專(zhuān)利名稱(chēng)：抗膀胱癌靶向超抗原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于膀胱灌注的抗膀胱癌靶向超抗原及其制備方法。
背景技術(shù)：
膀胱癌發(fā)病率位居我國(guó)泌尿生殖系惡性腫瘤第一位，且呈逐年上升趨勢(shì)。膀朧癌中 超過(guò)卯。/。是移行細(xì)胞癌(transitional cell carcinoma,TCC)，而其中約75 85%為局限在粘 膜層和固有層的淺表性膀胱癌(superficial bladder cancer,SBC)。對(duì)SBC患者可采用經(jīng) TURBT和膀朧部分切除術(shù)；但術(shù)后10%-67%的患者在12個(gè)月內(nèi)，24%-84%的患者在5 年內(nèi)復(fù)發(fā)甚至進(jìn)展。因此術(shù)后膀胱灌注化療或免疫治療是SBC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。
然而膀胱灌注化療不同于系統(tǒng)化療，藥物的療效不是與藥物劑量而是與局部藥物的 濃度成正比，同時(shí)還依賴(lài)于藥物與膀胱壁的接觸時(shí)間、灌注藥物的最佳pH值等因素。由 于大部分化療藥物可溶性差，易在灌注后第一次排尿時(shí)排出；同時(shí)不少藥物刺激性較大， 膀胱灌注可引起局部粘膜糜爛、尿道損傷引發(fā)尿道狹窄等，因而目前應(yīng)用的藥物不是療 效較差,就是副作用太大,使得標(biāo)準(zhǔn)方案并不能按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。
BCG (減毒牛型結(jié)核分支桿菌疫苗)膀胱灌注免疫治療是另一標(biāo)準(zhǔn)方案,作為一種 外源性的免疫刺激劑，通過(guò)誘導(dǎo)極強(qiáng)的非特異性免疫反應(yīng)來(lái)發(fā)揮機(jī)體本身的抗腫瘤效 應(yīng)。但BCG既然是活疫苗,就仍有一定致病力，在術(shù)后膀胱黏膜未痊愈時(shí)更是如此，可 出現(xiàn)包括各器官、系統(tǒng)分支桿菌感染以及多種變應(yīng)性疾病在內(nèi)的多種嚴(yán)重并發(fā)癥。改良 使用減毒株或其胞壁成分雖可減少但并不能從根本上改變BCG的毒副作用。
超抗原(Superantigen，下稱(chēng)SAg)是一類(lèi)由細(xì)菌外毒素和逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白構(gòu)成的抗原 性物質(zhì)，它不需要抗原提呈細(xì)胞加工處理,以完整的蛋白質(zhì)分子形式直接與胞膜MHCII類(lèi) 分子抗原結(jié)合槽外側(cè)結(jié)合，導(dǎo)致帶有特異性V卩節(jié)段T細(xì)胞大量活化增殖，并使之釋放多 種細(xì)胞因子，通過(guò)以下兩種途徑對(duì)腫瘤產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷作用
①SAg依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(superantigen dependent cell mediated cyto-toxicity ，下稱(chēng)SDCC): SAg激活CD8+殺傷力很強(qiáng)的抑制T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (cytotoxic or suppressor T lymphocytes ，CTL)和CD4+輔助性(helper)T細(xì)胞，直接或間接地殺傷表達(dá)MHCn類(lèi)分子的腫瘤細(xì)胞。
②細(xì)胞因子參與的抑瘤作用被激活的T細(xì)胞所釋放多種細(xì)胞因子非特異地直接 或間接殺傷腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子-a (TNF- a )、白細(xì)胞介素 -2(IL-2)、干擾素-Y(IFN-Y)等。與BCG相比較，其抗瘤作用類(lèi)似，但激活的T細(xì)胞范 圍更廣，釋放的細(xì)胞因子更多，因而抗瘤作用更為強(qiáng)大，在抗膀胱癌的體內(nèi)外研究中效果 顯著。
然而，單純使用SAg灌注治療膀胱癌雖然避免了全身應(yīng)用SAg可能導(dǎo)致的免疫紊 亂等毒副作用，但仍存在著抗瘤譜窄(MHCir腫瘤細(xì)胞的低殺傷性等)和靶向性差(同 時(shí)殺傷MHCn+的正常細(xì)胞等)的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前膀胱癌灌注治療效果差、毒副作用大或抗瘤普窄、特異性弱等缺點(diǎn)， 提供一種簡(jiǎn)單、高效的應(yīng)用于膀胱灌注的抗膀胱癌耙向超抗原及其制備方法。
本發(fā)明抗膀胱癌靶向超抗原包含由耙向部分和超抗原部分，二者之間以化學(xué)連接劑 連接，所說(shuō)的靶向部分為可與膀胱癌細(xì)胞特異性結(jié)合的抗膀胱癌單克隆抗體BDI-1片 段，所說(shuō)的超抗原部分為金黃色葡萄球菌的腸毒素A,所說(shuō)的連接劑為3-(2-吡啶二巰基) 丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(下稱(chēng)SPDP)，其結(jié)構(gòu)通式如下
(BDI-lFab-NHOCCH2 CH2 SSCH2 CH2 CONH)n-SEA，
其中n《7的整數(shù)，優(yōu)選為4或5。
本發(fā)明抗膀胱癌靶向超抗原包含了單克隆抗體(McAb)耙向的SAg, McAb不僅 能有效地將T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子靶向腫瘤細(xì)胞，從而大大降低了對(duì)MHCn陽(yáng)性 正常細(xì)胞的殺傷，同時(shí)還起到了類(lèi)似于MHCn的抗原遞呈作用，SDCC對(duì)表達(dá)McAb 靶向相關(guān)抗原的MHCn'腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用。而由重鏈VH、 CHl及完整輕鏈構(gòu)成 的McAbFab段既保持了 McAb的靶向性，又避免McAbFc段與非癌組織的非特異性結(jié) 合，同時(shí)穿透性更好，與SAg聯(lián)合可更好的發(fā)揮靶向抗腫瘤效應(yīng)。
本發(fā)明提供該抗膀胱癌靶向超抗原制備方法，包括以下步驟
(1) 抗膀胱癌單克隆抗體BDI-lFab段的制備及純化
BDI-1加木瓜蛋白酶和(3-巰基乙醇，反應(yīng)得Fab,用磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline,下稱(chēng)PBS)透析后上蛋白G柱純化，收集流出峰，超濾離心濃縮，加 雙蒸水和1M Bacine， PH為9.0,得PH8.5含BDI-lFab的Bacine混合體系備用；
(2) 用化學(xué)連接劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP )制備BDI-lFab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原
將腸毒素A (SEA)和步驟(1)所得Bacine混合液分別以6、 IO倍過(guò)量的摩爾比 加入連接劑SPDP，反應(yīng)得SEA-PDP和Fab-PDP，分別離心取上清，加醋酸鈉緩沖液超 濾濃縮3次；SEA-PDP中加入1M的二硫代蘇糖醇(DTT)反應(yīng)得SEA-SH,離心，上 清加醋酸鈉緩沖液，超濾濃縮3次后，加入5倍摩爾過(guò)量的Fab-PDP，混合，4'C搖床 偶聯(lián)過(guò)夜，得含有BDI-lFab-SEA的混合物；
(3)抗膀胱癌靶向超抗原的純化
步驟(2)所得偶聯(lián)混合物，離心，取上清，過(guò)suiperdex-200柱，以蛋白質(zhì)液相層 析系統(tǒng)(High performance Liquid Chromatography,下稱(chēng)HPLC)純化并收集產(chǎn)物。
綜上所述，本發(fā)明將靶向超抗原抗腫瘤模式引入到膀胱癌的治療領(lǐng)域，抗膀胱癌靶 向超抗原既保留了 BDI-lFab對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的靶向性，又保持了 SEA強(qiáng)大的活化T淋 巴細(xì)胞殺傷膀胱腫瘤細(xì)胞作用，克服了單純SAg治療膀胱癌抗瘤普窄、特異性差的缺點(diǎn)； 沿用我們以往的局部運(yùn)用SAg抗腫瘤戰(zhàn)略，將抗膀胱癌靶向超抗原應(yīng)用于膀胱灌注治 療，避免全身應(yīng)用可能引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂及毒素中毒綜合征等毒副作用，具有 低毒、安全性；與全身應(yīng)用耙向超抗原抗腫瘤戰(zhàn)略不同，本膀胱灌注的抗膀胱癌靶向超 抗原可直接使用鼠源單克隆抗體而不必用基因工程技術(shù)將其人源化。本發(fā)明采用化學(xué)偶 聯(lián)法制備Fab-SEA，簡(jiǎn)化了制備工藝，便于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，有望發(fā)展成為簡(jiǎn)單、高效、安 全的抗膀胱癌免疫灌注治療的靶向藥物。


圖1是抗膀胱癌靶向超抗原的制備與純化色譜圖，其中A為BDI-1酶切所得Fab 純化色譜圖，B為SEA洗脫色譜圖C為制備的抗膀胱癌靶向的超抗原純化色譜圖。
圖2為抗膀胱癌靶向超抗原SDS-PAGE分析圖譜，其中A為純化前樣品電泳圖；B 為抗膀胱癌靶向超抗原純化后的第一峰樣品電泳圖。
圖3為免疫組化法鑒定抗膀胱癌靶向超抗原的抗膀胱癌抗體靶向活性，其中A為以 膀胱癌細(xì)胞為抗原片、抗膀胱癌靶向超抗原為一抗實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性結(jié)果；其中，B、 C為以 SEA、 PBS代替抗膀胱癌靶向超抗原為一抗的對(duì)照組陰性結(jié)果；D為以結(jié)腸癌細(xì)胞代 替膀胱癌細(xì)胞為抗原片的對(duì)照組陰性結(jié)果。
圖4為抗膀胱癌靶向超抗原促T淋巴細(xì)胞增殖活性的鑒定。
圖5為抗膀胱癌靶向超抗原誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、 TNF-a、 IFN-y活性鑒定。圖6(A)為抗膀胱癌靶向超抗原、SEA活化PBMC對(duì)BIU-87細(xì)胞株體外增殖抑制作 用比較；圖6(B)為抗膀胱癌靶向超抗原、SEA活化PBMC對(duì)LOVO細(xì)胞株體外增殖抑 制作用比較；圖6(C)為SEA活化PBMC對(duì)BIU-87、 LOVO細(xì)胞株體外增殖抑制作用比 較。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明抗膀胱癌靶向超抗原的制備過(guò)程 一、 實(shí)驗(yàn)需用材料的準(zhǔn)備 1.試劑的準(zhǔn)備
① SEA凍干粉劑lmg/瓶購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；
② 人膀胱癌單克隆抗體BDI-1， lmg/ml購(gòu)自杭州九源基因工程有限公司；
③ 木瓜蛋白酶(2mg/ml， 24units/mg)、 二硫代蘇糖醇(DTT)、 SPDP (4mg/ml)、 SEA 單抗均為Sigma公司產(chǎn)品；
④ 蛋白G柱(protein G HP lml)以及surperdex-200:購(gòu)自Pharmacia公司；
⑤ BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KeyGen公司；CCK-8試劑盒Dojindo公司產(chǎn)品。
Protein Ladder: Fermentas公司產(chǎn)品；
⑦抗兔二抗、DAB顯色試劑盒北京中杉金橋公司產(chǎn)品；
⑥ 人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD公司；
⑨ RPMI1640: GIBCO公司產(chǎn)品；
⑩ 胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司； 2.細(xì)胞及處理
① 人膀胱癌移行細(xì)胞株BIU-87、人大腸腺癌細(xì)胞株Lovo:購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì) 胞庫(kù)，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、37'C恒溫、5%(:02飽和濕度環(huán)境傳代 培養(yǎng)，每2 3天換液l次；
② 健康成人新鮮肝素抗凝外周血購(gòu)自江蘇省血液中心。
實(shí)施例1 BDI-lFab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原的制備 制備步驟
1.單抗BDI-lFab段的制備與純化10ml的BDI-1與50ul的木瓜蛋白酶，加(3-巰基乙醇至終濃度20u M， 37'C下反 應(yīng)3h得Fab， PBS透析過(guò)夜；透析后的樣品上蛋白G柱純化，PBS洗柱并收集流出峰； 15ml超濾離心管(孔徑80000D) 2000G離心lh濃縮；力n 500 u I雙蒸水、50 u 1 Bacine (1M， pH9.0)，得lml0.1MpH8.5的Bacine體系備用。
本步驟中，BDI經(jīng)木瓜蛋白酶切、proteinG層析后獲得了純化的Fab段產(chǎn)物。
2. 用化學(xué)連接劑SPDP制備BDI-lFab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原
取0.24mg SEA溶于400 u 1 PBS，取lml上述Bacine，分別過(guò)surperdex- 200以HPLC 確認(rèn)其出峰時(shí)間；再各加入10nl和30iUSPDP (摩爾比分別為6、 IO倍過(guò)量)常溫反 應(yīng)30min得SEA-PDP、 Fab-PDP， 10000rpm離心5min，取上清加醋酸鈉緩沖液超濾濃 縮3次；取400 u 1 SEA-PDP加入1M的DTT20 ti 1常溫反應(yīng)30min得SEA-SH， 10000rpm 離心5min;上清加醋酸鈉緩沖液超濾濃縮3次后取400ul SEA-SH加600 U 1Fab-PDP (抗 體5倍過(guò)量)，4"C搖床偶聯(lián)過(guò)夜。
本步驟中，獲得了尚未純化的目的產(chǎn)物，并確定了 SEA、 Fab經(jīng)Sephadex G-200洗 脫后各自的出峰時(shí)間圖1A.是Fab段Sephadex G-200洗脫色譜圖，出峰時(shí)間在27.5min 左右；B.是SEA經(jīng)Sephadex G-200洗脫色譜圖，出峰時(shí)間在30min左右。
3. 抗膀胱癌靶向超抗原的純化
取偶聯(lián)過(guò)夜所得混合物，10000rpm離心取上清，過(guò)surperdex-200以HPLC收集16 27min的第一峰產(chǎn)物以及27min以后的二、三峰產(chǎn)物。
本步驟中，獲得了純化的抗膀胱癌耙向超抗原產(chǎn)物圖1C.是抗膀胱癌靶向超抗原 純化色譜圖，由于在Fab、 SEA出峰前即出現(xiàn)收集峰，提示制備成功；根據(jù)Fab、 SEA 的出峰時(shí)間，在兩者出峰前收集所得產(chǎn)物即為純化的目的產(chǎn)物。
實(shí)施例2蛋白質(zhì)液相層析系統(tǒng)的各收集峰分子量和純度的鑒定 采用8%濃度的凝膠，SDS-PAGE不連續(xù)系統(tǒng)，考馬斯亮蘭染色，以SEA、 Fab標(biāo) 準(zhǔn)蛋白對(duì)照，鑒定各收集峰蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和純度見(jiàn)圖2。
如圖2中，A是純化前樣品電泳圖Lanel為Marker,最大分子量96kd; Lane2 為抗膀胱癌靶向超抗原純化前樣品；Lane3為SEA標(biāo)準(zhǔn)品，分子量28kd左右；Lane4 為Fab標(biāo)準(zhǔn)品，分子量50kd左右。結(jié)果顯示純化前樣品除SEA、 Fab外還包括更大 分子量的蛋白，再次提示制備成功。.B.是純化后的第一峰樣品電泳圖Lanel為Marker, 最大分子量250kd; Lane2為第一峰樣品，平均分子量250kd左右；Lane3為Fab標(biāo)準(zhǔn)品參照，分子量50kd。顯示目的產(chǎn)物得到了有效的純化。
按BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，20u 1樣品測(cè)得562nm吸 光值為0.191 ±0.001，故純化后樣品蛋白濃度約為0.18ixg/nl;經(jīng)計(jì)算吸光值推算Fab: SEA摩爾比為4 5:1，以SEA摩爾濃度進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例3抗膀胱癌耙向超抗原靶向活性鑒定
膀胱癌細(xì)胞株BIU-87爬片作為抗原片，一抗用尿液稀釋的抗膀胱癌靶向超抗原樣 品，二抗用抗SEA兔McAb，三抗用非生物素化的兔二抗，DAB顯色；分別以L(fǎng)ovo細(xì) 胞爬片代替抗原片，SEA、 PBS代替一抗作為對(duì)照。
制得的抗膀胱癌靶向超抗原經(jīng)尿液稀釋后仍錨鑿于膀胱腫瘤細(xì)胞表面，如圖3A， 以抗膀胱癌耙向超抗原為一抗，BIU-87細(xì)胞的胞膜多可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性染色(400);如圖 3B、 C， PBS代替一抗對(duì)照組胞膜未見(jiàn)陽(yáng)性染色(x400);如圖3D;以L(fǎng)ovo細(xì)胞爬片代 替抗原片對(duì)照組胞膜未見(jiàn)陽(yáng)性染色(x400)。提示抗膀胱癌靶向超抗原即便在尿液中依然 保留了 BDI-lFab段的抗體靶向活性。
實(shí)施例4 抗膀胱癌靶向超抗原體外促外周血單個(gè)核細(xì)胞(Periphera blood mononuclear cell, PBMC)增殖活性鑒定
Ficoll密度梯度離心法分離健康成年男性PBMC;以2xl0V孔接種PBMC于96孔 培養(yǎng)板，分別加入倍比稀釋的SEA及同摩爾濃度的抗膀胱癌耙向超抗原，終體積IOOW， 以含10%胎牛血清的RPMI1640全培養(yǎng)液及植物血凝素(201^g/ml)作為陰性及陽(yáng)性對(duì) 照；各組均設(shè)6個(gè)平行孑L，培養(yǎng)72h后每孔加10ulCCK-8,孵育4h后上酶標(biāo)儀測(cè)OD450nm， 計(jì)算細(xì)胞增殖活性，以增殖指數(shù)(Prolifemtion Index, PI)表示，PI二實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照 組OD值。
如圖4顯示了抗膀胱癌靶向超抗原、SEA促PBMC增殖活性對(duì)比，從總體上看， 抗膀胱癌靶向超抗原對(duì)PMBC的促增殖作用隨濃度的增高而增強(qiáng)，以36nM濃度組為最， 并與360nM、 3.6nM濃度組無(wú)顯著差異(P》0.05);同摩爾濃度下，其促增殖作用雖較 SEA組略低，但在多數(shù)濃度組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P^0.05)，提示抗膀胱癌靶向超抗原 依然保留了 SEA強(qiáng)大的促T細(xì)胞增殖作用。
實(shí)施例5抗膀胱癌靶向超抗原誘導(dǎo)PBMC分泌IL-2、 TNF-a、 IFN々活性鑒定 鑒于Q.0036 0.36nM水平SEA與抗膀胱癌靶向超抗原促PBMC增殖效應(yīng)存在差異性，選擇0.036nM作為刺激濃度，比較同摩爾濃度SEA及抗膀胱癌靶向超抗原刺激后， PBMC培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平。lxl0V瓶接種PBMC細(xì)胞于25cm2的培養(yǎng)瓶，，加入終 濃度為0.0036nM的SEA及抗膀胱癌靶向超抗原，終體積5ml,以含10%胎牛血清的 RPMI1640全培養(yǎng)液作為對(duì)照，培養(yǎng)72h后離心取上清，按ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行， 酶標(biāo)儀測(cè)OD450nm，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后求出待測(cè)樣品值。重復(fù)三次，以均值代表測(cè)定結(jié) 果。
EUSA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，圖5表示抗膀胱癌靶向超抗原、SEA誘導(dǎo)PBMC分泌細(xì)胞因 子的活性對(duì)比抗膀胱癌靶向超抗原組IL-2、 TNF-a、 IFN-Y均高于陰性對(duì)照(P<0.05)， 但與SEA組差異無(wú)顯著性(P》0.05)。顯示抗膀胱癌靶向超抗原有效誘導(dǎo)PBMC分泌IL-2、 TNF-ct、 IFN-y;提示抗膀胱癌靶向超抗原完整保留了SEA誘導(dǎo)PBMC分泌細(xì)胞因子的作 用。
實(shí)施例6抗膀胱癌靶向超抗原、SEA活化PBMC對(duì)BIU-87、 Lovo體外增值抑制 作用檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、抗膀胱癌靶向超抗原及SEA實(shí)驗(yàn)組；以PBMC為效應(yīng)細(xì)胞，BIU-87、 Lovo為耙細(xì)胞。3X 103/扎接種BIU-87、 Lovo于96孔培養(yǎng)板A，終體積100ul;以10:1、 20:1、 40:1的效耙比接種PBMC于96孔培養(yǎng)板B,并分別給予0.036 3.6nM的SEA及 抗膀胱癌靶向超抗原，終體積100ul;每組設(shè)6個(gè)平行孔,并設(shè)單獨(dú)BIU-87、 Lovo對(duì)照 孔(T)和單獨(dú)PBMC對(duì)照孔(E)，刺激48h;經(jīng)6h腫瘤細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液A、 B板混合 再培養(yǎng)24h， CCK-8法測(cè)OD450nm，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(抑制率=
/OD(T) X 100%)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨濃度及效靶比的增加抗膀胱癌靶向超抗原對(duì)兩株細(xì)胞的增殖抑制 作用均逐漸增強(qiáng)；同摩爾濃度、效靶比下抗膀胱癌靶向超抗原對(duì)BIU-87細(xì)胞株的抑制 作用顯著高于相應(yīng)對(duì)照組及SEA組(P<0.05);對(duì)Lovo細(xì)胞的抑制作用雖顯著髙于對(duì) 照組，但與SEA組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P》0.05);同濃度、效靶比下，SEA介導(dǎo)的PBMC 對(duì)BIU-87、 Lovo體外增值抑制作用差異無(wú)顯著性(P》0.05)(圖6 A、 B、 C)。提示抗 膀胱癌靶向超抗原能顯著增強(qiáng)對(duì)其靶向的MHCn'膀胱腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，而對(duì)其非 耙向的MHCn'的其他細(xì)胞則無(wú)增強(qiáng)作用。
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權(quán)利要求
1. 抗膀胱癌靶向超抗原，其特征是包含由靶向部分和超抗原部分，二者之間以化學(xué)連接劑連接，所說(shuō)的靶向部分為可與膀胱癌細(xì)胞特異性結(jié)合的抗膀胱癌單克隆抗體BDI-1片段，所說(shuō)的超抗原部分為金黃色葡萄球菌的腸毒素A，所說(shuō)的連接劑為3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯SPDP，其結(jié)構(gòu)通式如下(BDI-1Fab-NHOCCH2CH2SSCH2CH2CONH)n-SEA，其中n≤7的整數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗膀胱癌靶向超抗原，其特征是n為4 5。
3. —種權(quán)利要求1所述的抗膀胱癌靶向超抗原的制備方法，其特征是按如下步驟(1) 抗膀胱癌單克隆抗體BDI-IFab段的制備及純化抗膀胱癌單克隆抗體BDI-1加木瓜蛋白酶和p-巰基乙醇，反應(yīng)得Fab，用PBS透 析后上蛋白G柱純化，收集流出峰,超濾離心濃縮，加雙蒸水和IMBacine, PH為9.0， 得PH8.5含BDI-lFab的Bacine混合體系備用；(2) 用化學(xué)連接劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯制備BDI-lFab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原將腸毒素A和步驟(1)所得Bacine混合液分別以6、 10倍過(guò)量的摩爾比加入連接 劑SPDP，反應(yīng)得SEA-PDP和Fab-PDP，分別離心取上清，加醋酸鈉緩沖液超濾濃縮3 次；SEA-PDP中加入1M的二硫代蘇糖醇反應(yīng)得SEA-SH，離心，上清加醋酸鈉緩沖液， 超濾濃縮3次后，加入5倍過(guò)量的Fab-PDP，混合，(C搖床偶聯(lián)過(guò)夜，得含有 BDI-lFab-SEA的混合物；(3)抗膀胱癌靶向超抗原的純化步驟(2)所得偶聯(lián)混合物，離心，取上清，過(guò)surperdex-200柱，以HPLC純化并收集產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗膀胱癌靶向超抗原，包含靶向部分和超抗原部分，靶向部分為可與膀胱癌細(xì)胞特異性結(jié)合的抗膀胱癌單克隆抗體BDI-1片段，超抗原部分為金黃色葡萄球菌的腸毒素A(SEA)，二者以化學(xué)連接劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯連接而成如下通式(BDI-1Fab-NHOCCH₂CH₂SSCH₂CH₂CONH)_n-SEA，n≤7。本靶向超抗原既保留了BDI-1Fab對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞的靶向性，又保持了SEA強(qiáng)大的活化T淋巴細(xì)胞殺傷膀胱腫瘤細(xì)胞作用，將其應(yīng)用于膀胱灌注治療，療效顯著，且低毒、安全。本發(fā)明采用化學(xué)偶聯(lián)法制備Fab-SEA，簡(jiǎn)化了制備工藝，便于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101429252SQ20081015626
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日
發(fā)明者震 貢, 林 郝, 韓從輝 申請(qǐng)人:徐州市中心醫(yī)院