專(zhuān)利名稱(chēng)：抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)移因子是從多種抗原致敏的正常動(dòng)物白細(xì)胞中提取出來(lái)的一種淋巴因子，或從經(jīng)某種抗原刺激后的恢復(fù)期動(dòng)物血細(xì)胞中提取出來(lái)的一種淋巴因子。前者稱(chēng)非特異性轉(zhuǎn)移因子，后者則稱(chēng)特異性轉(zhuǎn)移因子。這兩種轉(zhuǎn)移因子在體內(nèi)外最重要的是可傳遞細(xì)胞免疫功能,作為過(guò)繼免疫治療的一種免疫制劑，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種重要作用。
轉(zhuǎn)移因子目前的制備方法是將動(dòng)物新鮮或冷凍的脾臟及淋巴結(jié)在25°C
左右去除脂肪及結(jié)締組織，然后用純化水洗凈；將洗凈的組織切成小塊，加入
適量水，用組織搗碎機(jī)破碎細(xì)胞，制成勻漿，加適量純化水，混勻，置-2(TC反復(fù)凍融5 8次，融化溫度不得超過(guò)37"C;將凍融的勻漿離心(離心溫度4°C)，去沉淀，留上清液備用；上清液裝透析袋，透析24-48小時(shí)，半成品過(guò)濾除菌；成品的配置與檢驗(yàn)。
抗菌肽是經(jīng)誘導(dǎo)，由動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的可對(duì)抗外源性病原體的防御性肽類(lèi)活性物質(zhì)，分子量小、活性強(qiáng)，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲(chóng)作用，甚至對(duì)癌細(xì)胞也具有殺傷作用，應(yīng)用十分廣泛。目前的制備方法是以新鮮雞小腸為原料，去脂肪、漿膜和內(nèi)容物，稱(chēng)重后冷凍剪碎，搗碎成漿。勻漿后隔水煮沸15分鐘，按照l(shuí): 1的比例加入5%乙酸，并在4。C條件下攪拌過(guò)夜，次日將混合物在4"C溫度條件下以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清，保存在4。C環(huán)境中。將沉淀物用等體積5%乙酸混合，再置于4。C攪拌浸提過(guò)夜，重復(fù)上述離心過(guò)程，取上清，合并兩次上清液，調(diào)整pH值，再次離心，棄沉淀，上清液冷凍干燥品即為抗菌肽。
現(xiàn)有技術(shù)制備轉(zhuǎn)移因子及抗菌肽的主要缺點(diǎn)是針對(duì)疾病沒(méi)有特異性，治療效果不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中制備的抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子針對(duì)疾病沒(méi)有
3特異性，治療效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，提供一種生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)出率高、效果更好的抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案概述如下
一種抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，由如下步驟組
成
(1) 用禽流感病毒H5N1血清亞型滅活疫苗0. 25-lmL肌肉注射免疫10日齡實(shí)驗(yàn)雞，在15日齡時(shí)，再以同批疫苗0.3mL肌肉注射加強(qiáng)免疫；
(2) 密切監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達(dá)到高峰值時(shí)，無(wú)菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟或抗凝血，用脾臟或外周血制備淋巴細(xì)胞單層；
(3) 對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
(4) 當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用植物血凝素誘導(dǎo)培養(yǎng)，即獲得抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明以較少的雞脾臟或外周血為原料，制成淋巴細(xì)胞單層，在體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞單層即可生產(chǎn)出大量抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子和抗菌肽的混合體，本發(fā)明的方法制備的抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽無(wú)需進(jìn)一步的提純，可經(jīng)超聲波及凍融簡(jiǎn)單處理后直接將混合體用在禽類(lèi)體內(nèi)，即可起到抗禽流感病毒及抗菌的作用，提高禽類(lèi)的免疫力。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1
一種抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，步驟(1).免疫
用禽流感病毒H5N1血清亞型滅活疫苗0. 25mL肌肉注射免疫10日齡實(shí)驗(yàn)雞，同步設(shè)立空白對(duì)照組，在15日齡再以同批疫苗0.3mL肌肉注射作為加強(qiáng)免疫；
(2)密切監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達(dá)到高峰值時(shí)，無(wú)菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟，用脾臟制備淋巴細(xì)胞單層，步驟為A、處理雞脾臟
取新鮮雞脾臟置于無(wú)菌玻璃容器中，加入PBS(pH為7. 2)溶液浸泡半小時(shí)或浸于質(zhì)量百分濃度為1%的新潔爾滅溶液中，取出以酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除脾臟脂肪及包膜，用PBS(pH為7. 2)液洗滌一次，再將脾臟-剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪將脾臟剪成lmm3小塊，再用PBS(pH為7. 2) 液洗滌3次，以去除血細(xì)胞、色素物質(zhì)及剪碎過(guò)程中機(jī)械損傷的細(xì)胞；
B、 消化及分散組織塊
將上步清洗過(guò)的PBS(pH7.2)液吸掉、將剪碎的組織塊移入錐形瓶中，按 組織塊體積的5倍量加入0. 25yQ胰蛋白酶液(pH為7. 7)，置37t:水浴中消化 30分鐘。每隔10分鐘搖動(dòng)一次錐形瓶，以便組織塊散開(kāi)，以利繼續(xù)消化，直 到組織變成松散、表面發(fā)毛時(shí)為止，這時(shí)從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶 液，再用PBS(pH為7.2)液洗滌3次，用O. 5%水解乳蛋白——Hanks液洗， 用口徑稍大的細(xì)管吹打數(shù)次，用四層紗布濾過(guò)；
C、 細(xì)胞計(jì)數(shù)
采用標(biāo)有O. lmm字樣的血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法與白細(xì)胞計(jì)數(shù)相 同； '
D、 細(xì)胞懸液的分裝和培養(yǎng)
按細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞懸液用營(yíng)養(yǎng)液調(diào)整至60萬(wàn)/毫升細(xì)胞懸液。將 細(xì)胞懸液分裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶(100ml)和細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，分裝量為該瓶容量的1/5， 蓋上蓋，做好標(biāo)識(shí)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶和轉(zhuǎn)瓶分別放在二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶 機(jī)上培養(yǎng)；
E、 觀察
置于37'C培養(yǎng)的細(xì)胞，需逐日進(jìn)行觀察。若細(xì)胞己生長(zhǎng)，則要觀察細(xì)胞 的形態(tài)特征并判斷其所處的生長(zhǎng)階段(游離期、吸附期、繁殖期、維持期和衰 退期)，直至形成淋巴細(xì)胞單層。
(3) 對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)
在作傳代細(xì)胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下現(xiàn)察，以確定細(xì)胞己長(zhǎng) 成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。
(4) 當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用植物血凝素誘導(dǎo)培養(yǎng) 當(dāng)脾淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，更換維持液同時(shí)加入植物血凝素誘導(dǎo)培養(yǎng)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)后對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)-
將細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)超聲破碎后取樣檢測(cè)轉(zhuǎn)移因子和抗菌肽的濃度。 轉(zhuǎn)移因子濃度的測(cè)定對(duì)轉(zhuǎn)移因子的定量多以多肽含量定量用Folin-酚法或分光光度法測(cè)定多肽含量，以多肽含量lmg為一個(gè)轉(zhuǎn)移因子單位。此工 藝生產(chǎn)的轉(zhuǎn)移因子含量是常規(guī)生產(chǎn)的的4 5倍。
抗菌肽濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液， 所生產(chǎn)的抗菌肽的濃度是常規(guī)提取量的10倍。
應(yīng)用實(shí)例
200只15日齡肉雞(經(jīng)過(guò)健康檢查無(wú)菌)分為A、 B、 C、 D、 E共5組， 每組40只，B、 C、 D、 E組經(jīng)過(guò)人工感染0. 6ml禽流感病毒強(qiáng)毒攻毒后作實(shí)驗(yàn)。 A組為健康組，不感染病毒，不給藥；B組陰性對(duì)照組，感染病毒，不給藥；C 組和D組為本發(fā)明的方法制備的產(chǎn)品，C組為低劑量組，按0. 06 g/雞/天注射； D組為藥物組合物高劑量組，按O. 12 g/雞/天注射；E組為傳統(tǒng)"雙黃連口服 液"治療組，按0.1g/雞/天給藥，用藥用天。結(jié)果表明，采用本發(fā)明抗禽 流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法制備的產(chǎn)品對(duì)禽流感病毒有著 明顯的免疫作用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
編號(hào)組別死亡率。Z治愈率o^有效率o^
A健康組097. 5(39/40)100.0(40/40)
B陰性對(duì)照組55,0(22/40)5.0(2/40)25.0(10/40)
C低劑量治療組22.5(9/40)42.5(17/40)77. 5(31/40)
D高劑量治療組10.0(4/40)62. 5(25/40)87.5(35/40)
E"雙黃連口服 液"治療組25.0(10/40)45.0(18/40)75.0(30/40)
結(jié)果表明，低劑量治療組、高劑量治療組與陰性對(duì)照組差異非常顯著(p
<0.01)，說(shuō)明本發(fā)明一種抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法 制備的產(chǎn)品對(duì)禽流感病毒具有顯著的治療作用；特別是高劑量治療組應(yīng)用明顯 優(yōu)于傳統(tǒng)"雙黃連口服液".治療組療效(P<0.01)。
抑菌實(shí)驗(yàn)
抑菌實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明所生產(chǎn)的產(chǎn)品微克分子濃度能殺死87%以上的革蘭 陽(yáng)性、革蘭陰性細(xì)菌和真菌。它的抗菌譜廣，能抑制葡萄球菌、溶血性鏈球菌、 大腸桿菌、產(chǎn)氣單胞菌、綠膿桿菌、巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、放線菌、分枝桿菌 等十余種近450株分離株，且實(shí)驗(yàn)中抑菌圈直徑在16mm以上的細(xì)菌在87%以 上。半成品和成品的檢驗(yàn)
半成品檢定半成品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌檢査、pH值等項(xiàng)檢測(cè)。 成品檢定成品分別作轉(zhuǎn)移因子和抗菌肽的鑒別試驗(yàn)、外觀檢測(cè)、pH值、
多肽含量、特異活性試驗(yàn)、蛋白質(zhì)反應(yīng)、無(wú)菌檢査、細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性等
項(xiàng)檢驗(yàn)。
實(shí)施例2:
一種抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，步驟-
(1) 免疫
用禽流感病毒H5N1血清亞型滅活疫苗lmL肌肉注射免疫10日齡實(shí)驗(yàn)雞， 同步設(shè)立空白對(duì)照組，在15日齡再以同批疫苗O. 3mL肌肉注射做為加強(qiáng)免疫;
(2) 密切監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達(dá)到高峰值時(shí)， 無(wú)菌采取抗凝血，用外周血制備淋巴細(xì)胞單層，步驟為-
無(wú)菌靜脈采取動(dòng)物全血20毫升，加1%肝素溶液0. 2ml抗凝，靜置60分 鐘，用帶膠球吸管吸取紅細(xì)胞層以上的所有血漿，特別是緊接紅細(xì)胞層上的白 細(xì)胞層要盡量吸取，分裝于消毒離心管內(nèi)，用PBS(pH為7. 2)液反復(fù)洗滌2次， 離心速度1200轉(zhuǎn)/分，然后用含30%犢牛血清水解乳蛋白40毫升進(jìn)行白細(xì)胞 培養(yǎng)，均勻混合后分裝于容量100毫升培養(yǎng)方瓶或磚瓶中，塞緊瓶塞，置37 'C恒溫箱中或磚瓶機(jī)中培養(yǎng)，經(jīng)2天，白細(xì)胞均勻貼壁，即制成淋巴細(xì)胞單層。
(3) 對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
在作傳代細(xì)胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，以確定細(xì)胞已長(zhǎng) 成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。
(4) 當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用植物血凝素誘導(dǎo)培養(yǎng)。 當(dāng)脾淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，更換維持液同時(shí)加入植物血凝素誘導(dǎo)培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)移因子濃度的測(cè)定、抗菌肽抑菌實(shí)驗(yàn)的方法、半成品和成品的檢驗(yàn)項(xiàng)目 均同實(shí)施例1。 抗菌肽抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果
抑菌實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明所生產(chǎn)的產(chǎn)品微克分子濃度能殺死8抓以上的革蘭 陽(yáng)性、革蘭陰性細(xì)菌和真菌。它的抗菌譜廣，能抑制葡萄球菌、溶血性鏈球菌、 大腸桿菌、產(chǎn)氣單胞菌、綠膿桿菌、巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、放線菌、分枝桿菌 等十余種近450株分離株，且實(shí)驗(yàn)中抑菌圈J:徑在16mm以上的細(xì)菌在84%以上。
實(shí)施例3
一種抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，由如下步驟組
成
(1) 用禽流感病毒H5N1血清亞型滅活疫苗0.5 mL肌肉注射免疫10日齡 實(shí)驗(yàn)雞，在15日齡時(shí)，再以同批疫苗0.3mL肌肉注射加強(qiáng)免疫；
(2) 密切監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達(dá)到高峰值時(shí)， 無(wú)菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟，用脾臟制備淋巴細(xì)胞單層；
(3) 對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
(4) 當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用植物血凝素誘導(dǎo)培養(yǎng)，即獲得禽流 感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。
實(shí)施例4
一種抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，由如下步驟組
成
(1) 用禽流感病毒H5N1血清亞型滅活疫苗0. 75 mL肌肉注射免疫10日 齡實(shí)驗(yàn)雞，在15日齡時(shí)，再以同批疫苗0.3mL肌肉注射加強(qiáng)免疫；
(2) 密切監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達(dá)到高峰值時(shí)， 無(wú)菌采取實(shí)驗(yàn)雞抗凝血，用外周血制備淋巴細(xì)胞單層；
(3) 對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
(4) 當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用植物血凝素誘導(dǎo)培養(yǎng)，即獲得禽流 感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。
8
權(quán)利要求
1.一種抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，其特征是由如下步驟組成(1)用禽流感病毒H5N1血清亞型滅活疫苗0.25-1mL肌肉注射免疫10日齡實(shí)驗(yàn)雞，在15日齡時(shí)，再以同批疫苗0.3mL肌肉注射加強(qiáng)免疫；(2)密切監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達(dá)到高峰值時(shí)，無(wú)菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟或抗凝血，用脾臟或外周血制備淋巴細(xì)胞單層；(3)對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(4)當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用植物血凝素誘導(dǎo)培養(yǎng)，即獲得抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽的制備方法，步驟為(1)用禽流感病毒免疫實(shí)驗(yàn)雞；(2)密切監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)疫苗免疫抗體水平，在抗體水平達(dá)到高峰值時(shí)，無(wú)菌采取實(shí)驗(yàn)雞脾臟或抗凝血，用脾臟或外周血制備淋巴細(xì)胞單層；(3)對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(4)當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用植物血凝素誘導(dǎo)培養(yǎng)，即獲得抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽。本發(fā)明的方法制備的抗禽流感病毒特異性轉(zhuǎn)移因子與抗菌肽無(wú)需進(jìn)一步的提純，可經(jīng)超聲波及凍融簡(jiǎn)單處理后直接將混合體用在禽類(lèi)體內(nèi)，即可起到抗禽流感病毒及抗菌的作用，提高禽類(lèi)的免疫力。
文檔編號(hào)C07K14/47GK101684142SQ20081015176
公開(kāi)日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者王連民, 田杏芳 申請(qǐng)人:天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司