專利名稱：用于檢測(cè)和測(cè)定綠原酸的抗體、方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小分子半抗原的抗體及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及綠原酸及其衍生物的抗體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和定量綠原酸的方法和試劑盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶聯(lián)物(conjugate)和抗體。
其中"檢測(cè)"是指定性分析物質(zhì)是否存在。其中"測(cè)定"是指對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。
綠原酸(Chlorogenic acid，以下簡稱CA),分子式C16H1809，分子量354.30，是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinic acid， l-羥基六氫沒食子酸)生成的縮酚酸，異名咖啡鞣酸，系統(tǒng)名1， 3， 4， 5-四羥基環(huán)己烷羧酸-(3， 4-二羥基肉桂酸酯)，化學(xué)名3-0-咖啡酰奎尼酸(3-0-caffeoylquinic acid)。
中藥或中藥復(fù)方是一個(gè)復(fù)雜的巨系統(tǒng)，其中的化學(xué)成分具有結(jié)構(gòu)多樣性和復(fù)雜性的特點(diǎn)。揭示中藥或中藥復(fù)方化學(xué)成分在體內(nèi)靶器官的分布，細(xì)胞或亞細(xì)胞定位，以及體內(nèi)分布的動(dòng)態(tài)變化，時(shí)量一時(shí)效關(guān)系等，是闡明中藥或中藥復(fù)方作用耙點(diǎn)以及作用機(jī)理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。綠原酸作為抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分，是金銀花、杜仲、忍冬藤、魚腥草、茵陳、梔子、清開靈注射液等藥材和中成藥，在藥典或國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的定性和定量的指標(biāo)成分。
從相關(guān)文獻(xiàn)可知，針對(duì)綠原酸的定性與定量，目前建立了多種檢測(cè)和測(cè)定分析方法，如薄層層析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色譜法。但含綠原酸的生物樣品(包括血漿、尿、唾液等)含有大量的影響含量測(cè)定的蛋白質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)；同時(shí)綠原酸可能呈結(jié)合狀態(tài)，必須經(jīng)過處理，排除內(nèi)源性雜質(zhì)和代謝物的干擾，使結(jié)合狀態(tài)的綠原酸游離后才能測(cè)定；同時(shí)還需要濃縮以滿足儀器檢測(cè)靈敏度的要求，處理程序復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；同時(shí)由于綠原酸進(jìn)入體內(nèi)后，組織中的分布是極其微量的，即使經(jīng)過富集，進(jìn)行含量測(cè)定仍是極其困難的。另外，對(duì)于綠原酸在靶器官和組織中分布，以及細(xì)胞和亞細(xì)胞定位的研究，需要通過免疫組織化學(xué)和western-blot等方法，但由于缺乏綠原酸的抗體，阻礙了此方面的研究。因此，有必要開發(fā)出一種用于檢側(cè)和測(cè)定生物樣品中綠原酸的方法，對(duì)闡明相關(guān)藥材或復(fù)方的作用機(jī)理，以及其體內(nèi)分布和代謝研究，將具有特別的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的半抗原綠原酸可提供確定的結(jié)構(gòu)性抗原決定部位，但是它本身并不具備免疫原性，因此必須要偶聯(lián)到適宜的賦予抗原性的載體物質(zhì)上，這樣所形成的免疫原才會(huì)在注射到宿主動(dòng)物體內(nèi)后誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供一種如下結(jié)構(gòu)的免疫原-
o
其中R是0至6個(gè)碳的烷基橋(連接半抗原與載體物質(zhì)的橋)，優(yōu)選R = 0，即Pl直接與綠原 羰基碳原子結(jié)合，或R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基， 更優(yōu)選R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞垸基。
Pl是賦予抗原性的載體物質(zhì)。載體物質(zhì)選自蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片合成的多肽或半合成的多 肽。其中蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目鏡蛋白和脂蛋白，優(yōu)選為 牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙種球蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、鎖眼形血藍(lán)蛋白(keyhole limpet haemocyanin， KLH)，更優(yōu)選自鎖眼形血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白(BAS)。合成多肽或 半合成多肽是具有足夠數(shù)量的可利用氨基的合成聚氨基酸，優(yōu)選多聚賴氨酸。合成或天然聚 合物是帶有反應(yīng)官能基的聚合物材料，特別是能夠結(jié)合到半抗原產(chǎn)生免疫原的碳水化合物、 酵母或多糖。
半抗原的制備本發(fā)明描述了半抗原綠原酸在羧基處或任一羥基處與賦予抗原性的載體 物質(zhì)發(fā)生的偶聯(lián)作用，產(chǎn)生免疫原。為了讓半抗原的結(jié)構(gòu)特征充分暴露，可在-C00H位點(diǎn)上 接上一個(gè)連接臂。據(jù)此以綠原酸為起始原料，同時(shí)以氯化亞楓，氨基丁酸或氨基己酸等為原 料，經(jīng)過二步反應(yīng)，合成了半抗原2和3。產(chǎn)物2和3純化后分別經(jīng)質(zhì)譜(MS)和核磁共振 氫譜和碳譜(1麗MR和13CNMR)確證。
免疫原的合成本發(fā)明的半抗原和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域己知的任何連接方 式。例如但不限于碳二亞胺法(EDC )、戊二醛法等。采用碳二亞胺法制備綴合物和免疫原時(shí)， 是將0. 2毫摩爾的半抗原綠原酸溶解在N, N-二甲基甲酰胺中，加入1. 5當(dāng)量的二環(huán)己基碳二 亞胺和3當(dāng)量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)過夜，離心，取上清液加入到10-20mg/mL 的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)1-6小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0. Olmol/L 的PBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保存于-2(TC的冰箱中。
合成免疫原的分析方法為了確認(rèn)載體物質(zhì)上結(jié)合有適當(dāng)?shù)陌肟乖?，在免疫前，使用?外分光度法或矩陣輔助紫外激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)對(duì)每個(gè)免疫原進(jìn)行評(píng)估。綠原酸免疫原反應(yīng)物和產(chǎn)物的吸收峰相比(200nm-400nrn)，可判斷是否偶合，并根據(jù) 反應(yīng)物和產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算偶聯(lián)物與半抗原的比例。
使用voyager STR生物分光度測(cè)量方法研究站激光解析質(zhì)譜與延遲萃取結(jié)合進(jìn)行MALDI -TOF質(zhì)譜e將每個(gè)要分析的等分試樣在0. 1%的三氟乙酸水溶液中稀釋制成lmg/ml的試樣溶 液。使用芥子酸基質(zhì)和牛血清白蛋白作為外標(biāo)分析等分試樣(luL)。
對(duì)于優(yōu)選的載體物質(zhì)，牛血清白蛋白或KLH而言，優(yōu)選半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比為6-15:
第二方面，免疫檢測(cè)時(shí)需要將綠原酸與標(biāo)記試劑進(jìn)行偶合。因此，本發(fā)明提供一種如下 結(jié)構(gòu)的偶合物； O
其中R是0至6個(gè)碳的烷基，P2是可檢測(cè)的標(biāo)記試劑，標(biāo)記試劑選自酶、發(fā)光物質(zhì)、放射性 物質(zhì)或它們的混合物，更優(yōu)選地標(biāo)記試劑是過氧化物酶。最優(yōu)選地標(biāo)記試劑是辣根過氧化物 酶(HRP)。發(fā)光物質(zhì)選自生物發(fā)光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)。
偶合物的合成利用混合酸配法，但不限于此法，可以采用已知的其他偶合方法。將0. 25 毫摩爾半抗原綠原酸溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯， 室溫下反應(yīng)l-2小時(shí)，反應(yīng)液加入到10-20mg/mL的卵清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應(yīng) 1-4小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.01niol/L的PBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保存于 -20匸的冰箱中。
另一方面，本發(fā)明涉及對(duì)于本發(fā)明第一方面的免疫原產(chǎn)生的抗體，這些抗體能夠至少與 一個(gè)綠原酸結(jié)構(gòu)上的表位結(jié)合，優(yōu)選與完整的綠原酸結(jié)構(gòu)表位相結(jié)合，該抗體是多克隆的， 或是單克隆的，優(yōu)選為單克隆抗體，且具有對(duì)綠原酸的特異性，并對(duì)于結(jié)構(gòu)上相關(guān)的咖啡酰 基類化合物交叉的反應(yīng)活性應(yīng)低于10%，優(yōu)選低于5%，更優(yōu)選低于線，最優(yōu)選低于0.5%。
免疫檢測(cè)時(shí)要將該抗體固定在支撐底物上。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括將所述血清抗體 固定到支撐底物上，優(yōu)選固體支持物，最優(yōu)選聚苯乙烯固體支持物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備抗體的方法，該方法包含通過重復(fù)給予根據(jù)本發(fā)明的綠原酸的免疫原免疫動(dòng)物，優(yōu)選脊稚動(dòng)物，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物，并收集從免疫動(dòng)物得到的血清的步驟。 另一方面，本發(fā)明包括在試樣中檢測(cè)或測(cè)定綠原酸的方法，該方法包括用本發(fā)明的偶合
物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物接觸試樣；檢測(cè)或測(cè)定結(jié)合的綴合物的數(shù)量；并且
從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷試樣中綠原酸的存在或數(shù)量。
另一方面，本發(fā)明還描述了如何將針對(duì)這種免疫原產(chǎn)生的抗體用于開發(fā)可用來檢測(cè)和測(cè)
定綠原酸的存在的通用分析方法和相應(yīng)的試劑盒。本該試劑盒包括用本發(fā)明的偶合物或其混
合物和本發(fā)明的抗體或其混合物。該試劑盒可以任意地包括應(yīng)用所述綴合物和所述抗體在試
樣中檢測(cè)或測(cè)定綠原酸的指導(dǎo)。優(yōu)選地，試樣是溶液，如生物流體。更優(yōu)選地，試樣是血清 或尿。在本發(fā)明的方法和試劑盒中，首選各自不同的交聯(lián)劑(免疫原的和偶合物的)。
另一方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的偶合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物在試 驗(yàn)試樣如生物流體中檢測(cè)或測(cè)定綠原酸。
為了產(chǎn)生多克隆抗血清，將免疫原與Freund佐劑混合，并且將混合物注射入宿主動(dòng)物體 內(nèi)，如兔、羊、鼠、天竺鼠或馬。進(jìn)一步注射(加強(qiáng))并取血清試樣評(píng)價(jià)抗體滴度。3 但 達(dá)到最佳滴度時(shí)，隨后將宿主動(dòng)物放血得到適當(dāng)體積的特異性的抗血清。要求的抗體純化水 平視計(jì)劃的應(yīng)用而定。對(duì)于許多目的，根本不需要純化，但是，在其它情況下，例如抗體固 定在固體載體上，純化步驟能夠除去不想要的物質(zhì)和除去非特異性的結(jié)合。本發(fā)明特異性抗 體作為試劑在免疫試驗(yàn)中用于測(cè)定或檢測(cè)生物流體中的綠原酸的試劑是有用的。
單克隆抗體的制備本發(fā)明所述單克隆抗體是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組 成該群體的抗體個(gè)體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員己知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，本發(fā)明完全 抗原，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)單克隆抗體的產(chǎn)生。對(duì)于單克隆抗體，可利用雜交瘤技術(shù)來制 備或可用重組DNA法制備。骨髓瘤細(xì)胞可選鼠類的骨髓瘤細(xì)胞系，包括衍生自M0PC-21和 MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細(xì)胞系以及SP-2 、 NZO或X63-Ag8-653細(xì)胞，以及人骨髓瘤和小 鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系。
對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長于其中的培養(yǎng)基進(jìn)行分析以檢測(cè)具有所需特異性的單克隆抗體的產(chǎn) 生，如通過體外結(jié)合分析，例如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表達(dá)抗 體的細(xì)胞的位置可用FACS進(jìn)行檢測(cè)。然后，可將雜交瘤克隆通過有限稀釋步驟形成亞克隆， 并通過標(biāo)準(zhǔn)方法生長。為了達(dá)到這一目的而使用的適合的培養(yǎng)基包括，例如，DMEM或 RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物體內(nèi)作為腹水瘤生長。
由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基、腹水或血清中，通過常規(guī)的免疫球蛋白純化工藝 適當(dāng)?shù)氐玫椒蛛x，這些純化工藝為例如，蛋白A-瓊脂糖法(protein A-S印harose)、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方案中，抗綠原酸單克隆抗體采用Balb/C小鼠腹水生產(chǎn)單克隆抗體 的方法制備。將約106 -107雜交瘤細(xì)胞接種到致敏的小鼠腹腔內(nèi)，2-4周內(nèi)可見腹部明顯脹大。 抽取腹水，經(jīng)飽和硫酸按沉淀法粗提出IgG ，再將粗提的抗體經(jīng)親和層析柱(Protein G-S印hrose)純化。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 半抗原化合物1
金銀花藥材100g， 用95%乙醇或50%的乙醇水溶液，固液比均為1: 10，調(diào)節(jié)溶液的pH=3， 5(TC左右提取3次。合并提取液，濃縮至無醇味，4'C冰箱冷藏過夜，抽濾得上清液，將此上 清液加入聚酰胺樹脂裝于玻璃柱(400X10mra)中，至流出液變渾濁，依次用水、10%、 20%、 30%、 40%和50%乙醇水溶液(鹽酸調(diào)節(jié)pH至4. 0左右)梯度洗脫，HPLC檢測(cè)合并綠原酸含量大于60% 的洗脫液，濃縮后置于O'C冰箱中析晶，抽濾。上述晶體溶于適量水中，加于S印hadexLH-20 柱柱頂。層析條件為洗脫劑50。/。的丙酮水溶液(pH二4)、流速0.5mL/min。 HPLC檢測(cè)，合并綠 原酸洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥得綠原酸純品。 實(shí)施例2
按氯化亞楓(S0Cl2)和綠原酸裝入三口燒瓶中，在磁力攪拌下，加熱回流反應(yīng)lh，蒸餾除 去多余的氯化亞楓，即得產(chǎn)物氯化綠原酸。按投料比Y氨基丁酸CA=1.5:1，在三口燒瓶中 投入Y氨基丁酸，冰浴下加入適量NaOH溶液，攪拌溶解，溶解在二惡垸中，加入恒壓滴液漏 斗中，分五次滴加此溶液，隨后補(bǔ)加適量NaOH溶液，使反應(yīng)液pH值維持在8-10，加畢，繼 續(xù)在0-4。C反應(yīng)5h 。升至室溫，用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯提取， 合并乙酸乙酯提取液，用水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮得到固體物，經(jīng)硅膠柱層析純化得半 抗原四垸基化綠原酸。 實(shí)施例3
按實(shí)施例2的方法，用6—氨基己酸合成六烷基化綠原酸。 實(shí)施例4
將0. 2毫摩爾的半抗原綠原酸溶解在2mlN， N-二甲基甲酰胺中，加入1. 5當(dāng)量的二環(huán)己 基碳二亞胺和3當(dāng)量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)過夜，離心，取上清液O. lml加入到 20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應(yīng)1_6小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水 和0. Olmol/L的PBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保存于-2(TC的冰箱中。 實(shí)施例5
8將0. 25毫摩爾半抗原綠原酸溶解在2mlN， N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL 氯甲酸丁酯，室溫下反應(yīng)1-2小時(shí)，反應(yīng)液加入到10-20mg/mL的卵清蛋白碳酸鹽緩沖溶液 中，攪拌反應(yīng)1-4小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0. 01mol/L的PBS緩沖溶液透析3-5d， 分裝保存于-2(TC的冰箱中。 實(shí)施例6
制備方法同實(shí)施例2 ，只是將KLH換成牛血清白蛋白(BSA)，制得CA-BSA全抗原120mg 。 實(shí)施例7
免疫原(CA-BSA、 CA-KLH)按常規(guī)方法各免疫了三只兔子。從加強(qiáng)免疫第二次開始，在 每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測(cè)定效價(jià)。待第4次 免疫時(shí)，兔子獲得了高效價(jià)的抗體，經(jīng)純化制成凍干粉后的效價(jià)分別為20000: 1。 實(shí)施例8
先將綠原酸抗原與弗氏佐劑乳化，用PBS將完全抗原CA—KLH配制成lmg/ral的溶液， 然后將完全抗原溶液與弗氏佐劑等體積混合，用高速震蕩器震蕩形成均勻乳濁液，將此乳濁 液用于動(dòng)物的免疫。選擇8周齡的小鼠進(jìn)行注射免疫。取8周齡的健康Balb/C小鼠12只， 在第0天，每只腹腔注射完全弗氏佐劑乳化抗原100uL 。第14天，再對(duì)每只小鼠腹腔注射 不完全弗氏佐劑乳化抗原100uL 。第21天，以摘小鼠眼球法采血，用ELISA方法檢測(cè)血清 中抗體效價(jià)(滴度)。第28天，再次腹腔注射不完全弗氏佐劑乳化抗原100uL 。在細(xì)胞融合 反應(yīng)前一周，用100ug/100ul抗原生理鹽水再次加強(qiáng)免疫。采血后經(jīng)測(cè)定，所得抗血清效價(jià) 為l :64000。細(xì)胞融合操作3天后檢查細(xì)胞融合情況，8天后加HT'完全培養(yǎng)基，每孔加入 lral。在12天間，就可以觀察到雜交細(xì)胞的克隆。當(dāng)克隆直徑長到約lmm時(shí)，用CA-BSA包 被的酶聯(lián)板來篩選出抗CA的雜交瘤細(xì)胞。篩選到的陽性克隆用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，以 CA-BSA包被的ELISA法酶標(biāo)板來篩選抗CA的特異性雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)五次克隆后，得到一株 能分泌專一性抗體的抗氯胺酮單克隆細(xì)胞。 實(shí)施例9
取實(shí)施例4中經(jīng)過4次免疫的小鼠，用CA-BSA包被的酶聯(lián)板測(cè)定抗血清的滴度。將包 被抗原以10ug/ml稀釋于pH 9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液中，100ul /孔加入到96孔酶標(biāo)板 于4。C過夜。棄去包被液后用1%明膠/ PBS在37。C下封閉2小時(shí)，然后用PBS-Tween-20洗 液洗板3遍，再加入稀釋后的CA抗血清，置于37。C孵育1小時(shí)。用PBS-Tween-20洗液洗板 3遍，加入1:2000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG多抗，37'C孵育1小時(shí)后用 PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加TMB/H202底物進(jìn)行顯色I(xiàn)Omin ，并用終止液(0. 1N硫酸) 終止顯色。在450nm光波長下測(cè)定吸收值(OD)，與空白對(duì)照孔的OD均值比較，采用計(jì)量資料的t 檢驗(yàn)，取P〈0.05的最低稀釋度作為此抗體的效價(jià)。經(jīng)比色測(cè)定，所得綠原酸抗血清的效價(jià)為 1:6400 。 實(shí)施例10
融合效率分析用CFSE綠色熒光預(yù)標(biāo)記的淋巴細(xì)胞顯綠色，用PE標(biāo)記的抗小鼠B220 單克隆抗體預(yù)標(biāo)記的SPZ/0細(xì)胞顯紅色，兩種細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞帶有雙色熒光。經(jīng) 流式細(xì)胞儀測(cè)定分析雙熒光細(xì)胞比例，用于反映融合效率。如圖2所示，代表PE標(biāo)記的抗 小鼠B220單克隆抗體預(yù)標(biāo)記的SPZ/0 (骨髓瘤)細(xì)胞，代表CFSE綠色熒光預(yù)標(biāo)記淋巴細(xì) 胞，代表帶有雙色熒光的雜交瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)體系中脾細(xì)胞和SPZ/0的最初融合效率約為 45% ， ELISA法測(cè)定陽性率為15 % 。
權(quán)利要求
1、一種如下通式的免疫原其中R是0至6個(gè)碳的烷基橋(連接半抗原與載體物質(zhì)的橋)，P1是賦予抗原性的載體物質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的免疫原，R = 0，即？1直接與綠原酸羰基碳原子結(jié)合。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l的免疫原，R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的 亞烷基。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或3的免疫原，R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞垸基。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l的免疫原，其中載體物質(zhì)為蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成或天然多肽或半合 成多肽、合成或天然聚合物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或5的免疫原，其中蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、 和脂蛋白。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或5的免疫原，其中蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段選自牛血清白蛋白、卵清蛋白、 牛丙種球蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、鎖眼形血藍(lán)蛋白(keyhole limpet haemocyanin， KLH) 等。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或5的免疫原，其中合成或天然多肽或半合成多肽是具有足夠數(shù)量的可利 用氨基的合成聚氨基酸。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1或5的免疫原，其中合成或天然聚合物選自碳水化合物、酵母或多糖。
10、 抗如權(quán)利要求1至9的免疫原的抗體，其中抗體能與完整的綠原酸中的至少一種結(jié)構(gòu)性 抗原決定部位結(jié)合。
11、 如權(quán)利要求10的抗體，其中抗體固定在支持底物上，特別是聚苯乙烯固體支持物。
12、 制備如權(quán)利要求10或11中的抗體的方法，該方法包括將如權(quán)利要求1至9的免疫原重 復(fù)給予動(dòng)物而使動(dòng)物免疫，以及從免疫動(dòng)物中收集所得到的血清抗體；以及利用免疫學(xué)上可 接受的細(xì)胞系與產(chǎn)生抗體的免疫動(dòng)物單克隆細(xì)胞系融合后產(chǎn)生的細(xì)胞系，所制備的單克隆抗 體。
13、 如權(quán)利要求12的方法，其中該方法還包括將所述血清抗體固定在支持底物上。包括如權(quán)利要求l至3中任一項(xiàng)的半抗原與可檢測(cè)到的標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合的偶聯(lián)物。
14、 一種如下結(jié)構(gòu)的偶合物<formula>formula see original document page 3</formula>其中R是0至6個(gè)碳的垸基，P2是可檢測(cè)的標(biāo)記試劑。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14的偶合物，標(biāo)記試劑選自酶、發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)或它們的混合物。
16、 根據(jù)權(quán)利要求14或16的偶合物，標(biāo)記試劑是過氧化物酶。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16的偶合物，標(biāo)記試劑是辣根過氧化物酶(HRP)。
18、 根據(jù)權(quán)利要求14或15的偶合物，發(fā)光物質(zhì)是生物發(fā)光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)。
19、 用于檢測(cè)和定量樣品中綠原酸的方法，該方法包括將供試樣品和如權(quán)利要求14至18中 任一項(xiàng)的偶聯(lián)物或其混合物，與如權(quán)利要求10或11的抗體或其混合物接觸；檢測(cè)或定量結(jié) 合的偶聯(lián)物；以及從校準(zhǔn)曲線中推出樣品中綠原酸的存在或含量。
20、 用于檢測(cè)和定量綠原酸的試劑盒，該試劑盒包括如權(quán)利要求14至18中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物 或其混合物，以及如權(quán)利要求10或11的抗體或其混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供包括綠原酸或其衍生物的半抗原，與賦予抗原性的載體物質(zhì)結(jié)合的前述半抗原的免疫原，與標(biāo)記試劑結(jié)合的前述半抗原的偶聯(lián)物(包被原)，以及抗前述免疫原的抗體，該抗體能與完整的綠原酸中的至少一種結(jié)構(gòu)性抗原決定部位結(jié)合。本發(fā)明還提供用于檢測(cè)或定量樣品中綠原酸的方法和試劑盒，以及前述偶聯(lián)物和前述抗體在檢測(cè)或定量綠原酸中的用途。本發(fā)明對(duì)綠原酸具有特異性，可用于樣品中檢測(cè)綠原酸的存在和測(cè)定綠原酸的含量。
文檔編號(hào)C07K14/76GK101486762SQ200810172700
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者任會(huì)明, 屈會(huì)化, 李翼飛, 楊愛玲, 王慶國, 蔣興凱, 琰 趙 申請(qǐng)人:北京中醫(yī)藥大學(xué)