專利名稱：附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段及利用該功能肽段構(gòu)建的多重抗原肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段及利用 該功能肽段構(gòu)建的多重抗原肽。
背景技術(shù)：
人口 、資源和環(huán)境問題是嚴(yán)重影響本世紀(jì)人類生存和經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的關(guān)鍵 問題，避孕節(jié)育研究受到極大重視。迄今為止，男性避孕方法還局限于傳統(tǒng)的 體外排精、絕育術(shù)和使用避孕套等，尚無高效、方便、安全、可逆的避孕新措 施問世。幾十年來，研究者都試圖以生殖相關(guān)激素和精子特異性蛋白為靶抗原，將 免疫方法應(yīng)用于男性生育控制，但仍存在諸多問題，如尚未找到最佳的特異性 靶抗原，天然抗原的弱抗原性和免疫耐受，免疫避孕效果不理想等。這些問題 已成為避孕疫苗發(fā)展和應(yīng)用的巨大障礙。2001年，人類附睪蛋白酶抑制劑(epididymal protease inhibitor, Eppin) 首次被發(fā)現(xiàn)，其在睪丸和附睪中優(yōu)勢表達(dá)，主要分布于精子表面和精漿中。用 保留羧基端的Eppin截短蛋白免疫的雄性獼猴出現(xiàn)可逆性的不育(避孕率7/9， 可逆率5/7),精液分析發(fā)現(xiàn)精子的前向運(yùn)動能力減弱，而精子的數(shù)量及體內(nèi)雄 激素水平不受影響，亦未見自身免疫性疾病的發(fā)生，表明Eppin是一種極有發(fā) 展前途的靶抗原，但其為自身抗原，故仍存在免疫原性弱和免疫耐受等問題， 此外，未對Eppin中可能導(dǎo)致遠(yuǎn)期毒副反應(yīng)的不良肽段做剔除或加工。發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供Eppin的功能肽段，選自SEQ ID No. 1 或SEQ ID No. 2所示氨基酸序列。
本發(fā)明的目的之二在于提供利用所述Eppin的功能肽段構(gòu)建的多重抗原肽， 由下式表示B2K或B4K2K或B8K4K2K其中B是附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段，選自與SEQ ID No. 1具有至少80%序列 相同性的多肽或/和與SEQ ID No. 2具有至少80%序列相同性的多肽； K是雙官能單元。進(jìn)一步，所述附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段選自SEQ ID No. 1或/和SEQ ID No. 2所示氨基酸序列；進(jìn)一步，所述附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段，選自SEQ ID No. l和SEQ ID No. 2 所示氨基酸序列，且兩種序列的摩爾比為1 : 1;進(jìn)一步，所述雙官能單元選自半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或鳥 氨酸；進(jìn)一步，所述雙官能單元為賴氨酸。本發(fā)明的目的之三在于提供一種包含免疫學(xué)有效量的所述多重抗原肽的 組合物。進(jìn)一步，還包含藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的目的之四在于提供所述Eppin的功能肽段在制備免疫原中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之五在于提供所述多重抗原肽在制備男性避孕疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于(1)發(fā)明人在分析Eppin的氨基酸序列及蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合 免疫信息學(xué)相關(guān)理論和研究手段，對Eppin的功能肽段進(jìn)行了篩選和鑒定，本發(fā) 明公開了其中兩個功能肽段Bl具有SEQ ID No. l所示氨基酸序列，B卩具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列；本發(fā)明的功能肽段具有成份單一，結(jié)構(gòu)簡單，激發(fā)的免
疫反應(yīng)針對性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于制備免疫原；(2)本發(fā)明利用Eppin的功能肽段構(gòu)建了多重抗原肽，研究證實(shí)，所得多 重抗原肽可提高功能肽段的免疫原性同時不影響其抗原特異性，能夠刺激機(jī)體 產(chǎn)生高滴度的特異于功能肽段的抗體，誘導(dǎo)高效、安全、可逆的抗生育作用， 可用于制備男性避孕疫苗，為男性避孕的臨床主動免疫治療提供新的手段，具 有重要的開發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，能夠產(chǎn)生重大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本 發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中附圖為本發(fā)明多重抗原肽的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明釆用錯位重復(fù)套式方法，將Eppin分成32個多肽片段，再將各多肽 片段與載體蛋白偶聯(lián)制得32個免疫原，各免疫原作體外抗Eppin特異性抗體識 別檢測，再將各免疫原分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑組成組合物，以 此組合物免疫雄性小鼠，進(jìn)行體內(nèi)免疫原性檢測和抗生育能力研究，由此篩選 出數(shù)個免疫原性強(qiáng)、抗體產(chǎn)生穩(wěn)定、具有高效抗生育能力的免疫原，從而獲得 Eppin的功能肽段。本發(fā)明公開了其中兩個功能肽段功能肽段B1，具有SEQ ID No. l所示氨基酸序列；功能肽段B2，具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列。多重抗原肽(Multiple antigenic peptide, MAP)是在一個樹狀核心的 分枝上連接功能肽段而形成的放射狀分子肽。該樹狀核心由一個或多個雙官能 單元如半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或鳥氨酸構(gòu)成。樹狀核心分子量 小，免疫原性弱，不足以誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)，將功能肽段與之連接后，機(jī)體 能夠產(chǎn)生針對功能肽段的特異性免疫應(yīng)答，是替代傳統(tǒng)交聯(lián)載體蛋白，提高功 能肽段的免疫原性同時不影響其抗原特異性的有效辦法。
本發(fā)明利用Eppin的功能肽段Bl或/和B2構(gòu)建了兩種類型的多重抗原肽。 一種類型是在樹狀核心的所有分枝上共價(jià)連接Eppin的功能肽段Bl或B2;另一 種類型是在樹狀核心的不同分枝上分別連接Eppin的功能肽段Bl和B2，連接在 分枝上的B1和B2的摩爾比可為1 : l或其它比例。本領(lǐng)域/>知，具有至少80%序 列相同性的多肽基本上可以保持原功能肽段的生物學(xué)活性。這些多肽包括但不 限于(1)有一個或幾個氨基酸殘基被取代、缺失或/和插入的多肽，取代或插 入的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的；(2)在一個或多個氨基 酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽。因此，與Eppin的功能肽段Bl或B2具有至少80y。 序列相同性的多肽都可以用于構(gòu)建本發(fā)明所述的多重抗原肽，都能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā) 明目的。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些多重抗原肽均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。在上述兩種類型的多重抗原肽中，由不同數(shù)量如一個、三個或七個雙官能 單元構(gòu)成的樹狀核心可分別形成二分枝、四分枝或八分枝，因此，在本發(fā)明中， 每種類型的多重抗原肽又可分別制成二分枝肽、四分枝肽或八分枝肽。本發(fā)明的多重抗原肽，可以利用Fmoc策略以固相多肽合成法先分別合成 Eppin的功能肽段和樹狀核心，再將二者按一定比例共價(jià)連接制成多種抗原肽； 也可以利用Fmoc策略以固相多肽合成法直接合成多重抗原肽。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，其包含免疫學(xué)有效量的所述多重抗原肽和 藥學(xué)上可接受的載體，可制成男性避孕疫苗等藥物形式。本發(fā)明多重抗原肽的 免疫學(xué)有效量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、健康狀況和個體反應(yīng)等變 化，通常劑量為每千克體重l-5毫克，這一劑量可以一次或多次施用。藥學(xué)上可 接受的載體一般應(yīng)與免疫原相容且對受體無害，包括但不限于弗氏完全佐劑、 弗氏不完全佐劑、霍亂毒素B等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地確定藥物劑 型，包括速釋或/和緩釋制劑。各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行制備。 所得藥物制劑可以通過任何一種便利的途徑施用，包括皮下的、口服的、肌內(nèi) 的、腹膜內(nèi)的，或其他腸胃外的或腸道的途徑。以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
一、 多重抗原肽的i殳計(jì)將E卯in的功能肽段Bl或/和B2的羧基端與賴氨酸共價(jià)連接，可制得二分 枝肽MAP-Bl-2、 MAP-B2-2和MAP-Bl/B2-2，其結(jié)構(gòu)示意圖如附圖(A) 、 (D)和(G)所示；將Eppin的功能肽段Bl或/和B2的羧基端與三聚賴氨酸共價(jià)連接，可制 得四分枝肽MAP-B1-2、 MAP-B2-2和MAP-Bl/B2-2，其結(jié)構(gòu)示意圖如附圖(B)、(E) 和(H)所示;將Eppin的功能肽段Bl或/和B2的羧基端與七聚賴氨酸共價(jià)連接，可制 得八分枝肽MAP-B1-8、 MAP-B2-8、 MAP-B1/B2-8,其結(jié)構(gòu)示意圖如附圖(C)、(F) 和(I)所示。二、 多重抗原肽的制備多重抗原肽MAP-B1 -4的制備方法，包括以下步驟a、 合成Eppin的功能肽段采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，在固相多肽合成儀(ABI 431A型)上合成稱取O. 1 誦ol的王樹脂，按照樹脂氨基酸=1 : 5 (摩爾比)的反應(yīng)比，根據(jù)功能肽段 的氨基酸序列稱取各氨基酸；以二氯曱烷(DCM)溶脹樹脂，再依照去除Fmoc 保護(hù)基、活化、偶聯(lián)的步驟，按照功能肽段的氨基酸序列使肽鏈從羧基(C) 端逐個向氨基(N)端延伸，待合成完畢后，將肽鏈從樹脂上裂解下來，同時 去除多種保護(hù)基，再以反相高效液相色譜法(RP-HPLC)進(jìn)行純化，即得；b、 合成三聚賴氨酸采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，在固相多肽合成儀(ABI 431A型)上合成稱取O. 1 mmol的王樹脂，按照樹脂氨基酸=1 : 5 (摩爾比)的反應(yīng)比，稱取2次反應(yīng) 的賴氨酸(Lys);以DCM溶脹樹脂，再依照去除Fmoc保護(hù)基、活化、偶聯(lián)的 步驟，依次連接第l級和第2級Lys,完成三聚賴氨酸的合成，進(jìn)而將三聚賴氨 酸從樹脂上裂解下來，去除保護(hù)基，以RP-HPLC進(jìn)行純化，即得；c、 將Eppin的功能肽段與三聚賴氨酸共價(jià)連接
將步驟a制得的Eppin的功能肽段溶解于濃度為0. 1 mol/L、 pH值為7. 5 的磷酸鹽緩沖液(PBS)中；于室溫、攪拌反應(yīng)條件下，在步驟b制得的三聚 賴氨酸溶液中，緩慢加入MBS [即曱基丙烯酸曱酯(M) 、 丁二烯(B)和苯 乙烯(S)的三元共聚物]溶液，加完后于室溫下攪拌反應(yīng)2小時，再按照功 能肽段三聚賴氨酸=8 : 1 (摩爾比)的反應(yīng)比例，緩慢加入上述功能肽段溶 液，加完后于室溫下攪拌反應(yīng)3小時，所得反應(yīng)物經(jīng)脫鹽處理后，再以RP-HPLC 進(jìn)行純化，即得多重抗原肽。參照上述方法，可制得本發(fā)明其它多重抗原肽。二、多重抗原肽的鑒定方法a、實(shí)驗(yàn)動物分組將100只體重為18-20 g的清潔級6-8周齡Balb/c 雄性小鼠隨機(jī)分成5組MAP-Bl-4樣品組(多重抗原肽MAP-Bl-4 )、MAP-Bl/B2-4 樣品組(多重抗原肽MAP-B1/B2-4) 、 Bl對照組(Eppin的功能肽段B1 ) 、 B2 對照組(Eppin的功能肽段B2)和空白對照組(PBS),每組20只；b、 免疫方案MAP-B1-4樣品組和MAP-Bl/B2-4樣品組將多重抗原肽稀 釋于濃度為O. 1 mol/L、 pH值為7. 5的PBS中，配制成濃度均為40 pg/mL的溶 液，再將此溶液與霍亂毒素B等體積混合，充分乳化，制得免疫原；Bl對照組 和B2對照組以Eppin的功能肽段替代多重抗原肽，按樣品組所述方法制得免 疫原；空白對照組以PBS替代多重抗原肽，按樣品組所述方法制得免疫原； 各組免疫步驟為首次免疫，將免疫原于小鼠皮下多點(diǎn)注射，每只20網(wǎng)(1 mL ); 以后每間隔2周，以同樣方法加強(qiáng)免疫l次，共3次；c、 免疫原性檢測首次免疫前后，每間隔一定時間，對各組小鼠行尾靜 脈采血，分離血清，采用ELISA法測定血清中特異性抗體的滴度；ELISA法具 體方法為MAP-Bl-4樣品組和MAP-Bl/B2-4樣品組將多重抗原肽稀釋于濃度 為O. 1 mol/L, pH值為7. 5的PBS中，配制成濃度為2 lag/mL的包被液；Bl對照 組和B2對照組以Eppin的功能肽段替代多重抗原肽，按樣品組所述方法制得 包被液；空白對照組以PBS為包被液；各組將包^皮液加至96孔反應(yīng)板中，每
孔IOO 置溫度4。C包凈皮過夜，棄去包凈皮液，以PBST (含Tween-20的PBS) 洗板3次，再對應(yīng)加入倍比稀釋的各組免疫小鼠血清，每孔IOO 置溫度 37。C孵育l小時，棄去血清稀釋液，以PBST洗板3次，再加入辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(稀釋度為l : 5000， Promega公司)，每孔100pl， 置溫度37。C孵育1小時，棄去標(biāo)記抗體，以PBST洗板3次，再加入四曱基聯(lián)苯 二胺(TMB)顯色液，置溫度37。C孵育10分鐘后終止反應(yīng)，測量450 nm波長處 的吸光度A值，待測孔A值大于或等于空白對照組2. l倍者判為陽性，以判為陽 性的最高稀釋倍數(shù)為抗體滴度。d、抗生育能力檢測于末次免疫后2周，按雌雄小鼠數(shù)量比為l : l行雌 雄小鼠合籠實(shí)驗(yàn)，觀察雌鼠受孕率；末次免疫結(jié)束并經(jīng)過3個動情周期后，按 雌雄小鼠數(shù)量比為l : l再行雌雄小鼠合籠實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測雄鼠血清中特異性抗體的 滴度和合籠后雌鼠的受孕率。結(jié)果MAP-B1-4樣品組免疫小鼠血清特異性抗體生成曲線如圖2所示，可 見首次免疫后2周小鼠血清中即有抗MAP-Bl特異性抗體產(chǎn)生，以后抗體滴度逐 漸升高，于免疫后6周達(dá)到最高值1 : 8000，再逐漸降低，于免疫后11周降至1 : 2000; MAP-B1 /B2-4樣品組小鼠血清特異性抗體生成曲線與MAP-B1-4樣品組相 近，首次免疫后2周小鼠血清中即有抗MAP-B1/B2特異性抗體產(chǎn)生，以后抗體 滴度逐漸升高，于免疫后6周達(dá)到最高值1 : 8000，再逐漸降低，于免疫后ll 周降至l : 1000;在末次免疫后2周的雌雄小鼠合籠實(shí)驗(yàn)中，各組雌鼠的受孕率分別是 MAP-Bl-4樣品組15% (3/20) ， MAP-Bl/B2-4樣品組20% (4/20) ， Bl對照 組35%( 7/20) ， B2對照組30%( 6/20)，空白對照組90% ( 18/20 ), MAP-Bl-4 樣品組、MAP-Bl/B2-4樣品組、B1對照組和B2對照組分別與空白對照組比較， 均有顯著性差異(P《0. 05);在末次免疫結(jié)束并經(jīng)過3個動情周期后的雌雄小鼠合籠實(shí)驗(yàn)中，MAP-Bl-4 樣品組雄鼠血清中的特異性抗體滴度為l : 1000,雌鼠受孕率為50°/。(8/16);MAP-B1/B2-4樣品組雄鼠血清中的特異性抗體滴度為1 : 400，雌鼠受孕率為 80% ( 12/16 )。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得出如下結(jié)論E卯in的肽段Bl、 B2具有免疫原性， 能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，誘導(dǎo)抗生育作用，證實(shí)為Eppin的功能肽段； 本發(fā)明的多重抗原肽可提高功能肽段的免疫原性同時不影響其抗原特異性，能 夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的特異于功能肽段的抗體，誘導(dǎo)高效、安全、可逆的抗 生育作用，可用于制備男性避孕疫苗。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡 管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不 偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
序 列 表<110〉 中國人民解;^文軍第三軍醫(yī)大學(xué)< 120〉 附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段及利用該功能肽段構(gòu)建的多重抗原肽<160> 2<210> 1<211〉 12<212〉 PRT<213〉 智人(Human )<400〉 1Ser Met Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gin Gly Asn Asn 1 5 10<210〉 2<211> 12<212〉 PRT<213〉 智人(Human)<400> 2His Trp Trp Tyr Asp Lys Lys Asp Asn Thr Cys Ser 1 5 10
權(quán)利要求
1、附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段，選自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示氨基酸序列。
2、 利用權(quán)利要求i所述的附睪蛋白酶抑制劑的功能肽^a構(gòu)建的多重抗原肽，由下式表示B2K或B4K2K或B8K4K2K其中B是附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段，選自與SEQ ID No. 1具有至少80%序列 相同性的多肽或/和與SEQ ID No. 2具有至少80%序列相同性的多肽； K是雙官能單元。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多重抗原肽，其特征在于所述附睪蛋白酶抑制 劑的功能肽段選自SEQ ID No. l或/和SEQ ID No. 2所示氨基酸序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多重抗原肽，其特征在于所述附睪蛋白酶抑制 劑的功能肽l殳，選自SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示氨基酸序列，且兩種序 列的摩爾比為1 : 1。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2至4之任一權(quán)利要求所述的多重抗原肽，其特征在于 所述雙官能單元選自半胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或鳥氨酸。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多重抗原肽，其特征在于所述雙官能單元為賴 氨酸。
7、 包含免疫學(xué)有效量的權(quán)利要求2所述的多重抗原肽的組合物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于還包含藥學(xué)上可接受的載體。
9、 權(quán)利要求l所述的附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段在制備免疫原中的應(yīng)用。
10、 權(quán)利要求2所述的多重抗原肽在制備男性避孕疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段及利用該功能肽段構(gòu)建的多重抗原肽；本發(fā)明的附睪蛋白酶抑制劑的功能肽段選自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示氨基酸序列，具有成分單一、結(jié)構(gòu)簡單、激發(fā)的免疫反應(yīng)針對性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于制備免疫原；本發(fā)明的利用該功能肽段構(gòu)建的多重抗原肽，在由一個或多個雙官能單元構(gòu)成的樹狀核心的分枝上共價(jià)連接該功能肽段而得到；該多重抗原肽可提高功能肽段的免疫原性同時不影響其抗原特異性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的特異于功能肽段的抗體，降低血清附睪蛋白酶抑制劑水平，誘導(dǎo)高效、安全、可逆的抗生育作用，可用于制備男性避孕疫苗。
文檔編號C07K7/00GK101397332SQ20081023289
公開日2009年4月1日 申請日期2008年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月20日
發(fā)明者畏 何, 吳玉章, 孫黎黎, 李彥鋒, 李晉濤, 梁志清 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)