專利名稱：一種提取和純化蟲草素的方法以及制備蟲草素干粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域，涉及藥用天然化合物的提取、分離、 純化，更具體地講，本發(fā)明涉及一種從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取 和純化蟲草素的方法以及制備蟲草素干粉的方法。
背景技術(shù)：
蟲草素(3'-脫氧腺苷)是蛹蟲草中的主要活性成分之一，是一 種具有多種生理活性的核苷類物質(zhì)，對(duì)多聚腺苷酸聚合酶有很強(qiáng)的抑 制作用，具有修復(fù)細(xì)胞、保護(hù)生命體遺傳密碼的特殊功效，并有抑菌 作用、抗腫瘤作用、防止心腦血管疾病等多種功效。在20世紀(jì)70年 代蟲草素就被發(fā)現(xiàn)有抑制腫瘤、抗瘧原蟲和抑制mRNA翻譯的作用； 九十年代研究發(fā)現(xiàn)，添加腺苷脫氨酶抑制劑對(duì)其抗腫瘤活性的表達(dá)起 著重要作用，蟲草素的研究從而獲得突破性進(jìn)展；美國(guó)1997年開始 將蟲草素用于一期臨床實(shí)驗(yàn)，治療急性前B和前T淋巴細(xì)胞白血病 患者；蟲草素還表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗真菌、抗HIV-I型病毒和選擇性抑 制梭菌屬細(xì)菌活性。蟲草素能干擾細(xì)胞RNA和DNA的合成，抑制不 正常細(xì)胞(癌細(xì)胞)的分裂，并能作為區(qū)別細(xì)胞中不同的RNA聚合酶 的工具，具有修復(fù)基因、保護(hù)生命體遺傳密碼的特殊功效，現(xiàn)在蟲草 素在美國(guó)作為抗癌、抗病毒新藥，已經(jīng)進(jìn)入三期臨床。因?yàn)槠涔πл^ 突出，市場(chǎng)對(duì)其需求旺盛，目前其價(jià)格相當(dāng)昂貴，達(dá)每克數(shù)萬元。綜合分析國(guó)內(nèi)外公開的專利和文獻(xiàn)可知，目前獲得蟲草素的主要方法 有有機(jī)合成，從人工培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體中提取，從人工液態(tài)培養(yǎng) 的冬蟲夏草或蛹蟲草菌絲體中提取，從子實(shí)體采收后長(zhǎng)滿菌絲體的蛹 蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取等；蟲草素提取的方法主要有水浸法、醇
提法、超臨界C02萃取法等；蟲草素純化技術(shù)主要有離子交換樹脂吸 附、氧化鋁層析、硅膠層析、大孔樹脂吸附等。
利用微波福射能來提高天然物質(zhì)的提取提率是一種新發(fā)展起來的 新技術(shù)，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、適用范圍廣、提取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省 時(shí)間、節(jié)省試劑、污染小等特點(diǎn)。目前，除主要用于環(huán)境樣品預(yù)處理 外，還用于生化、食品、工業(yè)分析和天然產(chǎn)物提取等領(lǐng)域。但在國(guó)內(nèi)， 微波提取技術(shù)用于天然藥物提取的研究報(bào)道還比較少。微波法提取微 波提取的原理是在微波場(chǎng)中，不同物質(zhì)的吸收微波能力的差異，使得 被處理物體中的某些區(qū)域或某些組分被選擇性加熱，從而使得被提取 物質(zhì)能快速?gòu)谋惶幚砦矬w中分離，進(jìn)入到介電常數(shù)較小、微波吸收能 力相對(duì)差的提取劑中。同時(shí)微波法透入被處理物體時(shí)，能使被處理物 體內(nèi)部、外部幾乎同時(shí)被加熱升溫，內(nèi)外加熱均勻一致，形成體熱源 狀態(tài)，大大縮短了常規(guī)加熱中的熱傳導(dǎo)時(shí)間。微波法提取的高提取得 率機(jī)理可從以下3個(gè)方面來分析①壓力降破胞機(jī)制微波輻射散發(fā) 出的高頻龜磁波能直達(dá)物料內(nèi)部的微管束和細(xì)胞系統(tǒng)，細(xì)胞吸收微波 能后內(nèi)部溫度迅速上升，從而使細(xì)胞內(nèi)壓超過細(xì)胞壁所能承受的極 限，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)的有效成分自由流出。②促擴(kuò)散機(jī)制微 波所產(chǎn)生的電磁場(chǎng)可加速目的提取組分的分子由固體內(nèi)部向固液界面擴(kuò)散的速率。例如，以水作溶劑時(shí)，在微波場(chǎng)的作用下，水分子由 高速轉(zhuǎn)動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，此時(shí)水分子發(fā)生汽化以加強(qiáng)提取的驅(qū)動(dòng)
力；或者釋放出自身多余的能量回到基態(tài)，將所釋放出的能量傳遞給 其他物質(zhì)的分子，以加速其熱運(yùn)動(dòng)，從而縮短目的提取組分的分子由 固體內(nèi)部擴(kuò)散至固液界面的時(shí)間，結(jié)果使提取速率提高。(D分子極變
促裂機(jī)制微波能是一種由離子遷移和偶極子轉(zhuǎn)動(dòng)而引起分子運(yùn)動(dòng)的 非離子化輻射能，當(dāng)它作用于分子時(shí)，可促進(jìn)分子的轉(zhuǎn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)，若分
子具有一定的極性，即可在微波場(chǎng)的作用下產(chǎn)生瞬時(shí)極化，并以24. 5 億次/s的速度作極性變換運(yùn)動(dòng)，從而產(chǎn)生鍵的振動(dòng)、撕裂和粒子間
的摩擦和碰撞，并迅速生成大量的熱能，促使細(xì)胞破裂，使細(xì)胞液溢 出并擴(kuò)散至溶劑中。
高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPIX) 是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于20世紀(jì)60年代后期引入了氣相色 譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小 而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相， 故又稱高壓液相色譜。制備型高效液相色譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)天然藥物大劑 量的快速分離純化，可廣泛地應(yīng)用于微生物、中草藥等生物體中天然 藥物的分離純化領(lǐng)域，但在國(guó)內(nèi)，該技術(shù)的應(yīng)用還未成為主流。
近年來，用米飯、雞蛋粉為主要原料做固體培養(yǎng)基人工培育蛹蟲 草子實(shí)體的技術(shù)得到了廣泛的發(fā)展，但是子實(shí)體采收后長(zhǎng)滿菌絲體的 固體培養(yǎng)基殘基的利用卻鮮有報(bào)道。子實(shí)體采收后長(zhǎng)滿菌絲體的蛹蟲 草固體培養(yǎng)基殘基中蟲草素含量高達(dá)0.5%，如能有75%提取得率，則從lkg蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中可獲得3. 75克蟲草素提純物，經(jīng)濟(jì)效益相當(dāng)可觀，故無論從變廢為寶、減少資源浪費(fèi)的角度，還是從提高經(jīng)濟(jì)效益的角度，從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取和純化蟲草素的方法均值得重視和推廣。目前從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取和純化蟲草素的公開報(bào)道和專利不多，綜合分析后可發(fā)現(xiàn)，其提取方法多采用傳統(tǒng)的水浸法、醇提法，粗提得率較低，純化技術(shù)多采用離子交換樹脂吸附、大孔樹脂吸附等，自動(dòng)化程度低，一 所純化的蟲草素最終純度還是有所限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取和純化蟲草素的方法，可解決現(xiàn)有技術(shù)從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取和純化蟲草素時(shí)，蟲草素粗提得率低、蟲草素最終純度較低、工業(yè)化生產(chǎn)自動(dòng)化程度較低的問題，目的是為更加高效、合理地利用蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基，更加方便地生產(chǎn)出高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值的生物醫(yī)藥產(chǎn)品，更好地滿足人類健康事業(yè)的需求。
本發(fā)明的技術(shù)方案是該方法是采用微波法從人工蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基的水溶液中制備粗提液，然后采用高效液相色譜法對(duì)除雜后的粗提液進(jìn)行純化。
本發(fā)明大致包括如下步驟A.微波粗提稱取粉碎后的人工蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基，按一定固液比加水混勻，在一定微波強(qiáng)度下輻射1 3分鐘，同樣條件下重復(fù)提取一次，離心收集上清液；B. 濃縮除雜濃縮除雜步驟A中取得的上清液蒸發(fā)濃縮至原
體積的1/3 1/6，用2 5倍體積的無水乙醇沉淀過夜，離心去除雜質(zhì)，取上清液用活性碳除色素；
C. 用制備型高效液相色譜進(jìn)行蟲草素純化。
其中，步驟A中微波法提取的最佳條件是微波強(qiáng)度P50，固液比1:20，提取時(shí)間2min，提取次數(shù)2次。
步驟B中的最佳方案是微波法提取后的粗提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行低壓濃縮到原體積的五分之一，所得濃縮液用3倍體積無水乙醇沉淀過夜，5000r/min離心15min除去蟲草多糖等醇不溶雜質(zhì)，取上清液用等量的活性碳混勻，搖床振搖12h，過濾除色素。
步驟C中用制備型高效液相色譜進(jìn)行純化的色譜條件如下色譜柱為GRACE VYDAC， 238DE1022, 250mmx22mm或Kromasil100-10， C18, 250mmx21.2mm;流動(dòng)相為甲醇水=15:85;流速10-20mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254-260nm;檢測(cè)溫度為25-30°C 。
為達(dá)到蟲草素各種純度的生產(chǎn)要求，經(jīng)高效液相色譜純化后的蟲草素峰收集液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后再上制備型高效液相色譜，進(jìn)行不定次數(shù)的高效液相色譜多輪純化(次數(shù)由蟲草素生產(chǎn)要求達(dá)到的純度來確定)。
本發(fā)明還提供了一種制備蟲草素干粉的方法，經(jīng)一次或多次高效液相色譜純化后的蟲草素峰收集液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除甲醇并濃縮到原體積的三分之一，然后用真空冷凍干燥法或噴霧干燥法得到蟲草素干粉。本發(fā)明提出的微波法從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素，粗提得率達(dá)76%以上，操作簡(jiǎn)便易行。微波法所制備的粗提液經(jīng)常規(guī)醇沉除雜和活性碳脫色后，即可上制備型高效液相色譜，經(jīng)一次或多次高效液相色譜純化后的蟲草素的純度可以滿足不同的生產(chǎn)要求(純度
最高可達(dá)99.9%以上)。本發(fā)明中提出的微波-HPLC聯(lián)用的從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取和純化蟲草素的方法，簡(jiǎn)單易行，自動(dòng)化程度高，且粗提得率達(dá)高，可達(dá)高純度，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的較高端技術(shù)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖
對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1:
將于電熱鼓風(fēng)千燥箱中8(TC干燥至恒重的人工蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基，用中藥粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，按固液比1:20，加入純水，混勻，在微波爐中于微波強(qiáng)度P50下提取2min，同樣條件下重復(fù)提取一次，離心收集上清。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行低壓濃縮到原體積的五分之一，濃縮液用3倍體積無水乙醇沉淀過夜，5000 r/min離心15min除去蟲草多糖等醇不溶雜質(zhì)，然后用等量的活性碳混勻，搖床振搖12h，過濾除色素。除雜后的濃縮液用制備型高效液相色譜進(jìn)行蟲草素的純化，色譜條件如下色譜柱為GRACE VYDAC， 238DE1022，250mmx22mm， 250mmx21.2mm;流動(dòng)相為甲醇水=15:85 ;流速15mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;檢測(cè)溫度為3(TC。收集蟲草素峰流出液，分析型HPLC檢測(cè)純度為83.50/。，純度達(dá)出口標(biāo)準(zhǔn)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮初次收集的蟲草素峰流出液到原體積的三分之一，所得濃縮液再次上制備型高效液相色譜，色譜條件同前，收集蟲草素峰流出液，分
析型HPLC檢測(cè)純度為95.2%，純度達(dá)對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮第二次收集的蟲草素峰流出液到原體積的三分之一，所得濃縮液第三次上制備型高效液相色譜，色譜條件同前，收集蟲草素峰流出液，分析型HPLC檢測(cè)純度為99.9M，純度達(dá)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)第三次收集的蟲草素峰流出液到原體積的三分之一 (同時(shí)除甲醇)，所得濃縮液真空冷凍干燥后成蟲草素凍干粉純品。 _
將于電熱鼓風(fēng)干燥箱中80"C干燥至恒重的人工蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基，用中藥粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，稱取3Kg，按固液比1:20加入純水60 Kg，混勻，分批在微波爐中于微波強(qiáng)度P50下提取2min，同樣條件下重復(fù)提取一次，離心收集上清。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行低壓濃縮到原體積的五分之一，濃縮液用3倍體積無水乙醇沉淀過夜，5000 r/min離心15 min除去蟲草多糖等醇不溶雜質(zhì)，然后用等量的活性碳混勻，搖床振搖12h，過濾除色素。除雜后的濃縮液用制備型高效液相色譜進(jìn)行蟲草素的純化，色譜條件如下色譜柱為Kromasil100-10， C18, 250mmx21.2mm;流動(dòng)相為甲醇水=15:85 ;流速15mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;檢測(cè)溫度為30°C。收集蟲草素峰流出液，分析型HPLC檢測(cè)純度為84.5%，純度達(dá)出口標(biāo)準(zhǔn)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮初次收集的蟲草素峰流出液到原體積的三分之一，所得濃縮液再次上制備型高效液相色譜，色譜條件同前，收集蟲草素峰流出液，分析型HPLC檢測(cè)純度為95.6%，純度達(dá)對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮第二次收集的蟲草素峰流出液到原體積的三分之一，所得濃縮液第三次上制備型高效液相色譜，色譜條件同前，收集蟲草素峰流出液，分析
型HPLC檢測(cè)純度為99.9。/。，純度達(dá)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)第三次收集的蟲草素峰流出液到原體積的三分之一 (同時(shí)除甲醇)，所得濃縮
液噴霧干燥后成蟲草素凍干粉純品。
權(quán)利要求
1、一種提取和純化蟲草素的方法，其特征在于該方法是采用微波法從人工蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基的水溶液中制備粗提液，然后采用高效液相色譜法對(duì)除雜后的粗提液進(jìn)行純化。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取和純 化蟲草素的方法，其特征在于該方法包含以下步驟-A. 微波粗提稱取粉碎后的人工蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基，按一定 固液比加水混勻，在一定微波強(qiáng)度下輻射1 3分鐘，同樣條件下重 復(fù)提取一次，離心收集上清液；B. 濃縮除雜步驟A中取得的上清液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3 1/6，用2 5倍體積的無水乙醇沉淀過夜，離心去除雜質(zhì)，取上清液 用活性碳除色素；C. 用制備型高效液相色譜進(jìn)行蟲草素純化。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取 和純化蟲草素的方法，其特征在于步驟A中微波法提取的最佳條 件是微波強(qiáng)度P50，固液比1:20，提取時(shí)間2min，提取次數(shù)2次。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取 和純化蟲草素的方法，其特征在于步驟B中的最佳方案是微波 法提取后的粗提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行低壓濃縮到原體積的五分之一，所 得濃縮液用3倍體積無水乙醇沉淀過夜，5000 r/min離心15 min除去 蟲草多糖等醇不溶雜質(zhì)，取上清液用等量的活性碳混勻，搖床振搖12h，過濾除色素。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取 和純化蟲草素的方法，其特征在于步驟C中用制備型高效液相色 譜進(jìn)行純化的色譜條件如下色譜柱為GRACE VYDAC， 238DE1022, 250mmx22mm或Kromasil 100-10， C18， 250mmx21.2mm;流動(dòng)相為 甲醇:水=15:85;流速10-20mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254-260nm;檢測(cè)溫 度為25-30。C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取和純化蟲草素的方法，其特征在于為達(dá)到蟲草素各種純度的生產(chǎn)要求，經(jīng)高效液相色譜純化后的蟲草素峰收集液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后再上制備 型高效液相色譜，進(jìn)行不定次數(shù)的高效液相色譜多輪純化。
7、 一種制備蟲葶素干粉的方法，其特征在于經(jīng)一次或多次高 效液相色譜純化后的蟲草素峰收集液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除甲醇并濃縮到原體 積的三分之一，然后用真空冷凍干燥法或噴霧干燥法得到蟲草素干 粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從蛹蟲草固體培養(yǎng)基殘基中提取和純化蟲草素的方法以及制備蟲草素干粉的方法。該方法采用微波法進(jìn)行提取，極大地提高了蟲草素的粗提得率，達(dá)75％以上，粗提液濃縮并除雜后，采用高效液相色譜法進(jìn)行純化，經(jīng)三輪純化，最終純度可達(dá)99.9％以上。本方法粗提率高，操作方便，質(zhì)量可控、穩(wěn)定，自動(dòng)化程度高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H19/16GK101492483SQ20081017195
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2008年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月27日
發(fā)明者芳 劉, 周英彪, 張善信, 王曉寧, 鄭貴朝, 陳生龍 申請(qǐng)人:東莞市生物技術(shù)研究所