專利名稱：：從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法、肽和檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種通過使用包含瓜氨酸殘基或其類似物的肽來從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法。
背景技術：
：該方法由國際專利申請PCT/NL97/00624已知。該文獻中描述了來源于絲聚蛋白的，包含瓜氨酸或其類似物的肽用于從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的應用。因此，所用的肽適于診斷應用，并且與當時釆用的方法相比，使更可靠的檢測成為可能。更特別的，該方法能降低假陽性率，也就是具有更高的特異性。此外，其敏感性也相對較高。一種被稱為cfcl的肽，被36%的來自患有類風濕性關節(jié)炎的患者的血清識別。該肽的環(huán)狀變異體表現(xiàn)出被更好地識別(63%)。前言所述的方法還由國際專利申請PCT/FR00/01857已知。該文獻中描述了來源于纖維蛋白或纖維蛋白原的，包含瓜氨酸或其類似物的肽用于從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的應用。PCT/EP98/07714中描述了來源于絲聚蛋白(原)的合成肽在診斷類風濕性關節(jié)炎中的應用。該申請中還記載了來源于人波形纖維蛋白，細胞角蛋白l,細胞角蛋白9以及其他中間纖絲蛋白的合成肽。然而，上述提到的方法仍只能從全部類風濕性關節(jié)炎患者中檢測出有限數(shù)目的患者。因此，強烈需要一種可實現(xiàn)敏感性增加而同時保持實質上相等或甚至提高的特異性的方法。
發(fā)明內容為了達到該目的，本發(fā)明提供了一種如前言所述的方法，該方法的特征在于所述的自身抗體與含有XG基序的肽單元和含有XnonG基序的肽單元接觸，其中X為瓜氨酸殘基或其類似物，G為甘氨酸，而nonG為除甘氨酸以外的氨基酸。下述實驗顯示，獲自患有類風濕性關節(jié)炎的患者的血清中含有兩種不同的抗體群。其中一群抗體與諸如上文提到的已出版文獻中公開的XG肽單元反應。該群抗體可通過已公開的XG肽單元部分地檢測到，當釆用本發(fā)明所述的肽單元時，則能檢測到更大部分的該群抗體。另一群抗體與XnonG肽單元反應。直到目前為止，在已出版的文獻中還沒有觀察到這群抗體。如下文更詳細的記栽，來自于患有類風濕性關節(jié)炎患者的大多數(shù)血清都含有這兩群抗體。因此，這些血清可以通過包括XG或XnonG肽單元的診斷測試來檢測。然而看來似乎相當大一部分患有類風濕性關節(jié)炎的患者的血清只含有兩群抗體中的一種。因此，采用上述已出版公開的文獻中描述的診斷測試，無法檢測或僅能檢測極小一部分的僅含有對XnonG肽單元的抗體的血清。如今，如果診斷測試中包括XnonG肽單元，則可以檢測大部分的這類血清。因而本發(fā)明所述的改進診斷方法包括至少一種XG和一種XnonG肽。因此與已出版公開文獻中記栽的測試相比，本發(fā)明所述的i貪斷測試可達到20%更為敏感。當所述的具有XnonG基序的肽單元包括一非來源于天然蛋白如人類絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，或纖維蛋白原，以及相關的蛋白波形纖維蛋白，及細胞角蛋白l和細胞角蛋白9，或其他相關的中間纖絲蛋白的部分時，可以獲得特別好的結果。令人驚奇的是，結果顯示，當將該非來源于天然蛋白的XnonG肽與本發(fā)明所述的XG肽組合時，可得到一更加改進的診斷方法。更特別的，這種肽單元組合在本發(fā)明所述的方法中的應用提供了一種敏感性非常高，且保持優(yōu)異的特異性的診斷方法。由于上述提到的公開文獻仍然是基于下述觀念，即來自于RA患者的自身抗體與來源于天然存在的蛋白，例如絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白1或細胞角蛋白9的肽特別好地發(fā)生反應，因此這就更讓人驚訝了。例如，PCT/EP98/07714中記載了一種絲聚蛋白來源的XnonG肽(IPG1249)。它與3.3%的SLE患者血清交叉反應，且與絲聚蛋白有82%的同源性。當所述的具有XnonG基序的肽單元包含一種三肽時，則可獲得較好的結果，其中三肽的中間氨基酸為瓜氨酸或其類似物，其優(yōu)選選自XXK,XXY,KXI，MXR，RXY，WXK，MXH，VXK，NXR，WXS,RXW，YXM，IXX，XXF，RXH，TXV，PXH,AXF，F(xiàn)XR，YXF，LXM，LXY，YXP，HXS和PXW。優(yōu)選的，nonG為選自H，I，W,S，R，K，Y，M，F(xiàn),V，P，Cit或其類似物的氨基酸。如下述實驗所示，這類XnonG肽單元非常有效。包括XG基序的肽單元，可來源于或不來源于絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白l或細胞角蛋白9，并且有效地是由PCT/NL97/00624中已知的cfcl。在本文的上下文中，術語氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸，和具有D-構型或L-構型的氨基酸。在本申請中，非天然氨基酸應理解為該類的氨基酸存在于反-倒位肽，反向肽，其中側鏈位于肽骨架的酰胺氮原子上的肽，和其中肽骨架上的CO被2，3或優(yōu)選單一-CHr基團所替代的肽(假肽)中。氨基酸還可被修飾。例如，羧酸基團可以被酯化或可被轉化為酰胺，同時氨基基團可被烷基化，例如，甲基化?？蛇x的，肽上的功能基團可以提供有保護基團或標記(例如熒光或放射性標記)。肽中的氨基基團和羧酸基團可以以通過使用酸或堿而形成的鹽的形式存在。如果采用合成肽，則很容易制備可以使用的本發(fā)明范圍內的所有種類的變異體。例如，芳族側鏈基團，如來源于苯丙氨酸和酪氨酸，可^^皮一個或多個閨素原子卣化。肽模擬(peptidomimetic)和有枳4莫擬(organomimetic)的實施方案也落在本發(fā)明的范圍內，及其在本發(fā)明所述方法中的應用。還可采用其類似物來代替Cit殘基，例如那些在圖1中列出的氨基酸形式的類似物。這種類似物及其制備方法為本領域的普通技術人員所公知。例如，Sonkeetal.在StereoselectiveBiocatalysis(2000)，pp.23-58中有記栽，以及在Greene:ProtectivegroupsinOrganicsynthesis(Wiley,NewYork1999)中。依照有利的實施方案，所述的瓜氨酸類似物的側鏈具有如下通式(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中Q=NH2，CH3，NHCH3或N(CH3)2;Y=0，NH,或NCH3;Z=0,NH或CH2;和n=2，3或4;條件是如果Q=NH2和Z=NH,則Y不為NH。在本文上下文中，肽單元應理解為長度至少7個氨基酸的肽。肽單元可以具有一個或多個側鏈。同時，肽單元或肽單元的末端可以彼此相互獨立地被乙?；?，糖基化，烷基化，或磷酸化。本文上下文中所述的肽單元是指非來源于絲聚蛋白(原)，纖雄蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白l或細胞角蛋白9，和其他中間纖絲蛋白，如果與這些蛋白的同源性(氨基酸序列的相似性)低于80%，更優(yōu)選的低于75%，如低于70%或65%，最優(yōu)選的低于60%，例如低于55%或50%。所述的肽單元列于表5中，其非來源于絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白1和細胞角蛋白9，且同源性介于15-45%。關于同源性檢查，精氨酸、瓜氨酸和瓜氨酸類似物被認為是等同的(同一的)。包括XG和XnonG的肽單元可以是或不是相同分子的一部分。隨后將對此進行敘述。為了進行檢測試驗，所述的肽單元可以與一栽體相連，并可選地提供有標記。得到的復合物可以通過本領域普通技術人員7>知的任何方式檢測。所述的復合物可以間接檢測，例如在竟爭試驗的情況下，其中復合物本身不標記。與兩個肽單元的反應可以同時或相繼地并在相同容器(例如微量滴定板的孔)或不同容器中發(fā)生。本申請不旨在作為教導如何成為本領域普通技術人員的教育出版物。因此，本申請僅限于提供了使本領域普通技術人員能夠理解發(fā)明，實施發(fā)明和理解本發(fā)明要求保護的范圍的充分信息。優(yōu)選的，所述的肽單元被確認患有RA的患者的100份隨機血清中的至少2份所識別。很明顯，優(yōu)選采用能被顯著更高百分比的，優(yōu)選至少30%的血清識別的肽單元。本發(fā)明所述方法中的肽單元的數(shù)目優(yōu)選為2或大于2。優(yōu)選的，本發(fā)明涉及上述的一種方法，其中具有XG基序的肽單元和具有XnonG基序的肽單元被至少10%的患者系列血清同時識別。毫無疑問，優(yōu)選那些導致更高敏感性的肽單元組合。采用本文所述的一些肽單元組合，診斷測試可以獲得40，60，70,80或甚至85和高于90%的敏感性。已顯示，如果其中的至少一種肽單元為環(huán)狀肽單元，則檢測的敏感性可以進一步提高。具有XG基序的肽單元和具有XnonG的肽單元優(yōu)選為多肽(multipeptide)的一部分。根據(jù)本發(fā)明的上下文，多肽為包括至少2個抗原性肽單元的分子，也就是，可以或可以不通過共價鍵連接的肽單元的組合。這種多肽可以由線性的，分枝狀的，環(huán)狀的肽單元或這些的組合來組成。多肽既可以由具有相同氨基酸序列的肽單元組成，也可由具有不同氨基酸序列的肽單元組成。根據(jù)本發(fā)明所述的多肽包括至少7個，優(yōu)選至少IO個氨基酸，也就是所述的肽單元可以重疊。理所當然的，XG和XnonG基序不能重疊。本發(fā)明還涉及對于本發(fā)明所述方法非常有用的XnonG肽單元，其包括具有如下通式(II)的序列(Al-A2-A3-A4曙A5)畫Cit國(A6)-(A7-A8-A9畫A10畫A11)(II)其中，Al-A2-A3-A4-A5為選自下述的氨基酸序列-RHGRQIRCitYK-HGRQCit-GRQCitCit-FQMCitH-C證RGM誦ARFQM—QCitYKW-KPYTV-RNLRL-RRRCitY-RFKSN-RGKSN-RWVSQ-MKPRY-KSFVW-YSFVW-FQMRH匿R醒NR-RMGRP及其同源序列；A7為除甘氨酸之外的氨基酸；A7-A8-A9-A10-A11為選自下述的氨基酸序列-KYIIY-TNRKF-KWCitKI-CkRAVI-RCitGHS-CitGRSR-CitYIIY-CitRLIR-IERKR-FMRKP-FMRRP-ERNHA-AVITA-TPNRW-TYNRW-RTPTR-RIVVV-HARPR-RGMCitR-IRFPV及其同源序列；以及具有通式(II)的肽的功能類似物。本發(fā)明還涉及一種XnonG肽單元，其對本發(fā)明所述方法十分有用，其包括具有通式(III)的序列(B1-B2-B3-B4-B5-B6)-Cit-(B7)-(B8畫B9-B10-B11)(HI)其中Bl-B2-B3-B4-B5-B6為選自下述的氨基酸序列-INCitRAS-ICitKRLY-KC"CitYNI-RLYFICit-IRQGAR-CitERCitVQ-CitHQRIT-RICitRVCit-GRNQRY-RCitRQHP-CitCitRCitVA-RPKQHV-RKCitGCitR-RCitCitRNT-RCitQCitFT-QLVYLQ-QYNRFK-CitLRHIR-PRCitCitCitK-RCitQVRY-GRCitHAH-ARHVIR-RCitGHMF-GRNIRV-QIFYLCit-RQGPIA-GVYLVR-NCitCitRRV-KCitRLCitY-GRRCitCitL-RMPHCitH及其同源序列；B7為除甘氨酸之外的氨基酸；B8-B9-B10-B11為選自下述的氨基酸序列-CitHRR-CitIRR-FRRN-AQTT-GYPK-RPPQ-GCitRK-PIPR-YTIH隱RIKA-CitRVR-TRRP-TIRP-IKCitR畫RNVV-CitRRY-CitRPR-TRCitCit-CitCitGR-LCURCk-RVRCit-VPRT-YCitFR-ARCitCit-RQCitR-HIRR-C薩MR-CitRICit-VRKS-PCitCHR-CkRRK及其同源序列；以及具有通式(III)的肽的功能類似物。如聯(lián)系在A1畫A2誦A3畫A4-A5，A7-A8-A9-A10-A11，Bl-B2-B3-B4-B5-B6和B8-B9-B10-B11中的應用，術語"同源序列，，是指每一氨基酸序列的至多兩個氨基酸可以被許多其他氨基酸置換(包括瓜氨酸和/或其類似物)，至多兩個氨基酸(包括或其類似物)可以被引入，以及至多兩個氨基酸可以缺失。聯(lián)系在具有通式(II)或(III)的肽中的應用，術語"類似物，，是指，可選地-一個或多個氨基酸可具有D-構型，-肽的一個或多個側鏈(除了瓜氨酸或其類似物的側鏈)或末端可以相互獨立地被乙?；?，糖基化，烷基化，或磷酸化；以及-一個或多個氨基酸可被非天然氨基酸所置換。A6和B7(相互獨立)優(yōu)選選自Cit，H，I，K，R，S,W，Y，M，F(xiàn)，V和P。用于本發(fā)明所述方法的特別優(yōu)選的肽特征在于其包括至少一個選自下列的肽序列RHGRQCitCitKYIIY工RCitKCitITNRKFRHGRQCitCitCitYIIARFQMCitHCitRL.工RQCitKWCitKIERKRKPYTVCitKFMRKPKPYTVCitKFMRRPRNRCitRERNHARRRCitYCitRAVITARFKSNCitRTPNRWRGKsNCitRTYNRWRFKsNCitRTYNRWGKsNCitRTPNRWRWVsQCitRRTPTRMKPRYCitRRIVVVKSFVWCitSHARPRYSFVWCitSHARPRRNMNRCitWRGMCitRMGRPCitWIRFPV以及<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>或其類似物。本發(fā)明所述方法中使用的合適的XG肽優(yōu)選包括具有通式(IV)的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>C3-C4-C5代表3個氨基酸，其中至少1個氨基酸，優(yōu)選2個氨<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>基酸相互獨立地為堿性的，芳族的，或V;C6等于一個堿性或芳族氨基酸，或等于A，GE，P，V，S或Cit或其類似物；和C7畫C8-C9-C10為SRAA，SCitAA,RPLD，RVVE或PGLD;以及具有通式(IV)的肽的類似物。聯(lián)系在具有通式(IV)的肽中的應用，術語"類似物，，是指，可選地---個或多個氨基酸可具有D-構型，-肽的一個或多個側鏈(除了瓜氨酸或其類似物的側鏈)或末端相互獨立地可以被乙?；?，糖基化，烷基化，或磷酸化；以及-一個或多個氨基酸可被非天然氨基酸所置換。適于本發(fā)明所述方法使用的XG肽的特定例子包括選自下列的序列HQRKWCitGASRAAHQHWRCitGASRAAHQFRFCitGCitSRAAHQERRCitGESRAAHQKWRCitGFSRAAHQRWKCitGGSRAAHQRRTCitGGSRAAHQRRGCitGGSRAAHQCitFRCitGHSRAAGFFSACitGHRPDHQERGCitGKSRAAHQEKRCitGKSRAAHQRWCitGKSRAAHQKRNCitGKSRAAEGGGVCitGPRVVEHQWRHCitGRSCitAAHQKWNCitGRSRA.AHQKFWCitGRSRAAHQKCitKCitGRSRAAHQKWRCitGRSCitAAHQAWRCitGRSCitAAHQNQWCitGRSRAAHQNSKCitGRSRAAHQKRRCitGRSRAAHQKRFCitGRSRAAHQKRYCitGRSRAAHQKRHCitGRSRAAHQERACitGSSRAAHQEKMCitGVSRAAHQKRGCitGWSRAAHQRRVCitGW■SRAAHQWNRCitGWSRA'AHQQRMCitGWSRAAHQSHRCitGWSRAAHQFRFCitGWSRAAHQKRRCitGWSRAAGVKGHCitGYPGD或其類似物。本發(fā)明所述的肽優(yōu)選為環(huán)狀肽，其中的環(huán)包括至少IO個氨基酸，更優(yōu)選至少11個氨基酸。本領域普通技術人員通曉制備環(huán)狀肽的各種方法，因此無需進一步的解釋。根據(jù)本發(fā)明的一個最優(yōu)選的方法，XG肽與至少一個XnonG肽聯(lián)合使用，其中XG肽選自如下組0002-27HQKRGCitGWSRAA0002-29HQRRVCitGWSRAA0002-31HQRRTCitGGSRAA0002-32HQRKWCitGASRAA0002-36HQFRFCitGCitSRAA0002-37HQKWR'CitGRSCitAA0002-63HQFRFCitGWSRAA且X幽G肽選自如下組:0107-32KPYTVCitKFMRRP0107-35arfqmCithCitr;lir0107-45YsFVWCitsHARpR0113-30ARFQMRHCitRiR0218-36RNLRIjCitRERNHA根據(jù)診斷測試期望達到的特異性和敏感性，以及待檢測的類風濕性關節(jié)炎血清的個別群，優(yōu)選的XG和XnonG肽單元的組合選自如下組0002-27and0107-32;0002-27和0107-3550002-27和0107-45^0002-27和0113-30;0002-27和0218-36，2-29和0107-3250002-29和0107-35;0002-29和0107-45;0002-29和0113-30;0002-29和0218-36;0002-31和0107-32;0002-31和0107-35;0002-31和0107-45;0002-31和0113-30;0002-31和0218-36;0002-32和0107-32;0002-32和0107-35;0002-32和0107-45;0002-32和0113-30^0002-32和0218-36;0002-36和0107-32j0002-36和0107-35;0002-36和0107-45;0002-36和0113-30;0002-36和0218-36;0002-37和0107-32;0002-37和0107-35;0002-37和0107-45;0002-37和0113-30;0002-37和0218-36;0002-63和0107-32;0002-63和0107-35;0002-63和0107-45;0002-630113-30;0002-63和0218-36.上述提到的組合顯示出產(chǎn)束敏感性平均增加6%,將XG和XnonG肽的這種組合測試的總敏感性升高到75-78%。下述實施例中描述的結果進一步顯示各種不同的肽單元還檢測出不同的血清類群。通過加入第3個肽單元或甚至是第4個或更多肽單元，可以實現(xiàn)額外的敏感性增加。取決于選自上述組的肽單元組合，本發(fā)明所述的i貪斷測試的敏感性可達88-92%。本發(fā)明還涉及一種多肽，特征在于其為線性的或分枝狀的多肽，包括至少兩個相互獨立地選自如下的線性的或環(huán)狀的肽序列-選自具有通式(II)和(III)的肽單元及其類似物的肽單元；-具有通式(IV)的肽單元及其類似物。這種多肽很適于在本發(fā)明所述的方法中使用。由于肽以相同的已知比例4吏用，并且避免了測定期間或預備工作期間的額外操作(例如，用多肽包被微量滴定板)，因此這類多肽使得更簡4吏和更可靠地實施該方法成為可能。本發(fā)明進一步涉及一種從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中測定自身抗體的存在的診斷試劑盒，其中所述的診斷試劑盒包括根據(jù)權利要求5到13任意一項所述的肽，或根據(jù)權利要求14所述的多肽，或其混合物，以及至少一種另外的試劑。本發(fā)明還涉及如上文所述的肽或免疫毒素分子的抗體，或其組合物，用作藥物組合物。本發(fā)明進一步涉及如上文所述的肽或免疫毒素分子的抗體或其組合物用于制備用于類風濕性關節(jié)炎的藥物組合物或診斷試劑。本發(fā)明還涉及如上文所述的肽或其組合物在制備用于治療自身免疫性疾病的藥物組合物中的應用，其通過增加抗原免疫復合物的大小，從而改善對所形成的免疫復合物的凈化來實現(xiàn)。本發(fā)明因此還涉及一種通過向需要這種治療的患者體內引入至少一種本發(fā)明所述的肽，來治療類風濕性關節(jié)炎的方法。本發(fā)明進一步涉及一種用于選擇適于診斷RA的肽的方法，其中用從患有RA的患者獲得的抗體來篩選肽文庫，且其中所述的肽文庫選自如下組文庫(1):HQE^SCit^SSRAA其中2￡=除了半胱氨酸和色氨酸之外的任何氨基酸文庫(2):HQ2￡^2￡CitG^SR/CitAA其中^=除了半胱氨酸之外的任何氨基酸，但包括瓜氨酸文庫(3):HQES2￡Cit^SSR/CitAA其中s=除了半胱氨酸之外的任何氨基酸，但包括瓜氨酸Lib(4):XXXXXXCitXXXXX其中2￡=除了半胱氨酸之外的任何氨基酸，但包括瓜氨酸或其等同物。最后，本發(fā)明涉及一種可借助于上文提到的方法獲得的用于診斷測試中的肽。術語"用于治療的藥物組合物"或"用于治療的藥物"或"蛋白質在制備用于治療的藥物中的應用，，涉及如上所述用于治療疾病的包含如上文所述的肽或與該肽特異性結合的抗體以及藥學上可接受的載體或賦形劑(這兩個術語是可互換的)的組合物。本領域普通技術人員熟知的合適的載體或賦形劑為鹽，Ringer's溶液，葡萄糖溶液，Hank's溶液，油脂類，油酸乙酯，5%葡萄糖鹽水，提高等滲性和化學穩(wěn)定性的物質，緩沖液和防腐劑。其他適合的栽體包括其自身不誘導產(chǎn)生對接受所述組合物的個體有害的抗體的任何載體，如，蛋白質，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸和氨基酸聚合物。所述"藥物，，可以采用本領域普通技術人員已知的任何方式給藥。本發(fā)明所述的肽可以被標記(如本領域公知的，放射性，熒光或其他標記方式)或可與載體一起提供。以這種形式存在的這類肽也屬于本發(fā)明保護范圍之內。例如，肽可與載體蛋白偶聯(lián)，所述的栽體蛋白諸如匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白。同時，本發(fā)明所述的肽可以非共價或共價地與固相載體偶聯(lián)，所述的固相栽體諸如微球體(金，聚苯乙烯等)，載玻片，芯片，或反應容器壁或微量滴定板上的孔。所述的肽可以用直接或間接的標記進行標記。實例包括生物素，熒光素和酶，例如辣根過氧化物酶。所有這些都是本領域普通技術人員公知的，因此不需要進一步的解釋。圖1例示可以用于本發(fā)明的瓜氨酸類似物。具體實施方式實施例實施例1:肽合成如DeKosterH.S.等人(J.Immunol.Methods,187，pp.177-188，(1995))所述來合成瓜氨酸化(chrullinated)的肽。采用肽分子通過酰胺鍵結合其上的微粒珠(bead)，從而當除去保護基團后，肽分子仍然結合在微粒珠上。為了合成肽，使用了一種自動化多肽合成儀(AbimedAMS422,Abimed，Langenfeld，Germany)。摻入的氨基酸和肽連接物6-氨基己酸用Fmoc-基團保護，并且為了促進偶聯(lián)，采用PyBOP和N-甲基嗎啉活化受保護的氨基酸。必要時，側鏈也采用保護對酸敏感的側鏈的基團來保護。所釆用的微粒珠的直徑為約100pm，同時每個微粒珠包含大約100pmol的肽。據(jù)估計，該量中的大約0.5%與外部結合，并且在原則上可與抗體接近。為了更大量合成，采用了具有酸敏感性連接物的微粒珠。肽合成的化學過程與上文中已經(jīng)描述的過程大致相當。采用三氟乙酸將肽裂解下來，并通過乙醚沉淀的方法分離，所有都依照本領域/>知的方法，對此本領域技術人員不需要進一步的解釋。當然也可以從商業(yè)來源獲取具有期望序列的肽。各肽的純度和身份通過分析RP-HPLC和飛行時間質譜法(MALDI-TOF)來檢驗。借助于上述方法，構建了4個肽文庫，每一個都包括了大量的(8xl(^)瓜氨酸化肽。如下通式顯示了每一文庫中的肽的氨基酸序列文庫(l):HQE^2￡Cit2￡2￡SRAA其中2￡=除半胱氨酸和色氨酸以外的任何氨基酸文庫(2):HQU2￡CitG2￡SR/CitAA其中2￡=除半胱氨酸以外但包括瓜氨酸的任何氨基酸文庫(3):HQES2￡Cit2￡2￡SR/CitAA其中2￡=除半胱氨酸以外但包括瓜氨酸的任何氨基酸文庫(4):XXXXXXCitXXXXX其中2￡=除半胱氨酸以外但包括瓜氨酸的任何氨基酸對這些文庫根據(jù)下文中描述的方法采用患有類風濕性關節(jié)炎的患者的血清來進行篩選。實施例2:微粒珠偶聯(lián)的肽與來自于患有類風濕性關節(jié)炎(RA)患者的血清的反應借助于蛋白A-瓊脂糖凝膠，從臨床診斷患有RA的患者的血清中分離IgG。將微粒珠與下述溶液一起溫育，所述溶液包括i)來自患者的全血清，或ii)與報道酶基團(堿性磷酸酶標記試劑盒；Roche/Boehringer,Mannheim,Germany)纟晨合的患者的IgG。對于血清(i),將其與堿性磷酸酶綴合的抗-人IgG抗體(DakoD0336;DakoImmunoglobulins,Glostr叩,Denmark)—起進行第二次溫育。每次溫育后，都釆用pH8.9的Tris-HCl緩沖液(50mMTrispH8.9，150mMNaCl,0.5%Tween20)充分徹底漂洗微粒珠。借助顯微鏡，選擇肽已結合了最多人IgG的微粒珠(經(jīng)堿性磷酸酶底物染色后，所述底物轉變?yōu)椴蝗艿挠猩a(chǎn)物，從而這些微粒珠成為最強著色的微粒珠)。實施例3:ELISA以稍大量合成最感興趣的肽，以形成線性和環(huán)狀變異體，在大多數(shù)情況下為瓜氨酸和精氨酸(-對照)變異體。測試這些肽與來自于RA患者的一系列血清的反應性。將所述肽包被于ELISA板并與來自RA患者的血清一起溫育。每份血清測試一式兩份。來自健康者的血清用作陰性對照。實施例4:XG肽家族通過采用與cfcl(參見PCT/NL97/00624，其以參考文獻方式包括于此)呈陽性反應的血清，發(fā)現(xiàn)具有在相對于瓜氨酸殘基的+l位(即C-末端)的甘氨酸的肽。置換+1位置上的G,如采用A(丙氨酸)，則降低反應性65%。在某些肽中，-3位置上的E(谷氨酸)優(yōu)選不被A置換(活性喪失47%)。類似的，-4位置上的Q(谷氨酰胺)，-5位置上的H(組氨酸)，和+3位置上的S(絲氨酸)常表現(xiàn)出是有利的。因此，選擇出多種具有-XG-組合的肽序列，它們全部都與RA血清反應。優(yōu)選的該XG家族成員的特定例子為表l:XG肽家族:HQRKWCitG■ASRAA(0002-32)HQHWRCitGASRAA(0002-42)HQFRFCitGCitSRAA(0002-36)HQERRCitGESRAA(020699-2)HQKWRCitGFSRAA(0102-74)HQRWKCitGGSRA'A(0002-28)HQRRTCitGGSRAA(0002-31)HQRRGCitGGSRAA(0002-33)HQCit.FRCitGHSRAA(0002-43)GFFSACitGHRPIjD(OIOI-"HQERGCitGKSRAA(020699-1)HQEKRCitGKSRAA(020699-4)HQRWCitGKSRAA(0002-30)HQKRNCitGKSRAA(0002-38)EGGGVCitGPRVVE(010卜5)HQWRHCitGRSCitAA(0002-34)HQKWNCitGRSRAA(0002-24)HQKFWCitGRSRAA(0002-25)HQKCitKCitGRSR.AA(0002-26)HQKWRCitGRSCitAA(0002-37)HQAWRCitGRSCitAA(0002-40)HQNQWCitGRSRAA(0002-44)HQNSKCitGRSRAA(0002-45)HQKRRCitGRSRAA(0102-76)HQKRFCitGRSRAA(0102-77)HQKRYCitGRSRAA(0102-78)HQKRHCitGRSRAA(0102-79)HQERACitGSsRAA(020699-3)HQEKMCitGVsRAA(020699-5)HQKRGCitGWsRAA(0002-27)HQRRVCitGWsRAA(0002-29)HQWNRCitGWsRAA(0002-35)HQQRMCitGwsRAA(0002-41)HQSHRCitGwsRAA(0002-39)HQFRFCitGwsRAA(0002-63)HQKRRCitGwsRAA(0102-75)GVKGHCitGYpGLD(Q101-3)從上述數(shù)據(jù)中可得出對特定位置表現(xiàn)出具有優(yōu)先選擇的氨基酸的共有序列。優(yōu)選^皮RA血清識別的XG肽單元因而可以由如下表示-3-2-l0+1+2KRRXGRRWWEK所有這些肽都顯示出好到優(yōu)異的結果。特別是肽0002-35，0002-36和0002-63非常令人滿意。在大多數(shù)情況下，這種肽的環(huán)狀變異體的反應甚至更好(見下文)。偶爾，這也不總是這樣。例如，線性肽0101-7與55%的血清反應。而該肽的環(huán)狀變異體"僅，，與186份RA-血清中的45%發(fā)生反應。正如所料，這些肽的精氨酸變異體(其中瓜氨酸被精氨酸置換)不與RA血清反應。實施例5:XG肽的環(huán)狀變異體下文所述的肽按照半胱氨酸-溴乙酸方法來環(huán)化。測試了幾種環(huán)狀變異體，特別是肽0002-27,0002-29,0002-31,0002-36，和0002-63的環(huán)狀變異體被證實令人感興趣。環(huán)大小多種充分反應的肽用于合成另外的環(huán)狀肽，其中每一個具有不同的環(huán)大小。最終測試了其中的8，9,10,11和12-聚體(mer)。所有這些肽都分別與48份RA血清和8份正常血清進行ELISA檢測。其中，8-和9-聚體與一些血清反應(分別為22%(滴度O,47)和28%(滴度O,5))，但滴度(發(fā)現(xiàn)的OD值)遠低于采用較大的環(huán)時(10-聚體33%,滴度值為0.60;11-和12-聚體50%，平均滴度為0.74)。表2:采用環(huán)狀肽0002-36的血清分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>上表代表了與獲自患有RA的患者和患有多種其他自身免疫疾病的患者的血清的ELISA。這顯示了RA血清對肽如0002-36的高度特異性。幾乎沒有一例顯示出獲自其他自身免疫疾病的血清和來自于正常健康個體的材料呈陽性。同時還測試了肽0002-36的精氨酸變異體(R位于0和+2位置上，即代替了通式中的Cit)，并顯示出對所有測試的RA和正常血清都為陰性。表3:與來自[PCT/NL97/00624j的肽cfcl相比較，肽36與132份RA血清的ELISA<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>通過采用環(huán)狀cfcl以及環(huán)k的0002-36,可增加額外的2%敏感性(總73%,見表4),只要其不伴隨著特異性的下降，這對于這類應用是一個受歡迎的改進。后者似乎不是這種情況。因此，在XG組的肽中，關于其與RA抗體反應的能力存在多樣性。表4:cfl,0002-36,和0002-63的環(huán)狀變異體與186份RA血清的ELISA<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在2組RA血清(總共318份血清)中比較0002-36的線性和環(huán)狀變異體，環(huán)狀變異體顯示出比線性變異體反應頻率更高(和更好)。更好是由于環(huán)狀變異體的OD值也比線性組合物高得多。無論環(huán)狀變異體是通過兩個半胱氨酸之間的-S-S-鍵產(chǎn)生，還是通過形成硫醚，例如，通過半胱氨酸和溴乙?；鶊F反應(由半胱氨酸側鏈上的硫羥與N-末端溴乙?；鶊F反應形成，形成硫醚)，這都無關緊要。在肽合成后，通過使與微粒珠結合的肽(肽基樹脂)與同一肽中的溴乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應，從而形成N-末端溴乙?；鶊F。在pH-8的磷酸鹽緩沖的乙腈水溶液中，發(fā)生環(huán)閉合。實施例6:XnonG肽家族令人驚奇的是，還發(fā)現(xiàn)一類肽，其非來源于絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白l和細胞角蛋白9，且能被不與或僅輕微地與上述XG家族的肽反應的RA血清識別。這些肽的特征在于Cit的C-末端側的氨基酸為堿性(R，K，H),芳族(W，Y,F)，脂族(M，I，V)或Cit，S或P(見表5)，但不為G。因此，將其命名為XnonG家族。值得注意的是，在-2，-1,+1和+2位置上，XnonG肽包括了相對較多的帶正電荷的氨基酸。因此，這些RA血清中的抗體在一種不同的肽背景中與瓜氨酸反應。所提到的XnonG肽都與一種或多種XG-陰性血清反應。例如，肽0107-32,0107-35,和0107-45與大約15-18%的XG陰性血清反應。與環(huán)狀cfcl和環(huán)狀0002-36的組合相比，基于一種或多種這些肽的ELISA測試引起敏感性提高至少5%(從73%上升到78%)。十分重要的是，提到的XnonG肽中沒有一個與對照血清反應。表<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>YSFVWCitSHARPRRNMNRCitWRGMCitBRMGRPCit:W2RFPV以及INC丄tRASC丄tKCitH工CitKR:LYCitMCitIKCitCitYNICitCitFR1/YFIC丄tCitRAQT工RQGARCitRC5"KCitERCitVQCitRRPCUHQRITCitVGCitRICitRVCitCitTE>IGRN<2RYCitLYTIRCitRQH￡>CitHRICitCitRCitVACitFRPK<3HVCitHTRRRKCitGCitRCitCitRCitCitRNTCitHICitFTCitCitLQCitCitCitFKCitCitCitHIRCit<2TCitCitKCitVRYCitCitHAHCitPRIRCitCitVHMFCitVYRVCitCitAIiCitCitHR工ACitIiHIVRCitLCitCitRRVCitMRLCitYCitE>CitCitL>CitRRCitQQLVYQYNRCitLRPRCitCitQRCitR2i"VCitIFQGVYCitCitRRME1RGAGQRGNKGRRRRRNTPQRKIPRHKACitRVRTIRPKCitRRNVVRRYRPRCitCitCitCitGRCitRCitRCitRTRCitRRR!■VE>CitFRCitQCitRRMMRCitRVRKPCitHCitHCitSCitRRICitSCitRK(0107-45)(0107-30〉(0102-72)0215-"0222-560222-570223_12150202咖21S0202咖3061102RA0206l:i02RA030S1102咖50611Q2咖6061102RA0706UQ2RA08061102RA0906U02RA11061102RA1206U02組4061102RA15061102BA16061102RA17181102RMH221102RA01221102RA020218-36271102RA01271102咖2271102RR0327U02RA04從上述數(shù)據(jù)中，可以推導出對某些特定位置有優(yōu)先選擇的氨基酸的共有序列。因此，優(yōu)選被RA血清識別的XrumG肽單元可由以下表示-5-43-2-l0+1+2+3+4+5RRRRRXRRRRRNYVGHTIIKFIYYPPHSVNG實驗表明，例如，環(huán)狀形式的肽0107-35與18%的不與環(huán)狀0002-36反應的血清反應。采用其他肽還可使該敏感性進一步增加。例如，采用環(huán)狀肽0107-32還可進一步增加8%。這可使敏感性增加至80%。對肽0107-45發(fā)現(xiàn)了類似值。52份XG-陰性血清中的總共17份(32%)顯示出與一種或多種XnonG肽反應。這意味著采用多于2種XG和XnonG肽的組合(本發(fā)明的優(yōu)選實施方案)，可實現(xiàn)敏感性超過80%。因此，這優(yōu)于通過具有通式IV的肽和由PCT/NL97/00624中已知的那些肽的組合所能實現(xiàn)的。通過采用更多的肽，敏感性可更進一步增加。當采用環(huán)狀XG肽(例如0002-63或0002-36)與線性或環(huán)狀XnonG肽(例如0107-35)一起測試RA血清時，對于318份RA血清，獲得78%的敏感性。加入第3個，第4個，甚至可能的第5個肽，增加敏感性至85。/。(分別為肽0107-32，0107-42，0107-34)。318份RA血清中僅有48份不與一種所提到的肽反應。實施例7:包含XG和XnonG肽單元的診斷測試的敏感性和特異逸采用上述方法，測試了7種XG肽單元與表2中提到的來自于患有類風濕性關節(jié)炎的患者的318份血清的反應性。借助于在表2中提到的來自于對照患者和正常供體的血清，確定了其特異性。表6顯示了各個肽單元的特異性和敏感性。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>根據(jù)本文中所述的方法，測試了5種XnonG肽單元與表2中提到的來自于患有類風濕性關節(jié)炎的患者的相同的318份血清的反應性。同樣，借助于在表2中提到的來自對照患者和正常供體的血清，確定了其特異性。表7顯示了各個肽單元的特異性和敏感性。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>釆用如工人尸/l迎wJl。切-貝渭的80份血清來測試表7中提到的XnonG肽單元的反應性。因此，表8中提到的百分比顯示出包含對XnonG肽單元的抗體，但不包含XG反應性抗體的血清百分比。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>上述結果顯示，如果將表6的每一XG肽單元與表7中的每一肽單元組合，可預期敏感性增加。所有下文給出的肽單元組合均采用了上述來自于患有類風濕性關節(jié)炎的患者的318份血清組中的代表性部分進行了檢測。該實驗事實上顯示獲得了敏感性平均增加6%,將這種組合測試的總敏感性升至75-78%。測試的肽單元組合涉及肽單元0002-27與0107-32;0002-27與0107-35;0002-27與0107-45;0002-27與0113-30;0002-27與0218-36;0002-29與0107-32;0002-29與0107-35;0002-29與0107-45;0002-29與0113-30;0002-29與0218-36;0002-31與0107-32;0002-31與0107-35;0002-31與0107-45;0002-31與0113-30;0002-31與0218-36;0002-32與0107-32;0002-32與0107-35;0002-32與0107-45;0002-32與0113-30;0002-32與0218-36;0002-36與0107-32;0002-36與0107-35;0002-36與0107-45;0002-36與0113-30;0002-36與0218-36;0002-37與0107-32;0002-37與0107-35;0002-37與0107-45;0002-37與0113-30;0002-37與0218-36;0002-63與0107-32;0002-63與0107-35;0002-63與0107-45;0002-63與0113-30和最后0002-63與0218-36。關于表6和表8的結果，還應該注意到，各種肽單元還檢測出不同的血清組群。由此可以推論如果加入第3種肽單元或甚至是第4種或更多的肽單元，則上述提到的XG和XnonG肽單元組合還能產(chǎn)生敏感性的進一步增加。取決于所選擇的肽單元組合，本發(fā)明所述的診斷測試的確可以達到88-92%的敏感性。序列表<110>-StichtingTechnischeWetenschappenVenrooij,Walthei:JDrijfhout,JanWBoekel,MartinusAPruijn,GerardusJ<12<D>從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法、肽和檢測試劑盒<130>NL45032<150>1019540<151>2001-12-11<160>207<170>Pa.tentlnversion3，1<210><21!l>12<212>PRT..<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1>.:(12)<223>x-瓜氨酸<■>1HisGinLysArgGlyXaaGlyTrpSerArgAlaAla1510<210>2<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC—FEATURE<222>(1)-:(12)<223>X-瓜氨酸<400>2HisGinArgArgValXaaGlyTrpSerArgMaAla1'510■<210>3<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(1).:(12)<223>X-瓜氨酸<徹>3HisGinArgArgThrXaaGlyGlySerArgAlaAla1510<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC—FEATURE<222>(".:(12)<223>X-瓜氨酸<400>4HisGinArgLysTrpXaaGlyAlaSerArgAlaMa1510<210>5<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).:(12)<223〉乂=瓜氨酸<400>5HisGinPheArgPheXaaGlyXaaSerArgAlaAla1510<210>6<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).:(12><223>X-瓜氨酸<400>6HisGinLysTrpArgXaa15GlyArgSerXaaAlaAla10<210>7<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MOD—RES<222>(1):.(12><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEMURE<222>(1>.:(12)<223>X-瓜氨酸<4O0>7HisGinPheArgPheXaaGlyTrpSerArgAlaAla1'510<210>8<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC—FEATURE<222>(1).:(12)<223>X-瓜氨酸<400>8LysProTyrThrValXaaLysPheMetArgArgPro510<210>9<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC—FEATTOE<222>(1).7(12)<223>X-瓜氨酸<400>9AlaArgPheGinMetXaaHisXaaArgLeulieArg15<210>10<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>乂=瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>x-瓜氨酸<糊>10TyrSerPheValTrpXaaSerHisAlaArgProArg15<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>:X-瓜氨酸<400>11AlaArgPheGinMetArgHisXaaArgLeulieArg1510<210>12<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>乂=瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<223>X-瓜氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(1),:(12)<223>X-瓜氨酸<徹>12ArgAsnLeuArgtieuXaaArgGluArgAsnHisAla<220><223>X-瓜氨酸<220><221>M工SC一FEAT麗<222>(1>.:(5)<223><400>13ArgHisGlyArgGin15<210>14<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).:(5)<223>X-瓜氨酸<400>14<210><211><212><213>.人工序列135PRTlieArgXaaTyr!Lys15<210><211><212><213>155PRT人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221><222><223>MISC一FEM口RE(1).:(5>乂=瓜氨酸<400>15HisGlyArgGinXaa15<210><211><212><213>165PRT人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221><222><223>MISC—FEATURE(1).:(5)X-瓜氨酸<400>16GlyArgGinXaaXaa15<210><211><212><213>175PRT人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221><222><223>MISC一FEATURE(1).:(5)X-瓜氨酸<400>17PheGinMetXaaHis15<210>18<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>M工SC一FEATURE<222>(1>.:(5)<223>X-瓜氨酸<400>18XaaTipArgGlyMet15<210>19<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).:(5)<223>X-瓜氨酸<■>19AlaArgPheGinMet15<210>20<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).T(5><223>X-瓜氨酸<400>20GinXaaTyrLysTrp<210><211>215<212>PRT<213>人工序列<220>x-瓜氨酸<223><400>21LysProTyrThrVal15<210>22<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(d.:(5)<223>x-瓜氨酸<楊>22AxgAsnLeuArgLeu15<210>23<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221><222><223>MISC—FEATURE(i).:(5)x-瓜氨酸<400>23ArgArgArgXaaTyr15<210>24<211>5<212〉PRT<213>入工序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC—FEATURE<222>(1).:(5)<223>X-瓜氨酸<400>27MetLysProArgTyr15<210>28<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223〉X-瓜氨酸<220><221>MISC_FEATURE<222>(1).:(5)<223>X-瓜氨酸<400>28LysSerPhe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aaLeuXaaArgProXaaXaaArg1510<210>164<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220〉<221>MISCFEATORE<222>(i).:(i2><223>x-瓜氨酸<400>164ArgMetProHisXaaHisXaaSerXaaArgArgLys1510<210>165<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>X-瓜氨酸<400>165HisGinArgLysTrpXaaGlyAlaSerArgAlaAla1510<210>166<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>x-瓜氨酸<400>166HisGinHisTrpArgXaaGlyAlaSerArgAlaAla1510<210>167<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>M工SCFEATURE<222>(1).:(12)<223><400>167HisGinPheArgPheXaaGlyXaaSerArgMaAla1510<210>168<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223><400>168HisGinGluArgArgXaaGlyGluSerArgAlaAla1510<210>169<211>12:<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>x-瓜氨酸<400〉169HisGinLysTrpArgXaaGlyPheSerArgAlaAla1510<210>170<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>'X-瓜氨酸<220><221>MISCi^EATURE<222>(1).7(12><223>x-瓜氨酸<權>170HisGinArgTrpLysXaaGlyGlySerArgAlaAla15<210>m<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>X-瓜氨酸<40o>mHisGinArgArgThrXaaGlyGlySerArgAlaAla1510<210>172<211>12<212>.PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222〉(1):(12)<223>乂=瓜氨酸<400>172HisGinArgArgGlyXaaGlyGlySerArgAlaAla1510<210>173<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>乂=瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(i).:(工2)<.223>x-瓜氨酸<糊>173HisGinXaaPheArgXaaGlyHisSerArgAlaMa1510<210>174<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEAT咖<222>(i).:(i2)<223>x-瓜氨酸<400>174GlyPhePheSerAlaXaaGlyHisArgProLeuAsp1510<210>175<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).:(12)<223>x-瓜氨酸<權>175HisGinGluArgGlyXaaGlyLysSerArgAlaAla1510<210>176<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>x-瓜氨酸<223><220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>x-瓜氨酸<4O0>176HisGinGluLysArgXaaGlyLysSerArgMaAla1510<210>177<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>x-瓜氨酸<400>177HisGinArgTrpLeuXaaGlyLysSerArgAlaAla1510<210>178<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC—FEATURE<222>(1).:(12)<223>乂=瓜氨酸<400〉178HisGinLysArgAsnXaaGlyLysSerArgAlaAla1510<210>179<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>x-瓜氨酸<400>179GluGlyGlyGlyValXaaGlyProArgValValGlu1510<210>180<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(i).:(12)<223>x-瓜氨酸<400〉180HisGinTrpArgHisXaaGlyArgSerArgAlaAla1510<210>181<211>12<212>PRT<213>.人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>U).:(12)<223>x-瓜氨酸<400>181HisGinLysTrpAsnXaaGlyArgSerArgAlaAla1510<210>182<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATORE<222>(1>.:(12)<223>x-瓜氨酸<400>182HisGinLysPheTrpXaaGlyArgSerArgAlaAla15<210>183<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>U).:(12)<223>x-瓜氨酸<400>183HisGinLysXaaLysXaaGlyArgSerArgAlaAla1510<210>184<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).:(12)<223>X-瓜氨酸<400>184HisGinLysTrpArgXaaGlyArgSerXaaAlaMa1510<210>185<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1),:(12)<223>x-瓜氨酸<400>185Hi.sGinAlaT^rpArgXaaGlyArgSerXaaAlaMa15<210>186<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>乂=瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1),:(12)<223>X-瓜氨酸<糊>186HisGinAsnGinTrpXaaGlyArgSerArgAlaAla1510<210>187<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).:(12)<223>乂=瓜氨酸<鄉(xiāng)>187H丄sGinAsnSerLysXaaGlyArgSerArgAlaAla1510<210>188<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223><220><221>MISCFEAT口RE<222>(i).:(12)<223>x-瓜氨酸<■>188HisGinLysArgArgXaaGlyArgSerArgAla1510<210>189<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223><400>189HisGinLysArgPheXaaGlyArgSerArgAlaAla1510<210>190<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).:(12)<223>乂=瓜氨酸<權>190HisGinLysArgTyrXaaGlyArgSerArgAlaAla1510<210>191<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:U2廣<223>x-瓜氨酸<■>191HisGinLysArgHisXaaGlyArgSerArgAlaAla1510<210>192<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>乂=瓜氨酸<400>192HisGinGluArgAlaXaaGlySerSerArgAlaAla1510<210>193<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<formula>formulaseeoriginaldocumentpage99</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage99</formula><221>MISCJFEATURE<222>(1)-:(12)<223>乂=瓜氨酸<■>196HisGinTrpAsnArgXaaGlyTrpSerArgAlaAla1510<210>197<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>X-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223>x-瓜氨酸<■>197HisGinGinArgMetXaaGlyTrpSerArgAlaAla1510<210>198<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223><220><221>MISCFEATURE<222>(1).:(12)<223><400>198HisGinSerHisArgXaaGlyTrpSerArgAlaAla15'10<210>199<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>x-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<formula>formulaseeoriginaldocumentpage101</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><223>X-除cys和tip以外的任何氨基酸<220><221><222><223>MISC一FEATORE(6).:(6)X-瓜氨酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(7).:(12)<223>X-除cys和trp以外的任何氨基酸<400>202HisGinGluXaaXaaXaaXaaXaaSerArgAlaAla1510<210>203<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽文庫<220><221>MISC一FEATURE<222>(7),:(12)<223>X-除cys以外的任何氨基酸<220><221><222><223>MISC—FEATURE(1).:(5)x-除cys以外的任何氨基酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(6)-:(6)<223>X-瓜氨酸<400>203HisGinXaaXaaXaaXaaGlyXaaSerArgAlaAla1510<210>204<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽文庫<220><221><222><223>MISC-FEATURE(1).:(5)X-蜍cys以外的任何氨基酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(6).:(6)<223>X-瓜氨酸<220><221>MISC—FEATURE<222>(10):(10)<223>X-瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(7).:(9)<223>X-除cys以外的任何氨基酸<徹>204HisGinXaaXaaXaaXaaGlyXaaSerXaaAlaAla1510<210>205<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽文庫<220><221>MISC一FEATORE<222>(1).:(5><223>X^除cys以外的任何氨基酸<220><221>MISC一FEATURE<222>("-:(12)<223>X-餘cys以外的任何氨基酸<220><221>MISC—FEATURE<222>(6).:(6)<223>X-瓜氨酸<>205HisGinGluXaaXaaXaaXaaXaaSerArgAlaAla1510<210>206<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>肽文庫<220><221>m工sc—feature<222>(1):(5)<223>X-除cys以外的任何氣基酸<220><221>MISC—FEATURE<222>(7).:(9)<223>X，.除cys以外的任何氨基酸<220><221>MISC一FEATURE<222>(6).:(6)<223>X-瓜氨酸<220><221><222><223>misc一feAture(io):.(io)x-瓜氨酸<400>206HisGinGluXaaXaaXaaXaaXaaSerXaaAlaAla1510<210>207<211>12<212>'PRT<213>人工序列<220><223>肽文庫<220><221>MISC一FEATURE<222>(1).:(6)<223>X-餘cys以外的任何氨基酸<220><221><222><223>MISC_FEATURE(7).:(7)乂=瓜氨酸<220><221>MISCFEATURE<222>(8).,(12)<223>X-除cys以外的任何氨基酸<400>207XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa1510權利要求1.一種從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法，其中至少一種包含瓜氨酸殘基或其類似物的反應性肽與前述的自身抗體接觸一段足夠長的時間，從而允許在該至少一種反應性肽與自身抗體之間形成復合物，隨后檢測該復合物，其特征在于所述的自身抗體與包含XG基序的肽單元，和包含XnonG基序的肽單元接觸，其中X為瓜氨酸殘基或其類似物，G為氨基酸甘氨酸，而nonG為除甘氨酸以外的氨基酸。2.如權利要求l所述的方法，其特征在于nonG為選自H,I，W，S，R，K,Y,M，F(xiàn)，V，P，Cit的氨基酸或其類似物。3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于至少一種肽單元為環(huán)狀肽單元。4.如任意一項前述權利要求所述的方法，其特征在于所述的具有XG基序的肽單元和具有XnonG的肽單元為多肽的一部分。5.如任意一項前述權利要求所述的方法，其特征在于XnonG肽單元非來源于絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白l和細胞角蛋白9。6.如任意一項前述權利要求所述的方法，其特征在于所述的XG肽單元選自如下組0002-27HQKRGCitGWSRAA0002-29HQRRVCitGWSRAA0002-31HQRRTCitGGSRAA0002-32HQRKWCitGASRAA0002-36HQFRFCitGCitSRAA0002-37HQKWRCitGRSCitAA0002—63HQFRFCitGwsRAA而所述的XnonG肽單元選自如下組:1.0107--32KPYTVCitKFMRRP0107--35ARFQMCitHCitRIiIR0107--45YSFVWCitSHARPR0113--30ARFQMRHCitRIiIR0218--36RIiRIiCitRERNHA7.—種包含具有通式(II)的序列的肽(A1-A2畫A3-A4-A5)-Cit-(A6)-(A7-A8-A9畫A10-A11)(II)其中Al-A2-A3-A4-A5為選自如下組的氨基酸序列-RHGRQ-IRCitYK-HGRQCit-GRQCitCi-FQMCitH-CitW畫-ARFQM-QCitYKW-KPYTV-肌RIi-腿CitY-RFKSN-RGKSN-RWVSQ-MKPRY-KSFVW-YSFVW-FQMRH-R薩R-RMGRP及其同源序列；A6表示除甘氨酸以外的氨基酸；A7-A8-A9-A10-A11表示選自如下組的氨基酸序列1.-KYI工Y-T醒F-匿itKI-CitRAVI-RCitGHS-CitGRSR-CitYI工Y-CitRIiIR-IERKR-FMRKP-FMRRP-ERNHA-AVITA-TPNRW-TYNRW-RTPTR-RIVW-HARPR-RGMCitR-IRFPV及其同源序列；以及具有通式(II)的肽的類似物。8.—種包含具有通式(III)的序列的肽(B1-B2-B3-B4-B5-B6)-Cit-(B7)曙(B8-B9-B10-B11)(III)其中Bl-B2-B3-B4-B5-B6為選自如下組的氨基酸序列-INCitRAS-ICitKRLY-KCitCitYNI-RWFICit-IRQGAR-CitERCitVQ-CitHQRIT-R工CitRVCit-GRNQRY-RCitRQHP-CitCitRCitVA-RPKQHV-RKCitGCitR-RCitCitRNT-RCitQCitFT-QLVYLQ-GYNRFK-CitliRHIRPRCitCitCitK-RCitQVRY-GRCitHAH-ARHVIR-RCitGHMF-GRNIRV-QIFYLCit-RQGPIA-GVYLVR-NCitCitRRV-KCitR!LCitY-GRRCitCitlj-RMPHCitH及其同源序列；B7表示除甘氨酸以外的氨基酸；B8-B9-B10-B11表示選自如下組的氨基酸序列-CitHRR-CitIRR-FRRN-AQTT-GYPK-RPPQ-GCitRK-PIPR-YTIH-RIKA-CitRVR-TRRP-TIRP-IKCitR-RNW-CitRRY-CitRPR-TRCitCit-CitCitGR-LCitRCit-RVRCit-VPRT-YCitFR-ARCitCit-RQCitR-HIRR-CitMMR-CitRICit-VRKS-PCitCitR-CitRRK及其同源序列；以及具有通式(III)的肽的功能類似物。9.如權利要求7或8所述的肽，其特征在于A6和B7相互獨立地選自Cit，H，I,K，R，S，W,Y，M，F(xiàn),V和P。10.如權利要求7到9中的任意一項權利要求所述的肽，其特征在于所述的肽為環(huán)狀肽，其環(huán)包含至少8，9，10或多于10個氨基酸。11.如權利要求10所述的肽，其特征在于所述的肽為環(huán)狀肽，其環(huán)包含至少11個氨基酸。12.如權利要求7到11中的任意一項所述的肽，其特征在于它包括選自如下組的肽序列RHGRQCitCitKYIIIRCitKCitITNRKRHGRQCitCitCitIARFQMCitHCitRIIQCitKWCitKIERKKPYTVCitKFMRKPKPYTVCitKFMRRPRNRIjCitRERNHARRRCitYCitRAVITRFKSNCitRTPNRWRGKsNCitRTYNRWRFKsCitRTYNRWRGKsNCitRTPNRwRWVsQCitRRTPTRMKPRYCitRRIVVVKSFVWCitSHARPRYSFVWCitSHARPRRNMNRCitWRGMCitRMGRPCitwIRFPV或其類似物。13.如權利要求8到11任意一項所述的肽，其特征在于它包括選自下組的肽序列INCitRASCitKCitHRRICitKR:lYCitMCitIRRKCitCitYNICitCitFRRNRIjYFICitCitRAQTTIRQGARCitRGYPKCitERCitVQCitRRPPQCitHQRITCitVGCitRKRICitRVCitCitTpIPRGRNQRYCit:LYTIHRCitRQHPCitHRI.KACitCitRCitVACitFCitRVRPKQHVCitHTRRPRKCitGCitRCitCitTIRPRCitCitRNTCitHIKCitRRCitQCitFTCitCitRNVVQIjVYQCitCitCitRRYQYNRFKCitCitCitRPRCitLRHIRCitQTRCitCitPRCitCitCitKCitRCitCitGRRCitQVRYCitCitLCitRCitGRCitHAHCitPRVRCitARHVIRCitCitVPR-TRCitGHMFCitVYCitFRGRNIRVCitCitARCitCitQIFYIiCitCitHRQCitRRQGPIACitLHIRRGVYIiVRCitLCitMMRNCitCitRRVCitMCitRICitKCitRIiCitYCitPVRKSGRRCitCitLCitRPCitCitRRMPHCitHCitSCitRRK或其類似物。14.一種包含具有通式(IV)的序列的肽(C1-C2)-(C3-C4-C5)-X誦G-C6-(C7國C8國C9-C10)(IV)其中Cl-C2為HQ，GF，EG或GV;C3-C4-C5表示3個氨基酸，其中至少l個，且優(yōu)選2個相互獨立地為堿性，芳族，或V;C6等于堿性或芳族氨基酸，或等于A，G，E，P，V，S或Cit或其類似物；且C7-C8-C9-C10為SRAA，SCitAA,RPLD,RVVE或PGLD;以及具有通式(IV)的肽的類似物。15.如權利要求14所述的肽，其特征在于所述的肽為環(huán)狀肽，其環(huán)包含至少8，9，10，或多于10個氨基酸。16.如權利要求15所述的肽，其特征在于所述的肽為環(huán)狀肽，其環(huán)包含至少11個氨基酸。17.如權利要求14到16中任意一項所述的肽，其特征在于它包括選自如下組的序列HQRKWCit<3ASRAAHQHWRCitGASRAAHQFRFCitGCitSRAAHQERRCitGEsRAAHQKWRCitGE"sRAAHQRWKCitGGsRAAHQRRTCitGGsRAAHQRRGCitGGsRAAHQCitFRCitGHSRAAGFFSACitGHRPDHQERGCitGKSRAAHQEKRCitGKSRAAHQRWCitGKSRAAHQKRNCitGKsRAAEGGGVCitGPRVVEHQWRHCitGRSCitAAHQKWNCitGRSRAAHQKFWCitGRSRAAHQKCitKCitGRSRAAHQKWRCitGRSCitAAHQAwRCitGRSCitAAHQNQWCitGR.sRAAHQNSKCitGRsRAAHQKRRCitGRsRAAHQKRFCitGRsRAAHQKRYCitGRsRAAHQKRHCitGRsRAAHQERACit<3SsRAHQEKMCitGVsRAAHQKRGCitGWsRAAHQRRVCitGWsRAA■HQWNRCitGWsRAAHQQRMCitGWsRAAHQSHRCitGWsRAAHQFRFCitGwsRAAHQKRRCitGwsRAAG;V:GHCitGYpGL,D或其類似物。18.—種多肽，其特征在于它為線性或分枝狀的多肽，包括至少兩個相互獨立地選自以下的線性或環(huán)狀肽序列選自具有通式(II)和(III)的肽單元及其類似物的肽單元；具有通式(IV)的肽單元及其類似物。19.一種用于確定類風濕性關節(jié)炎的自身抗體的存在的診斷測試試劑盒，其特征在于它包含權利要求7到17所述的肽，或權利要求18所述的多肽，或其混合物，以及至少一種另外的試劑。20.—種選擇適合于診斷RA的肽的方法，其中采用從患有RA的患者獲得的抗體篩選肽文庫，且其中所述的肽文庫選自如下組文庫(l):HQEHCitUSRAA其中^-除半胱氨酸和色氨酸以外的任何氨基酸文庫(2):HQUSCitG2￡SR/CitAA其中^-除半胱氨酸以外但包括瓜氨酸的任何氨基酸文庫(3):HQEUCitUSR/CitAA其中2￡=除了半胱氨酸外但包括瓜氨酸的任何氨基酸文庫(4):XXXXXXCitXXXXX其中^-除半胱氨酸以外但包括瓜氨酸的任何氨基酸或其等同物。21.—種可借助于如權利要求20所述方法獲得的用于診斷測試中的肽。全文摘要本發(fā)明涉及從患有類風濕性關節(jié)炎的患者中檢測自身抗體的方法、肽和檢測試劑盒。為此，根據(jù)本發(fā)明，使用了至少兩種肽單元，其中至少一種肽單元包括非來源于絲聚蛋白(原)，纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細胞角蛋白1和細胞角蛋白9的部分，并且所述肽單元包括XG基序，以及一種肽單元包括XnonG基序，其中X為瓜氨酸或其類似物，而nonG為除甘氨酸之外的氨基酸。文檔編號C07K7/06GK101408546SQ20081021598公開日2009年4月15日申請日期2002年12月11日優(yōu)先權日2001年12月11日發(fā)明者G·J·M·普盧伊恩,J·W·德里夫休特,伯克爾M·A·M·范,文盧伊W·J·W·范申請人:技術科學基金會