專利名稱：拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合及其表達(dá)載體，以及通過該拆分
熒光蛋白的融合蛋白的組合篩選病毒包膜蛋白的受體的方法，和篩選膜融合的促進(jìn)劑或抑 制劑的方法。特別是可以通過顯示在細(xì)胞膜上的螢光來篩選病毒包膜蛋白的受體的方法， 以及，篩選膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
膜融合是生物系統(tǒng)中非常普遍的現(xiàn)象。肌肉發(fā)生，受精作用，以及囊泡的運(yùn)輸過程 中都涉及到膜融合。具有包膜的病毒侵染宿主細(xì)胞，同樣依賴于膜融合。膜融合是由兩個(gè) 膜所分開的兩個(gè)獨(dú)立區(qū)室發(fā)生合并形成一個(gè)區(qū)室的過程。人們可以使用多種不同的技術(shù)監(jiān) 測(cè)這個(gè)過程。 一種方法是使用一對(duì)拆分蛋白，當(dāng)它們相互重新結(jié)合的時(shí)候，將會(huì)重新獲得其 整體蛋白的活性。 膜融合是有包膜病毒(其中一些與新發(fā)傳染病相關(guān)，例如禽流感，SARS以及艾滋 病)侵入宿主細(xì)胞時(shí)首先要發(fā)生的步驟。在這些新發(fā)傳染病中，HIV-1的感染以及AIDS已 對(duì)人類的健康形成了全球性的威脅。在結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的融合抑制劑獲得成功之后，HIV-1包膜 蛋白(Env)成為了一個(gè)重要的抗HIV-1化療耙點(diǎn)(Chan，1997 ;Weissenhorn， 1997 ;Eckert，
2001 ;Este，2007 ;Poveda， 2005)。最近，研究人員設(shè)計(jì)出了一種旨在干擾Env與其輔助受體 CCR5相互作用的新型抑制劑(Santoro，2004)。因此，Env介導(dǎo)的膜融合的表型鑒定方法對(duì) 于新抑制劑的研發(fā)或者藥物抗性突變株的評(píng)估是非常有價(jià)值的(01son，2003)。 對(duì)于HIV-1，研究人員利用細(xì)胞-細(xì)胞或者病毒_細(xì)胞的膜融合分析方法已經(jīng)設(shè) 計(jì)出了一些能產(chǎn)生可測(cè)量或者可辨別信號(hào)的表型鑒定方法。其中，觀察合胞體的形成是最 簡(jiǎn)單的方法(Kimpton， 1992);但這種方法不能保證客觀且定量。利用在膜融合過程中，從 一個(gè)區(qū)室到另一個(gè)區(qū)室發(fā)生的物質(zhì)轉(zhuǎn)移所釋放出的信號(hào)，如可視染料，轉(zhuǎn)錄因子，自我互補(bǔ) 的蛋白質(zhì)片斷，是分析膜融合的主要方法手段(Lin，2005 ;Sakamoto，2003 ;Bl咖enthal，
2002 ;Barbeau， 1998 ;Furuta， 2006)。使用這類方法，通過光學(xué)設(shè)備的監(jiān)測(cè)，如激光共聚 焦顯微鏡，加載到膜上或者胞質(zhì)中的染料的移動(dòng)能提供膜融合的詳細(xì)信息(Blumenthal， 2002)。還可以通過流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)完成高通量的分析(Huerta，2002 ;Lin，2003)。
但前者并不能處理太多的樣品，而后者需要進(jìn)一步優(yōu)化將細(xì)胞聚集現(xiàn)象和真正 的融合現(xiàn)象區(qū)分出來(Huerta，2006)。研究人員也廣泛地使用轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)對(duì)膜融合的 檢測(cè)，例如使用T7RNA聚合酶(T7RNApo1)或者Tat，與他們所識(shí)別的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基 因(Feng， 1996 ;Lin，2005 ;Sakamoto, 2003 ;Barbeau， 1998)。此方法既敏感而且可以定量， 但是由于報(bào)告基因存在轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，因而具有一段延遲時(shí)間。同時(shí)，那些具有自我 互補(bǔ)能力的蛋白片斷，特別是拆分的酶，由于具有通用性也被研究人員經(jīng)常用到；但由于 大部分的酶底物不具有膜通透性，這樣的分析方法通常需要破壞細(xì)胞膜(Holland, 2004 ; J皿，2007)。這樣就不能夠?qū)δと诤鲜录M(jìn)行連續(xù)地監(jiān)測(cè)。也有人使用電生理記錄的方法 (Monck， 1992)，但是這種方法使用并不廣泛，因?yàn)槠浞椒ń⒎浅?fù)雜并且能夠同時(shí)分析的事件數(shù)目太少。 所以在現(xiàn)有技術(shù)里就不存在一種技術(shù)，即為對(duì)大量樣品既迅速又準(zhǔn)確地鑒定Env 介導(dǎo)的膜融合的表型的方法。同時(shí)也缺乏一種簡(jiǎn)便地篩選病毒包膜蛋白的受體的方法，和 一種簡(jiǎn)便地篩選膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的方法。

發(fā)明內(nèi)容
( — )發(fā)明的摘要
(發(fā)明所要解決的問題) 本發(fā)明經(jīng)過對(duì)大量拆分蛋白的研究和實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)利用基因工程改造的拆分綠色熒 光蛋白(GFP)開發(fā)了一種基于細(xì)胞的通用膜融合檢測(cè)方法。這種方法可以解決前述問題， 即迅速又準(zhǔn)確地鑒定Env介導(dǎo)的膜融合的表型的方法。同時(shí)也提供一種簡(jiǎn)便地篩選病毒包 膜蛋白的受體的方法，和一種簡(jiǎn)便地篩選膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的方法。 [OOW] (二)發(fā)明的詳細(xì)說明 本發(fā)明的目的是提供一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，包括第一拆分 熒光蛋白的融合蛋白和第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分熒光蛋白的 融合蛋白，為可自我重新結(jié)合的已被拆分的熒光蛋白的一部分和一種和磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol)結(jié)合的蛋白的融合蛋白；第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，為前述 熒光蛋白的剩余部分和前述的磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)結(jié)合的蛋白的融合蛋 白，其特征在于，前述的第一拆分熒光蛋白的融合蛋白與前述第二拆分熒光蛋白的融合蛋 白結(jié)合后，前述熒光蛋白可以自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光功能，從而發(fā)出熒光。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種病毒包膜蛋白的受體的篩選方法，該方法包括 以下步驟a)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b)將 本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中 表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體，c)混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，d)檢 驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì)胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式融合后的熒光，該螢光為前述 第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的篩選方法，該方法 包括以下步驟a)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)， b)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì) 胞中表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體，c)加入促進(jìn)或抑制病毒包膜蛋 白與受體結(jié)合的促進(jìn)劑或抑制劑，d)混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，e)檢驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì) 胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式而融合后的熒光，該螢光為前述第一熒光蛋白和前 述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。 本發(fā)明是利用基因工程改造的拆分綠色熒光蛋白(GFP)開發(fā)了一種基于細(xì)胞的 通用膜融合檢測(cè)方法。其原理在于這種拆分GFP蛋白在膜融合的時(shí)候會(huì)發(fā)生重新結(jié)合，進(jìn) 而能夠發(fā)出熒光。本發(fā)明將為膜周邊蛋白(PMP :peripheralmembrane protein)融合到拆 分GFP蛋白的N末端就可以進(jìn)一步將這個(gè)檢測(cè)信號(hào)定位到膜上。 如果將膜周邊蛋白的一種ra結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology domain)融合到拆分 GFP蛋白的N末端就可以進(jìn)一步將這個(gè)檢測(cè)信號(hào)定位到膜上。當(dāng)使用該方法檢測(cè)HIV-lEnv
5介導(dǎo)的膜融合過程的時(shí)候，在共培養(yǎng)的30分鐘后即可檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)。使用該方法不
加入任何其它外源性底物即可進(jìn)行活體細(xì)胞監(jiān)測(cè)。(具體實(shí)施形態(tài)) 以下通過提供本發(fā)明的具體實(shí)施形態(tài)來說明本發(fā)明，但是這里說明的具體實(shí)施形 態(tài)只是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例而已，不是用來限定本發(fā)明的范圍以及其等同范圍的。屬于本 技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)者可以容易地理解本說明書所記述的發(fā)明范圍以及本發(fā)明的等同范圍。
(第一實(shí)施形態(tài)) 本發(fā)明的第一實(shí)施形態(tài)為提供一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，包括第 一拆分熒光蛋白的融合蛋白和第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分熒光蛋白 的融合蛋白，為可自我重新結(jié)合的已被拆分的熒光蛋白的一部分和一種和磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol)結(jié)合的蛋白的融合蛋白；第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，為前述 熒光蛋白的剩余部分和前述的磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)結(jié)合的蛋白的融合蛋 白，其特征在于，前述的第一拆分熒光蛋白的融合蛋白與前述第二拆分熒光蛋白的融合蛋 白結(jié)合后，前述熒光蛋白可以自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光功能，從而發(fā)出熒光。
本發(fā)明不局限特定的拆分熒光蛋白，可以使用的拆分熒光蛋白可以是現(xiàn)有的技術(shù) 中存在的所有的可拆分的熒光蛋白(fluorescent)或是可拆分的冷光(luminescent)蛋 白，也可以使用拆分熒光酶。因?yàn)橥ㄟ^加入酶的對(duì)應(yīng)底物(substrate)就可以定量地測(cè)量 拆分熒光酶的活性(activity)。 另外本發(fā)明中的所謂的「拆分」是指，在蛋白的氨基酸序列的一個(gè)點(diǎn)上將蛋白拆分 為兩部分，而這被拆分的兩部分可能自我重新結(jié)合后恢復(fù)其原來的功能。這里所謂的「自我 重新結(jié)合」包括自我重聚(self-reassociate)或是自我再組(self reassemble)等形式。
在本發(fā)明中優(yōu)先采用的拆分熒光蛋白為，綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein, GFP)。本發(fā)明采用的一種和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)結(jié)合的蛋白為 膜周邊蛋白(PMP :peripheralmembrane protein)，優(yōu)選PH結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology domain)。因?yàn)閷⒛ぶ苓叺鞍缀捅徊鸱值臒晒獾鞍椎囊徊糠秩诤虾?，表達(dá)在細(xì)胞膜附近的當(dāng) 該融合蛋白和該熒光蛋白的另一部結(jié)合后就會(huì)導(dǎo)致熒光蛋白的自我重新結(jié)合發(fā)出螢光，所 以可以通過檢驗(yàn)顯示在細(xì)胞膜上的螢光，即迅速又準(zhǔn)確地判斷細(xì)胞融合是否發(fā)生。
本實(shí)施形態(tài)所優(yōu)選的ra結(jié)構(gòu)域是人磷脂酶c s的ra結(jié)構(gòu)域，由10個(gè)79堿基長(zhǎng)
度的寡居核苷酸組裝合成的。另外優(yōu)化的拆分熒光蛋白為GFP，其拆分點(diǎn)在氨基酸序列的第 214和第215之間，可以將GFP拆分成GFP卜10和GFPn兩部分。 因此，本實(shí)施形態(tài)優(yōu)選的第一拆分熒光蛋白的融合蛋白和第二拆分熒光蛋白的融 合蛋白分別為，ra和GFP卜^的融合蛋白或ra和GFPn的融合蛋白，拆分熒光蛋白的融合蛋
白的組合為ra和gfp卜1Q的融合蛋白以及ra和gfpu的融合蛋白的組合。其融合蛋白的序
列如下； PH和GFP!—10的融合蛋白(ra-split-GFPw) (SEQ ID No :1)
(PH :1-170， linker :171—172， splitGFP卜10 :173—386)TVLSKDPNE PH禾口GFPn的融合蛋白(PH-split-GFPn) (SEQ ID No :2)
(PH :1-170， linker :171-172， splitGFPn :173-189)
SCLRKADKNKDNKMSFKELQNFLKEFKRDHMVLHEYVNAAGIT
(第二實(shí)施形態(tài)) 本發(fā)明的第二實(shí)施形態(tài)為一種表達(dá)載體的組合，包括第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載 體，其特征在于，第一表達(dá)載體包括表達(dá)前述第一拆分熒光蛋白的融合蛋白的基因，第二表 達(dá)載體包括表達(dá)前述第二拆分熒光蛋白的融合蛋白的基因。
本實(shí)施形態(tài)中的表達(dá)載體組合中的第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體的具體例為，ra
和GFP卜1Q的融合蛋白基因的表達(dá)載體，ra和GFPU的融合蛋白基因的表達(dá)載體。 本實(shí)施形態(tài)中的表達(dá)載體可以使用質(zhì)粒載體等本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的
表達(dá)載體。 本發(fā)明的第二實(shí)施形態(tài)為一種表達(dá)載體的組合，其中，前述第一表達(dá)載體和前述
第二表達(dá)載體中的任一個(gè)為包膜蛋白表達(dá)載體，再包括了表達(dá)病毒包膜蛋白的基因，該包
膜蛋白表達(dá)載體可以同時(shí)表達(dá)包膜蛋白以及第一拆分熒光蛋白的融合蛋白或第二拆分熒
光蛋白的融合蛋白。由此，本實(shí)施形態(tài)中的表達(dá)載體組合優(yōu)選以下兩組 A.包括HIV-1的包膜蛋白的基因，ra和GFP卜w的融合蛋白的基因的表達(dá)載體，以
及，包括ra和GFPn的融合蛋白的基因的表達(dá)載體的組合； B.包括HIV-1的包膜蛋白的基因，ra和GFPn的融合蛋白的基因的表達(dá)載體，以 及，包括ra和GFP卜1Q的融合蛋白的基因的表達(dá)載體的組合； [OO38](第三實(shí)施形態(tài)) 本發(fā)明的第三實(shí)施形態(tài)為一種病毒包膜蛋白的受體的篩選方法，該方法包括以下
步驟a)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b)將本發(fā)
明(權(quán)利要求5)所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中表達(dá)，
該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體，c)混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，d)檢驗(yàn)第一
細(xì)胞和第二細(xì)胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式融合后的熒光，該螢光為前述第一熒
光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。 本實(shí)施形態(tài)是一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合的使用，它用于病毒包膜蛋白
的受體的篩選方法的形態(tài)。因?yàn)楸景l(fā)明的拆分熒光蛋白在自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光
功能，從而發(fā)出熒光，所以，轉(zhuǎn)染在不同的細(xì)胞里第一拆分熒光蛋白的融合蛋白和第二拆分
熒光蛋白的融合蛋白只有在其細(xì)胞融合之際才能自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光功能，從
而發(fā)出熒光。通過檢驗(yàn)螢光(GFP的信號(hào))就可以檢驗(yàn)出細(xì)胞是否融合。而且因?yàn)楸緦?shí)施
形態(tài)的被拆分熒光蛋白和膜周邊蛋白相結(jié)合，所以當(dāng)細(xì)胞融合時(shí)，通過顯示在細(xì)胞表面的
螢光來即時(shí)的判斷細(xì)胞是否發(fā)生融合。 本實(shí)施形態(tài)優(yōu)選通過病毒包膜蛋白和其對(duì)應(yīng)的受體的結(jié)合而發(fā)生的細(xì)胞融合。比
7如HIV-1的包膜蛋白和受體CD4與其輔助受體CCR5或受體CD4與其輔助受體CXCR4的結(jié)
合會(huì)導(dǎo)致含有HIV-1的包膜蛋白的細(xì)胞和含有受體CD4與其輔助受體CCR5或受體CD4與
其輔助受體CXCR4的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞融合。本實(shí)施形態(tài)可以篩選HIV-1的包膜蛋白的受體是
CD4與其輔助受體CCR5還是受體CD4與其輔助受體CXCR4，或是其兩者。 本實(shí)施形態(tài)的第一步驟為本發(fā)明所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，
這樣就產(chǎn)生了包括包膜蛋白以及第一拆分熒光蛋白的融合蛋白或第二拆分熒光蛋白的融
合蛋白的第一細(xì)胞。本實(shí)施形態(tài)的第二步驟為本發(fā)明所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基
因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體，這樣
就產(chǎn)生了只含有第一細(xì)胞內(nèi)的包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體和另外一個(gè)拆分熒光蛋白的融合蛋
白的第二細(xì)胞。 在混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞后(本實(shí)施形態(tài)的第三步驟)，只有在包膜蛋白和其 對(duì)應(yīng)的受體存在下才可能發(fā)生第一細(xì)胞和第二細(xì)胞的融合以及檢測(cè)到，GFP卜w和GFPn重組 后的螢光。所以本實(shí)施形態(tài)可以通過細(xì)胞表面上顯示的螢光的測(cè)試來篩選包膜蛋白所對(duì)應(yīng) 的受體。 另外，為了提高篩選包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體的效率，本實(shí)施形態(tài)里還可以增加一
個(gè)篩選第一細(xì)胞和第二細(xì)胞的步驟。(第四實(shí)施形態(tài)) 本發(fā)明的第四實(shí)施形態(tài)為一種膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的篩選方法，該方法包括 以下步驟a)將本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b)將 本發(fā)明(權(quán)利要求5)所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中 表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體，c)加入促進(jìn)或抑制病毒包膜蛋白與 受體結(jié)合的促進(jìn)劑或抑制劑，d)混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，e)檢驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì)胞通 過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式而融合后的熒光，該螢光為前述第一熒光蛋白和前述第 二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前的螢光。 從前述的第三實(shí)施形態(tài)可以知道，如果采用和HIV-1的包膜蛋白對(duì)應(yīng)的受體，第 一細(xì)胞和第二細(xì)胞一般會(huì)融合。在此前提下，在細(xì)胞融合時(shí)再添加抑制劑的話，就可以通過 細(xì)胞表面上顯示的螢光的測(cè)試來篩選抑制細(xì)胞融合，也就是抑制HIV-1的包膜蛋白和其對(duì) 應(yīng)的受體結(jié)合的抑制劑。同樣也可以通過細(xì)胞表面上顯示的螢光的測(cè)試來篩選促進(jìn)細(xì)胞融 合，也就是促進(jìn)HIV-1的包膜蛋白和其對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合的促進(jìn)劑。 另外，為了提高篩選包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體的效率，本實(shí)施形態(tài)里還可以增加一
個(gè)篩選第一細(xì)胞和第二細(xì)胞的步驟。(三)發(fā)明的效果 本發(fā)明通過提供一種新穎的拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合并開發(fā)了一種基于 細(xì)胞的膜融合檢測(cè)方法。由于不需要其他的外源性底物，該方法可以節(jié)省開支和勞力。此 外，本發(fā)明可以在分析中使用相同的活體細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)測(cè)膜融合的過程。這兩個(gè)特性都非常 適用于高通量地篩選那些作用于膜融合過程中不同時(shí)間點(diǎn)的新膜融合抑制劑。如果使用 CCR5/CD4+細(xì)胞和CXCR4/CD4+細(xì)胞，這個(gè)方法可以很容易地應(yīng)用與檢測(cè)HIV-lEnv的指向 (嗜性)，將會(huì)對(duì)于新藥開發(fā)很有幫助。當(dāng)然，也可以容易地監(jiān)測(cè)除HIV-1外其它病毒的膜 融合過程。
另外使用不同的胞內(nèi)定位標(biāo)記之后，所產(chǎn)生的綠色熒光信號(hào)可以用于檢測(cè)兩個(gè)區(qū) 室之間的信息交流，例如囊泡運(yùn)輸。且GFPn蛋白具有分子量較小的優(yōu)點(diǎn)，可以使用前人工 作中所述方法與其它蛋白融合。


圖1為本發(fā)明中所使用質(zhì)粒的圖譜。(A)圖片上部，表達(dá)HIV-1包膜蛋白的 pNHcRedEluc質(zhì)粒圖譜，pCMV :人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，NLS :核定位信號(hào)，HcRed :紅色熒光蛋 白，f-Luc :螢火蟲熒光素酶，MSD :跨膜區(qū)，AmpR :氨芐青霉素抗性基因。圖片下部，所用MSD 的一級(jí)結(jié)構(gòu)。WT :野生型，VSV-G :水泡性口炎病毒G蛋白，GpA :血型糖蛋白A.預(yù)測(cè)的MSD 區(qū)域使用大寫字母表示。(B)拆分GFP蛋白的表達(dá)載體。其中質(zhì)粒骨架pdEGFP(圖片上 部)是通過刪除EGFP-N2質(zhì)粒Smal和BsrGI之間的EGFP基因序列獲得。MCS :多克隆位 點(diǎn)，spGFP :拆分GFP的插入位點(diǎn)，pSV40 :來源于SV40的啟動(dòng)子區(qū)域，SV40ori :SV40的復(fù)制 起始位點(diǎn)，Kan/NeoR :卡那霉素/新霉素抗性基因。(圖片下部)不同的spGFP蛋白。ffl domain :Pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域。GFP的下標(biāo)數(shù)字表示引入拆分點(diǎn)的GFP蛋白P折疊的位 點(diǎn)。圖中標(biāo)示了所用限制性酶切位點(diǎn)。 圖2為拆分GFP蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。(A)免疫印跡分析轉(zhuǎn)染了 GFP卜1Q和 ra-GFP^w的293CD4細(xì)胞，使用抗GFP抗體。圖中標(biāo)示了所表達(dá)的蛋白。EGFP :細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 增強(qiáng)型GFP蛋白。(B)轉(zhuǎn)染了 GFPn-FLAG或者PH_GFPn-FLAG表達(dá)載體的293FT細(xì)胞的蛋白 表達(dá)，使用抗FLAG單克隆抗體。(C)使用顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中單個(gè)拆分GFP蛋白的GFP 信號(hào)。BF表示明場(chǎng)，GFP:綠色熒光信號(hào)。 圖3為拆分GFP蛋白的胞內(nèi)定位。(A)轉(zhuǎn)染了 GFP卜1Q或者ffl-GFP卜1Q細(xì)胞的免疫 熒光檢測(cè)，使用抗GFP抗體。(B)轉(zhuǎn)染了 GFPU-FLAG， PH_GFPU-FLAG以及PH_GFPU表達(dá)質(zhì)粒 的細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，使用抗FLAG抗體。(C) ra-GFPh1Q或者GFP卜1Q與ra_GFPn， GFPU的共 轉(zhuǎn)。 圖4為通過膜融合產(chǎn)生綠色熒光信號(hào)。使用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染了相應(yīng)拆 分GFP蛋白表達(dá)載體的包膜表達(dá)細(xì)胞和受體表達(dá)細(xì)胞間發(fā)生的細(xì)胞融合。
圖5為通過拆分GFP方法和T7RNA聚合酶(T7RNApo1)轉(zhuǎn)移分析方法分析HIV-lEnv 介導(dǎo)的膜融合的時(shí)間進(jìn)程(A)拆分GFP方法的結(jié)果。箭頭標(biāo)示出了在早期時(shí)間點(diǎn)觀察到的 GFP信號(hào)區(qū)域。(B)T7RNApol轉(zhuǎn)移分析方法的結(jié)果。融合效率使用轉(zhuǎn)移的T7RNApo1所激活 的海腎熒光素酶(RenillaLuciferase)活性表示。海腎熒光素酶的活性通過除以螢火蟲熒 光素酶活性以標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染效率。NC表示負(fù)對(duì)照，PC :正對(duì)照。
具體的實(shí)施方式
(實(shí)施例一 )(i)拆分熒光蛋白和ra結(jié)構(gòu)域以及表達(dá)載體的構(gòu)建 本實(shí)施例使用的是人磷脂酶c s的ra結(jié)構(gòu)域，由10個(gè)79堿基長(zhǎng)度的寡居核苷 酸組裝合成。通過PCR將這些寡居核苷酸結(jié)合組裝起來(94°C 30秒，5(TC 30秒，72。C 40 秒30個(gè)循環(huán))。類似的，優(yōu)化的GFP基因是由30段40nt每段具有18個(gè)堿基重疊的寡居 核苷酸組裝合成的，命名為GFPop、—n。這兩段擴(kuò)增得序列隨后被克隆到CR4Bl皿t-T0P0 中并測(cè)序。GFPopt卜n通過PCR拆分為GFPpw(l-642bp)和GFPn (643-696bp)，并克隆到pCR4Blunt-T0P0中。Kl-GFP卜1Q和PH_GFPU基因是通過結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因和拆分的GFP 基因獲得，隨后被克隆到pdEGFP中，構(gòu)建成相應(yīng)的表達(dá)載體pdra-GFP卜1Q和pdPH-GFPu (圖 IB)。通過在3'引物中引入FLAG標(biāo)記序列，使用PCR的方法將FLAG標(biāo)記引入到拆分GFP 的C末端。根據(jù)前人工作獲得的pElucEnv (Miyauchi，2005)，通過使用前面含有核定位信號(hào) (NLS)的紅色熒光蛋白HcRed替換原載體中的EGFP部分，發(fā)明人得到了這種載體的衍生形 式，一種新的HIV-lEnv表達(dá)載體，命名為pNHcRedEluc (圖1A)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率可以通過 紅色細(xì)胞核的數(shù)目或者螢火蟲熒光素酶活性來監(jiān)測(cè)。 [OO61] (2)細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 293FT細(xì)胞(Invi trogen)以及293CD4細(xì)胞(Miyauchi ， 2005)培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清(Hyclone)的Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基中(DMEM， Sigma) 。 293FT培養(yǎng)基中 按照說明書加入了終濃度為500ii g/ml的遺傳霉素(Gibco)。瞬轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中使用的是Fugene HD試劑(Roche)。表達(dá)ra-GFP卜1Q的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是使用電轉(zhuǎn)化(Biorad GenePulsar)的方 法將pcPH-GFP卜1Q轉(zhuǎn)入到293CD4細(xì)胞中建立。所轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過700 y g/ml遺傳霉素進(jìn)行篩 選。
(3)融合檢測(cè) 拆分GFP介導(dǎo)的融合檢測(cè)使用如下步驟進(jìn)行。將表達(dá)載體pNHcRedEluc和 pdra-GFPn轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞中。同時(shí)將pdra-GFPp1Q轉(zhuǎn)入293CD4細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染42小時(shí)后，將 轉(zhuǎn)染后的293FT細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后的293CD4細(xì)胞貼面培養(yǎng)，并使用IN Cell Analyzer 1000 (GE healthcare)觀察活體細(xì)胞的融合情況，或者將細(xì)胞固定(4%多聚甲醛)使用激光共聚焦 顯微鏡(Olympus FLU0VIEWFV1000)檢測(cè)選定時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞融合情況。除了實(shí)驗(yàn)中所使用的 載體是pNHcRedEluc，T7RNApo1轉(zhuǎn)移方法的融合檢測(cè)均按照前人所述方法進(jìn)行(Miyauchi， 2005)。 (4)蛋白分析 樣品的準(zhǔn)備和免疫印跡實(shí)驗(yàn)均按照前人所述方法完成(Miyauchi，2005)。其中抗 FLAG抗體來自Sigma公司?？笹FP抗體來自Santa Cruz Biotechnology公司?；瘜W(xué)發(fā)光 信號(hào)使用LAS30001ite(Fuji)檢測(cè)。
(5)免疫熒光檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用丙酮甲醇溶液(1 : l，體積比)于室溫處理15分鐘固定，并使用 抗FLAG抗體(3 ii g/ml)于3(TC溫育40分鐘。實(shí)驗(yàn)所使用二抗使用Alexa Fluor 555標(biāo) 記，熒光信號(hào)是使用激光共聚焦顯微鏡(Olympus FLU0VIEWFV1000)觀測(cè)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(l)蛋白表達(dá) GFP叩Vn和HI結(jié)構(gòu)域的DNA片段使用材料與方法部分所述方法生成。將圖1中 A和B所示表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中表達(dá)，并使用免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。當(dāng)使用抗GFP 抗體檢測(cè)的時(shí)候，GFP卜1Q和ra-GFPh1Q分別對(duì)應(yīng)為25kDa和40kDa的條帶(圖2A)，檢測(cè)到 的PH-GFPp1Q的分子量大小與PH-GFPp1Q(23kDa)和ffl結(jié)構(gòu)域(18kDa)之和所預(yù)測(cè)的大小 一致。在檢測(cè)GFPn的表達(dá)時(shí)，抗GFP抗體沒有能夠檢測(cè)到任何條帶(數(shù)據(jù)未顯示)。這可 能是由于GFPn只有17個(gè)氨基酸，分子量太小的緣故，或者是該片段上缺乏抗GFP抗體的抗 原表位的緣故。
因此發(fā)明人又使用了含有或者不含有HI結(jié)構(gòu)域的FLAG標(biāo)記GFPU用于免疫印跡 檢領(lǐng)"檢測(cè)到了 22kDa大小的ra-GFPu蛋白，但是沒有檢測(cè)到GFPU_FLAG蛋白(圖2B)。這 個(gè)結(jié)果表明不含ra結(jié)構(gòu)域的GFPn片段是不穩(wěn)定的。與所預(yù)期的一致，單獨(dú)的拆分GFP蛋 白和拆分ra-GFP蛋白是不產(chǎn)生熒光信號(hào)的(圖2C)。
(2)使用免疫熒光分析檢測(cè)了 HI結(jié)構(gòu)域的結(jié)合效果 理論上來講，ra結(jié)構(gòu)域能將拆分GFP蛋白定位到細(xì)胞質(zhì)膜附近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，
在不含有ra結(jié)構(gòu)域的時(shí)候，拆分的GFPhw在整個(gè)細(xì)胞中分布，而拆分的ra-GFP卜w則定位在
轉(zhuǎn)染細(xì)胞的外周(圖3A)。無法檢測(cè)到FLAG標(biāo)記的GFPn的表達(dá)(圖3B，上)，這與免疫印 跡的結(jié)果相一致(圖2B)。另一方面，可以在細(xì)胞外周檢測(cè)到含有FLAG標(biāo)記的ra-GFPn(圖 3B，中)。不含F(xiàn)LAG標(biāo)記的PH-GFPn無法用anti-FLAG抗體檢測(cè)到(圖3B，下)。
(實(shí)施例二 ) (1)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中拆分GFP蛋白和HI融合的拆分GFP蛋白的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。
發(fā)明人將一對(duì)拆分GFP蛋白的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至293FT細(xì)胞中。當(dāng)兩個(gè)拆分GFP蛋 白片段被共轉(zhuǎn)染后，可以觀察到綠色熒光信號(hào)(圖3C)。與圖2和圖3中所示數(shù)據(jù)一致的 是，如果轉(zhuǎn)入ra-GFPn可以產(chǎn)生綠色熒光信號(hào)，而轉(zhuǎn)入GFPU則不能。當(dāng)ra-GFPu與GFP卜1Q 共轉(zhuǎn)的時(shí)候，可以在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀測(cè)到均勻的綠色熒光信號(hào)。這個(gè)數(shù)據(jù)結(jié)果表明這兩 個(gè)片段的結(jié)合在它們被定位到質(zhì)膜上之前就發(fā)生了 。而ra-GFPh1Q和PH-GFPU共轉(zhuǎn)的時(shí)候， 觀測(cè)到主要的綠色熒光信號(hào)位于共轉(zhuǎn)細(xì)胞的邊緣，同時(shí)在胞質(zhì)中也觀測(cè)到了一些綠色熒光 信號(hào)。后者可能反映了蛋白的結(jié)合發(fā)生在定位之前。
(2)使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)細(xì)胞之間的膜融合 將含有野生型的EnvpNHcRedEluc質(zhì)粒(pNHcRedElucWT)和pdPH_GFPn瞬轉(zhuǎn)入 293FT細(xì)胞，隨后與穩(wěn)定表達(dá)ra-GFPh1Q的293CD4共培養(yǎng)。我們首先使用激光共聚焦顯微 鏡對(duì)共培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)的圖像分析(圖4A)。由于轉(zhuǎn)入了核定位的HcRed蛋白，表達(dá) 包膜蛋白的細(xì)胞核會(huì)變成紅色。我們觀察到一些紅色的細(xì)胞核，其細(xì)胞周圍具有來自于含 Kl結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)spGFP產(chǎn)生的線狀綠色熒光信號(hào)。這些綠色熒光信號(hào)具有特異的定位，很 容易將其與細(xì)胞中非特異的自發(fā)熒光區(qū)分開來。同時(shí)可以通過合胞體中缺乏紅色的細(xì)胞核 來排除那些可能存在的自發(fā)融合現(xiàn)象。這個(gè)結(jié)果表明，不加入任何其它的染料或者底物，我 們可以同時(shí)利用pNHcRedEluc和拆分GFP蛋白更加客觀地監(jiān)測(cè)膜融合現(xiàn)象。
發(fā)明人接下來檢測(cè)了在這個(gè)方法中，GFP信號(hào)隨著時(shí)間進(jìn)程的發(fā)展情況。使用IN Cell Analyzer實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)融合的過程可。30分鐘后即可檢測(cè)到spGFP重新結(jié)合所產(chǎn)生 的綠色熒光信號(hào)，并且檢測(cè)到的數(shù)目和強(qiáng)度逐漸地增加(圖5A)。發(fā)明人將結(jié)果同傳統(tǒng)的 T7RNApo1轉(zhuǎn)移分析方法做了比較(圖5B)。這兩組數(shù)據(jù)相互吻合，在這兩個(gè)方法中都記錄 到了不斷增加的膜融合事件。本文所使用的拆分GFP方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它可以檢測(cè)到單 個(gè)膜的融合事件，而不是使用T7方法檢測(cè)到的平均活性。此外，與T7方法不同，該方法可 以對(duì)同樣的共培養(yǎng)活體細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
序列表(SEQUENCE LISTING) 〈110〉國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué)(The University of Tokyo)
中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所 〈120〉拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合及其表達(dá)載體和應(yīng)用
〈130>JSP080385〈160>2〈170>PatentIn version 3.1〈210>1〈211>386〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工融合蛋白(An artificial fusionprotein)〈400>1MetAspSerGlyArgAspPheLeuThrLeuHisGlyLeuGinAspAsp151015GluAspLeuGinAlaLeuLeuLysGlySerGinLeuLeuLysValLys202530SerSerSerTrpArgArgGluArgPheTyrLysLeuGinGluAspCys354045LysThrlieTrpGinGluSerArgLysValMetArgThrProGluSer505560GinLeuPheSerlieGluAsplieGinGluValArgMetGlyHisArg65707580ThrGluGlyLeuGluLysPheAlaArgAspValProGluAspArgCys859095PheSerlieValPheLysAspGinArgAsnThrLeuAspLeulieAla100105110ProSerProAlaAspAlaGinHisTrpValLeuGlyLeuHisLyslie115120125lieHisHisSerGlySerMetAspGinArgGinLysLeuGinHisTrp130135140lieHisSerCysLeuArgLysAlaAspLysAsnLysAspAsnLysMet145150155160SerPheLysGluLeuGinAsnPheLeuLysGluPheMetValSerLys165170175GlyGluGluLeuPheThrGlyValValProlieLeuValGluLeuAsp180185190GlyAspValAsnGlyHisLysPheSerValArgGlyGluGlyGluGly195200205AspAlaThrlieGlyLysLeuThrLeuLysPhelieCysThrThrGly210215220LysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGly
12
225230235240ValGinCys PheSer Arg TyrAspProHisMetLysGinHisAspPhe245250255PheLysSerAlaMet Pro GluGlyTyrValGinGluArgThrlieSer260265270PheLysAsp AspGly Lys TyrLysThrArgAlaValValLysPheGlu275280285GlyAspThrLeuVal Asn ArglieGluLeuLysGlyThrAspPheLys290295300GluAspGly Asnlie Leu GlyHisLysLeuGluTyrAsnPheAsnSer305310315320HisAsnValTyrlie Thr AlaAspLysGinLysAsnGlylieLysAla325330335AsnPheThrValArg His AsnValGluAspGlySerValGinLeuAla340345350AspHisTyr GinGin Asn ThrProlieGlyAspGlyProValLeuLeu355360365ProAspAsnHisTyr Leu SerThrGinThrValLeuSerLysAspPro370375380AsnGlu385〈210>2〈211>189〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工融合蛋白(An artificial fusionprotein)〈400>2MetAspSerGlyArg Asp PheLeuThrLeuHisGlyLeuGinAspAsp151015GluAspLeuGinAla Leu LeuLysGlySerGinLeuLeuLysValLys202530SerSerSerTrpArg Arg GluArgPheTyrLysLeuGinGluAspCys354045LysThrlieTrpGin Glu SerArgLysValMetArgThrProGluSer505560GinLeuPheSerlie Glu AsplieGinGluValArgMetGlyHisArg65707580ThrGluGlyLeuGlu Lys PheAlaArgAspValProGluAspArgCys859095PheSerlieValPheAspGinArgAsnThrLeuAspLeulieAla100105110ProSerProAlaAspAlaGinHisTrpValLeuGlyLeuHisLyslie115120125lieHisHisSerGlySerMetAspGinArgGinLysLeuGinHisTrp130135140lieHisSerCysLeuArgLysAlaAspLysAsnLysAspAsnLysMet145150155160SerPheLysGluLeuGinAsnPheLeuLysGluPheArgAspHis165170175MetValLeuHisGluTyrValAsnAlaAlaGlylieThr180185
1權(quán)利要求
一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，包括第一拆分熒光蛋白的融合蛋白和第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，其中，第一拆分熒光蛋白的融合蛋白，為可自我重新結(jié)合的已被拆分的熒光蛋白的一部分和一種和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)結(jié)合的蛋白的融合蛋白；第二拆分熒光蛋白的融合蛋白，為前述熒光蛋白的剩余部分和前述的磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)結(jié)合的蛋白的融合蛋白，其特征在于，前述的第一拆分熒光蛋白的融合蛋白與前述第二拆分熒光蛋白的融合蛋白結(jié)合后，前述熒光蛋白可以自我重新結(jié)合恢復(fù)拆分前的熒光功能，從而發(fā)出熒光。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，其中，前述一種和 磷脂酰肌醇(phosphat idylinositol)結(jié)合的蛋白是PH結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology domain)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合，其中，前述第一熒光 蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)，是綠色熒光蛋白，其拆分點(diǎn)在氨基酸序列的第214 和第215之間。
4. 一種表達(dá)載體的組合，包括第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體，其特征在于，第一表達(dá)載 體包括表達(dá)前述第一拆分熒光蛋白的融合蛋白的基因，第二表達(dá)載體包括表達(dá)前述第二拆 分熒光蛋白的融合蛋白的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種表達(dá)載體的組合，其中，前述第一表達(dá)載體和前述第二 表達(dá)載體中的任一個(gè)為包膜蛋白表達(dá)載體，再包括了表達(dá)病毒包膜蛋白的基因，該包膜蛋 白表達(dá)載體可以同時(shí)表達(dá)包膜蛋白以及第一拆分熒光蛋白的融合蛋白或第二拆分熒光蛋 白的融合蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的包膜蛋白表達(dá)載體，其中，病毒包膜蛋白為HIV-1包膜蛋白。
7. —種病毒包膜蛋白的受體的篩選方法，該方法包括以下步驟a) 將權(quán)利要求5所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b) 將權(quán)利要求5所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中 表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體，c) 混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，d) 檢驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì)胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式融合后的熒光，該螢 光為前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分前 的螢光。
8. —種膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的篩選方法，該方法包括以下步驟a) 將權(quán)利要求5所述的包膜蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第一細(xì)胞中表達(dá)，b) 將權(quán)利要求5所述的另外一個(gè)不含有包膜蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞中 表達(dá)，該第二細(xì)胞同時(shí)含有該包膜蛋白所對(duì)應(yīng)的受體，c) 加入促進(jìn)或抑制病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的促進(jìn)劑或抑制劑，d) 混合第一細(xì)胞和第二細(xì)胞，e) 檢驗(yàn)第一細(xì)胞和第二細(xì)胞通過病毒包膜蛋白與受體結(jié)合的方式而融合后的熒光，該 螢光為前述第一熒光蛋白和前述第二熒光蛋白中的至少一個(gè)自我重新結(jié)合后恢復(fù)的拆分 前的螢光。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的病毒包膜蛋白的受體的篩選方法，病毒包膜蛋白為HIV-1，受體為CD4與其輔助受體CCR5的組合體或是CD4與其輔助受體CXCR4的組合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的篩選方法，病毒包膜蛋白為 HIV-1，受體為CD4與其輔助受體CCR5的組合體或是CD4和其輔助受體CXCR4的組合體。
全文摘要
一種拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合和其表達(dá)載體，以及在細(xì)胞融合時(shí)通過檢測(cè)該拆分熒光蛋白的融合蛋白的組合中自我重新結(jié)合后的熒光蛋白的螢光來篩選病毒包膜蛋白的受體的方法，和篩選膜融合的促進(jìn)劑或抑制劑的方法。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101747438SQ20081018603
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者巖本愛吉, 松田善衛(wèi), 王健琪, 近藤直幸 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué);中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所