專利名稱：抗p選擇素單鏈抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因產(chǎn)品領(lǐng)域，特別是涉及一種具有特異靶向性的抗P選擇素基因工 程單鏈抗體及其在制備治療機(jī)體炎癥反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炎癥反應(yīng)是多種疾病如腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病及創(chuàng)傷后 共同的重要的病理過程。各種炎癥雖然有其特殊性，但從局部的病理變化看來,它們 都有很多共同點，即都是機(jī)體對致炎因子的損傷作用所產(chǎn)生的一種過激反應(yīng)。最近的 研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)炎癥的程度嚴(yán)重或發(fā)展成慢性炎癥時，它可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。
炎癥反應(yīng)始于炎癥細(xì)胞黏附、遷移、浸潤、活化以及炎癥因子釋放，白細(xì)胞與內(nèi) 皮細(xì)胞的粘附是炎癥的起始步驟，這一過程是由炎癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞 粘附分子所介導(dǎo)。粘附分子是由細(xì)胞合成的一種復(fù)合膜蛋白，存在于細(xì)胞膜或細(xì)胞外， 在炎癥過程中對白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用起著關(guān)鍵的作用。粘附分子介導(dǎo)的粘附 過程，首先是選擇素減慢血流中的白細(xì)胞，使其滾動到血管內(nèi)皮表面，然后整合素和 免疫球蛋白超家族促進(jìn)白細(xì)胞粘附到血管壁，并使其進(jìn)入內(nèi)皮。
選擇素家族主要介導(dǎo)白細(xì)胞血管壁粘附的第一階段。即可逆性粘附階段使白細(xì)胞 流動性減慢，形成滾動，為進(jìn)一步粘附創(chuàng)造條件。P選擇素(P-selectinectin， Ps) 又稱(GMP-140)，是一種分子量為140kD的I型膜糖蛋白，主要分布于靜息血小板的 a顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel palade小體中。當(dāng)受炎性介質(zhì)刺激后，P選擇素快速轉(zhuǎn)位 到細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)，與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞上的抗原結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞在內(nèi)皮上 黏附、滾動、聚集及活化并釋放炎癥遞質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)。
P選擇素作為血小板/內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)志和黏附受體，介導(dǎo)白細(xì)胞與活化內(nèi)皮細(xì) 胞等最初黏附，是啟動炎癥反應(yīng)并維持炎癥狀態(tài)的重要成分。正常情況下P選擇素不 表達(dá)或低表達(dá)，受到炎癥、損傷等因素刺激后可顯著表達(dá)，且原先不表達(dá)的組織也出 現(xiàn)表達(dá)。P選擇素參與了腫瘤、心血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病以及與年齡相 關(guān)的疾病(如關(guān)節(jié)炎、早老性癡呆病、骨質(zhì)疏松癥等)等多種病理生理過程，其過度 或持續(xù)表達(dá)己成為某些組織病變的標(biāo)志。因此，抑制P選擇素表達(dá)及其細(xì)胞黏附作用 為以上疾病的診斷和治療提供了新的策略。因此，進(jìn)一步研制抗P選擇素的基因工程 抗體，無疑在與炎癥相關(guān)疾病的診斷和治療中具有重要的價值。目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了一些具有抑制P選擇素活性的物質(zhì)，如于巖藻多糖、P選擇 素單克隆抗體和PSGL-1的抗體。實驗表明這些物質(zhì)在抑制炎癥反應(yīng)方面具有良好的 效果，但是還存在很多問題，如應(yīng)用上帶來很大副作用，特異性較差等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了本發(fā)明的目的在于提供一種能夠特異靶向于P選擇素位點，抑制P 選擇素表達(dá)及其細(xì)胞黏附作用，從而達(dá)到抗炎治療的作用的抗P選擇素單鏈抗體。 本發(fā)明所提供的抗P選擇素單鏈抗體，是下述氨基酸殘基序列之一
1) 序列表中的SEQ ID NO: 1;
2) 將序列表中SEQIDNO: 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并對P選擇素具有特異的耙向性，具有更好地抗黏附/抗炎耙向抑制效應(yīng)， 對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有很好的治療作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO: 1由240個氨基酸殘基組成。 編碼上述抗P選擇素單鏈抗體的基因，是下述核苷酸序列之一
1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列;
2) 編碼序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；
3) 與序列表中SEQ ID NO: 2限定的核苷酸序列具有90X以上同源性且對P選擇 素具有特異的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具 有很好的治療作用的核苷酸序列；
4) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0. 1XSSPE (或0. IXSSC)、 0.1% SDS的溶液在 65X:下洗膜。
序列表中的SEQ IDNO: 2由720個堿基組成，其編碼序列為自5，端第1-720位 堿基，編碼具有序列表中SEQ IDNO: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
具體來講，所述抗P選擇素單鏈抗體的重鏈可變區(qū)PVh具有序列表中的SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID NO: 3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基 酸殘基的取代、缺失或添加且對P選擇素具有特異的靶向性，具有更好地抗黏附/抗 炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有很好的治療作用的多肽；輕鏈可變區(qū)PVL具 有序列表中的SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID NO: 4的氨基酸 殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且對P選擇素具有特異的靶向 性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有很好的治療作用 的多肽。序列表中的SEQ ID NO: 3由122個氨基酸殘基組成，序列表中的SEQ ID NO: 4 由108個氨基酸殘基組成。
編碼抗P選擇素單鏈抗體的基因，其重鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQ ID NO: 5的DNA序列或編碼序列表中SEQ ID NO: 3的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表 中SEQ ID NO: 5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；輕鏈可變區(qū)編碼基因具有序列 表中SEQ ID NO: 6的DNA序列或編碼序列表中SEQ ID NO: 4的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn) 條件下可與序列表中SEQ ID NO: 6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在O. 1XSSPE (或0. IXSSC)、 0.1% SDS的溶液中，65°。條 件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO: 5由366個堿基組成，其編碼序列為自5'端第1至366 位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中的 SEQ ID NO: 6由324個堿基組成，其編碼序列為自5，端第1至324位堿基，編碼具 有序列表中SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明抗P選擇素單鏈抗體編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增抗P選擇素單鏈抗體編碼基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還提供了用于表達(dá)上述抗P選擇素單鏈抗體的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明所提供的用于表達(dá)上述抗P選擇素單鏈抗體的重組表達(dá)載體，是含有抗P 選擇素單鏈抗體基因的重組表達(dá)載體。
所述抗P選擇素單鏈抗體基因可插入到重組表達(dá)載體中。構(gòu)建所述重組表達(dá)載體 的出發(fā)載體，可為任意一種指本領(lǐng)域熟知的可進(jìn)行外源基因表達(dá)的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、 酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒(如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體)。 總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定表達(dá)，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一 個重要特征是通常含有復(fù)制點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
所述原核表達(dá)載體可為pET-32a、 pET-28a、 pET-28b、 pET-28c、 pET-21a(+)或 pET-30a等；所述真核表達(dá)載體可為pEE14. 1、pCMV5、pSilence1. 0-U6(Ambion， Austin, TX， USA) 、 pc醒、pEGFP-Nl、 pSV40、 pCI-腦(購于Promega公司)、pTEFl、 pPICZ a 、 pAM82或pAAh5等。
其中，以pEE14. l為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述抗P選擇素單鏈抗體基因的重組 表達(dá)載體為PEE14. 1/VH-Linker-W。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有所述抗P選擇素單鏈抗體基因的重組表達(dá)載體，如體外重組DNA技術(shù)，DNA合成技術(shù)和體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambrook， et al Molecular cloing， a Laboratory Manual. Cold spring harbor laboratory. New York, 1989)。所述抗P選擇素單鏈抗體基因的DNA序列可以有效連接到表達(dá)載體中 的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA的合成。所述啟動子可為大腸桿菌的lac或trp啟 動子、噬菌體啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或 其病毒中表達(dá)的啟動子。所述表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終 止子。
此外，所述表達(dá)載體還可包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞的表型形狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因 以及綠色熒光蛋白(GFP)基因或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因等。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達(dá)上述抗P選擇素單鏈抗體的方法。
本發(fā)明所提供的抗P選擇素單鏈抗體的表達(dá)方法，是將所述用于表達(dá)抗P選擇素 單鏈抗體的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分 離純化蛋白，得到抗P選擇素單鏈抗體。
所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；高等 真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌；鼠傷寒沙門氏菌的 細(xì)菌細(xì)胞；真核細(xì)胞如酵母、植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9等昆蟲細(xì)胞；CH0、 COS、 293 細(xì)胞或Bowes黑色素瘤細(xì)胞等動物細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為CHO細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列，將 會使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，長度通常為10-300個堿基對， 作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。如在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的長度約為100-270個堿 基對的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子或腺病毒增強(qiáng)子等。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)，將重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子， 誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并對重組蛋白進(jìn)分離純化。
培養(yǎng)含有本發(fā)明抗P選擇素單鏈抗體編碼基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件， 均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
本發(fā)明還提供了一種治療機(jī)體炎癥反應(yīng)的藥物。
本發(fā)明所提供的治療機(jī)體炎癥反應(yīng)的藥物，它的活性成分為上述抗P選擇素單鏈 抗體。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載 體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、吸收促進(jìn)劑或吸附載體等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液等多種形式。200810224769.6
說明書第5/14頁
上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為200 p g抗P選擇素單鏈抗體/kg體重，每隔1天給藥一次， 療程為14天。劑量和療程均可根據(jù)實際情況進(jìn)行調(diào)整。
本發(fā)明提供一種能與人P選擇素特異結(jié)合的抗P選擇素的單鏈抗體，該單鏈抗體 是采用噬菌體抗體庫技術(shù)，從構(gòu)建的抗P選擇素全套單鏈抗體基因噬菌體抗體庫中篩 選出來的，同時構(gòu)建了該單鏈抗體的真核表達(dá)載體，并篩選出了高效表達(dá)抗P選擇素
單鏈抗體的CHO細(xì)胞株，通過表達(dá)純化，得到了純度較高的單鏈抗體蛋白。該蛋白對 P選擇素具有特異的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反 應(yīng)具有很好的治療作用，可用于制備治療機(jī)體炎癥反應(yīng)的藥物。 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為輕鏈和重鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的1.2%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果
圖2為抗P選擇素單鏈抗體基因擴(kuò)增產(chǎn)物的1. 2%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果
圖3為抗P選擇素單鏈抗體的12% SDS-PAGE檢測結(jié)果
圖4為抗P選擇素單鏈抗體的Western Blot鑒定結(jié)果
圖5為生物學(xué)分布實驗結(jié)果
圖6為動物實驗結(jié)果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。 實施例l、抗P選擇素單鏈抗體的獲得
用下述方法篩選抗P選擇素單鏈抗體，具體方法包括以下步驟
1、 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定將分泌P選擇素抗體的雜交瘤細(xì)胞(參照雜交瘤細(xì)胞和單克
隆抗體實驗技術(shù)，許廷貴，1982.中的方法構(gòu)建)培養(yǎng)于含15X牛血清的完全RPMI1640 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)箱含5%0)2的混合氣體，濕度為98%。用ELISA方法鑒定培養(yǎng)上清中單 抗的特異性和滴度，結(jié)果抗體滴度達(dá)到l: 3200，且有明顯的種特異性。。
2、 mRNA的分離與純化用快速制備、純化mRNA試劑盒(Promega)并參照試劑盒 說明書從大約2X107個雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，并純化mRNA，具體方法為收集約 2X10:個雜交瘤細(xì)胞，加入175p l裂解液裂解細(xì)胞，25°C 13，000g離心10min，收集 上清，加入200ii 1 95%乙醇，轉(zhuǎn)移到吸附柱中，13，000g離心lmin，吸附RNA，加入 600" 1 RNA漂洗液，13,000g離心lmin，加50" 1 DNase I， 25。C孵育15 min消化DNA, 再加入200u 1 Dnase終止液，13， OOOg離心lmin， 600 ii 1 RNA漂洗液漂洗一次，250 w 1 RNA漂洗液漂洗一次，lOOtU Nuclease-Free H20洗脫總RNA.取1. Omg總RNA，加入RNase-Free Water至150 u 1， 65。C孵育10min，加入3W Biotinylated-OIigo(dT) Probe 和，l 20XSSC，冷卻至室溫，然后將RNA加入至lJSA-PMPs中，室溫孵育IO min，用磁 鐵吸附SA-PMPs，棄上清，用30014 0. 1XSSC漂洗4次，最后用RNase-Free Water 洗脫收集mRNA。
3、 cDNA制備以純化的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體方法為2Pg mRNA， Random Primers 0. 5mg/mL 2)4，加無核酸酶的水終體積為15W， 7(TC加熱8分鐘,在 冰上冷卻5min，短暫離心至管底部，加入5XBuffer 5(4, RNasin Ribonuclease Inhibitor 40u， 37。C 5min，再力口入Sodi咖Pyrophosphate, 40mM2. 5W，層Reverse Transcriptase 30u，補(bǔ)加無核酸酶的水至總體積25W，溫和混勻，37°C 60inin，反 應(yīng)結(jié)束后取出20M1作為模板，加入Second Strand 2. 5XBuffer 40Ml， Acetylated BSA， lmg/mL 5(4， DNA Polymerase I 23u， RNase H 0. 8u，無核酸酶的水終體積為100^1， 14°C孵育2小時，加入醇l 200mM EDTA終止反應(yīng)，即得到cDNA。
4、 抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增用PCR方法，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，在PCR 反應(yīng)體系中分別加入一套抗P選擇素單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)(V,.)引物(引物序列為 GACATCCAGATGACCCAGTCT和CCGTTTTATTTCCAACTTTGT)或重鏈可變區(qū)(VH)引物(引物 序列為GTGCAGCTGCAGGAGTCT和TCCTGAGGAGACGGTGACCGT) (Pharmac i a) ， 10 X PCR 緩沖液5u 1， dNTP終濃度為2. 5mM，混勻后經(jīng)IO(TC變性5min，加入2單位r邵DNA 聚合酶。總反應(yīng)體積為50ul?；靹蚝蠹拥V物油。進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)條件 是94。C變性30s。 55。C退火90s， 72。C延伸90s,反應(yīng)進(jìn)行到最后一個循環(huán)后在72°C 保溫10min。反應(yīng)結(jié)束后，分別從輕鏈和重鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物中取出3ul進(jìn)行 1.2%的瓊脂糖電泳檢測，檢測結(jié)果如圖l所示，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了 324bp的輕鏈可 變區(qū)基因和366bp的重鏈可變區(qū)基因，與預(yù)期結(jié)果相符，其余的用S印hagel尸 Bandpr印Kit (Pha皿cia)回收純化。
5、 單鏈抗體基因的連接將回收的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因與連接引物(引物序 列為ACCGTCTCCTCAGGAGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCT和
GGTCATCTGGATGTCAGAGCCGCCGCCACCCGAGCCGCCTCCGCC，編碼(Gly4Ser) 2的DNA序列) 在等摩爾濃度的條件下，加入2. 5mM的dNTP和3個單位的7^7 DNA聚合酶，10XPCR緩沖 液5"1，反應(yīng)體積為50ul。用液體石蠟油封閉后進(jìn)行7個退火循環(huán)，每個循環(huán)的反應(yīng) 條件為94。C變性30s， 64。C退火4min。
6、 單鏈抗體基因的擴(kuò)增以單鏈抗體基因為模板，在上述反應(yīng)體系中，加入一 對5'端含有Sfi 1， 3'端含有Not l酶切位點的引物(引物序列為30次PCR循環(huán)，每個循環(huán)條件為94。C變性lmin， 55。C退火2min， 72。C延伸2niin，反應(yīng) 進(jìn)行到最后一個循環(huán)后在72t:保溫10min。反應(yīng)結(jié)束后從PC對廣增產(chǎn)物中取出3 y L 1.2 %的瓊脂糖電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了720bp的單鏈抗體基因， 與預(yù)期結(jié)果相符，其余的用S印hagelsTM Bandpr印Kit回收純化。
7、 單鏈抗體文庫的構(gòu)建及表達(dá)將表達(dá)載體pCANTAB5E (Pharmacia)和回收后 的單鏈抗體基因分別經(jīng)Sfi l和Not l雙酶切，在T4連接酶的作用下，將pCANTAB5E表 達(dá)載體和單鏈抗體基因16'C連接過夜。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，并 把轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布在含100ug/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)板上，于37。C培養(yǎng)過夜。把生長 在平板上的轉(zhuǎn)化菌全部收集下來，用2XYTAG (含100iig/mL氨芐青霉素和2^葡萄糖) 稀釋細(xì)胞懸液至006。。=0. 2， 37。C培養(yǎng)培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約ODe。cF0. 4)，加入2X 109 pfu M13K07輔助噬菌體，37。C培養(yǎng)l小時，離心。用10mL 2XYTAK (含IOOu g/mL氨芐青霉 素和50yg/mL卡那霉素的2XYT)重懸沉淀細(xì)胞，37'C振蕩培養(yǎng)過夜，離心后收集含 有重組噬菌體的上清，即為單鏈抗體噬菌體表達(dá)文庫。
8、 重組噬菌體抗體的篩選用P選擇素抗原(購自上海史瑞克生物科技有限公司) 包被聚乙烯培養(yǎng)皿，將含有重組噬菌體的上清與該培養(yǎng)皿中37。C孵育2小時。用PBS洗 平皿20次，再用PBST (含O. 05% Tween 20的PBS)洗平皿20次，棄PBST。加入10mL處 于對數(shù)生長期TG1細(xì)胞，37i:培養(yǎng)l小時。離心，收集上清，進(jìn)行下一輪篩選。重復(fù)"吸 附-洗脫-繁殖"的篩選過程2次。在以M13K07輔助噬菌體超感染，就可以生成富集克 隆的噬菌體表面呈現(xiàn)文庫。
9、 單克隆重組噬菌體的篩選與鑒定第三輪篩選后，用2XYT將TG1菌液做倍數(shù) 稀釋(原液、1:10、 1:100、 1:1000)，然后涂布在SOBAG固體培養(yǎng)基(分子克隆，第 三版，黃培堂等譯)上，3(TC培養(yǎng)過夜。從平板上隨機(jī)挑取94個單菌落，分別接種于 100ul 2XYTAG (含100ug/mL氨芐青霉素和2M葡萄糖)培養(yǎng)液中，30。C培養(yǎng)過夜。 取20iil培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接于200y l含5Xl()8pfu/mLM13K07的2XYTAG培養(yǎng)液中，37。C培養(yǎng) 2小時。離心，用200ixl 2XYTAK (含lOO]i g/mL氨芐青霉素和50u g/mL卡那霉素的 2XYT)重懸沉淀細(xì)胞，30t:培養(yǎng)過夜。離心、收集上清，即為單克隆重組噬菌體。
用P選擇素抗原包被酶聯(lián)板，用0.5WBSA作為陰性對照，用羊抗M13噬菌體抗體作 為陽性對照。1XBSA的37。C封閉1小時。把100ul重組噬菌體抗體上清和封閉液的等 體積混合物加入到酶聯(lián)板中，對照孔中加入M13噬菌體。37。C孵育l小時，PBST (含O. 05 % Tween 20的PBS)洗板3次，PBS洗板3次。每孔加入IOOu 1羊抗M13噬菌體抗體 IgG-HRP(1:2000)， 37。C孵育l小時。PBST和PBS—次各洗板3次，加入新鮮配制的底物 H202-OPD,室溫反應(yīng)20min，加入50ul 2M ^504終止反應(yīng)，在A柳處檢測每孔的光吸收值。光吸收值為陰性對照的2. l倍以上的為陽性克隆，從中挑選出與P選擇素結(jié)合活性 最強(qiáng)的陽性克隆。
10、陽性克隆重組質(zhì)粒的DNA序列分析用T7 DNA序列TAATACGACTCACTATAGGG 測定該陽性重組質(zhì)粒上抗P選擇素單鏈抗體的DNA序列，結(jié)果該基因具有序列表中SEQ ID N0: 2的核苷酸序列，由720個堿基組成，其重鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中 SEQ ID NO: 5的DNA序列，輕鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQ ID NO: 6的DNA 序列，其編碼序列為自5'端第1-720位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO: 1的氨 基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，將該抗體命名為VL-Linker-VH (亦稱scFv)。
實施例2、抗P選擇素單鏈抗體scFv真核表達(dá)載體的構(gòu)建及高效表達(dá)細(xì)胞株的篩選 及抗P選擇素抗體的純化
一、 抗P選擇素單鏈抗體scFv真核表達(dá)載體的構(gòu)建及高效表達(dá)細(xì)胞株的篩選 為了得到在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面更接近于天然的高等生物蛋白
質(zhì)分子，把實施例1獲得的抗P選擇素單鏈抗體W-Linker-VH融合基因克隆至高效真核 表達(dá)載體pEE14. 1 (Lonza)中，得到攜帶抗P選擇素單鏈抗體V「Linker-Vh融合基因的 重組表達(dá)載體，命名為pEE14. 1/VfLinker-、。再利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒 pEE14. 1/VH-Linker-VL轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO中。轉(zhuǎn)染24小時后，吸去培養(yǎng)基， 加入10mL新鮮的選擇性培養(yǎng)基DMEM+10XFCS+25um MSX。在含5%〔02的混合氣體，濕 度為98X的37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2周后，出現(xiàn)大約1-2mm的克隆，用克隆環(huán)將出現(xiàn)的克 隆轉(zhuǎn)接至24孔板中，每孔加入lmL選擇性培養(yǎng)基DMEM+10^FCS+25iim MSX繼續(xù)培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)化子生長至5天后，吸取上清。將該上清100ul加入到用P選擇素抗原包被的酶聯(lián)板 中，37。C孵育l小時，PBS洗板3次。每孔加入100u 1HRP標(biāo)記的二抗抗體IgG(l:2000), 37。C孵育l小時。PBS洗板3次，加入新鮮配制的底物H202-0PD，室溫反應(yīng)20min,加入 50 Pl 2M H2S04終止反應(yīng)，在A，處檢測每孔的光吸收值。光吸收值為陰性對照的2. 1 倍以上的為陽性克隆，從中挑選出與P選擇素結(jié)合活性最強(qiáng)的陽性克隆，即為高效表 達(dá)抗P選擇素單鏈抗體的CHO細(xì)胞株。
二、 抗P選擇素單鏈抗體的純化
將高效表達(dá)的CHO細(xì)胞株放大培養(yǎng)，收獲上清。將上清緩慢加入HiTrap N-hydroxysuccinimide column(Amersham Biosciences)中，純化單鏈抗體。用 0. 01mol/L pH 7.4的PBS洗脫，流速為lmL/min，至洗出液0D2S。<0. 02為止。加入 0. lmol/L pH 2.4的甘氨酸-HCl緩沖液，流速為lmL/min，收集吸附下來的成分，立 即以lmol/L碳酸鈉中和，以免蛋白變性。經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot鑒定，結(jié)果結(jié)果如圖3和圖4所示，經(jīng)表達(dá)獲得了 240KD的目的蛋白，且該蛋白可與P選擇素特 異結(jié)合，與預(yù)期結(jié)果相符，表明獲得了純度很高的抗P選擇素單鏈抗體。
實施例3、動物實驗
一、 生物學(xué)分布實驗
采用Iodogen法將抗P選擇素單鏈抗體ScFv標(biāo)記'251，在涂布有200 y g Iodogen的EP 管中，依次加入現(xiàn)配制的50腿Lo/L PBS(pH7.4)150"、含lmg BSA溶解的ScFv 100 u 1 (100 u g) 、 Na'25l溶液15 u 1 (185MBq)，室溫下間斷輕微搖動標(biāo)記管15min。 SEP-PAK C18 柱分別用甲醇、雙蒸水和O. 1X三氟乙酸(TFA)各5mL依次洗滌使其活化；標(biāo)記混合物 上柱，0. 1XTFA淋洗；60%的乙腈溶液洗脫，收集前1.5mL洗脫液。經(jīng)冷凍干燥后， 用含lmg/raL BSA的PBS溶液稀釋、分裝，-80。C冰箱貯存?zhèn)溆?。雄性DBA/1J小鼠尾根部 皮下注射O. 1 mL膠原II和完全弗氏佐劑(均購于美國Sigma公司)，第21天加強(qiáng)一次 建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型。試驗和分組方法如下①對照組尾靜脈注射 125I-ScFv(2 ug)，分別在24h、 48h后斷頭處死，收集血液，取出組織器官，稱重并測 定其放射性(Bq)，結(jié)果換算為IDX/g組織。②關(guān)節(jié)炎組尾靜脈注射"5l-ScFv(2 ug)， 分別在24h、 48h、 72h、 96h后，采取同上處理、檢測。③關(guān)節(jié)炎治療組，尾靜脈注射 一次"5l-ScFv(0.25ug)， 24h后，采取同上處理、檢測。④關(guān)節(jié)炎治療組，每天尾靜脈 注射一次^I-ScFv(0.25ug)，連續(xù)7天、24h后，采取同上處理、檢測。結(jié)果如圖5所示， 表明本發(fā)明的抗P選擇素單鏈抗體ScFv可在關(guān)節(jié)炎部位高度聚集。
二、 動物試驗
利用類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型(同上)，從第21天開始試驗，分組如下 ①注射50u 1PBS對照組。②ScFv治療組，每天注射一次ScFv (0.25)mg，共注射7次。 ③ScFv治療組，每天注射一次ScFv (0.25) mg，共注射4次。④ScFv治療組，注射一 次ScFv (0.25) mg。第23天開始臨床評分，按一下標(biāo)準(zhǔn)對動物關(guān)節(jié)炎程度計分0分， 無關(guān)節(jié)炎；l分，輕微炎癥和爪部發(fā)紅；2分，嚴(yán)重紅斑和腫脹，影響爪部功能；3分， 爪部或關(guān)節(jié)變形、僵硬，失去功能。每只小鼠四肢最高總分為12分。結(jié)果如圖6所示， 從第23天開始，ScFv三個治療組的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯低于PBS組。
以上實驗結(jié)果證明本發(fā)明的抗P選擇素單鏈抗體ScFv對P選擇素具有特異的靶 向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有很好的治療作 用。<formula>formula see original document page 13</formula>Glu Leu Leu lie180
Arg Phe Ser Ser195
Asn lie Leu Ser210
Asn Leu Pro Leu225
Ser Glu Gly Asn Val Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser
185 190Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Leu Phe Thr lie Glu
200 205Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gin Thr Asp
215 220Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg230 235 240
<210〉 2
<211〉 720
〈212> DNA
<213〉 噬菌體
<400> 2
gtgcagctgc鄉(xiāng)3gtctggacctggcctggtgaaacct.tctcagtctctgtccctcacc60
tgcactgtcactggctactcaatcaccagtgattatgcctgg犯ctggatccggcaattt120
ccagg已a(bǔ)aca3actgg叫tggatgggctaca.taagcagtgga^gaaca^gctacaaccca180
tctctcaaaagtcgaatctcteitcactcgagacacatccaag犯ccagttcttcctgcag240
ttgaattctgtgactactgaggacacggccEiCEitattactgtgcaagacactatggtaac300
tacgagggctattactatgctatggactactggggcc肌gggaccacggtcaccgtctcc360
tcaggaggcggtggcggctcgggtggcggcggctctgacatccagatgacccagtctcca420
gcatccctgtccatggctataggagaaaaagtcaccatcacagcactggt480
attg已tgatg已t3tgB3Ctggtaccagcag鄉(xiāng)CC3gggga^cctcctgaactccttatt540
tcagaaggcaatgttcttcgtcctggagtcccatcccgattctccagcag600
acagattttctttttacgatctctcagaagatgttgcagattactactgt660
ttgC犯3Ctgataacttgcctctcacgttcggctcggggac朋agttggaaataaa^cgg720
〈210〉 3
〈211〉 122
〈212〉 PRT
〈213〉 噬菌體<400〉 3
Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin Ser
15 10 15
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr lie Ser Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
50 55 60
Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu Gin65 70 75 80
Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
His Tyr Gly Asn Tyr Glu Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly115 120
<210> 4
〈211〉 108
<212〉 PRT
<213〉 噬菌體
〈400〉 4
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala lie Gly
15 10 15
Glu Lys Val Thr lie Arg Cys lie Thr Ser Thr Gly lie Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Pro Pro Glu Leu Leu lie
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Val Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser<formula>formula see original document page 16</formula>gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa actgataact tgcctctcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa acgg
32權(quán)利要求
1、抗P選擇素單鏈抗體，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加并對P選擇素具有特異的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有很好的治療作用的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗P選擇素單鏈抗體，其特征在于所述抗P選擇素 單鏈抗體的重鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜?中SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且 對P選擇素具有特異的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎 癥反應(yīng)具有很好的治療作用的多肽；輕鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQ ID NO: 4的氨 基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID NO: 4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘 基的取代、缺失或添加且對P選擇素具有特異的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶 向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有很好的治療作用的多肽。
3、 編碼權(quán)利要求1或2所述抗P選擇素單鏈抗體的基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述編碼抗P選擇素單鏈抗體的基因，其特征在于所述基 因是下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列;2) 編碼序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列;3) 與序列表中SEQ ID NO: 2限定的核苷酸序列具有90X以上同源性且對P選擇 素具有特異的耙向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有很好的治療作用的核苷酸序列；4) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述編碼抗P選擇素單鏈抗體的基因，其特征在于所述編 碼抗P選擇素單鏈抗體的基因的重鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQ ID NO: 5的 DNA序列或編碼序列表中SEQ ID NO: 3的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中 SEQ ID NO: 5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；輕鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中 SEQ ID NO: 6的DNA序列或編碼序列表中SEQ ID NO: 4的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件 下可與序列表中SEQ ID NO: 6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6、 用于表達(dá)抗P選擇素單鏈抗體的重組表達(dá)載體，是含有權(quán)利要求3或4或5所述抗P選擇素單鏈抗體編碼基因的重組表達(dá)表達(dá)載體。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為 pEE14. 1/VH-Linker-VL。
8、 一種表達(dá)權(quán)利要求1所述抗P選擇素單鏈抗體的方法，是將權(quán)利要求6或7 所述用于表達(dá)抗P選擇素單鏈抗體的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì) 胞，從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離純化蛋白，得到抗P選擇素單鏈抗體。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
10、 權(quán)利要求1或2所述的抗P選擇素單鏈抗體在制備治療機(jī)體炎癥反應(yīng)的藥物 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗P選擇素單鏈抗體及其應(yīng)用。其目的是提供一種具有特異靶向性的抗P選擇素基因工程單鏈抗體及其在制備治療機(jī)體炎癥反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用?？筆選擇素單鏈抗體是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加并對P選擇素具有特異的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有很好的治療作用的蛋白質(zhì)。該蛋白對P選擇素具有特異的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效應(yīng)，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有很好的治療作用，可用于制備治療機(jī)體炎癥反應(yīng)的藥物。
文檔編號C07K16/28GK101456912SQ200810224769
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日
發(fā)明者劉雪林, 周育森, 孫巖松, 宋宏彬, 張傳福, 徐元勇, 勇 王, 賈雷立, 靳連群, 黃留玉 申請人:中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所