專利名稱：：鯊魚肝再生因子、其制備方法及其醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種鯊魚肝再生因子，還公開了其制備方法及其用用于治療酒精性肝損傷的用途。
背景技術(shù)：
：從海洋生物發(fā)現(xiàn)研究新藥是現(xiàn)代生物制藥的研究熱點(diǎn)，從而開拓了令人注目的藍(lán)色藥業(yè)領(lǐng)域。在比較了多種動(dòng)物肝細(xì)胞活性因子的基礎(chǔ)上，本研究組已從鯊魚肝臟中發(fā)現(xiàn)了多種鯊魚肝活性因子，比如鯊肝刺激物質(zhì)(sharkh印aticstimulatorysubstance，sHSS)和鯊肝活性肽，同其它來源的肝刺激物質(zhì)一樣，具有特異性促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成，阻止肝損傷和恢復(fù)肝功能的作用，還對(duì)免疫性肝損傷具有保護(hù)作用及免疫調(diào)節(jié)作用(見《藥學(xué)學(xué)報(bào)》2004年第l期17-21;《中國新藥雜志》2001，10(1):29-31);能緩解環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠血清溶血素生成的抑制作用及上調(diào)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠血清IL-2的含量(見《藥物生物技術(shù)》2003，10(3):149-151)。本發(fā)明的早期專利CN1250780中公開了分子量為15KD的鯊肝刺激物質(zhì)，它對(duì)各種急性肝損傷具有保護(hù)作用。在進(jìn)一步專利CN1680440中，還公開了相對(duì)分子質(zhì)量為8300Da的鯊肝活性肽和其制備方法及其用于防治糖尿病的用途。在此基礎(chǔ)上，本研究組又首次從條紋斑竹鯊(C力j70SCyWiwz^^7'0^//7)的肝臟中分離得到一種分子量約為13000u的活性多肽，命名為鯊魚肝再生因子(sharkH印aticRegenerativeFactor,sHRF)，經(jīng)研究鯊魚肝再生因子對(duì)各種化學(xué)性和免疫性肝損傷也都有很好的防治作用(見《藥物生物技術(shù)》2004年第四期247-249;2004年第五期324-328)。隨著人們生活水平的提高，酒精的消費(fèi)量逐年增多，酒精性疾病尤其是酒精肝損傷越來越引起人們的注意。酒精主要是在肝臟中代謝的，乙醇代謝過程中可產(chǎn)生一些副產(chǎn)物，如NADH/NAD增高，可影響正常糖代謝途徑，產(chǎn)生氧自由基，引起肝細(xì)胞損傷，甚至肝細(xì)胞壞死，肝纖維化和肝硬化。大鼠酒精肝模型的建立是研究酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)的可靠的動(dòng)物模型。為此采用高濃度酒精每日灌胃建立大鼠ALD模型，研究SHRF對(duì)酒精肝的防治作用。經(jīng)體內(nèi)藥效學(xué)試驗(yàn)證明鯊魚肝再生因子對(duì)慢性酒精性肝損傷起到一定的防護(hù)作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首次從鯊魚肝中條紋斑竹鯊(C/n7o^^/"',;/ag/o^w)的肝臟中分離得到一種分子量約為13000u的活性多肽，命名為鯊魚肝再生因子(sharkHepaticRegenerativeFactor,sHRF)，其相對(duì)分子量為13000u，等電點(diǎn)5.1，紫外特征吸收峰為280nm。本發(fā)明的鯊魚肝再生因子的制備方法如下取鯊魚肝臟，洗凈，絞碎；加水，膠體磨破碎細(xì)胞后，凍存，取出，融解；攪拌下升溫至85。C-90°C，保溫10-15min，再冷卻至3040°C;10000r/min離心，棄油及渣，留中間水層，經(jīng)過濾得粗濾液；粗濾液分別用截留分子量為50kD和20kD的超濾膜超濾，收集分子量小于20kD組分，即為粗提液；粗提液上樣于陰離子交換樹脂，用0.03mol/LpH7.5的PBS緩沖液洗滌，再用0.05-0.lmol/LpH8.0的PBS緩沖液洗脫，收集洗脫峰1，冷凍干燥；pH8.0的PBS緩沖液的濃度優(yōu)選0.05mol/L。凍干粉用水溶解透析后上樣于凝膠柱，純化水洗脫，收集洗脫峰2，冷凍干燥，即得鯊魚肝再生因子。上述陰離子交換樹脂在上樣前優(yōu)選先用0.03mol/LpH7.5的PBS緩沖液平衡，。上述陰離子交換樹脂優(yōu)選DEAE-s印haroseFastFlow柱。上述凝膠柱優(yōu)選Bio-GelP-10層析柱。本發(fā)明鯊魚肝再生因子具有優(yōu)異的預(yù)防或治療酒精性肝損傷的用途。體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明用高濃度酒精每日灌胃建立大鼠酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)模型，結(jié)果慢性酒精性肝損傷大鼠抗氧化系統(tǒng)活力下降，清除自由基，抗氧化能力下降。使用本發(fā)明的sHRF給藥劑量分別是9mg/kg，3mg/kg，1mg/kg，sHRF給藥治療組明顯提高S0D活性，降低MDA含量,提高大鼠清除體內(nèi)氧自由基能力，減少過氧化脂質(zhì)對(duì)組織器官的損傷，使機(jī)體氧化，抗氧化系統(tǒng)趨于平衡,對(duì)慢性酒精性肝損傷起到一定的防護(hù)作用。具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康Wistar大鼠，體重在180—200之間，雌雄兼?zhèn)?，分籠飼養(yǎng)。1.2試劑*本發(fā)明的鯊魚肝再生因子*聯(lián)苯雙酯滴丸預(yù)配成10mg/ml*ALT試劑盒，AST試劑盒，TG試劑盒，MDA試劑盒，S0D試劑盒，白蛋白試劑盒，總蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所)*白酒56度紅星二鍋頭(北京釀酒總廠)1.3器材低速離心機(jī)\722型分光光度計(jì)水浴鍋移液槍離心管手術(shù)器材(剪刀，鑷子)，試管滴管量筒青霉素小瓶燒杯等1.4實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)大鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼喂基礎(chǔ)飼料觀察3天后，根據(jù)體質(zhì)隨機(jī)分為6組，即模型組，正常組，陽性藥組,高.中.低劑量組，各組均為12只大鼠.陽性藥配制1mg/ml;受試藥品高劑量配制成0.9mg/ml;中劑量配制成0.3mg/ml;低劑量配制成0.lmg/ml參正常組以普通飼料喂養(yǎng)*模型組:上午下午兩次白酒灌胃，15ml/kg;*陽性藥上午白酒灌胃，15ml/kg;下午陽性藥灌胃10ml/kg*高劑量組:上午白酒灌胃，15ml/kg;下午鯊魚肝再生因子高劑量灌胃10ml/kg;*中劑量組上午白酒灌胃，15ml/kg;下午鯊魚肝再生因子中劑量灌胃10ml/kg;*低劑量組上午白酒灌胃，15ml/kg;下午鯊魚肝再生因子低劑量灌胃10ml/kg;1.5大鼠連續(xù)喂養(yǎng)五周。每周稱重量一次，按體重調(diào)整灌胃量。實(shí)驗(yàn)最后一天，禁食16小時(shí)后處死大鼠，眼眶取血，快速摘取肝臟，稱重100毫克組織勻漿，測各項(xiàng)肝指標(biāo)。剩余取肝右葉，放入體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片和染色。在普通光鏡下觀察肝組織損傷情況。1.6ALT、AST、TG的測定血清ALT、AST、TG測定嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行.1.7白蛋白，總蛋白的測定血清白蛋白，總蛋白測定嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行.1.8MDA、SOD的測定肝組織MDASOD測定嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行.SOD用黃嘌呤氧化酶法的改良法一-羥氨比色法.MDA含量測定用改良過的過氧化脂質(zhì)硫代吧比妥酸分光光度法(MDA-—TBA)比色法.1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以S土S表示，組間差異采用Student's"t-test"。2結(jié)果2.1—般情況觀察正常組鼠毛光澤，行動(dòng)靈活，食量和大便正常。模型組在灌服酒精后，輕者行走不便，動(dòng)作呆板，重者醉酒嗜睡，約lh后恢復(fù)正常。進(jìn)食量少于正常組，平均約為正常組的一半，各給藥組灌服酒精后，也出現(xiàn)酒后狀態(tài)，但恢復(fù)明顯比模型組快。2.2各組大鼠血清ALT、AST活性比較結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組血清中ALT、AST活性顯著增高，而sHRF高劑量和中劑量組能顯著降低酒精所致的大鼠血清ALT和AST的異常升高，并呈現(xiàn)良好的劑量相關(guān)性(表l)。表l鯊魚肝再生因子脂質(zhì)體對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清ALT和AST水平的影響(5±s)分組劑量(mg/kg)鼠數(shù)ALT(cal、sunit)AST(cal、sunit)sHRF91052.5±17.67**88.88±17.26**sHRF3859.38±16.If99.37±22.32'sHRF1977.63±13.86122.38±30.85聯(lián)苯雙酯10963.38±13.1389.63±18.89**模型組880.37±15.40130.75±21.56正常組1031.13±9.43**74.87±20.73**與模型組比較，*/<y.ft$;#/^zw2.3血清中白蛋白、總蛋白及甘油三酯含量的測定表2鯊魚肝再生因子脂質(zhì)體對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清白蛋白、總蛋白和甘油三酯水平的影響(7±s)分組劑量(mg/kg)鼠數(shù)白蛋白(g/L)總蛋白(g/L)甘油三酯(mg/dl)正常組—1032.4±4.981.1±12.277.59±24.08**模型組一827.9±5.4176.3±6.3176.37±44.63sHRF91033,5±3.56*75.1±4.2396.19±33.82**3829.8±4.0871.9±4.79139.98±82.261928.9±2.5073.6±2.69130.65±35.58*聯(lián)苯雙酯10929.1±5.4973.4±6.8288.59±20.24**:代0.05，"代O.01,mmodel.由表2可知，SHRF各給藥組均能抑制酒精損傷后大鼠肝組織中甘油三酯含量的升高，且9mg/kg劑量組有非常顯著的抑制作用。此外，S冊(cè)F能在一定程度上增加白蛋白含量，但對(duì)總蛋白含量無明顯影響，說明SHRF對(duì)肝細(xì)胞膠原纖維的生成有一定程度的抑制作用，從而減輕肝臟的纖維化，顯示出對(duì)大鼠酒精性肝損傷有一定的治療作用。2.4各組大鼠血清SOD、MDA活性比較見表3表3鯊魚肝再生因子脂質(zhì)體對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清SOD和MDA水平的影響(7±s)分組齊糧(mg/kg)鼠數(shù)SOD(u/ml)MDA(畫l/ml)正常組—1028.69±6.14*26.16±3.26*模型組_822.17±5.5738.55±13.91s冊(cè)F91032.33±7.58**26.76±5.29*3829.16±5.93*30.37±9.961925.84±9.0429.29±9.74<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組肝組織中SOD活性降低，而s服F高劑量和中劑量組能顯著提高SOD活性，并呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性，同時(shí)sHRF高劑量組和聯(lián)苯雙酯組給藥后可以降低肝組織中MDA含量，并有顯著性差異。肝SOD活性及MDA含量的高低則反映了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。說明鯊魚肝再生因子在整體水平上具有抗脂質(zhì)過氧化的功能，SHRF可能是通過穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，加強(qiáng)組織修復(fù)、清除自由基，抗脂質(zhì)過氧化作用，從而解除酒精對(duì)肝細(xì)胞造成的損害。2.5肝臟肉眼觀察正常組鼠肝色澤正常，被膜光滑。模型組鼠肝體積增大，色澤灰暗，并于臨近器官輕度粘連，各給藥組與空白組相比無明顯差異。2.6石蠟切片光鏡觀察結(jié)果見圖1，正常組肝臟組織形態(tài)學(xué)正常。模型組肝細(xì)胞紊亂，肝細(xì)胞可見不同程度水腫，胞質(zhì)疏松，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等，數(shù)量不一的脂肪空泡和水樣變性，匯管區(qū)大量炎細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，肝細(xì)胞未見明顯壞死。給藥組各給藥組肝臟總體病變程度較模型組輕。其中S服F低劑量組3/9例肝臟組織學(xué)形態(tài)基本正常，S服F中劑量組6/8例肝臟組織學(xué)形態(tài)基本正常，SHRF高劑量組9/10例肝臟組織學(xué)形態(tài)基本正常。陽性藥組6/9例肝臟組織學(xué)形態(tài)基本正常。由此我們可以得出，本發(fā)明的鯊魚肝再生因子對(duì)實(shí)驗(yàn)所致大鼠酒精性肝損傷有一定改善作用，其中中、高劑量組療效較好。圖l是本發(fā)明鯊魚肝再生因子(sHRF)對(duì)酒精性肝損傷大鼠的肝組織切片結(jié)果A:正常組；B:模型組；C:9.0mg/kgs服F;D:3.0mg/kgs服F，E:1.0mg/kgs服F，F(xiàn):10mg/kg聯(lián)苯雙酯圖2是本發(fā)明鯊魚肝再生因子(s服F)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測分子質(zhì)量(1.從上至下依次為97400，66200，43000，31000,20100，14400;2.s朋F(10ug)3.s服F(20ug)圖3是本發(fā)明鯊魚肝再生因子(sHRF)的等電點(diǎn)測定結(jié)果具體實(shí)施方式實(shí)施例1取鯊魚肝臟100kg,洗凈，絞碎；加水，膠體磨破碎細(xì)胞后，凍存過夜，次日取出，融解；在均勻攪拌過程中升溫至9(TC，保溫10min,再迅速冷卻至3(TC;10000r/min離心，棄油及渣，留中間水層，經(jīng)板框過濾得粗濾液；粗濾液分別用截留分子量為50kD和20kD的超濾膜超濾，收集分子量小于20kD組分，即為粗提液約311g;粗提液上樣于已用0.03mol/LpH7.5的PBS緩沖液平衡的DEAE-s印haroseFastFlow柱(AmershamBiosciences制造)，初始緩沖液洗滌，再用0.05mol/Lp朋.0的PBS緩沖液洗脫，收集洗脫峰l，得冷凍干燥的樣品38g;凍干粉用水溶解透析后上樣于Bio-GelP-10層析柱(Bio-Rad公司制造)，純化水洗脫，收集洗脫峰2，冷凍干燥，即得鯊魚肝再生因子15.8g。純度鑒定結(jié)果SDS-PAGE法電泳結(jié)果顯示，分離所得樣品為一條帶，見圖2。對(duì)SDS-PAGE的結(jié)果進(jìn)行掃描積分可得臉=13000。等電點(diǎn)測定經(jīng)等電聚焦檢測，其等電點(diǎn)約為5.1(圖3)。紫外吸收光譜分析經(jīng)檢測其最大紫外吸收峰為約280nm(279.80nm)。實(shí)施例2鯊魚肝再生因子脂質(zhì)體的制備將0.5克磷脂和0.5克膽固醇溶解100ml乙醚中，取實(shí)施例1方法制得的鯊魚肝再生因子100mg溶于60ml0.05mol/LPH7.0磷酸鹽緩沖溶液，然后與乙醚液混合，振搖，浴式超聲乳化，所得乳液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓除去有機(jī)溶劑，探頭超聲乳化0.5min，即得鯊魚肝再生因子脂質(zhì)體的混懸液。權(quán)利要求1、一種鯊魚肝再生因子，其特征在于其相對(duì)分子量為12000～14000道爾頓，等電點(diǎn)5.1，紫外特征吸收峰為280nm。2、權(quán)利要求l的鯊魚肝再生因子，其中相對(duì)分子量為13000道爾頓。3、權(quán)利要求l的鯊魚肝再生因子，其特征是由以下方法制備得到取鯊魚肝臟，洗凈，絞碎;加水，膠體磨破碎細(xì)胞后，凍存，取出，融解；攪拌下升溫至85'C-9(TC，保溫10-15分鐘，再冷卻至304(TC;10000r/min離心，棄油及渣，留中間水層，經(jīng)過濾得粗濾液；粗濾液分別用截留分子量為50kD和20kD的超濾膜超濾，收集分子量小于20kD組分，即為粗提液；粗提液上樣于陰離子交換樹脂層析柱，用PH7.5的磷酸鹽緩沖液洗滌，再用0.05-0.lmol/LpH8.0的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫峰1，冷凍干燥得凍干粉；凍干粉用水溶解透析后上樣于凝膠層析柱，純化水洗脫，收集洗脫峰2,冷凍干燥，即得鯊魚肝再生因子。4、權(quán)利要求3的鯊魚肝再生因子，其特征是pH8.0的磷酸鹽緩沖液的濃度為0.05mol/L。5、權(quán)利要求3的鯊魚肝再生因子，其特征是陰離子交換樹脂是DEAE-s印haroseFastFlow。6、權(quán)利要求3的鯊魚肝再生因子，其特征是凝膠柱層析填料是Bio-GelP-10或S印hadexG-75。7、一種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的鯊魚肝再生因子及藥學(xué)上可接受的載體。8、一種含權(quán)利要求1的鯊魚肝再生因子的脂質(zhì)體，其特征是將磷脂和膽固醇溶解在乙醚中，權(quán)利要求1的鯊魚肝再生因子溶于磷酸鹽緩沖溶液，然后與乙醚液混合，振搖，超聲乳化，所得乳液減壓除去乙醇，探頭超聲乳化，即得鯊魚肝再生因子脂質(zhì)體的混懸液。9、權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的鯊魚肝再生因子用于制備治療酒精性肝損傷的藥物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種鯊魚肝再生因子，其特征是其相對(duì)分子量為13000u，等電點(diǎn)5.1，紫外特征吸收峰為280nm。本發(fā)明還公開了其制備方法及其用用于治療酒精性肝損傷的用途。文檔編號(hào)C07K1/16GK101402680SQ20081023486公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者吳梧桐,謙李申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)