺MBS法將其與載體蛋白牛血清蛋白BSA偶聯(lián)，用凝膠電泳法測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。本發(fā)明成功合成了6-APA人工通用抗原，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了必需的人工抗原，可以滿足國內(nèi)對其研究的需要。
文檔編號C07K14/435GK101307092SQ20081012301
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日
發(fā)明者彭池方, 徐麗廣, 李灼坤, 胥傳來, 偉 馬 申請人:江南大學(xué)