專(zhuān)利名稱(chēng)：血竭素酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小分子物質(zhì)抗體及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及血竭素抗體及其制
備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血竭素系常用中藥血竭的主要有效成分之一，血竭系由麒麟竭樹(shù)的果實(shí)鱗片所分 泌的一種紅色樹(shù)脂，經(jīng)加工而成。血竭素對(duì)金黃色葡萄球菌、包皮垢分歧桿菌和白色念珠菌 均有抗菌活性。中醫(yī)用于跌打損傷，瘀血作痛，產(chǎn)后瘀阻等。由于目前市場(chǎng)上所售的血竭質(zhì) 量參差不齊，有的混入其他樹(shù)脂，所以急需發(fā)展一種能夠快速有效的檢測(cè)血竭質(zhì)量的方法。 目前常用的方法為紫外分光光度測(cè)定法和薄層層析法。由于酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)具有高通 量、快速及靈敏度高等特點(diǎn)，在中藥材的品質(zhì)鑒定等方面已經(jīng)獲得了廣泛的應(yīng)用，但血竭素 的免疫檢測(cè)方法還未見(jiàn)報(bào)道，所以建立一種血竭素的免疫檢測(cè)方法具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供血竭素抗體及其制備方法與應(yīng)用。 本發(fā)明所提供的血竭素抗體，是用血竭素抗原免疫動(dòng)物，然后從被免疫動(dòng)物的血 清中分離得到的；所述血竭素抗原按如下過(guò)程制備先將血竭素溶解在甲醇中，然后加入 適量的對(duì)氨基苯甲酰肼，TLC跟蹤血竭素反應(yīng)完全，生成化合物l，然后將化合物1重氮化后 與載體蛋白連接，得到血竭素抗原。 制備血竭素抗體的方法，是用血竭素抗原免疫動(dòng)物，然后從被免疫動(dòng)物的血清中 分離得到血竭素抗體，其特征在于所述血竭素抗原按如下過(guò)程制備所述血竭素抗原按 如下過(guò)程制備先將血竭素溶解在甲醇中，然后加入適量的對(duì)氨基苯甲酰肼，TLC跟蹤血竭 素反應(yīng)完全，生成化合物l，然后將化合物1重氮化后與載體蛋白連接，得到血竭素抗原。
為了使效果更好，載體蛋白需先在0-l(TC條件下溶解于pH9-10的碳酸鹽緩沖液 中，常用的載體蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、蘭素蛋白(KLH)、卵清白 蛋白(OVA)等。 血竭素抗原制備反應(yīng)結(jié)束后，通常需要經(jīng)過(guò)透析或過(guò)s印hadex G_25柱以除去未
聯(lián)結(jié)的血竭素及有機(jī)溶劑，然后冷凍干燥以濃縮制備得到血竭素抗原。 應(yīng)用所制備的血竭素抗原對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫后，取樣測(cè)定效
價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到要求時(shí)，可以開(kāi)始采血，分離出抗血清，即可以得到血竭素抗體。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供血竭素抗體在鑒定中藥材血竭真?zhèn)紊系膽?yīng)用。 在應(yīng)用血竭素抗體進(jìn)行鑒定中藥材血竭真?zhèn)螘r(shí)，其鑒定過(guò)程包括如下步驟 (1)血竭和待測(cè)藥材經(jīng)95%的甲醇提取，提取液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，加適量樣品稀釋
液成樣品液； (2)應(yīng)用血竭素抗體采用ELISA方法檢測(cè)樣品液； (3)通過(guò)觀察孔顏色，鑒別樣品的真?zhèn)?，顏色淺為真品，顏色深為假品。
步驟(2)中的ELISA方法用常規(guī)的間接法和直接法，其中，間接法可以按如下步驟 進(jìn)行操作 (1)用血竭素包被抗原包被酶聯(lián)板； (2)向酶聯(lián)板上同時(shí)加入血竭素樣品、血竭素抗體，反應(yīng)過(guò)后加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行反應(yīng)；
(3)加入0PD-H2(^溶液底物后終止反應(yīng)。也可以根據(jù)上述原理，利用本發(fā)明的血 竭素抗體制備各種檢測(cè)血竭真?zhèn)蔚脑噭┖?，以便于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。 血竭素是小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，不能直接剌激動(dòng)物產(chǎn)生抗體，要想制備血 竭素的抗體，就必須把血竭素與相應(yīng)大分子載體蛋白偶聯(lián)構(gòu)建人工抗原，并用合成的人工 抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體。利用本發(fā)明的方法可以方便快捷地獲得血竭素人工抗原， 成本低，效果好，利用合成的血竭素免疫抗原通過(guò)免疫動(dòng)物，可以快速高效地獲得血竭素抗 體。利用血竭素抗體鑒定中藥材血竭的真?zhèn)危哂锌焖佟㈧`敏的優(yōu)點(diǎn)。
試驗(yàn)材料
1、材料和試劑
血竭素購(gòu)于中國(guó)藥" 完全佐劑均購(gòu)于Sigma公司。
,生物制品檢定所；對(duì)氨基苯甲酰肼、BSA、 OVA、弗氏完全和不 i和試劑均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司。
美國(guó)Costar公司 芬蘭Thermo公司
芬蘭Thermo公司
芬蘭Thermo公司 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司
其他常規(guī)藥f 2、儀器設(shè)備 96孔可拆酶標(biāo)板 二氧化碳培養(yǎng)箱 自動(dòng)洗板機(jī)(Wellwash 4MK2) 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Multiskan MK3) 電熱恒溫培養(yǎng)箱 3、緩沖液 (1)包被緩沖液0. 05M的碳酸鹽緩沖液，pH 9. 6 ; (2)PBS :含0. 9% NaCl的0. 1M磷酸鹽緩沖液，pH 7. 5 ; (3) PBST :含有0. 1 % (v/v)吐溫-20的PBS ; (4)樣品稀釋液含有0. 5% (w/v)明膠的PBST ; (5)底物緩沖液含0. 01M的檸檬酸三鈉和0. 03M的Na2HP04， pH 5. 5 ; (6)顯色液在10mL含有2mg/mL OPD的底物緩沖液中加入4 y L的30% H202 (7)終止緩沖液2M的硫酸溶液。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、血竭素抗原的合成(圖1)
1、化合物1的合成 血竭素20mg，對(duì)氨基苯甲酰肼80mg，溶于95%甲醇，充氮?dú)?(TC加熱反應(yīng)24小
時(shí)，TLC跟蹤原料反應(yīng)消失(氯仿甲醇氨水=95 : 5 : 2) ，PTix初步分離純化合成的
半抗原，甲醇洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸干。 2、血竭素-BSA免疫原和血竭素-OVA包被原的合成 0. 02mmol合成的化合物1溶于5ml的0. lmol/L的鹽酸溶液中，滴加過(guò)量的1 % 亞硝酸鈉溶液，4t:避光持續(xù)攪拌反應(yīng)，(亞硝酸鈉的加入量可用淀粉碘化鉀試紙進(jìn)行監(jiān)控，當(dāng)試紙變?yōu)樗{(lán)黑色，說(shuō)明亞硝酸鈉過(guò)量)，溶液變成藍(lán)黑色后，繼續(xù)反應(yīng)15min，用ra9. 0， 0. 2mol/L的硼酸緩沖液溶解20mgBSA或15mg0VA，邊攪拌邊加入重氮化的半抗原，調(diào)節(jié)ffl 至9.0左右，4t:攪拌反應(yīng)過(guò)夜，PBS中透析3天。
實(shí)施例2、制備血竭素抗體 (1)取8-10周齡的Balb/C小白鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 (2)實(shí)驗(yàn)免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0. lmg每只，加強(qiáng)免疫劑量為0. 15mg每只，用無(wú)菌 水稀釋實(shí)施例1中得到的血竭素-BSA免疫抗原，無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后加入等體積弗氏完全佐 劑，充分乳化，直到滴入水中不擴(kuò)散。 (3)用乳化好的免疫抗原免疫小鼠，初免腹腔注射，加強(qiáng)免疫采用背部皮下多點(diǎn)注 射，注射O. 2-0. 3ml。 (4)基礎(chǔ)免疫后，采用不完全弗氏佐劑乳化免疫抗原，方法同(2)，每隔2周進(jìn)行加 強(qiáng)免疫，三免后開(kāi)始，每次面以后7天從小鼠眼眶采血，測(cè)效價(jià)，待效價(jià)大于1 : IOOOO后， 采血，分離出抗血清，即得抗體。
實(shí)施例3 、小鼠血清效價(jià)的檢測(cè) 第五免后7天小鼠眼眶采血，室溫靜置1小時(shí)后，放于4t:冰箱靜置過(guò)夜。5000rpm 離心5min，收集血清，用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)血清效價(jià)(表1)。 (1)包被抗原用包被緩沖液將血竭素-OVA倍比稀釋成適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，每孔加入
100iil，放入濕盒，于37t:溫箱中包被3小時(shí)后，甩干孔內(nèi)包被液，PBST洗滌5次。 (2)加入待測(cè)血清用樣品稀釋液將血清按照500， 1000， 2000， 4000， 8000倍稀釋
后，每孔加入100ul，放入濕盒，于37。C溫育30min后，PBST洗滌5次。 (3)加酶標(biāo)二抗用樣品稀釋液對(duì)酶標(biāo)二抗做適當(dāng)稀釋后，每孔加入100ul，于
37。C溫育30min后，PBST洗滌5次。 (4)顯色20mgOPD溶解于10ml底物緩沖液，加入4ul雙氧水，混勻后每孔加入 100ul。 (5)終止反應(yīng)用2M的硫酸溶液終止顯色反應(yīng)。 (6)判定結(jié)果血清效價(jià)定義為0D值為1時(shí)的小鼠血清稀釋倍數(shù)。 表1小鼠血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果
抗原 血清4000訓(xùn)01600032000
4002.2161.5381.0590.670
8001.7561.1360.7980.496
16001.3050.8260.5100.401
32000.8680.5620.4220.208 實(shí)施例4、血清特異性檢測(cè) 用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(圖2)對(duì)小鼠血清進(jìn)行特異性檢測(cè)，根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)抑制率的大小判
定血清的特異性。 (1)包被同實(shí)施例3 (2)競(jìng)爭(zhēng)抑制孔加入預(yù)先配置好的標(biāo)準(zhǔn)品50ul，空白孔加入50ul樣品稀釋液，將血清用樣品稀釋液按照500， 1000， 2000， 4000倍稀釋后，每孔加入50ul，于37。C溫育30min
后，PBST洗滌5次。 (3-5)同實(shí)施例3 (6)判定結(jié)果根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)抑制率判定小鼠血清的特異性。競(jìng)爭(zhēng)抑制率=(陽(yáng)性對(duì) 照孔OD值-抑制孔OD值)/陽(yáng)性對(duì)照孔OD值X 100% 。如果競(jìng)爭(zhēng)抑制率大于10%即可初 步判定血清具有特異性。(表2)(見(jiàn)圖2)
表2血竭素小鼠的血清特異性檢測(cè)結(jié)果
血清
2000 40008000 16000
Antiserum
抗原
I C I CI C I C
Immunogen
4001.7882.015 1.048 1.2280.6040.7470.370 0.452
8001.2611.6670.8420.9620.4650.5890.2310.370
16000.858U370.5460.6740.3350.4250.2090.274
32000.5670.7100.3630.4390.2120.2750.1650.208 注1為有血竭素時(shí)的OD值，C為沒(méi)有血竭素時(shí)的OD值。
實(shí)施例5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將血竭素標(biāo)樣按照100ug/ml ， 50ug/ml ， 25ug/ml ， 12. 5ug/ml ， 6. 25ug/ml ， 3. 125ug/ml ， 1.5625ug/ml稀釋成不同濃度，選定包被抗原1 : 800，抗體1 : 2000作為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的 抗原抗體組合。所得結(jié)果經(jīng)0rigin7.0軟件計(jì)算并作圖(圖3)，根據(jù)曲線確定抑制中濃度 IC50為50-60ug/ml。 實(shí)施例6、中藥材血竭真?zhèn)蔚蔫b定 (1)將血竭和甘草lg于研缽中，研磨后，95X甲醇提取過(guò)夜，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，加?品稀釋液稀釋。 (2)取血竭素-OVA抗原，用包被液按1 : 800稀釋?zhuān)瑢?6孔酶聯(lián)板用蒸餾水洗滌
后，每孔加入所配血竭素-OVA抗原稀釋液100 iU，于37。C保溫3h ; (3)取小鼠抗血清，用樣品稀釋液l : 2000稀釋?zhuān)每寡逑♂屢海?(4)取出酶聯(lián)板，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干，加入樣品液50iil，再加
入50 iil抗血清稀釋液，對(duì)照加入100 ii 1水，放37t:保溫箱中保溫30min ; (5)棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干后，每孔加入經(jīng)1 : 2000稀釋的HRP-山
羊抗小鼠IgG100iil，放入37。C保溫箱中保溫30min ; (6)酶聯(lián)板用洗滌液洗滌4次甩干后，每孔加入底物OPD_H202溶液100 iU， 37。C保 溫箱中保溫10min后用50 iil 2M H2S04終止反應(yīng)。 結(jié)果顯示，血竭提取液的孔與甘草粉提取液的孔顏色有明顯不同，含有血竭素的 顏色淺，不含有的顏色深，由此可鑒定血竭的真?zhèn)巍?br>

圖1 :血竭素全抗原合成全過(guò)程示意圖
6
圖2 :血竭素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法操作步驟示意圖 圖3 :基于血清建立的50%加樣量icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(BO和B分別為沒(méi)有血竭素 和有血竭素時(shí)的OD值)。 表2血竭素小鼠的血清特異性檢測(cè)結(jié)果 血清
2000 4000 8000 16000 Antiserum_
抗原
ImmunogenICICICIC
4001.7882.0151.0481.2280.6040.7470.3700.452
8001.2611.6670.8420.9620.4650.5890.2310.370
16000.8581.1370.5460.6740.3350.4250.2090.274
32000.5670.7100.3630.4390.2120.2750.1650.208 注1為有血竭素時(shí)的OD值，C為沒(méi)有血竭素時(shí)的OD值。
實(shí)施例5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將血竭素標(biāo)樣按照100ug/ml ， 50ug/ml ， 25ug/ml ， 12. 5ug/ml ， 6. 25ug/ml ， 3. 125ug/ ml，l. 5625ug/ml稀釋成不同濃度，選定包被抗原1 : 800，抗體1 : 2000作為建立標(biāo)準(zhǔn)曲 線的抗原抗體組合。所得結(jié)果經(jīng)0rigin7.0軟件計(jì)算并作圖(圖3)，根據(jù)曲線確定抑制中 濃度IC50為50-60ug/ml。
ug/ml 圖3基于血清建立的50%加樣量icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(BO和B分別為沒(méi)有血竭素和 有血竭素時(shí)的OD值) 實(shí)施例6、中藥材血竭真?zhèn)蔚蔫b定 (1)將血竭和甘草lg于研缽中，研磨后，95X甲醇提取過(guò)夜，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，加?品稀釋液稀釋。 (2)取血竭素-OVA抗原，用包被液按1 : 800稀釋?zhuān)瑢?6孔酶聯(lián)板用蒸餾水洗滌
后，每孔加入所配血竭素-OVA抗原稀釋液100 iU，于37。C保溫3h ; (3)取小鼠抗血清，用樣品稀釋液l : 2000稀釋?zhuān)每寡逑♂屢海?br> (4)取出酶聯(lián)板，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干，加入樣品液50iil，再加 入50 ill抗血清稀釋液，對(duì)照加入100 ii 1水，放37t:保溫箱中保溫30min ;
(5)棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗4次后甩干后，每孔加入經(jīng)1 : 2000稀釋的HRP-山 羊抗小鼠IgG100iil，放入37。C保溫箱中保溫30min ; (6)酶聯(lián)板用洗滌液洗滌4次甩干后，每孔加入底物OPD_H202溶液100 iU， 37"C保 溫箱中保溫10min后用50 iil 2M H2S04終止反應(yīng)。 結(jié)果顯示，血竭提取液的孔與甘草粉提取液的孔顏色有明顯不同，含有血竭素的 顏色淺，不含有的顏色深，由此可鑒定血竭的真?zhèn)巍?br> 權(quán)利要求
血竭素抗體，是用血竭素抗原免疫動(dòng)物，然后從被免疫動(dòng)物的血清中分離得到的；所述血竭素抗原按如下過(guò)程制備先將血竭素溶解在甲醇中，然后加入適量的對(duì)氨基苯甲酰肼，TLC跟蹤血竭素反應(yīng)完全，生成化合物1，然后將化合物1重氮化后與載體蛋白連接，得到血竭素抗原。
2. —種制備血竭素抗體的方法，是用血竭素抗原免疫動(dòng)物，然后從被免疫動(dòng)物的血清 中分離得到血竭素抗體，其特征在于先將血竭素溶解在甲醇中，然后加入適量的對(duì)氨基苯 甲酰肼，TLC跟蹤血竭素反應(yīng)完全，生成化合物l，然后將化合物1重氮化后與載體蛋白連 接，得到血竭素抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述載體蛋白需先在O-l(TC條件下溶解 于pH9-10的碳酸鹽緩沖液中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述載體蛋白選自牛血清白蛋白、人血清 白蛋白、蘭素蛋白或卵清白蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述得到血竭素抗原后，對(duì)其進(jìn)行透析或 過(guò)s印hadex G-25柱以除去未聯(lián)結(jié)的血竭素及有機(jī)溶劑，然后冷凍干燥以濃縮制備得到血 竭素抗原。
6. 血竭素抗體在鑒定中藥材血竭真?zhèn)沃械膽?yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于鑒定過(guò)程包括如下步驟(1) 血竭和待測(cè)藥材經(jīng)95 %的甲醇提取，提取液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊螅舆m量樣品稀釋液成 樣品液；(2) 應(yīng)用血竭素抗體采用ELISA方法檢測(cè)樣品液；(3) 通過(guò)觀察樣品液的顏色，鑒別樣品的真?zhèn)巍?br> 8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于步驟(2)所述應(yīng)用血竭素抗體采用ELISA 方法檢測(cè)樣品液按如下步驟進(jìn)行(1) 用血竭素包被抗原包被酶聯(lián)板；(2) 向酶聯(lián)板上同時(shí)加入血竭素樣品和血竭素抗體，反應(yīng)過(guò)后加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行反應(yīng)；(3) 加入0PD-H202溶液底物后終止反應(yīng)。
9. 包括權(quán)利要求1所述血竭素抗體的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了血竭素抗體及其制備方法與應(yīng)用，涉及小分子抗體及其制備與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供血竭素抗體及其制備方法，以及血竭素抗體在鑒定中藥材血竭素真?zhèn)紊系膽?yīng)用。本發(fā)明所提供的血竭素抗體，是用血竭素抗原免疫動(dòng)物，然后從被免疫動(dòng)物的血清中分離得到的；所述血竭素抗原按如下過(guò)程制備先將血竭素溶解在甲醇中，然后加入適量的對(duì)氨基苯甲酰肼，TLC跟蹤血竭素反應(yīng)完全，生成化合物1，然后將化合物1重氮化后與載體蛋白連接，得到血竭素抗原。應(yīng)用血竭素抗體采用ELISA方法檢測(cè)中藥材樣品，可以鑒定血竭真?zhèn)巍?br> 文檔編號(hào)C07K14/435GK101747433SQ20081018260
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者付梅紅, 何素平, 南鐵貴, 方婧, 林小玲, 王保民, 譚桂玉, 趙洪偉, 黃燕顏, 黃璐琦 申請(qǐng)人:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所;灝川生物科技有限公司