專利名稱：乳酸桿菌外膜蛋白提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，具體的說是提供一種作為微生物添加劑的 乳酸桿菌外膜蛋白的提取方法。
背景技術(shù)：
藥物詞料添加劑的廣泛運(yùn)用，尤其是抗生素飼料添加劑的利用，在動(dòng) 物防病治病等方面發(fā)揮重要作用的同時(shí)，也給畜牧生產(chǎn)和人類帶來了一定 的副作用。首先是抗生素在殺滅致病菌的同時(shí)，也殺滅了對(duì)動(dòng)物機(jī)體的有 益菌，破壞腸道內(nèi)微生物的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致動(dòng)物，特別是幼畜禽對(duì)病原 微生物的易感性。另外，長(zhǎng)期飼喂抗生素會(huì)使動(dòng)物機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生具有耐藥性 的細(xì)菌，這些細(xì)菌對(duì)人畜均有害。為此，各國都在積極進(jìn)行各種新型抗生 素替代品的研究開發(fā)，其中微生態(tài)制劑已目前研究的主要熱點(diǎn)之一。
微生態(tài)飼料添加劑是根據(jù)微生態(tài)學(xué)理論研制的含有對(duì)動(dòng)物有益微生物 的活菌制劑，它們通過維持動(dòng)物腸道內(nèi)微生態(tài)平衡而發(fā)揮作用，具有促進(jìn) 動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力等多種功能，且無污染、無殘留、無 耐藥性和對(duì)環(huán)境無害等，是一類新型綠色環(huán)保飼料添加劑。這些禽畜用的 益生菌制劑含有芽孢桿菌，乳酸桿菌，糞鏈球菌，雙歧桿菌，酵母等，光 合細(xì)菌和梭狀芽胞桿菌屬的部分菌株及噬菌蛭弧菌等也偶然被用做益生菌 添加到仔豬和仔雞飼料中。
微生態(tài)制劑的作用機(jī)理 一般認(rèn)為微生態(tài)制劑對(duì)促進(jìn)畜禽健康的作用 機(jī)理包括以下幾個(gè)方面1.幫助寄主腸道有益菌群盡快達(dá)到或者維持其生態(tài)平衡；2.飽和腸粘膜的吸附位點(diǎn)，致使病原菌無法在腸粘膜上定植；3.發(fā) 酵碳水化合物，產(chǎn)生短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，降低腸道內(nèi)pH值，從而抑制 腸道內(nèi)發(fā)酵蛋白質(zhì)的菌群活性，控制其發(fā)酵速度；4.刺激寄主免疫細(xì)胞的 活性，提高免疫球蛋白的水平；5.刺激寄主產(chǎn)生多種消化酶，協(xié)同寄主增 加對(duì)維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。
活菌微生態(tài)制劑在動(dòng)物養(yǎng)殖中的作用活菌制劑始于上世紀(jì)初，有人用酸 牛奶來調(diào)整幼畜腹瀉出現(xiàn)的腸道微生物菌群失調(diào)。后來，在研究中人們發(fā) 現(xiàn)用活菌制劑可防止畜禽的腹瀉和腸炎，繼之又發(fā)現(xiàn)活菌制劑還可改善動(dòng) 物對(duì)詞料的利用，并有利于促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育和腸道健康，從而擴(kuò)大了 活菌制劑在畜牧生產(chǎn)中的作用和應(yīng)用前景，概括起來，主要有以下幾個(gè)方 面的作用。
改善動(dòng)物胃腸道微生態(tài)環(huán)境研究表明，動(dòng)物自身及許多致病菌不會(huì)產(chǎn)生 各種有毒物質(zhì)，如胺、氨、細(xì)菌毒素、氧自由基等代謝產(chǎn)物。有些有益菌 可以阻止毒性胺和氨的合成或把它們分解中和細(xì)菌毒素，從而避免這些有 害物質(zhì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體組織細(xì)胞的損害作用。 一些好氧菌則通過產(chǎn)生超氧化物 歧化酶來消除氧自由基，減少或消除氧自由基對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞器膜質(zhì)結(jié)構(gòu)的 損害。乳酸菌能夠產(chǎn)生有機(jī)酸和抗菌物質(zhì)，降低腸道內(nèi)pH值和氧化還原電 位，有利于宿主生長(zhǎng)發(fā)育和維持腸道健康。
產(chǎn)生有益物質(zhì)動(dòng)物微生態(tài)活菌制劑能夠在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生各種消化酶，合 成B族維生素、維生素K等動(dòng)物所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；同時(shí)能促使動(dòng)物體增 加對(duì)腸道內(nèi)容物中鈣、鎂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。
建立和維持腸道微生態(tài)平衡研究表明，動(dòng)物腸道內(nèi)寄居的微生物，主要 為厭氧菌。通常情況下，腸道內(nèi)有益菌和致病菌會(huì)保持一定比例，當(dāng)條件發(fā)生改變時(shí)，致病菌大量繁殖引起平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致動(dòng)物體患病。當(dāng)需 氧型益生菌進(jìn)入消化道后，生長(zhǎng)繁殖消耗腸道內(nèi)大量氧氣，通過"生物奪氧" 使需氧型致病菌大幅度下降，因而起到防止動(dòng)物患病的作用。研究還發(fā)現(xiàn)， 益生菌能夠有秩序地定植于粘膜、皮膚等表面或細(xì)胞之間形成生物屏障， 這些屏障可以阻止病原微生物的定植，起著占位、爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)?；ダ采?br> 拮抗作用，形成保護(hù)屏障，阻止病原菌的侵入，從而對(duì)致病菌的定植產(chǎn)生 抑制作用。
增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)微生態(tài)制劑可作為非特異性免疫調(diào)節(jié) 因子，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力和細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，刺激動(dòng)物產(chǎn)生干 擾素，從而增強(qiáng)抗病能力。據(jù)報(bào)道，用活菌微生態(tài)制劑——益生素飼喂哺
乳仔豬，添加組腹瀉率明顯比對(duì)照組減少(3.91%, P<0.01)，成活率提 高79%。在10 2S日齡的仔豬飼料中添加益生素，試驗(yàn)組采食量平均比對(duì) 照組增加70g/d，增重提高4.2%。又有研究報(bào)道，在雛雞中分別飼喂和不 飼喂乳酸桿菌制劑兩個(gè)組的基礎(chǔ)上，進(jìn)行雞的白痢沙門氏菌攻毒試驗(yàn)。結(jié) 果表明，飼喂乳酸桿菌雛雞組與對(duì)照組相比，死亡率明顯降低了20。^。還 有報(bào)道稱在魚蝦飼料中添加微生態(tài)制劑，可使魚蝦增重提高10% 20%。
在畜牧生產(chǎn)中常用的微生態(tài)添加劑，乳酸菌和芽胞桿菌類益生菌為主 要的微生態(tài)添加劑。細(xì)菌細(xì)胞膜中的一種重要組成成分外膜蛋白(outer membrane Protein, OMP)的免疫作用越來越受到科技人員的關(guān)注，并進(jìn)行了 研究。實(shí)驗(yàn)證明，OMP具有良好的免疫原性，不僅可刺激體液免疫，而且 也可刺激細(xì)胞免疫作用。OMP有多種提取方法，張曉華等認(rèn)為不同研究者 得到的同一種細(xì)菌OMP的SDS-PAGE圖譜之所以有所不同，與細(xì)菌的培養(yǎng) 條件、OMP的制備方法以及菌株的不同有關(guān)。不同研究者制備的OMP其 免疫效果也不同。本試驗(yàn)采用高壓細(xì)胞破碎機(jī)破壁、粗提、SDS沉淀、SDS和HEPES再次沉淀、超濾純化提取的乳酸桿菌菌株OMP。
益生菌膜蛋白的提取方法有多種，在水提醇沉的基礎(chǔ)上，常采用反復(fù) 凍融、酶解、超聲波、膜處理等方法進(jìn)行輔助提取或精制。但這些方法均 有一些不足之處反復(fù)凍融的缺點(diǎn)在于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且細(xì)胞破裂率低，有效
利用低，不易純化；超聲波提取膜蛋白的優(yōu)勢(shì)是提取時(shí)間短，勿須加熱， 提取量多。但是，浸提物在長(zhǎng)時(shí)間破壁會(huì)發(fā)生變化，生物活性降低，有效 破壁率低，提取量有限不利于工業(yè)化生產(chǎn)；酶解法提取缺點(diǎn)在于必須要有 合適的pH、溫度，有效破比率低，提取量有限不利于工業(yè)化生產(chǎn)；超濾膜 技術(shù)應(yīng)用的缺點(diǎn)是必須知道目的膜蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量才能選取有效超濾 膜，否則須預(yù)選確定選膜，單采用一種膜分離效果有限。超濾與微濾、納 濾、反滲透及電滲析等多種性能的膜技術(shù)進(jìn)一步聯(lián)用，取代能耗大、費(fèi)用 高、周期長(zhǎng)且處理不徹底的傳統(tǒng)工藝操作，將是多糖提取工藝發(fā)展的新趨 勢(shì)；離子交換技術(shù)缺點(diǎn)在于根據(jù)膜蛋白特性選擇不同的柱型、洗脫劑種類、 pH值和洗脫速率，同樣提取量有限不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
因此，為了在最大限度保持蛋白活性的基礎(chǔ)上提取乳酸桿菌外膜蛋白， 使多糖的生物學(xué)功能研究更為準(zhǔn)確，同時(shí)為了適用于工業(yè)化生產(chǎn)的需求， 需要一種簡(jiǎn)單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、高效的乳酸桿菌外膜蛋白的提取方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)發(fā)明目的是提供一種乳酸桿菌外膜蛋白的提取方法，包
括
(1) 利用高壓細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行乳酸桿菌細(xì)胞的破壁；
(2) 粗提物進(jìn)行6000rpm， 15min離心，取上清液；(3) 在上清中加2%十二烷酰肌氨酸鈉溶液充分混勻，室溫作用lh， 于4°C 10000r/min超速離心lh;
(4) 將沉淀用10mmoL/LHEPES和等量2X十二烷酰肌氨酸鈉溶解， 室溫作用2h，于4。C10000r/min超速離心lh，將沉淀適量的溶于10mmoL/L HEPES(pH7.4)中。
(5) 經(jīng)過超濾處理后，分裝。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的高壓細(xì)胞破碎機(jī)的工作參數(shù)，優(yōu)選 1000bar、 50Hz。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的超濾，優(yōu)選使用0.45pm的微孔濾膜 或截留分子量為6400道爾頓的超濾膜(層析柱等)。
有益效果
1、 高壓細(xì)胞破碎機(jī)提取時(shí)間短，勿須加熱，破碎機(jī)破壁效果好，破壁 率高，因此能獲得較多的膜蛋白粗提物；
2、 高壓細(xì)胞破碎機(jī)提取過程是一個(gè)物理過程，浸提過程中無化學(xué)反應(yīng)， 浸提物在短時(shí)間內(nèi)保持不變，生物活性不減，同時(shí)提高了破碎速度，縮 短了破碎時(shí)間，可極大地提高提取效率；
3、 經(jīng)過幾次離心后去除大量破壁后的細(xì)胞碎片及一些雜蛋白，再經(jīng)過 超濾后達(dá)到了有粗提到精提的效果；
4、 經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所得的乳酸桿菌外膜蛋白產(chǎn)量為0.5kg/L，活性為 2xlOS活性單位/mg，完全滿足生產(chǎn)需要。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
7實(shí)施例l:乳酸桿菌外膜蛋白的提取
實(shí)施方案將乳酸桿菌及培養(yǎng)大量后，先用高壓細(xì)胞破碎機(jī)破壁，將粗
提物進(jìn)行6000rpm, 15min離心，取上清液，在上清中加2%十二垸酰肌氨 酸鈉溶液充分混勻，室溫作用lh，于4。C10000r/min超速離心lh，將沉淀 用10mmoL/L HEPES和等量2X十二烷酰肌氨酸鈉溶解，室溫作用2h，于 4°C10000r/min超速離心lh，將沉淀適量的溶于10mmoL/L HEPES(pH7.4)
中，經(jīng)過超濾處理后，分裝。
實(shí)施例2:外膜蛋白的產(chǎn)量和活性鑒定
根據(jù)實(shí)施例l的方法，利用紫外分光光度法測(cè)外膜蛋白含量，每2L菌 液，最終能得到lkg外膜蛋白。
另外，根據(jù)MTT法活性測(cè)定的方法，鑒定外膜蛋白或含有外膜蛋白的 微生物添加劑的活性，操作步驟如下
1、 接種細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血 清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103-104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔體積20(^1。
2、 培養(yǎng)細(xì)胞將培養(yǎng)板移入C02培養(yǎng)箱中，在37X:、 5。/。C02及飽和 濕度條件下，培養(yǎng)3-5天。培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟆?br> 3、 呈色培養(yǎng)第3-5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20pl， 37°C， 繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液上清。每孔加入150plDMSO
(二甲基亞砜)，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。
4、 比色選擇490nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定個(gè)孔吸收值，記錄結(jié)果。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)外膜蛋白原液的活性為2xl08活性單位/mg;含有外膜蛋白
的微生物添加劑溶液4xl0S活性單位/mg，完全能滿足生產(chǎn)需要。
權(quán)利要求
1、一種用于乳酸桿菌外膜蛋白的提取方法，包括(1)利用高壓細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行乳酸桿菌細(xì)胞的破壁；(2)粗提物進(jìn)行6000rpm，15min離心，3次，取上清液；(3)在上清中加2％十二烷酰肌氨酸鈉溶液充分混勻，室溫作用1h，于4℃10000r/min超速離心1h；(4)將沉淀用10mmoL/LHEPES和等量2％十二烷酰肌氨酸鈉溶解，室溫作用2h，于4℃10000r/min超速離心1h，將沉淀適量的溶于10mmoL/LHEPES(pH7.4)中。(5)經(jīng)過超濾處理后，分裝。
2、 權(quán)利要求1的方法，其中所述的高壓細(xì)胞破碎機(jī)的工作參數(shù)，優(yōu)選1000bar、 50Hz。
3、 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的超濾，優(yōu)選使用0.45pm的微孔濾膜或截留分子量為6400道爾頓的超濾膜(層析柱等)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種作為微生物添加劑的乳酸桿菌外膜蛋白的提取方法，包括高壓細(xì)胞破碎機(jī)破壁、粗提、SDS沉淀、SDS和HEPES再次沉淀、超濾純化。其中，所述的高壓細(xì)胞破碎機(jī)的工作參數(shù)，優(yōu)選1000bar、50Hz，破碎2次，超濾優(yōu)選使用0.45μm的微孔濾膜或截留分子量為6400道爾頓的超濾膜(層析柱等)。本發(fā)明方法去除大量破壁后的細(xì)胞碎片及一些雜蛋白，再經(jīng)過超濾后達(dá)到了有粗提到精提的效果，并且，浸提物在短時(shí)間內(nèi)保持不變，生物活性不減，同時(shí)提高了破碎速度，縮短了破碎時(shí)間，可極大地提高提取效率，能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。
文檔編號(hào)C07K1/34GK101475625SQ20081015399
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者李旭東, 王小娥, 蘇建東 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司