專利名稱：：一種源自鹿花盤(pán)的多肽、其制法及其防治糖尿病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種利用生物分離工程技術(shù)從鹿花盤(pán)中分離防治糖尿病的多肽。
背景技術(shù)：
：鹿花盤(pán)又稱角盤(pán)、珍珠盤(pán)，是梅花鹿或馬鹿鋸茸時(shí)在角基上部留下的茸腳骨化后第2年生茸時(shí)的脫落部分，或鋸去角的干燥鹿頂骨。民間用鹿角盤(pán)治療乳腺增生等巳有悠久歷史。因此，花盤(pán)的化學(xué)成分和藥理作用與鹿茸相似?；ūP(pán)粉己報(bào)道的藥理作用包括抑制乳腺增生、抗疲勞、改善有害因素引起的應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體的造血功能、抗炎抑菌以及鎮(zhèn)痛、促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能和T淋巴細(xì)胞的增殖能力、抑制乳腺癌的生長(zhǎng)等。目前尚未見(jiàn)有關(guān)花盤(pán)活性蛋白結(jié)構(gòu)及鹿茸和花盤(pán)抗糖尿病活性物質(zhì)研究工作的報(bào)告，故本研究符合我國(guó)中藥現(xiàn)代化的發(fā)展方向，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和應(yīng)用研究領(lǐng)域內(nèi)具有重要的社會(huì)意義和潛在的經(jīng)濟(jì)效益。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開(kāi)了一種源自鹿花盤(pán)的多肽，其相對(duì)分子量為7127.6道爾頓。本發(fā)明的多肽紫外特征吸收峰為205nm。雙縮脲反應(yīng)呈淡紫色，茚三酮反應(yīng)呈藍(lán)紫色。含16種氨基酸。本發(fā)明的多肽熱穩(wěn)定性好，在pH29之間穩(wěn)定。本發(fā)明的鹿花盤(pán)多肽的制備方法包括取鹿花盤(pán)，粉碎，酸提，紙漿過(guò)濾，凝膠過(guò)濾層析，反相層析。優(yōu)選的制備方法包括鹿花盤(pán)經(jīng)粉碎，pH3.5的醋酸提取，過(guò)濾，凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行純化，用蒸餾水洗脫鹿花盤(pán)多肽，反相層析，即得。凝膠過(guò)濾層析優(yōu)選用FPLC的SuperdexG75凝膠過(guò)濾層析柱。反相層析優(yōu)選用FPLC的RESOURCETMRPC柱，流動(dòng)相A:5%乙腈水溶液(含0.01%三氟乙酸)，B:95%乙腈水溶液(含0.01%三氟乙酸)，洗脫梯度為0-50%。上述過(guò)濾優(yōu)選用濾紙過(guò)濾醋酸提取液，再收集濾出液。體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的鹿花盤(pán)多肽具有優(yōu)異的降血糖效果。在四氧嘧啶誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型中，使用本發(fā)明的鹿花盤(pán)多肽，給藥劑量為300，100和30mg/kg時(shí)，降糖率分別為41.1%，47.6%和35.4%，而同樣的糖尿病模型中，格列苯脲(5mg/kg，)為28.5%。在KKay小鼠(合格證號(hào)SCXK(滬)2007-0005)糖尿病模型中，使用本發(fā)明制備的鹿花盤(pán)多肽，單次給藥3mg/只時(shí)，在4h，8h，12h，24hKKay小鼠血糖值由20.05±3.93mmol/L分別降為11.63±3.69，10.50±3.66，9.22±1.12，12.42±5.77mmol/L，而同樣的糖尿病模型中，格列本脲(5mg/kg，)分別由19.52±4.35mmol/L降為10.07±3.07，10.93±2.66，13.40±3.66，11.18±3.04mmol/L。下面是部分藥理學(xué)試驗(yàn)及結(jié)果一、四氧嘧啶糖尿病模型(n=14)取雌性ICR小鼠于動(dòng)物房預(yù)養(yǎng)2天以適應(yīng)環(huán)境。選取體重范圍在24±2g的小鼠禁食16h(禁食前需換墊料)后，尾靜脈注射四氧嘧啶(現(xiàn)配現(xiàn)用，臨用前用生理鹽水溶解)70mg/kg，注意預(yù)防造模后小鼠出現(xiàn)的低血糖反應(yīng)，適時(shí)給予葡萄糖(蒸餾水配制成5%溶液，腹腔注射lml)。72h后(禁食10h)。便攜式血糖儀檢測(cè)血糖值(尾尖取血)，選取空腹血糖值〉ll.lmmol/L并出現(xiàn)多飲、多食、消痩的小鼠為糖尿病模型小鼠。選取造模成功的糖尿病小鼠70只，按血糖值范圍隨機(jī)分為5組，每組14只，為模型組(給生理鹽水)、陽(yáng)性組(給格列苯脲5mg/kg)、本發(fā)明的的鹿花盤(pán)多肽(以下簡(jiǎn)稱CPU-22-6)治療組治療給藥高劑量組(300mg/kg)、治療給藥中劑量組(100mg/kg)和治療給藥低劑量組(30mg/kg)，且各組血糖值平均值相差不大于0.55mmol/L。同期另取14只正常小鼠作為正常對(duì)照組，試驗(yàn)給藥周期為28天，每天1次，灌胃給藥。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表l。表1鹿花盤(pán)多肽CPU-2206對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的作用(w=74)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>二、KKay小鼠糖尿病模型(n=10)10周齡雌性KKay小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，于動(dòng)物房預(yù)養(yǎng)2天以適應(yīng)環(huán)境。便攜式血糖儀檢測(cè)血糖值(尾尖取血)，選取血糖值〉ll.lmmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食的KKay小鼠為試驗(yàn)小鼠。按血糖值范圍隨機(jī)分為3組，每組10只，為模型組(給生理鹽水)、陽(yáng)性組(給格列本脲5mg/kg)、治療給藥組(給CPU-22063mg/只)，且各組血糖值平均值相差不大于0.55mmol/L。單次灌胃給藥，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2CPU-2206對(duì)KKay小鼠的作用(5±&w=<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>與模型組比較*P<0.0圖1是本發(fā)明制備的鹿花盤(pán)多肽的高效液相凝膠過(guò)濾色譜圖。圖2是本發(fā)明制備的鹿花盤(pán)多肽的高效液相RPC反相色譜圖。圖3是本發(fā)明制備的鹿花盤(pán)多肽的質(zhì)譜圖譜。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1離心上清液制備取鹿花盤(pán)5kg，粉碎后加預(yù)冷的pH3.5醋酸溶液15000ml于4'C攪拌30分鐘，然后在8000rpm"條件下冷凍離心20分鐘，取上清液，沉淀重復(fù)提取一次。將上述上清液合并，再用新華濾紙過(guò)濾，收集濾液，用雙縮脲法測(cè)其蛋白含量為11.194mg/ml。采用FPLC的SuperdexG75(購(gòu)自安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)(中國(guó))有限公司)凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行純化，上述上清液冷凍干燥后，上樣lml(濃度為50mg/ml)，用蒸餾水洗脫，收集峰2，用雙縮脲法測(cè)其蛋白含量為1.487mg/ml。取上述峰2上FPLC的RES0URSETMRPC3ml柱，上樣lml(濃度為lmg/ml)，流動(dòng)相A:5%乙腈水溶液(含0.01%TFA)，B:95%乙腈水溶液(含0.01%TFA)，洗脫梯度為0-100%，流速為lml/min。即可制備出鹿花盤(pán)多肽CPU-2206達(dá)0.045mg/ml。經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜儀測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量為7127.6。紫外特征吸收峰為205nm，雙縮脲反應(yīng)呈淡紫色，茚三酮反應(yīng)呈藍(lán)紫色。經(jīng)檢測(cè)鹿花盤(pán)多肽CPU-2206含16種氨基酸，見(jiàn)表3:表3鹿花盤(pán)多肽氨基酸成分分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>制得的鹿花盤(pán)多肽數(shù)據(jù)分析圖譜見(jiàn)圖1至圖3。權(quán)利要求1、一種源自鹿花盤(pán)的多肽，其特征是其相對(duì)分子量為7127.6道爾頓。2、權(quán)利要求l的多肽，其特征是紫外特征吸收峰為205nm。3、權(quán)利要求1或2的多肽的制備方法，包括鹿花盤(pán)經(jīng)粉碎，pH3.5的醋酸提取，過(guò)濾，凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行純化，反相層析，即得。4、權(quán)利要求3的制備方法，凝膠過(guò)濾層析柱為FPLC的SuperdexTMG75凝膠過(guò)濾層析柱，用蒸餾水洗脫鹿花盤(pán)多肽。5、權(quán)利要求3的制備方法，其中反相層析用FPLC的RESOURCETMRPC柱，流動(dòng)相A:5%乙腈水溶液，B:95%乙腈水溶液；洗脫梯度為0-50%，乙腈水溶液中均含0.01%三氟乙酸，百分比均為重量百分比。6、權(quán)利要求1的多肽用于制備治療或預(yù)防糖尿病的藥物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種利用生物分離工程技術(shù)從鹿花盤(pán)中分離防治糖尿病的多肽，本發(fā)明的多肽相對(duì)分子量為7127.6道爾頓，紫外特征吸收峰為205nm，雙縮脲反應(yīng)呈淡紫色，茚三酮反應(yīng)呈藍(lán)紫色。含16種氨基酸。本發(fā)明的多肽熱穩(wěn)定性好，在pH2～9之間穩(wěn)定。體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的鹿花盤(pán)多肽具有優(yōu)異的降血糖效果。文檔編號(hào)C07K1/00GK101402681SQ20081023486公開(kāi)日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者吉靜嫻,吳梧桐,璟錢(qián),黃鳳杰申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)