專利名稱：：一種采用復(fù)合層析介質(zhì)純化Fc融合蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，涉及抗體類蛋白質(zhì)的純化，特別是一種采用復(fù)合層析介質(zhì)純化Fc融合蛋白質(zhì)的方法。該方法主要用于動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)的治療用Fc融合蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)制備。
背景技術(shù)：
：抗體治療已成為當(dāng)今生物治療腫瘤、流行性和感染性疾病的重要手段?？贵w類藥物以其高度的特異性、有效性和安全性成為國際藥品市場上一大類新型治療劑[1]。動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)抗體類藥物已成為當(dāng)今生物制藥領(lǐng)域的主流。臨床許多抗體類藥物，特別是治療用藥，需用較高劑量或長期用藥，市場需求較大，因此該類生物制藥的大規(guī)模生產(chǎn)對工藝質(zhì)量要求較高，必須符合美國FDA標(biāo)準(zhǔn)。目前，約70-80。/。的抗體純化使用了ProteinA、ProteinG親和層析[2，3]，因為該法可一步從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中幾乎完全純化抗體(通常是IgG抗體)。蛋白質(zhì)A(ProteinA)來源于金黃色葡萄球菌的一個株系。ProteinA作為親和配體被固定于瓊脂糖上，它所包含的5個與IgGFc段結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。ProteinA也可以結(jié)合另一些免疫球蛋白與如IgA、IgM。天然和重組的ProteinA(rProteinA)對于免疫球蛋白IgG的Fc段有特異的結(jié)合。重組的ProteinA經(jīng)改造后含有一個C末端半胱氨酸，可以單一位點固定于瓊脂糖上，增加了其結(jié)合能力。ProteinA的色譜行為，與Fc的結(jié)合強度依賴于該蛋白的物種來源，而動態(tài)結(jié)合能力則決定于色譜環(huán)境與色譜條件。隨著FDA、SFDA等對于治療性抗體產(chǎn)品質(zhì)量要求的不斷提高，ProteinA親和層析純化后的抗體往往仍不能夠滿足要求，主要表現(xiàn)為一些污染性雜質(zhì)的存在，例如脫落的ProteinA、宿主細(xì)胞蛋白(HCP)、聚合體(D/A)等。由于ProtdnA親和層析介質(zhì)反復(fù)使用時不可避免的會發(fā)生某種程度的配體脫落，這可能是由于蛋白酶水解將蛋白質(zhì)從基質(zhì)上解離下來的結(jié)果。而脫落ProteinA或其'片段等污染物仍然保留了對IgG抗體的親和力，這樣將會形成復(fù)合物而難以從純化的抗體中除去，這種情況在治療性抗體藥物中是絕不允許的，因此去除是必須的[4，5]。同時ProteinA是細(xì)菌蛋白質(zhì)會引起不良免疫應(yīng)答反應(yīng)，根據(jù)報道ProteinA和IgG抗體形成的復(fù)合物在體內(nèi)可激活攜帶Fc的白細(xì)胞和補體系統(tǒng)得免疫應(yīng)答，產(chǎn)生氧化和過敏反應(yīng)[6]。Balint等人指出可通過凝膠過濾分離此種ProteinA-IgG復(fù)合體和IgG單,[7]，但該方法處理量少，不適于放大。J.邦納杰等人證明采用離子交換可以有效去除在使用過程中脫落的ProteinA[4，5]。其專利中有關(guān)抗體純化的描述采用離子交換層析，進(jìn)行分級收集離子交換的流通峰，經(jīng)Elisa檢測分級收集的產(chǎn)品中ProteinA-IgG復(fù)合體大為降低。但是該法采用了分級分離，對產(chǎn)物回收率造成較大的影響，其回收率為70%-80%，最優(yōu)僅為80%以上，對于具有高附加值的抗體產(chǎn)品而言這是非常不經(jīng)濟的；而且，該法中僅僅針對較為前期的親和層析介質(zhì)的ProteinA脫落進(jìn)行研究，并不具有代表性。值得關(guān)注的是，現(xiàn)有報道中采用的是以往的親和介質(zhì)，ProteinA脫落問題相對較為嚴(yán)重[4'5]，其中Streamline重組蛋白質(zhì)A親和介質(zhì)每毫克抗體中可得到大約或超過1000ng污染性ProteinA[8]。因此有必要采用有效方法進(jìn)行去除。然而，隨著技術(shù)的發(fā)展，目前廣泛應(yīng)用于抗體純化領(lǐng)域的親和層析介質(zhì)已經(jīng)由ProteinASepharoseFF，rProteinASepharose等介質(zhì)發(fā)展為ProS印-VaUltra,Mabselect，MabselectXtra，MabselectSuRe等新一代介質(zhì)，這些新型親和層析介質(zhì)的ProteinA脫落問題有了很大的改善，其中大量研究顯示MabselectSuRe應(yīng)用潛力更大[9'1()'11。MabSelect系列的ProteinA配體經(jīng)基因工程改造，C端含一個半胱氨酸，形成一個定向的硫鍵，同時增加了對IgG的有效結(jié)合。蛋白A和凝膠交聯(lián)時采用了全新的工藝流程，增加了介質(zhì)的穩(wěn)定性和膠內(nèi)孔的表面積，因此增加了流速和動態(tài)載量在線形流速為500cm/h和柱床高度為20cm的條件下，MabSelect的動態(tài)載量可以達(dá)到30mglgG/ml以上，超過原來A蛋白介質(zhì)數(shù)倍，在純化特性方面也明顯優(yōu)于其他幾種蛋白A偶聯(lián)的介質(zhì)。2004年底推出的MabSelectXtm和MabselectSuRe，載量又比普通MabSelect增加了近300/。[12]。目前，美國FDA建議產(chǎn)品中殘留ProteinA的量應(yīng)低于10ppm12ppm1131。R.Hahn等人的研究顯示，MabselectSuRe介質(zhì)的ProteinA脫落相對于其他介質(zhì)(MabselectXtra，ProSep-VaUltra)更低，一般處于3ppm以下，遠(yuǎn)低于以上標(biāo)準(zhǔn)1111。而且該研究顯示經(jīng)過50個使用循環(huán)過后，沒有升高的趨勢。這是因為MabSelect由于通過環(huán)氧共價交聯(lián)，蛋白A的脫落比其它同類介質(zhì)低一半以上。由此可見，對于使用Mabsdect等介質(zhì)進(jìn)行純化的Fc融合蛋白，脫落的ProteinA并不是主要污染性雜質(zhì)，且在相當(dāng)使用時期內(nèi)脫落的ProteinA并不會影響產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，對于其他污染性雜質(zhì)(如宿主細(xì)胞蛋白、聚合體等)的去除則顯得更為突出和重要。宿主細(xì)胞蛋白(HostCellProtein,HCP)是指生物制品中來源于宿主細(xì)胞的蛋白成分，其主要成分包括宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)化蛋白(即細(xì)胞分泌的促生長蛋白)，前者危險性在于引起機體過敏反應(yīng)，后者在于引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化[14]。理論上，傳代細(xì)胞的DNA和蛋白存在致腫瘤的可能性。同時，生物制品中的細(xì)胞殘留蛋白為異源蛋白(過敏原)，有可能引起機體的過敏反應(yīng)15]。有研究表明，地鼠腎細(xì)胞乙腦疫苗的過敏反應(yīng)可能與疫苗中地鼠腎細(xì)胞蛋白含量高有關(guān)[16]。但是，不同細(xì)胞的宿主細(xì)胞蛋白是不一樣的，就算是相同細(xì)胞，在最終產(chǎn)品中的HCP也是不一樣的。首先，這與抗體表達(dá)的方式有關(guān)，其次與使用的純化方法有關(guān)。RainerHahn等人比較了不同親和介質(zhì)的特性，發(fā)現(xiàn)MabSelectXtra，MabSelectSuRe，ProSep-vAUltra三種親和層析介質(zhì)純化后抗體中HCP的殘留各有差異[111。CHO細(xì)胞是被WHO和SFDA認(rèn)可用于抗體和重組蛋白等生物制品的生產(chǎn)的傳代細(xì)胞。該細(xì)胞遺傳背景清楚，核型穩(wěn)定，無外源因子污染，適合生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)，保證了大批量細(xì)胞的均質(zhì)性和安全性。但該細(xì)胞產(chǎn)生的HCP依然會影響產(chǎn)品的質(zhì)量。有研究顯示，親和層析之后的HCP水平一般在200ppm3000ppm之間t171，更有研究顯示，100ppm的HCP能夠引起患者的免疫反應(yīng)[18]?！吨袊幍洹啡?2005版)對CHO細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品提出要求宿主細(xì)胞殘余蛋白(HCP)占總蛋白含量的0.1%以下。因此純化過程中HCP的去除勢在必行。AndreasStein等人采用一種陽離子交換介質(zhì)直接從培養(yǎng)液中純化抗體，其產(chǎn)物中HCP量從發(fā)酵液的155000ppm降低至80ppm,純化系數(shù)達(dá)1800倍[19],取得了良好的效果。但作為第一步從發(fā)酵液中初步純化抗體，在其放大過程中受限制因素較多。j.邦納杰等人證明采用離子交換可以有效去除在使用過程中脫落的ProteinA[4'5]，取得了良好的效果。但其對于產(chǎn)物中HCP的去除卻沒有進(jìn)行報道。目前，針對HCP進(jìn)一步去除的文獻(xiàn)比較少，尤其是針對親和層析之后產(chǎn)品中HCP去除的研究報道更少。除了去除ProteinA和HCP之外，涉及Fc融合蛋白(但可以拓展至任何其他類型的生物醫(yī)藥蛋白)的另一純化問題是均質(zhì)二聚體與更高聚合體的形成。與蛋白質(zhì)A形成復(fù)合物(主要基于親和力甚至天然蛋白質(zhì)也能形成)相反，自發(fā)性的或者由鹽、由pH誘導(dǎo)的至少一部分分蛋白質(zhì)變性使得溶劑可接近表面的疏水區(qū)域暴露導(dǎo)致Fc融合或類似蛋白質(zhì)均受化學(xué)質(zhì)量定律的驅(qū)動看時形成聚合體。因此，與基于親和力的復(fù)合物形成相反，非特異性凝聚主要受溶劑排斥作用驅(qū)動，在這點上類似于晶體生長行為t^，最初仍可溶的聚合物隨時間而增加，進(jìn)而蛋白質(zhì)從溶液中沉淀。藥物給予后，低百分比的污染性聚合物還可能弓I發(fā)有害的免疫應(yīng)答反應(yīng)[2°]。迄今為止，能可靠的去除聚合物的方法最常用體積排阻層析(SEC)。然而,SEC是純化的瓶頸，與其他層析技術(shù)相比，它需要大量處理時間，材料昂貴并且加載容量低。據(jù)報道[21]，SEC可以有效檢測聚合物的存在，并能對其進(jìn)行定量研究，但也僅僅作為檢測手段進(jìn)行應(yīng)用，無法應(yīng)用于產(chǎn)品制備。另一方面，在純化過程中目標(biāo)產(chǎn)物的純度固然重要，但是純化效率也非常重要。純化效率主要體現(xiàn)在回收率和介質(zhì)處理能力兩方面。AndreasStein等人雖然獲得了較好的產(chǎn)品質(zhì)量，但離子交換層析本身要求高，因此樣品處理較為復(fù)雜，勢必會造成產(chǎn)物不必要的損失[19]。J.邦納杰等人面臨同樣的問題。在他們的方法中樣品須經(jīng)過透析和或超濾等方法處理，才能進(jìn)行下一步純化[4，5]。這對時間、設(shè)備、環(huán)境、人員等因素的要求較高，不容易滿足規(guī)?；a(chǎn)的需求。同時，他們采用了分級收集的方式來純化抗體，這樣在獲取高純度產(chǎn)物的同時是以犧牲回收率為前提的(其回收率最高僅為85%以上)[4，5]。介質(zhì)的處理能力由載量和流速兩者共同決定。對于規(guī)模化純化而言，更高的載量和流速更加適用。AndreasStein和J.邦納杰等人采用的離子交換介質(zhì)動態(tài)載量一般為50mglgG/ml介質(zhì)，流速一般為300cm/h500cm/hP^。而且其載量受到樣品處理效果、以及操作條件的影響較大，不適合大規(guī)模生產(chǎn)根據(jù)申請人所進(jìn)行的資料檢索，檢索到和本發(fā)明相關(guān)的有以下參考文獻(xiàn)-1.米力、唐浩等，一種高效快速純化片段抗體的方法，2004,中國發(fā)明專利，專利號ZL200410026022.1;2.DeborahK.Follman，RobertLFahrner.FactorialscreeningofantibodypurificationprocessesusingthreechromatographystepswithoutproteinA.JournalofChromatographyA，1024(2004)79-85。3.JorgThommes，AndreaBader，MarkusHalfar，etal.IsolationofmonoclonalantibodiesfromcellcontaininghybridomabrothusingaproteinAcoatedadsorbentinexpandedbeds.JournalofChromatographyA，752(1996)111-122。4.J.邦納杰，R.P.布拉克，M.R.戴維斯等，用于純化抗體的親和力加離子交換層析，2005，PCT專利申請，申請?zhí)?00580035236.8;5.J.邦納杰，A.普倫塔，用蛋白A和離子交換層析來純化抗體，2004，PCT專利，申請?zhí)?0048009347.7;6.Balint，etal.Tumoricidalresponsefollowingperfusionoverimmobilizedprotein'A:identificationofimmunoglobulinoligomersinserumafterperfusionandtheirpartialcharacterization,CancerRes，44(1984)73知7.Das，etal，SeparationofcomplexescontainingproteinAandIgGorFcgammaFragmentsbyhigh-performanceliquidchromatography,Analyt.Biochem，145(1985)27-36。8.IngenmarJohansson,IGGseparationmediumAmersh咖，2002，USAPatent(US6399750);9.R.Hahn，R.Schlegel，A.Jungbauer，ComparisonofproteinAaffinitysorbents，J.Chromatogr.B790(2003)35-51;10.R.Hahn，P,Bauerhansl，K.Shimahara，C.Wizniewski，A.Tscheliessnig,A.Jungbauer,ComparisonofproteinAaffinitysorbentsII.Masstransferproperties.JournalofChromatography.A1093(2005)98-110;11.RainerHahn，KazumichiShimahara，F(xiàn)ranzSteindl，AloisJungbauer,ComparisonofproteinAaffinitysorbentsIILLifetimestudy,JournalofChromatographyA.1102(2006)224-231;12.MabSelectXtraDatafileAmershamBiosciences11-0011-57;13.TheGoldSheet,2004，38，9;14.TanjaWolterandAndreasRichter，AssaysforcontrollingHost-cellimpuritiesinBiopharmaceuticals,BioProcesstechnical;15.侯繼鋒，程雅琴，不同方法測定基因工程藥物中中國倉鼠卵巢細(xì)胞蛋白殘留量的比較與分析，中國生化藥物雜志，23(2002)168-170;16.徐成林，唐巧英，原代地鼠腎細(xì)胞乙腦疫苗中殘余細(xì)胞基質(zhì)的檢測，中國生物制品學(xué)雜志，14(2001)48—50;17.R丄Fahrner，H丄Knudsen，C.D.Basey，W.Galan，D.Feuerhelm，Vanderlaa—n，G.S.Blank,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.18(2001)301;18.Konrad，M.Im咖nogenicityofproteinsadministeredtohumansfortherapeuticpurposes.TrendsBiotechnol.7(1989)17519.AndreasStein，AnderKiesewetter，CationexchangechromatographyinantibodypurificationpHscreeningforoptimisedbindingandHCPremoval,JournalofChromatographyB，848(2007)151-158;20.任躍明，程雅琴，倪道明，靜脈注射人免疫球蛋白的質(zhì)量控制，中國生物制品學(xué)雜志，18(2005)73;21.S.Gibert，N.Bakalam，X.Santeirelli，ThreestepchromatographicprocedurefortheproductionofaHis-tagrecombinantkinesinoverexpressedinE.coli，JournalofChromatographyB，737(2007)143-150;22.QS印haroseFF.DatafileGEHealthcare.17-0510-10;23.Chiti，etal.Rationalizationoftheeffectsofmutationsonproteinaggregationrate,Nature,424(2004)805-808;
發(fā)明內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種采用復(fù)合層析介質(zhì)純化Fc融合蛋白的方法，經(jīng)過長時間的摸索和大量的實驗證明，該方法能夠降低產(chǎn)物中污染性雜質(zhì)的水平，提高了目標(biāo)產(chǎn)物的純度，有效保證了產(chǎn)物質(zhì)量。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種采用復(fù)合層析介質(zhì)純化Fc融合蛋白的方法，其特征在于該方法選擇離子交換疏水復(fù)合層析介質(zhì)，調(diào)節(jié)層析緩沖系統(tǒng)的PH低于純化目標(biāo)蛋白的平均PI，同時調(diào)節(jié)該層析緩沖系統(tǒng)具有較高的離子強度，利用適當(dāng)?shù)膶游鰲l件，使純化目標(biāo)蛋白存在于流穿液中，而污染性雜質(zhì)則吸附到復(fù)合層析介質(zhì)上，收集所述的流穿液，從而純化目標(biāo)蛋白，有效的去除Fc融合蛋白的雜質(zhì)。本發(fā)明能夠有效的去除親和層析之后產(chǎn)品中的污染性雜質(zhì)，提高了終產(chǎn)物質(zhì)量，使其純度達(dá)99%以上。同時采用的離子交換疏水復(fù)合層析介質(zhì)經(jīng)實踐證明是一種高載量、高流速的介質(zhì)，更加適合于工業(yè)生產(chǎn)。綜上，本發(fā)明工藝銜接緊密，一步有效去除污染性雜質(zhì)，具有穩(wěn)定性好、過程控制指標(biāo)明確、適合規(guī)?；a(chǎn)等特點。圖1是Captoadhere層析色譜圖2是Superdex-200色譜圖(MabSelectSuRe洗脫液)；圖3是Superdex-200色譜圖(Captoadhere流穿液)；圖4是SE-HPLC色譜圖(Captoadhere流穿液)；以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。具體實施例方式本發(fā)明的采用復(fù)合層析介質(zhì)純化Fc融合蛋白的方法，采用離子交換疏水復(fù)合層析介質(zhì)，調(diào)節(jié)層析緩沖系統(tǒng)的pH低于純化目標(biāo)蛋白的平均pI，同時調(diào)節(jié)該層析緩沖系統(tǒng)具有較高的離子強度，通過有效的層析條件，使純化目標(biāo)蛋白存在于流穿液中，而污染性雜質(zhì)(如宿主細(xì)胞蛋白、聚合體等)則吸附到復(fù)合層析介質(zhì)上，一步收集該流穿液，從而純化目標(biāo)蛋白，有效的去除Fc融合蛋白的雜質(zhì)。具體包括以下步驟1)選用復(fù)合層析介質(zhì)復(fù)合層析介質(zhì)是復(fù)合了離子交換作用和疏水作用的介質(zhì)，其中離子交換作用是陰離子交換作用，優(yōu)選強陰離子交換作用，其中疏水作用優(yōu)選強疏水作用；2)選擇經(jīng)ProteinA親和層析法純化后的Fc融合蛋白，ProteinA是天然蛋白質(zhì)A或其功能性衍生物；3)調(diào)節(jié)待純化樣品(含有目標(biāo)蛋白)pH比所述目標(biāo)蛋白平均pi低0.5-2.5個pH單位，同時調(diào)節(jié)其離子強度為10ms/cm50ms/cm，高于常規(guī)離子交換介質(zhì)所用的離子強度(0ms/cm5ms/cm);應(yīng)注意此pi指實際收獲與純化抗體的pl，不是只從氨基酸序列預(yù)計的pl。實際中許多純化的抗體分子的多肽骨架被修飾了，例如糖基化。所述修飾可以是加入帶電荷部分，從而改變該分子的pl。通過等點聚焦(正F)測定產(chǎn)物抗體的pl，發(fā)現(xiàn)尤其是單克隆抗體蛋白翻譯后加工形成的微小不均一性，以及糖基化形式的產(chǎn)物抗體導(dǎo)致更寬的pi范圍，所有這些抗體在正F凝膠中形成類似于成片的條帶而非單一條帶，至少大多數(shù)產(chǎn)物有特定(pi)數(shù)值。因此，按照本發(fā)明，"平均pi"是指pi處于上述pi優(yōu)選范圍內(nèi)的抗體產(chǎn)物分子所共有的pl，其前提是假設(shè)這合理公平的代表了糖基化形式(抗體)的數(shù)量分布。4)層析緩沖系統(tǒng)的pH值設(shè)為比所述目標(biāo)蛋白的平均pi低0.5-2.5個pH單位，同時緩沖系統(tǒng)的離子強度設(shè)為10ms/cm50ms/cm，高于常規(guī)離子交換介質(zhì)所用的離子強度(0ms/cm5ms/cm);5)層析流速設(shè)為100cm/h600cm/h;使目標(biāo)蛋白存在于流穿液中，而污染性雜質(zhì)(如宿主細(xì)胞蛋白、聚合體等)則吸附到復(fù)合層析介質(zhì)上。6)—步收集所有流穿液中的目標(biāo)蛋白，檢測所收集的流穿液，其中蛋白單體的純度至少為99%，至少去除1%以上的污染性雜質(zhì)(如宿主細(xì)胞蛋白、聚合體形式蛋白)，目標(biāo)蛋白的回收率至少為90%以上。所述的Fc融合蛋白是動物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的Fc融合蛋白，即含抗體Fc結(jié)構(gòu)的融合蛋白或IgG類抗體蛋白；其中，含抗體Fc結(jié)構(gòu)的融合蛋白是對ProteinA有較高親和力的物種蛋白，其中IgG類抗體蛋白可以是鼠源性的，或是人源化的嵌合抗體、CDR-移植抗體以及全人源化的工程抗體。所述的Fc融合蛋白是基本上非凝聚的單體蛋白。所述的Fc融合蛋白是由哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的Fc融合蛋白，或CHO細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的抗體類蛋白。Fc融合蛋白的pl至少為6.5或高于6.5。本發(fā)明的凝聚物應(yīng)理解為相同蛋白質(zhì)的非共價結(jié)合，所述蛋白質(zhì)可以由單鏈蛋白質(zhì)或共價結(jié)合(例如通過二硫鍵結(jié)合)的均質(zhì)或異質(zhì)多條多肽構(gòu)成。與衍生其的單體一樣，本發(fā)明的凝聚物可溶于水溶液。例如，二聚體凝聚物是兩個IgG分子的非特異性結(jié)合。凝聚物的形成與對天然蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的變形影響(因素)緊密相關(guān)。例如，加熱與pH誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊變性可引發(fā)凝聚。因此，給定蛋白的凝聚速率有高度特異性，取決于各蛋白折疊特定的攻擊能量穩(wěn)定性[23]。本發(fā)明采用的復(fù)合層析介質(zhì)，是一種復(fù)合離子交換作用和疏水作用的介質(zhì)，經(jīng)申請人的實驗證明，它是一種高載量、高流速介質(zhì)。其動態(tài)載量可以達(dá)到75-300mgIgG/ml介質(zhì)，流速可以達(dá)到600cm/h，相對于現(xiàn)有技術(shù)采用的離子交換層析介質(zhì)更加適合于規(guī)?；a(chǎn)。緩沖液的pH設(shè)為不同于待純化產(chǎn)物蛋白的pl或平均pl，所述pH使產(chǎn)物蛋白具有表面電荷，當(dāng)接觸或浸沒于所述緩沖液中時，導(dǎo)致產(chǎn)物蛋白與復(fù)合介質(zhì)的帶電荷基團之間離子排斥。緩沖液的離子強度使產(chǎn)物蛋白和污染性雜質(zhì)具有不同的疏水特性，當(dāng)接觸或浸沒于所述緩沖液中時，導(dǎo)致產(chǎn)物蛋白與復(fù)合介質(zhì)的疏水基團之間疏水排斥，污染性雜質(zhì)與復(fù)合介質(zhì)的疏水基團之間疏水吸附。以下是發(fā)明人給出的實施例，需要說明的是，本發(fā)明不限于這些實施例。申請人采用改造的CHO細(xì)胞(TGLA)分泌的單克隆抗體進(jìn)行抗體的純化制備，該細(xì)胞是經(jīng)基因工程改造的CHO細(xì)胞，能穩(wěn)定高效表達(dá)抗CD20相關(guān)抗原的單克隆抗體。用機械攪拌式生物反應(yīng)器，大規(guī)模高密度懸浮培養(yǎng)TGLA細(xì)胞；首先澄清過濾細(xì)胞培養(yǎng)液，再采用MabSelectSuRe親和層析一步吸附大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)液中的抗體IgG，接著調(diào)節(jié)親和洗脫液的pH和離子強度，然后通過復(fù)合介質(zhì)Captoadhere,獲取完全符合標(biāo)準(zhǔn)的單克隆IgG半成品。本發(fā)明的工藝用連續(xù)純化過程獲取抗體，其工藝過程主要分以下幾步1、細(xì)胞液澄清去除100%的細(xì)胞及細(xì)胞碎片等有形物。2、MabSelectSuRe親和介質(zhì)層析初步純化和濃縮目標(biāo)產(chǎn)物。3、Captoadhere復(fù)合層析介質(zhì)獲取高純度目標(biāo)產(chǎn)物。實驗例1.細(xì)胞液澄清.采用0.22pm囊式濾器(PALL公司)，硅膠管、蠕動泵(保定蘭格泵有限公司)，恒流速過濾CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清，除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片。2.MabSelectSuRe親和層析利用AKTApurifier-100(GEHealthcare)層析系統(tǒng)，將20mlMabSelectSuRe(GEHealthcare)親和層析介質(zhì)裝載于XK16/20(GEHealthcare)層析柱中。以平衡緩沖液(20mMPB+150mMNaClpH6.0-7.0)充分平衡親和層析柱，待280nm的紫外吸收回到基線，且電導(dǎo)、pH保持穩(wěn)定時開始上樣，再以平衡緩沖液沖洗未結(jié)合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基線和電導(dǎo)、pH保持穩(wěn)定后，用洗脫緩沖液(100mM檸檬酸緩沖液，pH3.0-3.5)直接洗脫，收集洗脫液。3.Captoadhere復(fù)合層析介質(zhì)將親和層析洗脫液用1MTris-HCl調(diào)節(jié)至pH6-7，用NaCl調(diào)節(jié)離子強度至20ms/cm50ms/cm。利用AKTApurifier-100(GEHealthcare)層析系統(tǒng)，將20mlCaptoadhere(GEHealthcare)復(fù)合層析介質(zhì)裝載于XK16/20(GEHealthcare)層析柱中。以平衡緩沖液(lOOmM檸檬酸-Tris緩沖液/160-320mMNaCl，pH6.0-7.0)充分平衡Captoadhere復(fù)合層析柱，待280nm的紫外吸收回到基線，且電導(dǎo)、pH保持穩(wěn)定時開始上樣，再以平衡緩沖液沖洗未結(jié)合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基線和電導(dǎo)、pH保持穩(wěn)定后，用洗脫緩沖液(lOOmM乙酸)直接洗脫。收集流穿液，即為目標(biāo)蛋白。4.EUSA湖[)定HCP本法采用Cygnus公司的HCP檢測試劑盒(ImmunoenzymetricAssayfortheMeasurementofChineseHamsterOvaryHostCellProteins,F015，CygnusTechnologies)。參照試劑盒說明書，具體操作步驟如下1)向每個離心管中分別加入200ul的標(biāo)準(zhǔn)品(0-75ng/ml)、對照品、.檢測樣品；2)每個離心管中分別加入400ul的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗CHOHCP抗體；3)蓋好離心管，混勻，室溫孵育2小時；4)向96孔板條中轉(zhuǎn)移已經(jīng)反應(yīng)好的以上混合液，每孔200ul;5)蓋好板條，并放入密封的塑料袋，室溫下180rpm轉(zhuǎn)動孵育2小時；6)甩干板條中的液體，加清洗液350ul，再甩干，重復(fù)4次；7)每孔中加入200ul的顯色劑；8)蓋好板條，孵育90min;9)405/492nm讀值。5.凝膠過濾層析(SEC)測定測定D/A利用AKTApurifier-100(GEHealthcare)層析系統(tǒng)，以平衡緩沖液(20mMPB+150mMNaCl，pH7.2)充分平衡Superdex-200柱，待280nrn的紫外吸收回到基線和電導(dǎo)、pH保持穩(wěn)定時開始上樣，再以平衡緩沖液沖洗IO個柱體積。6.SE-HPLC測定產(chǎn)物純度利用自動化的WatersHPLC系統(tǒng)，以平衡緩沖液(lOOmMPB+100mMNa2SO4+0.05%NaN3，pH6.7)充分平衡TSKgelG3000SWXL柱(10個柱體積)，待280nm的紫外吸收回到基線和電導(dǎo)、pH保持穩(wěn)定時開始上樣，再以平衡緩沖液沖洗10個柱體積。結(jié)果1.ELISA測定HCP表1:Elisa測定Captoadhere層析過程中HCP結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注1#MabSelectSuRe洗脫峰；2#Captoadhere流穿峰；3#Captoadhere洗脫峰。表1顯示，Captoadhere處理后，大部分HCP均與Captoadhere介質(zhì)結(jié)合，并且在洗脫中收獲(見圖1)。經(jīng)過1#樣品與.2#樣品含量計算復(fù)合介質(zhì)Captoadhere去除率為86.5%。處理后，產(chǎn)品中HCP殘留量為0.00007%，遠(yuǎn)小于藥典規(guī)定0.1%，并且低于100ppm，不會引起可能的免疫反應(yīng)[18]?？梢?，Captoadhere具有良好的去除HCP的效果。同時經(jīng)計算該步驟回收率為95.7%(結(jié)果未列)。2.Superdex-200測定D/A表2Superdex-200測定Captoadhere層析過程中D/A結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注:1#MabSelectSuRe洗脫液；2#Captoadhere流穿；3#Captoadhere洗脫。對比Captoadhere純化前后D/A含量，由表2顯示以及圖2，圖3可見，在本發(fā)明條件下Captoadhere純化抗體后，其D/A含量由3.46%降低為0.25%，去除率為92.8%?？梢?，Captoadhere復(fù)合層析介質(zhì)能夠有效地去除D/A，有效保證了產(chǎn)品質(zhì)量。3.SE-HPLC測定產(chǎn)物純度經(jīng)SE-HPLC測定經(jīng)過Captoadhere純化后的產(chǎn)品純度由面積積分計算為99.72%(見圖4)。權(quán)利要求1.一種采用復(fù)合層析介質(zhì)純化Fc融合蛋白的方法，其特征在于該方法采用離子交換疏水復(fù)合層析介質(zhì)，調(diào)節(jié)層析緩沖系統(tǒng)的pH低于純化目標(biāo)蛋白的平均pI，同時調(diào)節(jié)該層析緩沖系統(tǒng)具有較高的離子強度，利用適當(dāng)?shù)膶游鰲l件，使純化目標(biāo)蛋白存在于流穿液中，收集該流穿液，而污染性雜質(zhì)則吸附到復(fù)合層析介質(zhì)上。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，該方法至少包括以下步驟1)層析緩沖系統(tǒng)采用復(fù)合層析介質(zhì)，該復(fù)合層析介質(zhì)是復(fù)合了離子交換作用和疏水作用的介質(zhì)，其中離子交換作用是陰離子交換作用或強陰離子交換作用，其中疏水作用是強疏水作用；2)選用經(jīng)ProteinA親和層析法純化后的Fc融合蛋白，ProteinA是天然蛋白質(zhì)A或其功能性衍生物；3)調(diào)節(jié)待純化樣品pH比所述目標(biāo)蛋白平均pi低0.5個pH單位2.5個pH單位，同時調(diào)節(jié)其離子強度為10ms/cm50ms/cm，高于常規(guī)離子交換介質(zhì)所用的離子強度；4)層析緩沖系統(tǒng)的pH值比所述目標(biāo)蛋白的平均pi低0.5個pH2.5個pH單位，同時緩沖系統(tǒng)的離子強度設(shè)為10ms/cm50ms/cm，高于常規(guī)離子交換介質(zhì)所用的離子強度；5)層析用流速設(shè)為100cm/h600cm/h，使目標(biāo)蛋白存在于流穿液中，污染性雜質(zhì)結(jié)合在復(fù)合層析介質(zhì)上；6)收集所有流穿液中的目標(biāo)蛋白，所收集的流穿液中，流穿液中蛋白單體的純度至少為99%,目標(biāo)蛋白的回收率至少為90%以上。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Fc融合蛋白是動物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的Fc融合蛋白，即含抗體Fc結(jié)構(gòu)的融合蛋白或IgG類抗體蛋白；其中，含抗體Fc結(jié)構(gòu)的融合蛋白是對ProteinA有較高親和力的物種蛋白，其中IgG類抗體蛋白可以是鼠源性的，或是人源化的嵌合抗體、CDR-移植抗體以及全人源化的工程抗體。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Fc融合蛋白是基本上非凝聚的單體蛋白。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Fc融合蛋白是由哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的Fc融合蛋白，或CHO細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的抗體類蛋白。6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的Fc融合蛋白的pI至少為6.5或高于6.5。7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的pH設(shè)為不同于待純化產(chǎn)物蛋白的pl或平均pl，所述pH使目標(biāo)蛋白具有表面電荷，當(dāng)接觸或浸沒于所述緩沖液中時，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白與復(fù)合介質(zhì)的帶電荷基團之間離子排斥。8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的離子強度使目標(biāo)蛋白和污染性雜質(zhì)具有不同的疏水特性，當(dāng)接觸或浸沒于所述緩沖液中時，目標(biāo)蛋白與復(fù)合介質(zhì)的疏水基團產(chǎn)生疏水排斥，而污染性雜質(zhì)與復(fù)合介質(zhì)的疏水基團產(chǎn)生親水吸附。9.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述收集的流穿液中蛋白單體的純度至少為99%，且該純度通過一步收集來實現(xiàn)，去除至少1%以上的污染性雜質(zhì)。全文摘要本發(fā)明公開一種采用復(fù)合層析介質(zhì)純化Fc融合蛋白的方法，該方法采用離子交換疏水復(fù)合層析介質(zhì)，調(diào)節(jié)層析緩沖系統(tǒng)的pH低于純化目標(biāo)蛋白的平均pI，同時調(diào)節(jié)該層析緩沖系統(tǒng)具有較高的離子強度，利用適當(dāng)?shù)膶游鰲l件，使純化目標(biāo)蛋白存在于流穿液中，收集該流穿液，而污染性雜質(zhì)(如宿主細(xì)胞蛋白、聚合體等)則吸附到復(fù)合層析介質(zhì)上，從而提高目標(biāo)蛋白純度。采用本發(fā)明的方法，最終雜質(zhì)去除率達(dá)1％以上，目標(biāo)蛋白純度達(dá)99％以上，目標(biāo)蛋白回收率達(dá)90％以上。本發(fā)明的方法在實現(xiàn)過程中銜接緊密，能夠一步有效去除污染性雜質(zhì)，具有穩(wěn)定性好、過程控制指標(biāo)明確、適合規(guī)模化生產(chǎn)等特點。文檔編號C07K1/18GK101318991SQ20081015025公開日2008年12月10日申請日期2008年7月4日優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日發(fā)明者浩唐,王科偉,力米申請人:陳志南;米力