專利名稱：一種植物低分子量rna的快速提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從植物中提取低RNA的方法，具體的說涉及一種低分子量RNA的 快速提取方法，適用于絕大多數(shù)植物組織的低分子量RNA的提取。
背景技術(shù)：
目前，低分子量RNA(low molecular weight RNA， L麗RNA)是指細(xì)胞中分子 量較小、堿基數(shù)較少的一類RNA分子，主要包括長度為20-24個(gè)核苷酸長度的小干涉 RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和5S RNA等。這些RNA在細(xì)胞活動(dòng)過程中 扮演了非常重要的作用，特別是siRNA和miRNA對于基因表達(dá)的調(diào)控是目前的研究熱點(diǎn)。
低分子量RNA的提取是其研究的一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作。常規(guī)的低分子量RNA提取方法 一般分2步先分離總RNA，再從總RNA中分離出低分子量RNA。主要有兩種策略經(jīng)典策略 是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)從總RNA中分離純化低分子量RNA，該方法分離過程繁 瑣復(fù)雜，得率低。第二種策略就是在破碎細(xì)胞、去除細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)后，用氯化鋰、聚乙二 醇(PEG)等沉淀去除大分子量RNA和基因組DNA，再用醇沉淀回收低分子量RNA。但這種方 法也需要經(jīng)過多次的低溫沉淀和高速離心，低分子量RNA損失較大，且提取過程較長，容易 出現(xiàn)RNA降解。 無論采用上述哪種策略，其第一步都是破碎植物組織、細(xì)胞，將全部核酸從細(xì)胞 中釋放出來。由于植物組織中有大量的內(nèi)源RNA酶，因此需要將RNA酶完全抑制住，避免 RNA的降解。這一步中往往使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、 異硫氰酸胍等強(qiáng)烈去污劑， 一方面幫助打開細(xì)胞，另一方面抑制RNA酶。另外，乙二胺四乙 酸(EDTA)也是經(jīng)常使用的RNA酶抑制劑。由于植物組織中常常含有豐富的多糖、多酚等 代謝物質(zhì)，不利于RNA的分離純化，因此，在這一步中還經(jīng)常使用聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、 P-巰基乙醇(P-ME)等去除多糖，抑制多酚氧化酶，以提取較高純度的RNA。
對于低分子量RNA的提取，不僅要求無RNA酶降解、無多酚多糖等污染，還要求沒 有DNA、高分子量RNA殘留。因此需要采用各種方法將DNA、高分子量RNA去除干凈，而且還 盡量減少低分子量RNA的損失。常規(guī)方法通過分級分離的方法，經(jīng)過數(shù)次沉淀才能提取比 較純凈的分子量RNA，而且還有被降解的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是為了解決上述技術(shù)問題而設(shè)計(jì)的一種植物中低分子量RNA的快速提 取方法。 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是 —種植物低分子量RNA的快速提取方法，提取緩沖液配比為2% PVP、2% CTAB、 0. IM至O. 6M醋酸鈉、25mM EDTA、2X的P _ME，提取緩沖液pH值范圍是4. 0_8. 0 ;植物中低 分子量RNA的提取方法是按如下步驟實(shí)現(xiàn)
①將提取緩沖液于65t:預(yù)熱30分鐘；
②取植物新鮮的組織樣品，于液氮中迅速研磨成粉末； ③按每lmL提取緩沖液中0. lg新鮮樣品的比例，將磨好的樣品粉末迅速轉(zhuǎn)移到提 取緩沖液中，于65t:水浴20分鐘，其間不斷震蕩；冰上冷卻后，加入等體積的配比為25 : 24 : i的水飽和酚氯仿異戊醇，混
勻，劇烈渦漩1-2分鐘，于4°C ， 20000g離心5分鐘; ⑤取上清，加入等體積配比為24 : i的氯仿異戊醇，劇烈混勻后，于4t:，20000g
離心5分鐘； ⑥取上清，加入等體積異丙醇，混勻后冰上放置10分鐘后，于4°C ， 20000g離心20 分鐘； ⑦棄上清，用80%酒精洗滌2次，超凈臺上放置至乙醇完全揮發(fā)；
⑧用20 ill DEPC水充分溶解RNA， -70。C低溫保存。
所述提取緩沖液使用低濃度鹽為0. 1至0. 6M的醋酸鈉溶液。
所述提取緩沖液pH值為5. 2。 本發(fā)明的有益效果是提供了一種全新的低分子量RNA提取方法，其核心思想是在 0. 1 0. 6M的NaAC低鹽環(huán)境中沉淀、去除DNA和高分子量RNA，再通過醇沉淀回收低分子 量RNA。根據(jù)分光光度分析和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，表明提取的的分子量RNA完整性 好、純度高、提取產(chǎn)率大。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過程簡單快速，適合各種植物組織的低分子量RNA提 取。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。 —種植物低分子量RNA的快速提取方法，提取緩沖液配比為2% PVP、2% CTAB、
0. IM至O. 6M醋酸鈉、25mM EDTA、2X的P-ME，提取緩沖液pH值范圍是4. 0-8. 0。 本實(shí)例中使用的植物組織是新鮮、幼嫩的番木瓜、擬南芥、木薯和橡膠樹的葉片。 植物中低分子量RNA的提取方法是按如下步驟實(shí)現(xiàn) ①將提取緩沖液于65t:預(yù)熱30分鐘； ②取植物新鮮的組織樣品，于液氮中迅速研磨成粉末； ③按每lmL提取緩沖液中0. lg新鮮樣品的比例，將磨好的樣品粉末迅速轉(zhuǎn)移到提 取緩沖液中，于65t:水浴20分鐘，其間不斷震蕩；冰上冷卻后，加入等體積的配比為25 : 24 : i的水飽和酚氯仿異戊醇，混
勻，劇烈渦漩1-2分鐘，于4°C ， 20000g離心5分鐘; ⑤取上清，加入等體積配比為24 : 1的氯仿異戊醇，劇烈混勻后，于4t:，20000g
離心5分鐘； ⑥取上清，加入等體積異丙醇，混勻后冰上放置10分鐘后，于4°C ， 20000g離心20 分鐘； ⑦棄上清，用80%酒精洗滌2次，超凈臺上放置至乙醇完全揮發(fā)； ⑧用20 ill DEPC水充分溶解RNA， -70。C低溫保存。 所述提取緩沖液使用低濃度鹽為0. 1至0. 6M的醋酸鈉溶液。 所述提取緩沖液pH值為5. 2。
本發(fā)明提供了一種快速、高效的低分子量RNA提取方法，其基本原理是在破碎細(xì) 胞后，基因組DNA和大分子量RNA分別與蛋白質(zhì)形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物和RNA-蛋白復(fù)合 物，這些DNA-蛋白復(fù)合物和RNA-蛋白復(fù)合物在酸性、低鹽環(huán)境中不溶解，可以通過酸酚抽 提去除。低分子量RNA則留在上清溶液中，可以通過乙醇或異丙醇沉淀回收。該提取方法 快速、高效，經(jīng)過酚抽提后只需一步沉淀就可以回收低分子量RNA。該方法提取的低分子量 RNA純度高，可用于低分子量RNA的克隆和Northern印跡雜交檢測。 常規(guī)的低分子量RNA提取通常采用分步抽提的方法，依次從細(xì)胞抽提液中除去蛋 白質(zhì)、DNA、高分子量RNA等，最后再通過異丙醇等沉淀回收小RNA，步驟多而且繁瑣，一方面 降低了低分子量RNA的得率，另一方面增加了 RNA降解的幾率。因此，我們發(fā)明了一種小 RNA的快速提取方法，其核心部分是在0. 1-0. 6M的低濃度醋酸鈉(NaAC)緩沖液中，DNA和 大分子量RNA分別與蛋白質(zhì)結(jié)合形成不溶的DNA-蛋白復(fù)合物以及RNA-蛋白復(fù)合物，通過 酚/氯仿抽提除去這些DNA-蛋白復(fù)合物和RNA-蛋白復(fù)合物后，即可從上清液中沉淀回收 低分子量的RNA。該方法簡便快速，適用于各種組織材料的提取。 由于DNA和RNA在不同濃度的鹽溶液中溶解度不同，因此不同醋酸鈉鹽濃度的提 取緩沖液的提取效果差別很大。通過測試不同材料，在0. 4M的濃度下，多數(shù)植物材料都可 以高效的提取低分子量RNA，然而，由于各組織內(nèi)的緩沖環(huán)境不同，部分材料可能會出現(xiàn)基 因組DNA和大分子量RNA殘留，可以通過降低NaAC濃度的方法來去除。如在無菌培養(yǎng)基上 生長的擬南芥幼苗的最合適NaAC濃度是0. 3M，而在土壤中培養(yǎng)的擬南芥葉片則需要0. 4M NaAC ;對于薄荷、三角梅等植物葉片，0. 1M的NaAC已經(jīng)足夠，稍高一些就會有DNA殘留；而 對于橡膠樹幼嫩葉片，O. 4 0. 6M的濃度都可以提取出干凈的低分子量RNA。
另外，提取緩沖液的pH值也會影響到提取效果。通過本方法，提取緩沖液的pH在 4. 0 8. 0之間都可以有效的提取出低分子量RNA，但pH在5. 2時(shí)提取效果最好，因此采用 pH5. 2的NaAC緩沖體系。 由于植物組織都含有內(nèi)源RNA酶以及多糖、多酚類物質(zhì)，因此提取緩沖液中還添 加了 2%的CTAB以及EDTA等RNA酶抑制劑，并在提取緩沖液中添加2% PVP和2%的P -巰 基乙醇(P-ME)，從而有效的防止褐化。 本發(fā)明不局限于上述最佳實(shí)施方式，任何人在本發(fā)明的啟示下得出的其他任何與 本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種植物低分子量RNA的快速提取方法，其特征在于提取緩沖液配比為2％PVP、2％CTAB、0.1M至0.6M醋酸鈉、25mM EDTA、2％的β-ME，提取緩沖液pH值范圍是4.0-8.0；植物中低分子量RNA的提取方法是按如下步驟實(shí)現(xiàn)①將提取緩沖液于65℃預(yù)熱30分鐘；②取植物新鮮的組織樣品，于液氮中迅速研磨成粉末；③按每1mL提取緩沖液中0.1g新鮮樣品的比例，將磨好的樣品粉末迅速轉(zhuǎn)移到提取緩沖液中，于65℃水浴20分鐘，其間不斷震蕩；④冰上冷卻后，加入等體積的配比為25∶24∶1的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇，混勻，劇烈渦漩1-2分鐘，于4℃，20000g離心5分鐘；⑤取上清，加入等體積配比為24∶1的氯仿∶異戊醇，劇烈混勻后，于4℃，20000g離心5分鐘；⑥取上清，加入等體積異丙醇，混勻后冰上放置10分鐘后，于4℃，20000g離心20分鐘；⑦棄上清，用80％酒精洗滌2次，超凈臺上放置至乙醇完全揮發(fā)；⑧用20μl DEPC水充分溶解RNA，-70℃低溫保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物低分子量RNA的快速提取方法，其特征在于提取 緩沖液使用低濃度鹽為0. 1至0. 6M的醋酸鈉溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物低分子量RNA的快速提取方法，其特征在于提取 緩沖液pH值為5.2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物低分子量RNA的快速提取方法，在破碎細(xì)胞后，基因組DNA和大分子量RNA分別與蛋白質(zhì)形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物和RNA-蛋白復(fù)合物，這些DNA-蛋白復(fù)合物和RNA-蛋白復(fù)合物在酸性、低鹽環(huán)境中不溶解，可以通過酸酚抽提去除。低分子量RNA則留在上清溶液中，可以通過乙醇或異丙醇沉淀回收。該提取方法快速、高效，經(jīng)過酚抽提后只需一步沉淀就可以回收低分子量RNA。該方法提取的低分子量RNA純度高，可用于低分子量RNA的克隆和Northern印跡雜交檢測。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過程簡單快速，適合各種植物組織的低分子量RNA提取。
文檔編號C07H21/00GK101735297SQ20081018483
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日
發(fā)明者安澤偉, 程漢, 高靜, 黃華孫 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所