專利名稱：一種誘導(dǎo)CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的多肽及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、具免疫抑制 作用的血吸蟲來源的多肽及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近些年來，"衛(wèi)生假說"認(rèn)為，西方發(fā)達(dá)國家過敏性疾病及自身免疫病的發(fā)病率明顯 增高，是由于幼年時獲感染的機(jī)率降低所致。在人類與病原體共同進(jìn)化的歷史長河中，病 原體已進(jìn)化出多種機(jī)制來調(diào)節(jié)宿主的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中最重要的一個機(jī)制就是病原體感 染能誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞-…專職的具免疫抑制功能的免疫細(xì)胞，主要包括在外周抗原激 活誘導(dǎo)的Trl細(xì)胞、Th3細(xì)胞、CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞(T regulatory cells, Tregs)等，對維 持外周免疫耐受、控制宿主免疫病理損傷等具有重要作用，同時也可能幫助病原體抑制機(jī) 體免疫功能、逃避機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)，有利于病原體在宿主體內(nèi)長期持續(xù)感染。因而， 模擬誘導(dǎo)病原體調(diào)節(jié)宿主免疫功能可用來開發(fā)一種新免疫治療策略即運用具免疫調(diào)節(jié) (特指誘導(dǎo)免疫抑制)功能的病原體和/或它的特定抗原，通過誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞等介 導(dǎo)免疫抑制，從而對自身免疫病、過敏性疾病、器官移植后免疫排斥等起到治療作用 (Padraic G. Fallonl and Antonio AIcami. Pathogen-derived immunomodulatory molecules: fUture i腿unotherapeutics TRENDS in Immunology, 2006, Vol.27 No. 10:470-476)。
血吸蟲感染是一種典型的慢性感染模型，大量研究已經(jīng)明確證明它能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 Tregs，從而抑制機(jī)體免疫功能。而且，研究也已表明，血吸蟲感染或暴露于血吸蟲來源 的抗原可預(yù)防1型糖尿病(IDDM)、多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis, MS)、克羅恩病(Cronh's disease)等Thl類細(xì)胞介導(dǎo)的疾??；還可以預(yù)防過敏性疾病如哮喘，Th2類細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。
進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，血吸蟲在哺乳動物宿主體內(nèi)不同生活史階段產(chǎn)生的抗原分子可誘 導(dǎo)宿主產(chǎn)生Tregs，有效抑制Thl、 Th2細(xì)胞介導(dǎo)的疾病(David W. Dunne and Anne Cooke. A worm's eye view of the immune system: consequences for evolution of human autoimmune disease. Nat. Rev. Immunol. 2005, 5:420-426)。因而，利用具有免疫調(diào)節(jié)功能的病原體來治 療無關(guān)的免疫性疾病、尤其更為合理的方法是分離、鑒定、制備并應(yīng)用這樣一種病原體來 源的具有免疫調(diào)節(jié)性的抗原分子來模擬病原體感染后誘導(dǎo)Tregs的效應(yīng)，將是一種新穎的 治療自身免疫病、過敏性疾病等、器官移植后免疫排斥等免疫性疾病的治療方法。
目前，利用抗原或多肽治療自身免疫病或過敏性疾病的研究中，主要是利用口服自身抗原、過敏原來誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)耐受，預(yù)防疾病的發(fā)生。在NOD (非 肥胖性糖尿病)小鼠中，口服人胰島素可誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+Tregs，使小鼠對隨后注射胰島素 的刺激產(chǎn)生耐受。同樣，在變應(yīng)性腦脊髓炎的小鼠模型中，皮內(nèi)免疫過敏原可誘導(dǎo)產(chǎn)生 抗原特異性的CD4+Tregs，從而抑制免疫反應(yīng)，減少小鼠變應(yīng)性腦脊髓炎的發(fā)生。但是， 完整的抗原或蛋白免疫可能交叉連接IgE，從而活化過敏性個體體內(nèi)的肥大細(xì)胞和嗜堿性 粒細(xì)胞，引發(fā)更嚴(yán)重的過敏性疾??；或活化自身免疫病患者體內(nèi)的致病性B、 T細(xì)胞，加 劇病情惡化。例如，狨猴利用髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白進(jìn)行耐受治療，可保護(hù)狨猴抗自 身免疫性腦脊髓膜炎的發(fā)生，但同時也引發(fā)了嚴(yán)重的、致死性脫髓鞘疾病。因而，鑒定具 有治療作用的表位肽(僅是全長抗原的一個小片段)應(yīng)該既能起到免疫治療作用、又可減少 不良副反應(yīng)，將是一種新的、很有前景的治療策略(MarkLarche， DavidCWraMi. Peptide-based therapeutic vaccines for allergic and autoimmune diseases. Natrue medicine supplement. 2005,11 (4): S69-S76) ， ( MichaelSela, Edna Mozes. Therapeutic vaccines in autoimmunity. PNAS， 2004，101(2):14586-14592)。
綜上所述，目前主要在國外，能誘導(dǎo)Tregs的多肽已被成功地嘗試用于治療多種自身 免疫病和過敏性疾病，并取得了較好的治療效果。但選擇合適的表位和相應(yīng)的表位肽是治 療成功的關(guān)鍵。因而，分離、鑒定能誘導(dǎo)Tregs的病原體來源多肽如血吸蟲來源多肽以用 于模擬病原體感染產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)，將是十分關(guān)鍵的因素。但是，國內(nèi)目前還沒有關(guān) 于能誘導(dǎo)Tregs并具免疫抑制性的病原體多肽的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、具有免疫抑制性的多肽。 本發(fā)明所說的能誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的多肽，其氨基酸序列為
VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED,如SEQ.ID.NO.l。發(fā)明人從編碼日本血吸蟲T表
位的多肽中，基于發(fā)明人經(jīng)篩選得到的上述序列。
上述所說的多肽具有增強(qiáng)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)的作用。 上述所說的多肽作為增強(qiáng)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)的免疫抑制劑的應(yīng)用。 上述所說的多肽在制備治療由免疫反應(yīng)引起的炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。 經(jīng)實驗表明，本發(fā)明所說的肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠脾、淋巴結(jié)細(xì)胞后，均顯
著增加了 CD4+CD25+Foxp3+ T細(xì)胞的數(shù)量；肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠CD4+CD25+Tregs細(xì)胞后，均顯著增強(qiáng)了 Tregs的抑制功能。
本發(fā)明提供有多肽，可有效抑制炎癥病理反應(yīng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1 SJMHE1增加CD4+CD25+Foxp3+ T cells數(shù)量
A: SJMHEl體內(nèi)免疫BALB/c小鼠，增加€04+。025卞(》^3+T cells數(shù)量； B: SJMHEl體外預(yù)處理naive小鼠脾、淋巴細(xì)胞4d后，增加€04+0025卞(《口3+T cells數(shù)量； C: SJMHEl體內(nèi)免疫BALB/c小鼠，CD4+CD25+Foxp3+T cells檢測流式圖； D: SJMHE1體外預(yù)處理naive小鼠脾、淋巴細(xì)胞4d后，CD4+CD25+Foxp3+T cells檢測流式圖； 圖2 SJMHE1增強(qiáng)CD4+CD25+Tregs的抑制功能
A: SJMHE1體內(nèi)免疫小鼠，SJMHE1增強(qiáng)CD4+CD25+Tregs的抑制功能
B: SJMHE1體外預(yù)處理naive小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞，增強(qiáng)其免疫抑制功能
圖3 IL-IO、 TGF-pi均參與了 SJMHE1增強(qiáng)CD4+CD25+Tregs抑制效應(yīng)的作用機(jī)制；
A: SJMHE1體內(nèi)免疫小鼠，Transwell實驗證明，IL-IO、 TGF-(31均參與了肽增強(qiáng)CD4+CD25+Tregs的抑
制效應(yīng)；
B:體外預(yù)處理naive小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞，Transwell實驗證明，IL-IO、 TGF-卩1均參與了肽增強(qiáng) CD4+CD25+Tregs的抑制效應(yīng)；
圖4 SJMHE1誘導(dǎo)的CD4+CD25+Tregs抑制DTH反應(yīng)和脾、淋巴細(xì)胞的增生； A: SJMHE1體內(nèi)免疫誘導(dǎo)的CD4+CD25+Tregs抑制DTH反應(yīng)；
B: SJMHE1誘導(dǎo)的CD4+CD25+Tregs抑制DTH小鼠脾、淋巴細(xì)胞對OVA抗原的增生；
C: SJMHE1誘導(dǎo)的CD4+CD25+Tregs抑制OVA免疫小鼠CD4+CD25—對OVA抗原的增生；
圖5 SJMHE1處理的BmDCs和M令s誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+ Tregs;
A: SJMHE1處理的BmDCs誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+ Tregs;
B: SJMHE1處理的M小s誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Tregs;
C: SJMHE1處理的BmDCs抑制CD4+ T細(xì)胞的增生；
D: SJMHE1處理的M+s抑制CD4+ T細(xì)胞的增生；
圖6 SJMHE1處理的BmDCs和呈不成熟的耐受表型；
A: SJMHE1處理的BmDCs和M+s，在倒置顯微鏡下，其形態(tài)學(xué)分析呈未刺激的圓形形態(tài)； B: SJMHE1處理的BmDCs和M小s,其表面分子表達(dá)下降； 圖7 SJMHE1在TLR2一小鼠中不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+ Tregs;
A: SJMHE1體內(nèi)免疫TLR2; 、 TLR4一小鼠，TLR2— J、鼠中不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Tregs;B: SJMHE1體外預(yù)處理TLR2一 、 TLR,小鼠脾、淋巴細(xì)胞，TLR2一小鼠中不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+ Tregs;
C: SJMHE1體內(nèi)免疫TLR27— 、 TLR4一小鼠，SJMHE1不能增強(qiáng)TLR2+小鼠CD4+CD25+ Tregs的抑 制性；
D: SJMHE1體外預(yù)處理TLR2一 、 TLR4一小鼠CD4+CD25+ Tregs， SJMHE1不能增強(qiáng)TLR2+小鼠 CD4+CD25+Tregs的抑制性；
圖8 SJMHE1處理TLR2一小鼠BmDCs和BmM())S不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+ Tregs;
A: SJMHE1體內(nèi)免疫TLR2一 、 TLR4一小鼠，分離小鼠BmDCs/BmM())S， SJMHE1不能誘導(dǎo)TLR2一
小鼠BmDCs/BmM—產(chǎn)生CD4+CD25+ Tregs;
B: SJMHE1體外預(yù)處理TLR2一 、 TLR4一小鼠BmDCs/BmM(j)s， SJMHE1不能誘導(dǎo)TLR2一小鼠 BmDCs/BmM(tis產(chǎn)生CD4+CD25+ Tregs。
具體實施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解 的含義。
下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)
理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細(xì)描迷的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用
試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同
試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
實施例一肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠脾、淋巴結(jié)細(xì)胞后，CD4+CD25+Foxp3+ T細(xì)胞 的數(shù)量變化；
1)合成日本血吸蟲一 T細(xì)胞表位肽SJMHE1，其氨基酸序列(SEQ.ID.NO. l)為 VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED (Val Pro Gly Gly Gly Thr Aia Leu Leu Arg Cys lie Pro Val Leu Asp Thr Leu Ser Thr Lys Asn Glu Asp)。并合成對照肽OVA323-339，其序列為 (SEQ. ID. NO. 2): ISQAVHAAEINEAGRY (lie Ser Gin Ala Val His Ala Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly Arg Tyr);肽、對照肽的合成純度均》99%。上述多肽均由上海生工公司完成， 肽的純度大于99%，由HPLC鑒定。
62)將肽(SJMHE1)、對照肽(OVA323'339)、 PBS與IFA制成乳化劑，IFA購自Sigma 公司，每100nl乳化劑中含肽、.'，肽各10pg，皮下免疫小鼠，兩周免疫一次，共免疫 兩次；艮卩每次在小鼠背部皮' '射100)LilSJMHEl的乳化劑(含10pgSJMHEl)、 OVA^^乳化劑(含K)嗎ovA^，)或PBS乳化劑。清潔級BALB/c小鼠購自上海斯
萊克實驗動物有限責(zé)任公司，8周齡，雌性。
3) 分離各組免疫小鼠的脾、淋巴結(jié)，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后， 取含有106個細(xì)胞的懸液，加入染色緩沖液至終體積為100jal。加入0.25MgPerCP標(biāo)記大 鼠抗小鼠CD3單克隆抗體、0.125|ttg FITC標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體和0.06pgAPC 標(biāo)記大鼠抗小鼠CD25單克隆抗體，4'C避光孵育30min，以標(biāo)記細(xì)胞表面CD3、 CD4和 CD25抗原。將標(biāo)記了表面抗原的細(xì)胞懸液經(jīng)固定、破膜后，加Fc阻斷劑，阻斷抗體的 非特異性結(jié)合后，加入0.5Mg PE標(biāo)記大鼠抗小鼠Foxp3單克隆抗體，4'C避光孵育30min， 進(jìn)行胞內(nèi)染色。最后將標(biāo)記好的細(xì)胞經(jīng)緩沖液洗滌后，用500)Lil重懸，經(jīng)FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量、比例。實驗中所用CD4、 CD25、 Foxp3 流式檢測抗體購自eBioscience公司的Mouse Regulatory T cell Staining Kit (貨號 88-88111-40); PerCP標(biāo)記的抗CD3抗體購自eBioscience公司，貨號為553067。
4) 分離naive小鼠的脾、淋巴結(jié)，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后， 24孔培養(yǎng)板中每孔含106個細(xì)胞，同時加入lpg/mlSJMHEl或OVA323—339，在完全1640 培養(yǎng)液中，37°C, 5% C02孵箱培養(yǎng)4d后，按上述步驟3)的方法標(biāo)記表面CD3、 CD4、 CD25分子，以及胞內(nèi)Foxp3分子，經(jīng)FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞的數(shù)量、比例。
結(jié)果如圖1所示，肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠脾、淋巴結(jié)細(xì)胞后，均顯著增加了 CD4+CD25+Foxp3+ T細(xì)胞的數(shù)量；
實施例二肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠CD4+CD25+Tregs細(xì)胞后，對Tregs抑制功能的 影響；
1)按上述實施例一中的方法免疫小鼠，分離各組免疫小鼠的脾、淋巴結(jié)，制成單細(xì) 胞懸液，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，用Mouse CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit (購自MiltenyiBiotec公司，貨號130-091-041)分離小鼠CD4+CD25+、 CD4+CD25-T細(xì)胞；非CD4+細(xì)胞經(jīng)50ng/ml絲裂霉素，37°C, 5% C02孵箱處理30min后，為APC。取5 X IOV孔純化的CD4+CD25+ T細(xì)胞、IX 105/孔CD4+CD25層T細(xì)胞、IX 105/孔APC， 加0.1ng/mlSJMHEl或OVA323—339，在抗-CD3刺激下，37°C, 5°/。 <302孵箱培養(yǎng)3d后，以 3H摻入法檢測肽對CD4+CD25+ Tregs抑制功能的影響，即細(xì)胞收獲前16 18 h加入 3H-TdR, 0.5uCi/孔，Beckman液閃儀測定cpm值。(抗-CD3抗體購自BD Pharmingen公司， 貨號553057)
2)分離naive小鼠的脾、淋巴結(jié)，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后， 按上述步驟l)的方法分離小鼠CD4+CD25+、 CD4+CD25- T細(xì)胞、及APC;用0.1jug/ml SJMHE1或OVA32"39在37°C, 5% 0)2孵箱中預(yù)處理CD4+CD25+ T細(xì)胞30min后，按上 述步驟l)的細(xì)胞比例與CD4+CD25'T細(xì)胞、APC共培養(yǎng)，以3H摻入法檢測肽體外預(yù)刺 激。04+0025+Tregs后，對其抑制功能的影響。
結(jié)果如圖2所示，肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠CD4+CD25+Tregs細(xì)胞后，均顯著 增強(qiáng)了 Tregs的抑制功能；
實施例三肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠CD4+CD25+Tregs細(xì)胞后，肽對CD4+CD25+Tregs 抑制效應(yīng)影響的作用機(jī)制；
1)按上述實施例一中的方法免疫小鼠，分離各組免疫小鼠的脾、淋巴結(jié)，制成單細(xì) 胞懸液，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，按上述實施例二中的方法分離小鼠CD4+CD25+、 CD4+CD25-T細(xì)胞；非CD4+細(xì)胞經(jīng)50ng/ml絲裂霉素，37°C， 5% 0)2孵箱處理30min后， 為APC。在24孔培養(yǎng)板中加入0.4|am Millicell (Millipore公司，半透膜隔板，可將細(xì)胞隔 開，只允許可溶性的分子通過)，取2.5X107孔純化的CD4+CD25+ T細(xì)胞加入Millicell 的上部、5X10V孔CD4+CD25- T細(xì)胞加入Millicell的下部；5乂105/孔APC和0.1ng/ml SJMHE1上下部均加入，在抗-CD3刺激下，37。C,5。/。C02孵箱培養(yǎng)3d后，以3H摻入法 檢測肽對CD4+CD25+ Tregs抑制功能的影響。同時有些孔加入3ng/ml大鼠抗小鼠IL-10 IgGl型單克隆抗體(Biolegend公司，貨號504903) 、 0.5ng/ml大鼠抗小鼠TGF-(31 IgGl 型單克隆抗體(USBiological公司，貨號T8250-16A)，或者兩種抗體均加入，檢測IL-IO、 TGF-pi是否參與肽對CD4+CD25+ Tregs抑制功能影響的作用機(jī)制；
2)分離naive小鼠的脾、淋巴結(jié)，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后， 按上述實施例二中的方法分離小鼠CD4+CD25+、 CD4+CD25—T細(xì)胞、及APC;用0.1ng/ml SJMHE1在37°C, 5% C02孵箱預(yù)處理CD4+CD25+ T細(xì)胞30min后，按上述步驟1)的細(xì)
8胞比例、培養(yǎng)方式與CD4+CD25— T細(xì)胞、APC共培養(yǎng)，以3H摻入法檢測肽體外預(yù)剌激 CD4+CD25+Tregs后，IL-IO、 TGF-pl是否參與肽對CD4+CD25+Tregs抑制功能影響的作 用機(jī)制；
結(jié)果如圖3所示，肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠CD4+CD25+Tregs細(xì)胞，IL-IO、 TGF-pi均參與了肽增強(qiáng)CD4+CD25+Tregs抑制效應(yīng)的作用機(jī)制；
實施例四建立遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型(DTH)，檢測肽誘導(dǎo)的CD4+CD25+Tregs體內(nèi)的調(diào) 節(jié)效應(yīng)；
1) 分離SJMHE1、 OVA323-339免疫小鼠CD4+CD25+、 CD4+CD25- T細(xì)胞，立即尾靜 脈過繼轉(zhuǎn)移入8w齡BALB/c小鼠，每只注射1Xl()6，ld后，各組小鼠足墊部免疫10(^1含 100ngOVA (fraction V， Sigma公司)的乳化劑，CFA乳化(完全福氏佐劑，Sigma公 司)。小鼠足墊部免疫OVA 13d后，左耳皮下注射20pl OVA (lmg/ml)，右耳皮下注 射20nlPBS;建立DTH小鼠模型；24h后，用游標(biāo)卡尺(Mitutoyo公司)檢測小鼠耳朵 厚度的改變，即左耳的厚度減去右耳的厚度。
2) 上述步驟1)中各組經(jīng)過繼轉(zhuǎn)移SJMHE1、 OVA323'339免疫小鼠CD4+CD25+、 CD4+CD25—T細(xì)胞，并經(jīng)OVA免疫和激發(fā)DTH模型小鼠，脫臼處死后，按前述方法制備 脾、淋巴結(jié)單個核細(xì)胞懸液，在96孔圓底培養(yǎng)板中，每孔5X 105細(xì)胞，并分別加入lng/ml、 10昭/m、100pg/ml OVA刺激，37°C， 5% C02孵箱培養(yǎng)3d后，以311摻入法檢測脾、淋 巴結(jié)單個核細(xì)胞對OVA刺激的增殖反應(yīng)能力；
3) BALB/c小鼠皮下免疫100pg OVA的乳化劑(CFA乳化)，2w后分離免疫小鼠 CD4+CD25—T細(xì)胞、APC。同時，分離SJMHE1、 0￥八323-339免疫小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞， 在96孔圓底培養(yǎng)板中，每孔加上述1 X 105 CD4+CD25+T細(xì)胞，1 X 105 CD4+CD257細(xì)胞、 1X 105APC，并在100|ag/ml OVA刺激下，37°C， 5% C02孵箱培養(yǎng)3d后，以3H摻入法檢 測免疫小鼠CD4+CD25—T細(xì)胞對OVA刺激的增殖反應(yīng)能力；
結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)移了肽免疫產(chǎn)生的CD4+CD25+Tregs,能顯著減輕DTH小鼠的 病理改變，減少外周脾、淋巴細(xì)胞對OVA的剌激反應(yīng)；肽免疫產(chǎn)生的CD4+CD25+Tregs 能顯著抑制OVA免疫小鼠CD4+CD25' T細(xì)胞對OVA刺激的增生反應(yīng)。
實施例五肽處理巨噬細(xì)胞(M小s)、樹突狀細(xì)胞(DCs)后，與naive CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測CD4+T細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量變化及其增殖能力；研究肽通過 何種APC誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Tregs;
1) 取BALB/c小鼠股骨、脛骨，盡量去除周圍組織肌肉，PBS、不完全1640洗滌后， 用鑷子固定長骨，剪刀剪去骨兩端，用5ml注射器抽取不完全1640，針頭分別從兩端插 入骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨變白；收集含骨髓前體細(xì)胞的不完全1640， 經(jīng)紅細(xì)胞裂解后，置37'C,5n/。C02孵箱內(nèi)孵育3h，吸出懸浮和半貼壁細(xì)胞，離心棄上清 后，用DC培養(yǎng)液重懸(加入了誘導(dǎo)DC細(xì)胞分化的細(xì)胞因子1 ng/ml rGM-CSF、 1 ng/ml rIL-4，均購自Peprotech公司，貨號分別為500-P65、 500-P54),計數(shù)后調(diào)整密度為6X lOVml,加入24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)；同時，有些培養(yǎng)孔中加入1 pg/ml SJMHE1或OVA32"39 刺激BmDCs;培養(yǎng)周期為8d，有些培養(yǎng)孔在培養(yǎng)6d時加入1 jxg/ml LPS,誘導(dǎo)BmDCs 成熟，作為SJMHE1、 OVA^^處理BmDCs的對照；同時設(shè)不加任何刺激劑的medium 為陰性對照。
2) 24孔培養(yǎng)板中，每孔6X105小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 (M小s)，購自American Type Culture Collection (Manassas, VA),有些培養(yǎng)孔中加入1 pg/ml SJMHE1或OVA323-339 刺激Mc()s;培養(yǎng)周期為2d，有些培養(yǎng)孔在培養(yǎng)24h后加入lpg/mlLPS，誘導(dǎo)M小s成熟， 作為SJMHE1 、 OVA323—339處理M小s的對照；同時設(shè)不加任何刺激劑的medium為陰性對 照。
3) 收集經(jīng)不同處理的BmDCs/Mcps，用染色緩沖液洗滌后，取5乂105細(xì)胞重懸于染 色緩沖液中，然后按說明書加入FITC-CD80 (貨號11-0801-81) 、 PE-CD40 (貨號 12-0401-81) 、 PE-CD86 (貨號:12-0862-81) 、 FITC-MHCII (貨號:11-5321-82)，均 購自eBioscience公司，檢測BmDCs/M(ps表面分子的表達(dá)變化。
4) 用Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit (購自Miltenyi Biotec公司，貨號130-090-860) 分離naive小鼠的CD4+ T細(xì)胞，與上述步驟1 )、 2)中SJMHE1 、 OVA323-339、 LPS、 medium 處理BmDCs/M(()s共培養(yǎng)(BmDCs/M(j)s經(jīng)50^g/ml絲裂霉素處理)，37°C, 5% C02孵箱 內(nèi)孵育3d后，按前述實施例一中的方法，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs 數(shù)量、比例；同時，以SH摻入法檢測CD4+T細(xì)胞的增殖能力；
結(jié)果如圖5、圖6所示，CD4+ T細(xì)胞與肽處理的BmDCs/M(ps共培養(yǎng)后，能誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs數(shù)量的增加；而且，CD4+T細(xì)胞的增生能力顯著減低；肽處 理的BmDCs/M(()s呈不成熟的耐受表型，其表面分子的表達(dá)水平降低。實施例六肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理TLR2、 TLR4々—小鼠脾、淋巴結(jié)細(xì)胞后， CD4+CD25+FOXp3+ T細(xì)胞的數(shù)量、功能變化；鑒定肽通過何種TLR誘導(dǎo)產(chǎn)生 CD4+CD25+Tregs;
TLR2一、 TLR4^小鼠購自南京大學(xué)國家小鼠遺傳資源中心，8周齡，雌性。
1) 按前述實施例一中的方法體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理TLR2、 TLR4^小鼠脾、淋巴結(jié) 細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Tregs數(shù)量、比例；
2) 按前述實施例二中的方法體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理TLR2'A、 TLR4一小鼠 CD4+CD25+Tregs細(xì)胞后，以3H摻入法檢測肽對TLR2'A、 TLR4一小鼠CD4+CD25+ Tregs 抑制功能的影響；
結(jié)果如圖7所示，肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理TLR2^、 TLR,小鼠脾、淋巴結(jié)細(xì)胞后， TLR4—z—小鼠的CD4+CD25+Foxp3+ T細(xì)胞的數(shù)量增加，功能增強(qiáng)，而TLR2;小鼠的 CD4+CD25+Fo鄧3+T細(xì)胞的數(shù)量不增加，功能也不增強(qiáng)，艮卩肽在TLR2^小鼠中不能誘 導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+ Tregs。提示，肽誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Tregs可能通過TLR2。 實施例七肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理TLR2'A、 TLR4一小鼠BmDCs/BmMcps，與naive CD4+ T細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量、功能變化；鑒定肽通過何種APC誘 導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Tregs;
1) 按實施例五中的方法制備BmDCs，同時在制備的骨髓前體中細(xì)胞中加入l ng/ml rM-CSF (購自Peprotech公司，貨號為500-P62G)，誘導(dǎo)分化BmMcps;按實施例五中 的方法用不同的刺激劑刺激BmDCs;按刺激BmDCs的方法刺激BmMcps;
2) 用Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit (購自Miltenyi Biotec公司，貨號130-090-860) 分離naive TLR2;、 TLR4vvJ、鼠的CD4+T細(xì)胞，與上述步驟1)中處理的BmDCs/BmM— 共培養(yǎng)(BmDCs/M(l)s經(jīng)5(^g/ml絲裂霉素處理)，37°C, 5% C02孵箱內(nèi)孵育3d后，按前 述實施例一中的方法，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs數(shù)量、比例；
結(jié)果如圖8所示，肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理TLR2、 TLR4^小鼠BmDCs/BmM())s, TLR4一小鼠BmDCs與naive CD4+ T細(xì)胞共培養(yǎng)后，可誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+ T細(xì)胞數(shù) 量的增力卩；而TLR2一小鼠BmDCs/BmM(J)S均不能誘導(dǎo)CD4+ T細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+ T細(xì)胞數(shù)量的增加；即肽處理TLR2^小鼠BmDCs和BmM |)s不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+ Tregs;提示，肽可能通過DCs上的TLR2誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Tregs。
11以上實驗說明SJMHE1可能通過DCs上的TLR2誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+Tregs，增強(qiáng)其 免疫抑制功能，并在DHT模型小鼠中證實，可有效抑制炎癥病理反應(yīng)，具有廣闊的應(yīng)用 目U景。
本發(fā)明不限于這些公開的實施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以及權(quán) 利要求范圍的各種變型和等效變化。SEQUENCE LISTING
〈110〉南京醫(yī)科大學(xué)
〈120〉 一種誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的多肽及應(yīng)用
〈160〉 2
〈210〉 1 〈211〉 24 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈400〉 1
Val Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys He Pro Val Leu 15 10 15
Asp Thr Leu Ser Thr Lys Asn Glu Asp
20 24
〈210〉 2
〈211〉 16
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈400〉 2
lie Ser Gin Ala Val His Ala Ala Glu lie Asn Glu Ala Gly Arg
15 10 15 Tyr
1權(quán)利要求
1、一種能誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的多肽，其特征在于，其氨基酸序列為VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED，如SEQ.ID.NO.1。
2、 權(quán)利要求1所說的能誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的多肽具有增強(qiáng)CD4+CD25+ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)的作用。
3、 權(quán)利要求1所說的能誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的多肽作為增強(qiáng)CD4+CD25+ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)的免疫抑制劑的應(yīng)用。
4、 權(quán)利要求1所說的能誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的多肽在制備治療免疫反應(yīng) 引起的炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、具免疫抑制作用的血吸蟲來源的多肽及應(yīng)用。所說的能誘導(dǎo)CD4⁺CD25⁺Tregs的多肽，其氨基酸序列為VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED。該多肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠脾、淋巴結(jié)細(xì)胞后，均顯著增加了CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T細(xì)胞的數(shù)量；肽體內(nèi)免疫或體外預(yù)處理小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs細(xì)胞后，均顯著增強(qiáng)了CD4⁺CD25⁺Tregs的抑制功能。本發(fā)明提供的多肽，可有效抑制炎癥病理反應(yīng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K14/00GK101580539SQ200810234928
公開日2009年11月18日 申請日期2008年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月4日
發(fā)明者豐 劉, 莎 周, 汪雪峰, 川 蘇, 蕾 賀 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)