專利名稱：一種淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從淫羊藿提取物中分離獲得純度大于98%的淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照 品的制備方法，主要包括初步柱分離或醇沉除雜脫色以及快速的高效液相制備方法規(guī)?；?制備。
背景技術(shù)：
淫羊藿(Herba Epimedii)是我國使用最為悠久的中藥之一，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、 祛風(fēng)濕的功效?，F(xiàn)代研究表明，淫羊藿具有抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)性功能、增加心腦血管血流量、 促進(jìn)造血功能、增強(qiáng)免疫、抗衰老、抗炎、抗腫瘤等多方面藥理作用。淫羊藿苷是淫羊藿的主 要活性成分，也是我國2005版國家藥典中淫羊藿藥材的含量測(cè)定成分，并規(guī)定其在藥材中 的含量應(yīng)達(dá)0.5%以上。淫羊藿苷的結(jié)構(gòu)式如下
OH OH 淫羊藿苷的分離制備方法主要有胡云峰等(中國專利CN200510061251. 1， 2007年公開)采用浸提、脫雜、萃取、樹脂吸附、干燥五大工序獲取不同含量的淫羊藿苷 (5% -50% );田景振等(山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào).2004，28(6) :456-458)用大孔吸附樹脂 法可獲得60. 30%含量的淫羊藿苷；梁冉等(西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2005， 14(2) :141 14)采用 30%乙醇超聲波輔助提取、聚酰胺柱及乙酸乙酯萃取的工藝可獲得60%含量的淫羊藿苷， 進(jìn)一步重結(jié)晶可獲得90. 94%含量的淫羊藿苷。文獻(xiàn)(Liu Renmin， et al. Journal of Chromatography A， 1064， 2005， 53-57)還報(bào)道了高速逆流色譜法制備98%含量的淫羊藿 苷，但僅僅是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模且使用特殊的設(shè)備和昂貴有毒的流動(dòng)相。目前，高效液相制備色譜 用于大規(guī)模(克級(jí)以上)制備98%含量的淫羊藿苷的工作還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在整合各種淫羊藿苷制備方法基礎(chǔ)上，通過樣品預(yù)處理研究、高效液相色 譜填料的選擇、快速色譜條件的開發(fā)、進(jìn)樣體積及濃度的優(yōu)化，以及檢測(cè)波長的選擇等多方 面研究，發(fā)明了一種低成本、快速的高效液相制備色譜方法，制備規(guī)?？蛇_(dá)20g/月并且保證純度(>98%)及產(chǎn)品色澤。本發(fā)明的目的是開發(fā)出一種可以獲得十克級(jí)規(guī)模并且純度
在98%以上的淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的制備新方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案 —種淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，以質(zhì)量含量^ 20%，優(yōu)選50%以上淫 羊藿苷提取物為原料，經(jīng)初步柱分離或醇沉除雜脫色，以制備型高效液相色譜為分離手段， 以一定比例的含乙腈水溶液為洗脫體系，獲得月產(chǎn)20g規(guī)模且純度大于98%的淫羊藿苷化 學(xué)對(duì)照品；具體步驟為
1)初步柱分離或醇沉除雜脫色 柱分離除雜脫色淫羊藿苷提取物用水或體積濃度40-80%乙醇水溶液溶解，上 樹脂柱或聚酰胺柱分離，以乙醇_水溶液梯度洗脫，其中乙醇的體積濃度從0% _70%變化， 收集體積濃度50-70%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末； 或醇沉除雜脫色將淫羊藿苷提取物用40-80%乙醇水溶液溶解，離心得沉淀物、 或靜置^ 4小時(shí)過濾沉淀物，沉淀物烘干后可得黃色粉末；
2)高效液相制備 黃色粉末用體積濃度40-80%的乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50 150mg/ml的 供試品溶液，經(jīng)0. 45 ii m微孔濾膜過濾；采用柱長為10-50cm、直徑為l-10cm的高效液相制 備色譜柱進(jìn)行分離，六通閥或泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為l-50ml，以體積濃度為15-55%的乙腈水 溶液為洗脫體系，流速控制在10-400ml/min，在線紫外檢測(cè)，收集純度大于98%的淫羊藿 苷流份； 3)淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的獲得 上述流份直接濃縮至干、或用甲醇或乙醇重結(jié)晶即可得到純度大于98%的黃白色 淫羊藿苷對(duì)照品。 上述方法中，初步柱分離用樹脂以非極性大孔吸附樹脂較好。高效液相制備過程 采用的流動(dòng)相中乙腈的體積濃度為20-30% ;高效液相制備柱的填料為C6、 C8或C18鍵合 相填料，其粒徑為5 20 ii m，紫外檢測(cè)波長優(yōu)選270nm、318nm或349nm，具體檢測(cè)波長根據(jù) 樣品中淫羊藿苷信號(hào)的超載情況而定。 以本發(fā)明從淫羊藿提取物中分離淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品具有如下優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)步
1.本發(fā)明以制備型高效液相為分離手段，使淫羊藿苷得到高效分離，可以獲得純 度在98%以上的淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品。 2.本發(fā)明發(fā)展的高效液相制備方法為快速制備方法，單針分離時(shí)間在10-20分鐘 之間，非常適合大批量化學(xué)對(duì)照品的制備；同時(shí)加上制備溶劑的回收再利用，可實(shí)現(xiàn)批量制 備的低成本。 3.本發(fā)明采用紫外檢測(cè)器在線檢測(cè)，淫羊藿苷的分離情況可以直接檢測(cè)，可直接 選擇性收集高純度流份，從而實(shí)現(xiàn)純度保證下的高回收率。 4.本發(fā)明在制備高效液相之前增加了除雜脫色步驟，一方面可有效延長色譜柱的 使用壽命，另一方面保證了產(chǎn)品具有好的色澤度。 總之，本發(fā)明工藝步驟簡單、周期短、純度高、色澤好，并且可大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1為重結(jié)晶前淫羊藿苷的HPLC分析圖譜(270nm)，其積分報(bào)告如下
NameRetentionTimeArea% Area
11. 661150900. 05
22. 52219090. 01
32. 722103340. 03
43. 39087830. 03
54. 709533380. 17
68. 354110700. 04
79. 097597910. 19
8淫羊藿苷11. 2613083234699. 48 圖2為重結(jié)晶后淫羊藿苷的HPLC分析圖譜(270nm)，其積分報(bào)告如下
NameRetentionTimeArea% Area
11. 666121130. 03
22. 635772820. 21
33. 39649580. 01
44. 38547950. 01
54. 613121920. 03
68. 931664480. 18
7淫羊藿苷11. 1193690802899. 5具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1 : 本實(shí)施例中，以50%的淫羊藿苷提取物為原料，以10iimC18鍵合相填料為吸附 劑，以含有乙腈-水(30 : 70，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下
1)脫色 提取物用70%乙醇水溶液溶解，靜置12小時(shí)，過濾，沉淀物烘干后得黃色粉末。
2)高效液相制備 上述黃色粉末用70 %乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50mg/ml的供試品溶液，經(jīng) 0. 45 ii m微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為ChromatorexC18鍵合相填料，粒徑 為10 ii m ;柱長19cm，直徑7. 5cm ;六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為10ml ;以30%乙腈-水溶液為洗 脫體系，流速控制在160ml/min，在線紫外檢測(cè)，收集含有淫羊藿苷的高純度流份；
3)淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的獲得 上述流份直接濃縮至干即可得到純度為99.48%的淫羊藿苷對(duì)照品(黃白色粉 末)(圖l);黃白色粉末用甲醇重結(jié)晶得到純度為99.52%的淫羊藿苷對(duì)照品(黃白色結(jié) 晶)(圖2)。
實(shí)施例2 本實(shí)施例中，以50%淫羊藿苷提取物為原料，以5iim的C18鍵合相填料為吸附劑， 以含有乙腈-水(25 : 75，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下
1)脫色 提取物用70%乙醇水溶液溶解，離心，過濾，沉淀物烘干后得黃色粉末。
2)高效液相制備 上述黃色粉末用60 %乙醇水溶液溶解，配置成濃度為80mg/ml的供試品溶液，經(jīng) 0. 45 ii m微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為McirosorbC18鍵合相填料，粒徑為 5 ii m ;柱長17cm，直徑5cm ;六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為2ml ;以25 %乙腈-水溶液為洗脫體 系，流速控制在60ml/min，在線紫外檢測(cè)，優(yōu)選檢測(cè)波長270nm，收集含有淫羊藿苷的高純 流份； 3)淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的獲得 上述流份直接濃縮至干即可得到純度為98.84%的淫羊藿苷對(duì)照品(黃白色粉 末)；黃白色粉末用甲醇重結(jié)晶得到純度為99.45%的淫羊藿苷對(duì)照品(黃白色結(jié)晶)。
實(shí)施例3 : 本實(shí)施例中，以20%的淫羊藿苷提取物為原料，以10iim C18鍵合相填料為吸附 劑，以含有乙腈-水(30 : 70，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下
1)脫色 提取物用40 %乙醇水溶液溶解，上HPD樹脂柱(I. D. 6 X 68)，乙醇-水梯度洗脫， 收集50%乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末。
2)高效液相制備 黃色粉末用70%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為100mg/ml的供試品溶液，經(jīng) 0. 45 ii m微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為ChromatorexC18鍵合相填料，粒徑 為10 ii m，柱長22cm，直徑7. 5cm ;泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20ml ;以30%乙腈-水溶液為洗脫體系，流速控制在160ml/min，在線紫外檢測(cè)，優(yōu)選檢測(cè)波長318nm或349nm，收集含有淫羊藿 苷的高純流份； 3)淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的獲得 上述流份直接濃縮至干即可得到純度為98. 16%的淫羊藿苷對(duì)照品(黃白色粉 末)。黃白色粉末用甲醇重結(jié)晶得到純度為99. 10%的淫羊藿苷對(duì)照品(黃白色結(jié)晶)。
實(shí)施例4 本實(shí)施例中，以33%的淫羊藿苷提取物為原料，以5 ii m的C18鍵合相填料為吸附 劑，以含有乙腈-水(28 : 72，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下
1)脫色 提取物用60%乙醇水溶液溶解，離心，過濾，沉淀物烘干后得黃色粉末。
2)高效液相制備 黃色粉末用70%乙醇水溶液溶解，配置成濃度為60mg/ml的供試品溶液，經(jīng) 0. 45 ii m微孔濾膜過濾；制備型高效液相柱填料品牌為Mcirosorb C18鍵合相填料；粒徑為 5 ii m ;柱長17cm，直徑5cm ;六通閥進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為5ml ;以28%乙腈-水溶液為洗脫體系， 流速控制在60ml/min，在線紫外檢測(cè)，收集含有淫羊藿苷的高純流份；
3)淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的獲得 上述流份直接濃縮至干即可得到純度為98.84%的淫羊藿苷對(duì)照品(黃白色粉 末)；黃白色粉末用甲醇重結(jié)晶得到純度為99.45%的淫羊藿苷對(duì)照品(黃白色結(jié)晶)。
權(quán)利要求
一種淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法，其特征在于以質(zhì)量含量≥20％的淫羊藿苷提取物為原料，經(jīng)初步柱分離或醇沉除雜脫色，以制備型高效液相色譜為分離手段，以一定比例的含乙腈水溶液為洗脫體系，獲得純度大于98％的淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品；具體步驟為1)初步柱分離或醇沉除雜脫色柱分離除雜脫色淫羊藿苷提取物用水或體積濃度為40-80％的乙醇水溶液溶解，上樹脂柱或聚酰胺柱分離，以乙醇-水溶液梯度洗脫，其中乙醇的體積濃度從0％-70％變化，收集體積濃度為50-70％的乙醇洗脫物，濃縮干燥得黃色粉末；或醇沉除雜脫色將淫羊藿苷提取物用40-80％乙醇水溶液溶解，離心得沉淀物、或靜置≥4小時(shí)過濾得沉淀物，沉淀物烘干后可得黃色粉末；2)高效液相制備黃色粉末用體積濃度40-80％的乙醇水溶液溶解，配置成濃度為50～150mg/ml的供試品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；采用柱長為10-50cm、直徑為1-10cm的高效液相制備色譜柱進(jìn)行分離，六通閥或泵進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1-50ml，以體積濃度為15-55％的乙腈水溶液為洗脫體系，流速控制在10-400ml/min，在線紫外檢測(cè)，收集純度大于98％的淫羊藿苷流份；3)淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的獲得上述流份直接濃縮至干、或用甲醇或乙醇重結(jié)晶即可得到純度大于98％的黃白色淫羊藿苷對(duì)照品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離制備方法，其特征在于柱分離過程采用的樹脂柱為非 極性樹脂柱。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離制備方法，其特征在于高效液相制備過程采用的制備 柱的填料為C6、 C8、或C18鍵合相填料，粒徑為5-20 y m。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離制備方法，其特征在于高效液相制備過程采用的流動(dòng) 相中乙腈的體積濃度為20-30%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離制備方法，其特征在于高效液相制備過程采用在線紫 外檢測(cè)，其檢測(cè)波長優(yōu)選270nm、318nm或349nm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離制備方法，其特征在于以質(zhì)量含量^ 50%淫羊藿苷提 取物為原料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品的分離制備方法。以含量不低于20％的淫羊藿苷提取物為原料，經(jīng)初步柱分離或醇沉除雜脫色，以制備型高效液相色譜為分離手段，以一定比例的含乙腈水溶液為洗脫體系，提取液直接減壓濃縮至干即可獲得純度大于98％的淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品。相比已報(bào)道淫羊藿苷的分離制備方法，本發(fā)明工藝步驟簡單、周期短、純度高、色澤好，并且可大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H17/00GK101747391SQ20081022988
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者王莉, 肖紅斌, 高明哲 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所