專利名稱：野蠶絲素蛋白溶液的制備及其濃縮方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種天然蛋白溶液的制備與濃縮方法，特別涉及一種從野蠶絲 的絲素纖維中獲得蛋白溶液的方法。該溶液可用于制取野蠶絲素蛋白凝膠、粉 末、薄膜、多孔海綿、再生纖維等，為生物醫(yī)用、藥品、化妝品、食品、保健 品等領域提供新材料。
背景技術：
由于從熟蠶體內(nèi)后部絹絲腺獲得的絲素蛋白只能滿足實驗室少量的需要， 不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，所以，需先將蠶絲絲素纖維提取、溶解、純化后 獲得柞蠶絲素蛋白水溶液，再根據(jù)應用目的的要求制備得到凝膠、粉末、薄膜、 多孔海綿等，用作生物醫(yī)用材料、藥品、化妝品、食品、保健品等的原料。
蠶分為家蠶(桑蠶)和野蠶(天蠶、柞蠶、菡麻蠶、柳蠶、樗蠶等)兩大 類。所有種類的蠶絲都主要由絲素和絲膠兩類蛋白質(zhì)所組成，其中絲素蛋白約 占70-85%，其余為絲膠蛋白及少量的繭絲蠟、灰分、碳水化合物等。由于種屬 基因和生活環(huán)境的差異，不僅各種蠶絲中絲素蛋白的含量不同，而且絲素蛋白 的結構有很大的差別。例如，每個家蠶絲素蛋白復合體的分子量約為2，280 kDa, 由重鏈(H鏈，分子量350 kDa)、輕鏈(L鏈，分子量26 kDa)及糖蛋白Pm (分子 量30kDa)組成，三者比例為H:L:P^6:6:1， H鏈由富甘氨酸序列-(Gly-X)r與 非富甘氨酸序列間隔排列而成而柞蠶絲素蛋白僅由H鏈組成，每條H鏈含有2639 個氨基酸殘基，分子量約216 kDa，除了頭部155個氨基酸外，柞蠶絲素由78個 聚丙氨酸序列-(Ala)--與非聚丙氨酸序列間隔排列而成。各種絲素蛋白化學結 構的差別，造成了他們的聚集態(tài)結構及物理、化學性質(zhì)有很大的差異。
在本發(fā)明作出前，國內(nèi)外許多文獻曾報道了家蠶絲素纖維的溶解、純化方 法，例如采用CaCl2、LiBr的濃溶液可以溶解家蠶絲素纖維(A. Azizawa， Nippon Sanshi Gakkaishi， 1959， 38, 340 ;公開號為CN1121836的中國發(fā)明專利"一 種創(chuàng)面保護膜及其制備方法")。雖然CaCl2、 LiBr、 Ca(SCN)2等許多中性鹽的 濃溶液能順利地溶解家蠶絲素纖維，但是卻不能將天蠶、柞蠶、蓖麻蠶、柳蠶等野蠶的絲素纖維完全溶解。
在本發(fā)明作出前，公開號為CN1415626的中國發(fā)明專利例"柞蠶絲素肽制 取方法"中，報道了柞蠶絲素纖維的水解方法；"鹽酸水解法制作水溶性絲粉 及其物性"[日蠶雜，1991，60(5):358 - 362.] —文中，公開了用鹽酸水解柞蠶 絲素纖維鹽酸水解法制作水溶性絲粉及其物性的方法；"應用微波技術水解柞 蠶絲的研究"[沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2004, 35 (3) : 280-282.]—文中，用微 波配合鹽酸水解柞蠶絲素纖維。這些方法使用強酸溶解柞蠶絲素，由于強酸對 絲素蛋白的強烈水解作用大量切斷了柞蠶絲素蛋白的分子鏈，得到的是分子量 較小的柞蠶絲素肽或游離氨基酸，不能得到分子量較大的柞蠶絲素蛋白。對于 天蠶、蓖麻蠶、柳蠶等野蠶絲素的溶解方法，國內(nèi)外還未見公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對已有技術存在的不足，提供一種能獲得分子量較大 的野蠶絲素蛋白溶液，以及濃縮野蠶絲素蛋白的方法。
本發(fā)明的技術方案是提供一種野蠶絲素蛋白溶液的制備方法，將野蠶絲 進行除雜、脫膠處理后得到野蠶絲素纖維，再進行如下步驟處理
(1) 將野蠶絲素纖維浸漬于溶解液中，所述的溶解液中，含有濃度為2.0 12.0 mol/L的中性鹽，濃度為0 12.0 mol/L的醇，其余為水；所述的中性鹽為 硫氟酸胍、硝酸鈣、硝酸鎂、氯化鈣、氯化鋅、硫氟酸鋰、硫氟酸鈉、溴化鋰 和硫氰酸鈣中的一種或它們的任意組合；醇為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和異丙 醇中的一種或它們的任意組合；野蠶絲素纖維與溶解液的質(zhì)量比為1: 5 1000; 在功率為0.2 2.0 kW的超聲波條件下處理5 120分鐘，再在30 98C的溫度 條件下處理15 360分鐘，得到野蠶絲素溶解液；
(2) 將上述步驟得到的野蠶絲素溶解液灌注于袋壁為半透膜的透析袋內(nèi)， 截留分子量為0.3 20 kDa，用去離子水或純水進行透析處理，得到野蠶絲素蛋 白分子量為15 250 kDa、濃度為6.0 wt。/。以下的野蠶絲素蛋白溶液。
本發(fā)明還提供一種野蠶絲素蛋白溶液的濃縮方法，將濃度為6.0 wtV。以下 的野蠶絲素蛋白溶液灌注于袋壁為半透膜的透析袋內(nèi)，截留分子量為0.3 20kDa，將上述透析袋置于盛有髙吸水材料的容器內(nèi)，室溫條件下放置1 3天，得到絲素蛋白分子量為15 250 kDa、濃度為6.0 30 wt。/。的野蠶絲素蛋白濃縮 溶液。
上述技術方案中，所述野蠶為柞蠶、天蠶、蓖麻蠶或柳蠶。髙吸水材料為 硅膠、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸鹽、醋酸乙烯共聚物、聚氨酯、聚環(huán)氧 乙烷或淀粉接枝共聚物。
采用本發(fā)明所提供的技術方案，具有以下明顯的優(yōu)點
1. 由于使用中性鹽，不使用酸性或堿性物質(zhì)溶解脫膠后的野蠶絲素纖維， 避免了酸或堿對絲素蛋白的大幅度水解，所以獲得的野蠶絲素蛋白分子量較大。
2. 由于在溶解液中含有醇類物質(zhì)，加快了中性鹽向浸漬于溶解液中的野蠶 絲素纖維內(nèi)部的擴散、滲透。
3. 由于同時使用超聲波處理，使溶解液中的中性鹽加速向浸漬于溶解液中 的野蠶絲素纖維內(nèi)部遷移，進一步增進了中性鹽對野蠶絲素纖維的溶解作用， 從而可以在避免對野蠶絲素蛋白大幅度水解的同時，在較低溫度、較溫和的條 件下將野蠶絲素纖維溶解。
4. 由于使用半透膜在常溫下透析提純，避免了采用鹽析或等電點法提純對 野蠶絲素蛋白分子構象的影響，防止絲素蛋白變性。
5. 由于在室溫下用髙吸水物質(zhì)捕獲從半透膜的孔隙中滲透出的水分而使 野蠶絲素蛋白溶液得到濃縮，避免了采用其他方法濃縮對野蠶絲素蛋白分子構 象的影響，且操作簡便、成本低。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述 實施例1
1. 去除天蠶繭內(nèi)的蠶蛹，用自來水反復清洗繭殼，去除繭殼中的灰塵等雜 質(zhì)，然后將繭殼置于60C烘箱內(nèi)干燥，得到除雜后的天蠶繭殼。
2. 配置脫膠液，脫膠液中含有0.25 %的碳酸鈉和0.1%的馬賽皂，其余為 水。將1千克除雜后的天蠶繭殼放入50升脫膠液中，于98 100'C處理兩次， 每次處理60分鐘。然后用水將天蠶繭殼充分清洗干凈，拉松，室溫晾干，得到 脫膠后的天蠶絲素纖維。3. 配置每升含9.0 mol硫氰酸鋰和1.0 mol乙醇，其余為水的溶解液。取 1000ml溶解液置于錐形瓶中。稱取IOO克脫膠后的天蠶絲素纖維，剪碎后加入 錐形瓶中。錐形瓶放入超聲波處理機內(nèi)，超聲波功率0.4kW,超聲波處理時間 100分鐘。
4. 從超聲波處理機內(nèi)取出錐形瓶，錐形瓶置于35'C的水浴中，攪拌溶解天 蠶絲素纖維2小時，得到天蠶絲素溶解液。
5. 將天蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為 9.0 12.0 kDa，將灌注了天蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器 內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析5天，得到 純化后的天蠶絲素蛋白水溶液，溶液中天蠶絲素蛋白的濃度為2.7wt%，分子 量分布范圍40 220 kDa。
6. 濃縮天蠶絲素蛋白溶液將濃度為2.7 wt96的天蠶絲素蛋白溶液灌注于 透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為9 12 kDa，將灌注了野蠶絲素 溶解液的逮析袋置于盛有聚乙二醇的容器內(nèi)，密封后在室溫持續(xù)放置3晝夜， 每24小時用新的聚乙二醇更換已經(jīng)吸水的聚乙二醇，得到濃度為25 wt96的天 蠶絲素蛋白溶液，溶液中天蠶絲素蛋白的分子量分布范圍40 220 kDa。
實施例2
1. 將0.2千克柞蠶生絲放入IO升濃度為0.25%的碳酸鈉水溶液中，于98 IOO"處理三次。前兩次用自來水，每次處理30分鐘。第三次用去離子水，處 理45分鐘。然后用水將繭殼充分清洗干凈，拉松，置于60X:烘箱內(nèi)干燥，得 到脫膠后的柞蠶絲素纖維。
2. 配置柞蠶絲素纖維溶解液，每升溶解液中含10.0 mol硝酸鈣、1.0 mol 甲醇和2.0 mol丙醇，其余為水。取500 ml溶解液置于錐形瓶中。稱取25克 脫膠后的柞蠶絲素纖維，剪碎后加入錐形瓶中。錐形瓶放入超聲波處理機內(nèi)， 超聲波功率1.5kW,超聲波處理時間60分鐘。
3. 從超聲波處理機內(nèi)取出錐形瓶，錐形瓶置于98t:的水浴中，攪拌溶解柞 蠶絲素纖維5小時，得到柞蠶絲素溶解液。
4. 將柞蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為 6.0 9.0kDa，將灌注了柞蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析5天，得到純化 后的拃蠶絲素蛋白水溶液，溶液中柞蠶絲素蛋白的濃度為1.2"%，分子量分 布范圍45 245 kDac
5.濃縮柞蠶絲素蛋白溶液將濃度為1.2 wtW的柞蠶絲素蛋白溶液灌注于 透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為9 12 kDa，將灌注了柞蠶絲素 溶解液的透析袋置于盛有干燥的硅膠的容器內(nèi)，密封后在室溫持續(xù)放置3晝夜， 每24小時用新的干燥的硅膠更換已經(jīng)吸水的硅膠，得到濃度為25.0 wt96的柞 蠶絲素蛋白溶液，溶液中祚蠶絲素蛋白的分子量分布范圍45 245 kDa。
實施例3
1. 去除蓖麻蠶繭內(nèi)的蠶蛹，用自來水反復清洗繭殼，去除繭殼中的灰塵等 雜質(zhì)，然后將繭殼置于60t:烘箱內(nèi)干燥，得到除雜后的蓖麻蠶繭殼。
2. 配置脫膠液，脫膠液中含有0.45%的碳酸鈉和0.2*的馬賽皂，其余為水。 將0.1千克除雜后的蓖麻蠶繭殼放入5升脫膠液中，于98 100'C處理兩次， 每次處理60分鐘。然后用水將蓖麻蠶繭殼充分清洗干凈，拉松，室溫晾干， 得到脫膠后的蓖麻蠶絲素纖維。
3. 配置每升含9.0 mol硫氰酸胍、2.0 mol氯化鋅和2.0 mol異丙醇， 其余為水的溶解液。取1000ml溶解液置于錐形瓶中。稱取50克脫膠后的蓖麻 蠶絲素纖維，剪碎后加入錐形瓶中。錐形瓶放入超聲波處理機內(nèi)，超聲波功率 1.2 kW，超聲波處理時間80分鐘。
4. 從超聲波處理機內(nèi)取出錐形瓶，錐形瓶置于75'C的水浴中，攪拌溶解蓖 麻蠶絲素纖維4小時，得到蓖麻蠶絲素溶解液。
5. 將天蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為 3.0 9.0 kDa，將灌注了蓖麻蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器 內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析5天，得到 純化后的蓖麻蠶絲素蛋白水溶液，溶液中蓖麻蠶絲素蛋白的濃度為1.4wt%， 分子量分布范圍20 240 kDa。
6. 濃縮蓖麻蠶絲素蛋白溶液將濃度為1.4 wtW的蓖麻蠶絲素蛋白溶液灌 注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為3.0 9.0 kDa，將灌注了蓖 麻蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有聚乙烯醇的容器內(nèi)，密封后在室溫持續(xù)放置2晝夜，中途滿24小時時用新的聚乙烯醇更換已經(jīng)吸水的聚乙烯醇1次，得到 濃度為18.0 wt 6的蓖麻蠶絲素蛋白溶液，溶液中蓖麻蠶絲素蛋白的分子量分布 范圍20 240 kDa。 實施例4
1. 去除柳蠶繭內(nèi)的蠶蛹，用自來水反復清洗繭殼，去除繭殼中的灰塵等雜 質(zhì)，然后將繭殼置于60t:烘箱內(nèi)干燥，得到除雜后的柳蠶繭殼。
2. 配置脫膠液，脫膠液中含有0.50 96的碳酸鈉，其余為水。將0.2千克 除雜后的柳蠶繭殼放入5升脫膠液中，于98 100C處理兩次，每次處理60分 鐘。然后用水將柳蠶繭殼充分清洗干凈，拉松，室溫晾干，得到脫膠后的柳蠶 絲素纖維。
3. 配置每升含10.0 mol硫氰酸鈣和1.0 mol甲醇，其余為水的溶解液。 取1000 ml溶解液置于錐形瓶中。稱取200克脫膠后的柳蠶絲素纖維，剪碎后 加入錐形瓶中。錐形瓶放入超聲波處理機內(nèi)，超聲波功率0.8kW，超聲波處理 時間60分鐘。
4. 從超聲波處理機內(nèi)取出錐形瓶，錐形瓶置于40'C的水浴中，攪拌溶解柳 蠶絲素纖維3小時，得到柳蠶絲素溶解液。
5. 將柳蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為 9.0 12.0kDa,將灌注了柳蠶蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器 內(nèi)，每隔2小時用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析5天，得到 純化后的柳蠶絲素蛋白水溶液，溶液中柳蠶絲素蛋白的濃度為4.5wt%，分子量 分布范圍20 250 kDa。
6. 濃縮柳蠶絲素蛋白溶液將濃度為4.5wt96的柳蠶絲素蛋白溶液灌注于 透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為3.0 9.0 kDa,將灌注了柳蠶絲 素溶解液的透析袋置于盛有聚丙烯酸的容器內(nèi)，密封后在室溫持續(xù)放置3晝夜， 中途滿24小時時用新的聚丙烯酸更換已經(jīng)吸水的聚丙烯酸，得到濃度為30.2 wtW的柳蠶絲素蛋白溶液，溶液中柳蠶絲素蛋白的分子量分布范圍20 250 kDa。
權利要求
1. 一種野蠶絲素蛋白溶液的制備方法，將野蠶絲進行除雜、脫膠處理后得到野蠶絲素纖維，其特征在于再進行如下步驟處理(1)將野蠶絲素纖維浸漬于溶解液中，所述的溶解液中，含有濃度為2.0～12.0mol/L的中性鹽，濃度為0～12.0mol/L的醇，其余為水；所述的中性鹽為硫氰酸胍、硝酸鈣、硝酸鎂、氯化鈣、氯化鋅、硫氰酸鋰、硫氰酸鈉、溴化鋰和硫氰酸鈣中的一種或它們的任意組合；醇為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和異丙醇中的一種或它們的任意組合；野蠶絲素纖維與溶解液的質(zhì)量比為1∶5～1000；在功率為0.2～2.0kW的超聲波條件下處理5～120分鐘，再在30～98℃的溫度條件下處理15～360分鐘，得到野蠶絲素溶解液；(2)將上述步驟得到的野蠶絲素溶解液灌注于袋壁為半透膜的透析袋內(nèi)，截留分子量為0.3～20kDa，用去離子水或純水進行透析處理，得到野蠶絲素蛋白分子量為15～250kDa、濃度為6.0wt％以下的野蠶絲素蛋白溶液。
2. —種野蠶絲素蛋白溶液的濃縮方法，其特征在于將濃度為6.0wt。/。以下 的野蠶絲素蛋白溶液灌注于袋壁為半透膜的透析袋內(nèi)，截留分子量為0.3 20kDa,將上述透析袋置于盛有髙吸水材料的容器內(nèi)，室溫條件下放置1 3天， 得到絲素蛋白分子量為15 250 kDa、濃度為6.0 30 wt。/。的野蠶絲素蛋白濃縮 溶液。
3. 根據(jù)權利要求l所述的一種野蠶絲素蛋白溶液的制備方法，其特征在于 所述的野蠶為柞蠶、天蠶、蓖麻蠶或柳蠶。
4. 根據(jù)權利要求2所述的一種野蠶絲素蛋白溶液的濃縮方法，其特征在于 所述的髙吸水材料為硅膠、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸鹽、醋酸乙烯共聚 物、聚氨酯、聚環(huán)氧乙烷或淀粉接枝共聚物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種野蠶絲素蛋白溶液的制備及其濃縮方法，將除雜脫膠后的柞蠶、天蠶、蓖麻蠶、柳蠶等野蠶絲素纖維浸漬于含中性鹽和醇類物質(zhì)的溶解液中，超聲波處理5～120分鐘，再于30-98℃溶解，得到絲素溶解液。將絲素溶解液透析除鹽，得到野蠶絲素水溶液，再用高吸水物質(zhì)經(jīng)半透膜脫水濃縮得到分子量15～250kDa、濃度6～35％的高濃度野蠶絲素溶液。由于使用中性鹽，避免了酸或堿對絲素蛋白的大幅度水解，因此，獲得的野蠶絲素蛋白分子量較大，可用于制取野蠶絲素蛋白凝膠、粉末、薄膜、多孔海綿、再生纖維等，為生物醫(yī)用、藥品、化妝品、食品、保健品等領域提供新材料。
文檔編號C07K1/00GK101445546SQ200810189778
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權日2008年12月31日
發(fā)明者盧神州, 李明忠, 王建南 申請人:蘇州大學