專利名稱：大腸埃希氏菌k88、k99、987p纖毛抗原的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及致病性大腸埃希氏菌的三種K88、K99、 987P 纖毛抗原的提取方法，屬于生物技術(shù)，特別是獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
仔豬黃痢是由特定0抗原型的致病性大腸埃希氏菌 (f. co7/)引起的初生仔豬的以下痢為特征的傳染病。該病主要導(dǎo)致1 周齡內(nèi)(主要是1~3日齡)仔豬發(fā)病，以排出黃色水樣糞便和漸進(jìn)性 死亡為特征，是影響規(guī)?；N豬場(chǎng)和農(nóng)村散養(yǎng)豬仔豬成活率的重要疾 病(SalajkaE,et al…Colonization factor different fromK88， K99， F41， and 987P inenterotoxigenic Escherichia coli strains isolated from postweaning diarrhoea in pigs. VetMicrobiol, 1992, 32 (2): 163;逄媛，等.仔豬腹渴性大腸桿菌基因工 程疫苗的研究進(jìn)展.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2007， (5): 2-3)。
致仔豬黃痢的致病性大腸埃希氏菌的致病力主要由粘附素性纖毛 和腸毒素兩類毒力因子構(gòu)成，二者密切相關(guān)且缺一不可。己發(fā)現(xiàn)豬大 腸埃希氏菌的的纖毛主要有F4(K88) 、 F5(K99)、 F6 (987P)以及比例較 小的F41。纖毛是一種蛋白質(zhì)，具有良好的免疫原性，以含單價(jià)或多價(jià) 纖毛抗原的滅活全菌疫苗或亞單位疫苗對(duì)妊娠母豬進(jìn)行免疫，可使仔 豬從初乳中獲得抗仔豬黃痢的被動(dòng)保護(hù)力(袁萬哲等.仔豬大腸桿菌病 K88-K99-987P-F41四價(jià)亞單位疫苗的研制V.疫苗生產(chǎn)與免疫效力試 驗(yàn).中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007, 27 ( 6 ): 818-821; GillP， Purchid V D. Ident ificat ion of K88 fimbriae of E. coli associated with piglet diarrhea. Indian Journal of Comparative Microbiology Immunology and Infective Diseases, 1999， 20 (2): 126-128; JinL Z， et al.. Inhibition of enterotoxingenic Escherichia coli K88， K99 and 987p by the Lactobacillus isolates from porcine intestine.Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000， 80(5): 619-624 )。
提取大腸埃希氏菌纖毛抗原的常用方法有兩種，即加熱法和切割 法(房海.大腸埃希氏菌.河北科學(xué)技術(shù)出版社，1997年，359-365 )。 其中加熱法的原理是將大腸埃希氏菌懸液加熱至一定溫度后(一般為 60~65°C),使菌毛與菌體分離；而分割法的原理是用勻漿攪拌器處理 大腸埃希氏菌懸液，在高速勻漿攪拌的機(jī)械切割作用下，使菌毛與菌 體分離。本發(fā)明綜合加熱法和切割法的特點(diǎn)，在將菌懸液加熱的同時(shí) 利用高速機(jī)械切割的方法提取纖毛抗原，不但提高了工作效率，提升 了提取液中纖毛抗原含量，而且適合于規(guī)模化處理大批樣品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、高效的可應(yīng)用于規(guī)模化提取大腸 埃希氏菌K88、 K99、 987P纖毛抗原的新工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)仔豬黃痢 纖毛亞單位疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的內(nèi)容為 一種提取大腸埃希氏菌K88、 K99、 987P纖毛抗 原的新工藝采用剪切機(jī)(T25型，德國(guó)IKA公司生產(chǎn))在58 ~ 65°C 對(duì)含不同纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按5000 ~ 6000r/min的剪 切強(qiáng)度剪切2 0 ~ 25min分別進(jìn)行各纖毛抗原的提取。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)進(jìn)行具體說明
1生產(chǎn)用種子制備 (1)生產(chǎn)用菌種表達(dá)K88纖毛抗原的大腸埃希氏菌菌種為 C83549,生長(zhǎng)K99纖毛抗原的大腸埃希氏菌菌種為C83644,生長(zhǎng)987P 纖毛抗原的大腸埃希氏菌菌種為C83710。
(1 )一級(jí)種子繁殖與鑒定將表達(dá)纖毛抗原的大腸埃希氏菌菌種 接種改良Minca液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基由蒸餾水配制，配方為每1 000毫 升培養(yǎng)基含KH2P04 1.36g， Na2HP04 12H20 2 0. 3g,酵母粉 lg， 酪蛋白胨 5g,甘油5ml，微量鹽液 lml。其中微量鹽溶液由蒸餾水配制，配方為每1000ml含MgS04 . 2H20 10g, MnCl2 . 4H20 lg， FeCl廣6H2Q 0. 135g， CaCl2 . 2H20 0. 4g ), 37。C振蕩培養(yǎng)6 ~ 10小時(shí) 后，用改良Minca固體培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉制成) 劃線，36~ 37'C培養(yǎng)20小時(shí)，在低倍鏡下選取光滑圓整的單個(gè)菌落若 干混合后接種改良Minca液體培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，將 C8 3549 、 C83644、 C8371 0抹的改良Minca液體培養(yǎng)物分別和K88、 K99、 987P纖毛抗血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，當(dāng)凝集快速而強(qiáng)烈(達(dá)到"++++" 程度)且純檢合格后，按10%加入甘油(V/V)混勻，分裝于滅菌小試 管中，作為一級(jí)種子。同時(shí)作好標(biāo)記(注明名稱、代次、分裝量、日 期等)，在-2(TC保存，使用期不超過6個(gè)月。
(2 )二級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子直接接種改良Minca固體培養(yǎng)基， 36 37。C培養(yǎng)20小時(shí)，選取光滑圓整菌落若干，擴(kuò)大培養(yǎng)后用相應(yīng)各 型纖毛抗血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，選取凝集快速而強(qiáng)烈(達(dá)到"++++" 程度)的鑒定菌落10個(gè)，混合接種改良Minca液體培養(yǎng)基，37。C搖振 培養(yǎng)16小時(shí)，再以相應(yīng)各型纖毛抗血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，當(dāng)凝集快 速而強(qiáng)烈(達(dá)到"++++"程度)且純檢合格后，即可用于接種。在2~ 8'C保存，應(yīng)不超過7天。
2 菌液培養(yǎng)
采用發(fā)酵培養(yǎng)法分別培養(yǎng)C8 3549、 C83644、 C8371 0菌林菌液。生 產(chǎn)工藝流程如下按發(fā)酵罐容積7(^加入改良Minca液體培養(yǎng)基，同時(shí) 按培養(yǎng)基體積0. 1%加入花生油，通入高溫蒸汽滅菌30分鐘，待培養(yǎng)基 溫度降至35~37°C，按培養(yǎng)基量的3% (V/V)向發(fā)酵罐中加入二級(jí)種 子，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37°C，調(diào)節(jié)融氧濃度至35%,發(fā)酵培養(yǎng)5 ~ 7小時(shí)。 取小量樣品進(jìn)行染色鏡檢，無雜菌污染后，以相應(yīng)型因子血清進(jìn)行玻 板凝集觀察纖毛生長(zhǎng)情況，檢驗(yàn)合格(凝集在"+++"以上)后，菌液 經(jīng)管式離心機(jī)離心(CQ105型，湘潭離心機(jī)有限公司生產(chǎn))，10000r/min 離心30min,菌泥按0. lg/ml比例重新懸浮于生理鹽水中。
3 纖毛提取采用剪切機(jī)(T25型，德國(guó)IKA公司生產(chǎn))，對(duì)重懸
5菌液中的K88、 K99、 987P纖毛抗原分別進(jìn)行提取。將C83549、 C83644、 C83710菌抹的重懸菌液置于合適體積的燒杯中(以菌懸液體積不多于 燒杯體積2/3為宜)，當(dāng)重懸菌液與水浴鍋預(yù)設(shè)的水溫(60~ 65°C ) — 致時(shí)，將剪切機(jī)的剪切頭置于燒杯底以上3~ 5cm位置，打開電源開關(guān)， 逐步調(diào)節(jié)剪切速度至預(yù)設(shè)速度(5 000 ~ 6 000r/min )后計(jì)時(shí)(20 ~ 25min)，進(jìn)行纖毛抗原的提取。
剪切處理后的各菌懸液分別經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)(CR22G，日本日立公 司生產(chǎn))，16000r/min離心30min，收集上清液，經(jīng)無菌0.22jim纖維
膜過濾除菌，置4i:水箱保存?zhèn)溆谩?br> 4 纖毛抗原的鑒定
(1 ) SDS-PAGE電泳參照房海的方法進(jìn)行(房海.大腸埃希氏菌. 河北科學(xué)技術(shù)出版社，1997年，359-365 )。
(2)抗原單位測(cè)定以凝集抑制法進(jìn)行抗原單位測(cè)定，參照《中 華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》的方法進(jìn)行(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè) 部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程(2000年版)，2000年，62-66 )。
本發(fā)明的積極意義本發(fā)明是結(jié)合了機(jī)械攪拌和熱裂解法兩種方 法的特點(diǎn)提供一種簡(jiǎn)便、高效的可應(yīng)用于規(guī)模化提取大腸埃希氏菌 K88、 K99、 987P纖毛抗原的新工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)仔豬黃痢纖毛亞單 位疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。采用本發(fā)明的工藝操作筒單，對(duì)設(shè)備要求 低，而且樣品處理量大。


圖l是本發(fā)明實(shí)施后，K88、 K99、 987P纖毛提取的SDS-PAGE電泳圖。
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例11. 菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)法培養(yǎng)C83549菌抹菌液。生產(chǎn)工藝流 程如下向發(fā)酵罐(BIOTECH-100L,上海保興生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn) 品)中加入改良Minca液體培養(yǎng)基70000ml,同時(shí)加入70ml花生油，通 入高溫蒸汽滅菌30min，待培養(yǎng)基溫度降至35~37°C，向發(fā)酵罐中加 入2100ml 二級(jí)種子，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37。C,調(diào)節(jié)融氧濃度至35%，發(fā) 酵培養(yǎng)7小時(shí)。取小量樣品進(jìn)行染色鏡檢，無雜菌污染后，以K88抗 血清進(jìn)行玻板凝集反應(yīng)，檢驗(yàn)合格(凝集在"+++"以上)后，菌液經(jīng) 管式離心機(jī)1 0000r/min離心30min,得菌泥122g，再將其重新懸浮于 1220ml生理鹽水中。
2. 纖毛提取將C83549菌抹的重懸菌液置于3000ml體積燒杯中， 置水浴鍋中加溫至58~63°C,將剪切機(jī)的剪切頭置于燒杯底以上3~ 5cm位置，打開電源開關(guān)，逐步調(diào)節(jié)剪切速度至5000 ~ 5500r/min后計(jì) 時(shí)20 ~ 25min，處理后的菌懸液經(jīng)連續(xù)流離心才/L 16000r/min離心30min: 收集上清液，經(jīng)無菌0. 22pm纖維膜濾器過濾除菌即得到K88纖毛抗 原，置4'C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 3. K88纖毛抗原的鑒定
(1) SDS-PAGE電泳電泳結(jié)果表明，按本發(fā)明工藝提取的K88 纖毛抗原液中含有濃度比較高的纖毛蛋白條帶，其他菌體蛋白條帶較 少極少，證明本工藝適合于提取K88纖毛抗原。提取纖毛蛋白電泳條 帶見附圖1中第2泳道的圖譜。
(2 )抗原單位測(cè)定將用本發(fā)明工藝提取的K88纖毛提取液進(jìn)行 抗原單位測(cè)定，結(jié)果為998. 6個(gè)抗原單位/ml。 實(shí)施例2
l.菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)法培養(yǎng)C83644菌抹菌液。生產(chǎn)工藝流 程如下向發(fā)酵罐(BIOTECH-100L,上海保興生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn) 品)中加入改良Minca液體培養(yǎng)基70000ml ，同時(shí)加入70ml花生油，通 入高溫蒸汽滅菌30min，待培養(yǎng)基溫度降至35~37°C，向發(fā)酵罐中加 入2100ml 二級(jí)種子，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37。C,調(diào)節(jié)融氧濃度至35%，發(fā)酵培養(yǎng)7小時(shí)。取小量樣品進(jìn)行染色鏡檢，無雜菌污染后，以K99抗
血清進(jìn)行玻板凝集反應(yīng)，4企驗(yàn)合格(凝集在"+++，，以上)后，菌液經(jīng)
管式離心機(jī)1 0000r/min離心30min,得菌泥145g,再將其重新懸浮于 145 0ml生理鹽水中。
2. 纖毛提取將C83644菌株的重懸菌液置于3000ml體積燒杯中， 置水浴鍋中加溫至60 - 65°C,將剪切機(jī)的剪切頭置于燒杯底以上3~ 5cm位置，打開電源開關(guān)，逐步調(diào)節(jié)剪切速度至55 00 6000r/min后計(jì) 時(shí)20~ 25min，處理后的菌懸液經(jīng)連續(xù)流離心才幾16000r/min離心30min 收集上清液，經(jīng)無菌0. 22戶纖維膜濾器過濾除菌即得到K99纖毛抗
原，置rc冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 3. K99纖毛抗原的鑒定
(1) SDS-PAGE電泳電泳結(jié)果表明，按本發(fā)明工藝提取的K99 纖毛抗原液中含有濃度比較高的纖毛蛋白條帶，還含有 一條濃度較低 的菌體蛋白條帶，證明本工藝適合于提取K99纖毛抗原。提取纖毛蛋 白電泳條帶見附圖1中第3泳道的圖譜。
(2) 抗原單位測(cè)定將用本發(fā)明工藝提取的K99纖毛提取液進(jìn)行 抗原單位測(cè)定，結(jié)果為798. 8個(gè)抗原單位/ml。
實(shí)施例3
1. 菌液培養(yǎng)釆用發(fā)酵培養(yǎng)法培養(yǎng)C83710菌抹菌液。生產(chǎn)工藝流 程如下向發(fā)酵罐(BIOTECH-100L,上海保興生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn) 品)中加入改良Minca液體培養(yǎng)基7Q000ml，同時(shí)加入70ml花生油，通 入高溫蒸汽滅菌30min，待培養(yǎng)基溫度降至35~37°C,向發(fā)酵罐中加 入2100ml 二級(jí)種子，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37。C，調(diào)節(jié)融氧濃度至35%,發(fā) 酵培養(yǎng)7小時(shí)。取小量樣品進(jìn)行染色鏡檢，無雜菌污染后，以987P抗 血清進(jìn)行玻板凝集反應(yīng)，檢驗(yàn)合格(凝集在"+++"以上)后，菌液經(jīng) 管式離心機(jī)1 0000r/min離心30min，得菌泥107g,再將其重新懸浮于 107 0ml生理鹽水中。
2. 纖毛提取將C83710菌抹的重懸菌液置于3000ml體積燒杯中，
8置水浴鍋中加溫至58~63°C，將剪切機(jī)的剪切頭置于燒杯底以上3~ 5cm位置，打開電源開關(guān)，逐步調(diào)節(jié)剪切速度至5000 ~ 5500r/min后計(jì) 時(shí)20 ~ 25min,處理后的菌懸液經(jīng)連續(xù)流離心才/L 16000r/min離心30min 收集上清液，經(jīng)無菌0. 22,纖維膜濾器過濾除菌即得到987P纖毛抗 原，置4'C冰箱保存?zhèn)溆谩?3. K88纖毛抗原的鑒定
(1) SDS-PAGE電泳電泳結(jié)果表明，按本發(fā)明工藝提取的987P 纖毛抗原液中含有濃度比較高的纖毛蛋白條帶，其他菌體蛋白條帶較 少極少，證明本工藝適合于提取987P纖毛抗原。提取纖毛蛋白電泳條 帶見附圖1中第4泳道的圖譜。
(2) 抗原單位測(cè)定將用本發(fā)明工藝提取的K88纖毛提取液進(jìn)行 抗原單位測(cè)定，結(jié)果為998. 6個(gè)抗原單位/ml。
權(quán)利要求
1. 一種大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛抗原的提取方法，其特征在于該方法是采用剪切機(jī)對(duì)在58～65℃對(duì)含不同纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按5000～6000r/min的剪切強(qiáng)度剪切20～25min分別進(jìn)行各纖毛抗原的提取。
2. 如權(quán)利要求1所述一種大腸埃希氏菌K88、 K99、 987P纖毛抗原的 提取方法，其特征在于含K88纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按溫度 58~60°C、剪切強(qiáng)度5000 ~ 5500r/min、剪切時(shí)間20 ~ 25min進(jìn)行提取。
3. 如權(quán)利要求1所述一種大腸埃希氏菌K88、 K99、 987P纖毛抗原的 提取方法，其特征在于含987P纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按溫度 58~60°C、剪切強(qiáng)度5000 ~ 5500r/min、剪切時(shí)間20 ~ 25min進(jìn)行才是取。
4. 如權(quán)利要求1所述一種大腸埃希氏菌K88、 K99、 987P纖毛抗原的 提取方法，其特征在于含K99纖毛抗原的大腸埃希氏菌的菌懸液按溫度 60~65°C、剪切強(qiáng)度5500 ~ 6000r/min、剪切時(shí)間20 ~ 25min進(jìn)行提取。
全文摘要
本發(fā)明涉及仔豬大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛抗原的提取方法，該方法結(jié)合了機(jī)械攪拌和熱裂解法兩種方法的特點(diǎn)提供一種簡(jiǎn)便、高效的可應(yīng)用于規(guī)模化提取致仔豬黃痢的大腸埃希氏菌K88、K99、987P纖毛抗原的新工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)仔豬黃痢纖毛亞單位疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。采用本發(fā)明的工藝操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，而且樣品處理量大。
文檔編號(hào)C07K14/195GK101429237SQ20081018755
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者健 孫, 李明義, 瀟 胡, 郭玉廣 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司