專利名稱：一種白果酚的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種白果酚(ginkgols)的制備方法。
背景技術(shù)：
銀杏(GMgoW/o^L.)是我國特有的古老樹種，銀杏的葉、果均可入藥，據(jù)"本草" 記載，銀杏作為藥用已有六百多年的歷史，二十世紀六十年代以來，銀杏黃酮、內(nèi)酯兩 大成分獨特的藥理作用和臨床效果得到肯定，使銀杏產(chǎn)首先在歐洲被廣泛接受，目前以 銀杏黃酮、內(nèi)酯為藥效成分的銀杏葉提取物(Extract of Ginkgo biloba，EGb)是公認的預(yù) 防、治療心腦血管疾病的天然植物藥。
銀杏酚酸是存在于銀杏中的另一大類活性成分，銀杏中的垸基酚酸類物質(zhì)包括白果 酚(ginkgols)、銀杏酸(ginkgolicacids)和白果二酚(bilobols)，三者的結(jié)構(gòu)式如下
其中銀杏酸的含量約占銀杏葉干重的1%，外種皮干重的5%。由于銀杏酸可疑的致 敏作用，長期以來被認為是EGb中的有毒成分，要求其在EGb761中的含量必須在5ppm 以下；而白果酚沒有銀杏酸所具有的致敏作用，因此在銀杏葉提取物中對其沒有限量要 求。
隨著人們對銀杏葉及其提取物中的酚酸類物質(zhì)的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)銀杏酸除了可 疑的致敏作用外還具有許多生物活性已有的研究表明銀杏酸對多種G+菌有良好的抑制
作用，能抑制部分人致病真菌及農(nóng)業(yè)病源菌的生長。銀杏酸對多種肺癌細胞株、淋巴瘤
細胞株的生長有很好的抑制作用，而對正常細胞的毒性作用較??；作者研究了銀杏酸對 淋巴瘤U937細胞的影響，發(fā)現(xiàn)銀杏酸能誘導U937細胞凋亡，說明銀杏酸的抗腫瘤作用與 誘導腫瘤凋亡有關(guān)。銀杏酸還具有良好的殺滅釘螺作用，是銀杏外種皮中的主要滅螺活 性成分，相關(guān)工作作者已申請了相關(guān)專利(一種植物殺釘螺劑及其制備方法與使用方法)，
并獲得授權(quán)(專利號ZL2005 1 0122657.6)。
有關(guān)銀杏酸的提取、制備、分析及活性已有多篇文獻報導
1.仰榴青，吳向陽，陳鈞.高效液相色譜法測定銀杏外種皮中的銀杏酸.分析化學，2002， 30 (8): 901-905.
2. Van Beek T.A. Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts .■ J. ChromatographyA, 2002, 967:21-55.
3. H. Jaggy, E. Koch. Chemistry and Biology of Alkyphenols from Ginkgo biloba L. Pharmazie,1997,52:735-738.
4. 楊小明，朱偉，陳鈞，等.銀杏酸單體的抗菌活性研究.中藥材，2004， 27 (9):
5. 楊小明；錢之玉；陳鈞.銀杏外種皮中銀杏酸的體外抗腫瘤活性研究.中藥材，2004， 27 (1): 40-42.
6. 吳向陽，仰榴青，陳鈞.銀杏酸單體的制備及抗菌作用研究.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2003， 發(fā)明人在進一步的研究中發(fā)現(xiàn)銀杏酸結(jié)構(gòu)中的羧基對熱具有不穩(wěn)定性，在加熱的
過程中容易脫羧而轉(zhuǎn)化成白果酚；作者通過生物活性測定，發(fā)現(xiàn)白果酚的抗腫瘤活性比 銀杏酸更強，因此白果酚可以作為一種比銀杏酸具有更強抗腫瘤效果、而無致敏作用的 活性物質(zhì)進行開發(fā)研究，有關(guān)白果酚抗腫瘤藥物的研究對研發(fā)新型腫瘤治療藥物、對銀 杏資源的充分開發(fā)利用，將產(chǎn)生巨大的社會和經(jīng)濟效益。
由于白果酚在銀杏葉、果及外種皮中的含量顯著低于銀杏酸，因此，除了直接從銀 杏中制備白果酚外，利用銀杏酸容易脫羧的特點，通過銀杏酸脫羧制備白果酚不失為一 種更經(jīng)濟的白果酚制備方法。
有關(guān)利用銀杏酸脫羧制備白果酚的方法，及白果酚的抗腫瘤活性目前均尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗腫瘤活性的化合物——白果酚的制備方法及其抗 腫瘤的用途。
本發(fā)明所涉及的白果酚為烷基或烯基苯酚類化合物，具有通式(I)的結(jié)構(gòu)。其中， R鏈為垸基或烯基，是抗腫瘤的主要活性成分，主要存在于銀杏^"^0&//06".)的葉、 果和外種皮中，或漆樹科漆樹屬植物的葉、果及樹皮中。其R基上的碳原子數(shù)為10 19， 雙鍵數(shù)0~3。其R基上碳原子可被其它原子，如O、 S 、 N或鹵素原子取代。
本發(fā)明所述白果酚可以采用以下方式制備
以銀杏酸為原料，采用加熱方法脫除銀杏酸苯環(huán)上的羧基，轉(zhuǎn)化成白果酚，具體如
下
1、將銀杏酸與堿金屬、堿土金屬或過渡金屬氫氧化物按100:1 ~10:1的比例(g/g)混合后， 在8(TC 10(TC加熱、攪拌條件下進行1~4小時，脫去羧基得到白果酚粗品；
661-663.2、 在白果酚粗品中加入2 10倍量(g/ml)的有機溶劑溶解，過濾，濃縮得到粗產(chǎn)物；
3、 將粗產(chǎn)物用硅膠柱層析純化，得到純度不小于96%的白果酚同系物。 上述制備方法中，堿金屬氫氧化物為氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀； 上述制備方法中，堿土金屬氫氧化物為氫氧化鈹、氫氧化鎂或氫氧化鋇； 上述制備方法中，過渡金屬氫氧化物為氫氧化銅、氫氧化鐵或氫氧化鋅，但不限于這三 種過渡元素氫氧化物；
上述制備方法中，有機溶劑為丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯或氯仿； 上述制備方法中，所述硅膠柱層析純化為梯度洗脫，洗脫液為氯仿和氯仿-甲醇混合溶液， 氯仿-甲醇混合溶液比例從9: 1 (v/v)逐漸變?yōu)?: 5 (v/v)，但不限于這一洗脫劑組合 體系。
所述的銀杏酸通過化學分離方法，從銀杏的葉、果、外種皮的提取物中得到；或?qū)?銀杏葉提取物在提取加工過程中剩余的肥料中重新回收；或從其它植物含有本類化合物 的各部分提取物中獲得。
包含本發(fā)明化合物的藥物可以是來源于銀杏的葉、果和外種皮的提取物，也可以是 來源于其它植物含有本類化合物的各部分提取物。
本發(fā)明要求保護該化合物及其藥學上可接受的鹽，酯，溶劑化物，結(jié)晶形態(tài) 的物質(zhì)。
包含本發(fā)明化合物的藥物可以單獨作為抗腫瘤劑使用，也可與其它抗腫瘤劑聯(lián)合使 用，以降低抗腫瘤效果或降低其毒副作用。
包含本發(fā)明化合物的藥物組合含有藥物可以接受的載體;所述的組合物可以是注射液 或口服藥物制劑。
從植物中尋找抗腫瘤藥物，在國內(nèi)外均為抗癌藥物研究的重點，有效地抗腫瘤化合 物具有重要的臨床價值和開發(fā)前景。我國有著豐富的銀杏資源，每年隨著白果的生產(chǎn)， 大量的銀杏外種皮被作為廢棄物浪費掉，利用銀杏外種皮中含量豐富的銀杏酸為原料， 制備具有顯著抗腫瘤活性的白果酚化合物，對于新型抗腫瘤藥物的開發(fā)，對于銀杏資源 的充分利用都具有重要意義。 具體實施方法
實施例l:白果酚同系物的制備 (1)銀杏酸的提取
將100g干燥、粉碎的銀杏外種皮，按1: 5的比例加入石油醚(沸程60 90。C)超聲萃取lh，過濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并提取，揮去石油醚得外種皮提取浸膏。
將浸膏分次用少量石油醚溶解加樣于硅膠柱上(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的
玻璃柱，濕法裝柱)，用石油醚乙醚甲酸=89: 11: 1 (V/V/V)洗脫，以薄層層析在 254nm處出現(xiàn)熒光為檢測，收集銀杏酸組分，濃縮至干；重復(fù)過柱一次，得到的銀杏酸 組分水洗至中性，濃縮至干，或用無水NaS04干燥后，得銀杏酸混合物。
(2) 白果酚的制備
取1.0 g銀杏酸和0.02 g NaOH混于一個50ml的單頸燒瓶中，浸入IOO'C的水浴， 磁力攪拌l小時，混合物冷卻至室溫，得到0.9g的白果酚，然后用3.0mL乙醇萃取。過 濾，濃縮得到一黑褐色油狀物。
該產(chǎn)物以乙醇溶解后，上樣于硅膠柱(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的玻璃柱， 濕法裝柱)，分別采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例從9: 1逐漸變?yōu)?: 5, V/V) 洗脫，以薄層層析在254nm處出現(xiàn)熒光為檢測，收集白果酚組分，濃縮至干；重復(fù)過柱 一次，得到的白果酚同系混合物。
(3) 白果酚的鑒定
制備得到的白果酚同系物為淺棕色液體，其甲醇溶液紫外吸收峰分別為201， 275nm; 紅外光譜(KBr壓片)上3340cm-1處有寬的vo.H振動，1260 cm"處vc.o和1370 cm"處的 So-H (面內(nèi))均可證實為垸基取代苯酚。
LC-ESI-MS (Thermo electron Croporation)分析安捷倫TC18柱(150x4.6腿,5nm)， 流動相甲醇一3MHAc溶液(90:10,v/v)，測得白果酚5個同系物的質(zhì)量分別為276， 304， 302， 330， 328，分別對應(yīng)于銀杏酸C13:0,C15:0,C15:1，C17:1和C17:2。 實施例2:白果酚同系物的制備
(4) 銀杏酸的提取
將100g干燥、粉碎的銀杏外種皮，按l: 5的比例加入石油醚(沸程60 90。C)超聲 萃取lh，過濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并提取，揮去石油醚得外種皮提取浸膏。
將浸膏分次用少量石油醚溶解加樣于硅膠柱上(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的 玻璃柱，濕法裝柱)，用石油醚乙醚甲酸=89: 11: 1 (V/V/V)洗脫，以薄層層析在 254nm處出現(xiàn)熒光為檢測，收集銀杏酸組分，濃縮至干；重復(fù)過柱一次，得到的銀杏酸 組分水洗至中性，濃縮至干，或用無水NaS04干燥后，得銀杏酸混合物。
(5) 白果酚的制備
取1.0 g銀杏酸和0.01g Mg (OH) 2混于一個50ml的單頸燒瓶中，浸入9(TC的水浴，磁力攪拌l小時，混合物冷卻至室溫，得到0.9g的白果酚，然后用8.5mL乙酸乙酯 萃取。過濾，濃縮得到一黑褐色油狀物。
該產(chǎn)物以乙醇溶解后，上樣于硅膠柱(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的玻璃柱， 濕法裝柱)，分別采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例從9: 1逐漸變?yōu)?: 5， V/V) 洗脫，以薄層層析在254nm處出現(xiàn)熒光為檢測，收集白果酚組分，濃縮至干；重復(fù)過柱 一次，得到的白果酚同系混合物。 (6)白果酚的鑒定
制備得到的白果酚同系物為淺棕色液體，其甲醇溶液紫外吸收峰分別為201, 275nm; 紅外光譜(KBr壓片)上3340cm"處有寬的vo.H振動，1260 cm'1處Vc.o和1370 cm'1處的 So-H (面內(nèi))均可證實為烷基取代苯酚。
LC陽ESI-MS (Thermo electron Croporation)分析安捷倫TCI 8柱(150x4.6mm,5^im)，流 動相甲醇一3%HAc溶液(90:10,v/v)，測得白果酚5個同系物的質(zhì)量分別為276， 304， 302， 330， 328，分別對應(yīng)于銀杏酸C13:0，C15:0,C15:1,C17:1和C17:2。 實施例3:白果酚同系物的制備及抗腫瘤活性
(1) 銀杏酸的提取
將100g干燥、粉碎的銀杏外種皮，按1: 5的比例加入石油醚(沸程60 90'C)超聲
萃取lh，過濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并提取，揮去石油醚得外種皮提取浸膏。
將浸膏分次用少量石油醚溶解加樣于硅膠柱上(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的 玻璃柱，濕法裝柱)，用石油醚乙醚甲酸=89: 11: 1 (V/V/V)洗脫，以薄層層析在 254nm處出現(xiàn)熒光為檢測，收集銀杏酸組分，濃縮至干；重復(fù)過柱一次，得到的銀杏酸 組分水洗至中性，濃縮至干，或用無水NaS04干燥后，得銀杏酸混合物。
(2) 白果酚的制備
取1.0 g銀杏酸和0.08 g Cu(OH)2混于一個50ml的單頸燒瓶中，浸入80。C的水浴， 磁力攪拌4小時，混合物冷卻至室溫，然后用5.0mL丙酮萃取。過濾，濃縮得到一黑褐 色油狀物。
該產(chǎn)物以氯仿溶解后，上樣于硅膠柱(硅膠120g，硅膠柱為32X400mm的玻璃柱， 濕法裝柱)，分別采用氯仿、氯仿-甲醇混合溶液(比例從9: 1逐漸變?yōu)?: 5， V/V) 洗脫，以薄層層析在254nm處出現(xiàn)熒光為檢測，收集白果酚組分，濃縮至干；重復(fù)過柱 一次，得到的白果酚同系混合物。
(3) 白果酚的鑒定
7制備得到的白果酚同系物為淺棕色液體，其甲醇溶液紫外吸收峰分別為201， 275nm; 紅外光譜(KBr壓片)上3340cm"處有寬的vo-H振動，1260 cm'1處vc-o和1370 cm"處的 S0-H (面內(nèi))均可證實為垸基取代苯酚。
LC-ESI-MS (Thermo electron Croporation)分析安捷倫TCI 8柱(150x4.6腿,5ijm)，流 動相甲醇一3n/。HAc溶液(90:10,v/v)，測得白果酚5個同系物的質(zhì)量分別為276， 304， 302， 330， 328，分別對應(yīng)于銀杏酸C13:0，C15:0，C15:1,C17:1和C17:2。
(4)白果酚同系物的抗腫瘤活性
采用MTT法，白果酚以DMSO溶解，再用DMEM培養(yǎng)液稀釋成需要濃度；將對 數(shù)生長的腫瘤細胞用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成5xl04 個/mL細胞懸液，接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔20(^L于37'C， 5%0)2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h后，將不同濃度的藥液加入上述培養(yǎng)孔內(nèi)，設(shè)5個平行孔，以含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液為陰性對照，順鉑為陽性對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，中止前4 h加入5mg/ml MTT 溶液2(^L，培養(yǎng)4h后吸出培養(yǎng)液，加入DMSO20(VL，震蕩均勻，在490nm處測定光 密度(OD值)，按公式計算腫瘤細胞生長抑制率。抑制率(％) =1- (OD實驗-OD空白)/ (OD對照-OD空自)X100%。 實驗設(shè)三次重復(fù)。
試驗了白果酚對人肝癌細胞株SMMC7721、人白血病細胞株K562和人膠質(zhì)瘤細胞株 U251的細胞毒性，結(jié)果見表l。
表l、銀杏酸、白果酚對人腫瘤細胞的抑制作用LDso(mg/L)
細胞SMMC7721K562U251
白果酚6.852.714.8
銀杏酸13.067.821.6
順鈾4.24.56.權(quán)利要求
1、一種白果酚的制備方法，其特征在于以銀杏酸為原料，采用加熱方法脫除銀杏酸苯環(huán)上的羧基，轉(zhuǎn)化成白果酚。
2、 如權(quán)利要求l所述的一種白果酚的制備方法，具體為(1)將銀杏酸與堿金屬、堿土金屬或過渡金屬氫氧化物按100:1 ~10:1的比 例(g/g)混合后，在80°C~ IO(TC加熱、攪拌條件下進行1 4小時，脫去羧基得到 白果酚粗品；(2) 在白果酚粗品中加入2 10倍量(g/ml)的有機溶劑溶解，過濾，濃縮得 到粗產(chǎn)物；(3) 將粗產(chǎn)物用硅膠柱層析純化，得到純度不小于96%的白果酚同系物；
3、 如權(quán)利要求2所述的一種白果酚的制備方法，其特征在于堿金屬氫氧 化物為氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀。
4、 如權(quán)利要求2所述的一種白果酚的制備方法，其特征在于堿土金屬氫 氧化物為氫氧化鈹、氫氧化鎂或氫氧化鋇。
5、 如權(quán)利要求2所述的一種白果酚的制備方法，其特征在于過渡金屬氫 氧化物為氫氧化銅、氫氧化鐵或氫氧化鋅。
6、 如權(quán)利要求2所述的一種白果酚的制備方法，其特征在于有機溶劑為 丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯或氯仿。
7、 如權(quán)利要求2所述的一種白果酚的制備方法，其特征在于所述硅膠柱層析純化為梯度洗脫，洗脫液為氯仿和氯仿-甲醇混合溶液，氯仿-甲醇混合溶液比例從9: 1 (V/V)逐漸變?yōu)?: 5 (V/V)。
8、 如權(quán)利要求1或2所述的一種白果酚的制備方法，其特征在于所述的 銀杏酸通過化學分離方法，J人銀杏的葉、果、外種皮的提取物中得到；或?qū)︺y杏 葉提取物在提取加工過程中剩余的肥料中重新回收；或從其它植物含有本類化合 物的各部分提取物中獲得。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種白果酚的制備方法。所述白果酚是用包括如下步驟的方法制備的從銀杏(葉、果及外種皮)中制備得到銀杏酸，將銀杏酸加熱處理脫羧，經(jīng)純化制得白果酚。本發(fā)明所制備的白果酚可有效地抑制人腫瘤細胞增殖，其對人腫瘤細胞的抑制作用均優(yōu)于銀杏酸。
文檔編號C07C37/50GK101514143SQ20081023428
公開日2009年8月26日 申請日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者方 劉, 楊小明, 龔愛華 申請人:江蘇大學