專利名稱：昆蟲c-型凝集素重組表達(dá)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的DNA重組表達(dá)技術(shù)及應(yīng)用， 具體涉及一種C-型凝集素及其功能域的重組表達(dá)的創(chuàng)制方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動(dòng)物免疫系統(tǒng)分為先天性和獲得性兩部分，先天免疫在多細(xì)胞生物進(jìn)化的早期出現(xiàn)， 不僅存在于脊推動(dòng)物、無脊推動(dòng)物，也存在于植物中，而獲得性免疫只存在于脊椎動(dòng)物中。 先天免疫是昆蟲等無脊椎動(dòng)物抵御病源生物入侵和危害的唯一途徑。先天免疫包括細(xì)胞免疫 和體液免疫兩個(gè)途徑，其基本過程是首先由模式識(shí)別受體識(shí)別外來異物，稱為感染的非己 識(shí)別，隨后引發(fā)激活絲氨酸蛋白酶和解除絲氨酸蛋白酶抑制劑的細(xì)胞外級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而將受 到感染的信號(hào)放大為更強(qiáng)的"危險(xiǎn)"信號(hào)或解除錯(cuò)誤警報(bào)，然后引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而導(dǎo)致免 疫基因的轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。先天免疫反應(yīng)的策略不在于它們能識(shí)別每一個(gè)可能的抗原， 而是能夠識(shí)別在微生物中普遍存在的高保守的共有結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)被稱為病原相關(guān)分子模式 (pathogen assiciated molecular patterns, PAMPs)，而先天免疫系統(tǒng)中能夠識(shí)別這些分子模式的 受體稱為模式識(shí)別受體(pattem recognition rec印tors, PRRs)。對(duì)病原微生物表面獨(dú)特分子結(jié)構(gòu) 的識(shí)別是先天免疫識(shí)別的基礎(chǔ)。其中，感染的非己識(shí)別對(duì)于缺少適應(yīng)性免疫的無脊椎動(dòng)物尤 為重要。非己識(shí)別是因?yàn)槟Ｊ阶R(shí)別受體可以識(shí)別或結(jié)合那些微生物表面保守的、而在宿主中 又不存在的病原相關(guān)分子模式。最廣泛和有效的識(shí)別自己和非己的方法就是識(shí)別病原微生物 表面的碳水化合物結(jié)構(gòu)。 '
C-型凝集素(C-type lectin)是先天免疫反應(yīng)中的一種模式識(shí)別受體，在Ca"存在下 能特異的識(shí)別病原微生物表面的糖類物質(zhì)，引起宿主的一系列免疫反應(yīng)從而有效地抵抗病原 微生物的入侵。無脊椎動(dòng)物中C-型凝集素家族在免疫相關(guān)時(shí)期高表達(dá)，原因是可以以其特 有的碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域CRD結(jié)合微生物表面碳水化合物，在免疫反應(yīng)的非己識(shí)別中起重 要作用。C-型凝集素(C-type lectin)從1988年被定義名稱以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一千多種。 全基因組序列研究表明，C-型凝集素從蠕蟲，果蠅到脊椎動(dòng)物，雖然不完全相同，但不同 C-型凝集素的碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域CRD序列(carbohydrate recognition domain, CRD) 具有相對(duì)保守的氨基酸殘基，C-凝集素的碳水化合物結(jié)合活性是通過碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域 來實(shí)現(xiàn)的，因此，重組表達(dá)凝集素全長(zhǎng)基因(含結(jié)構(gòu)域)或僅表達(dá)凝集素的碳水化合物識(shí)別
4結(jié)構(gòu)域均可以獲得有活性的產(chǎn)物。
家蠶等經(jīng)濟(jì)家養(yǎng)昆蟲在養(yǎng)殖過程中遭受各種病源生物危害，對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損 失，迫切需要高效無害的藥物來防治病害。雖然已經(jīng)有家蠶等昆蟲的凝集素克隆和功能研究 的報(bào)道，但目前為止沒有關(guān)于昆蟲凝集素的重組表達(dá)和用于感染性疾病防治的研究報(bào)道。特 別是棉鈴蟲凝集素基因是我們首次克隆得到并進(jìn)行重組表達(dá)和功能研究。用于棉鈴蟲在長(zhǎng)期 自然選擇和人為使用各種微生物農(nóng)藥的選擇下形成了極強(qiáng)的抗逆性，在免疫基因方面進(jìn)化成 了比家蠶等養(yǎng)殖昆蟲更強(qiáng)的免疫功能，并且棉鈴蟲和家蠶都是屬于鱗翅目昆蟲，基因的相似 性較高，因此通過生物工程技術(shù)生產(chǎn)的棉鈴蟲O型凝集素較從其它生物來源的凝集素具有 更好的抗病能力，可以用于家蠶等養(yǎng)殖昆蟲的病害防治。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種家養(yǎng)昆蟲感染性病害使用的生物藥物， 用于家蠶等養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)昆蟲的感染性病害防治。
本發(fā)明在大腸桿菌中重組表達(dá)了棉鈴蟲C-型凝集素(Ha-lectin)基因及該基因的兩個(gè) 碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-recognition domains, CRD) Ha-CRD1和Ha-CRD2， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在大腸桿菌中重組表達(dá)的棉鈴蟲C-型凝集素(Ha-lectin)基因及兩個(gè)結(jié)構(gòu)域 Ha-CRD1和Ha-CRD2有幫助昆蟲抵抗病源生物侵襲的功能，可以用于經(jīng)濟(jì)昆蟲如家蠶在養(yǎng)殖 生產(chǎn)中的病害防治。
本發(fā)明提供基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域 Ha-CRDl和Ha-CRD2的生物藥物，其特征是，將棉鈴蟲C-型凝集素基因及該基因的兩個(gè)碳水 化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRDl和Ha-CRD2,重組表達(dá)到大腸桿菌中。
優(yōu)選的，所述棉鈴蟲(We"comr; aar/w'ger3) C-型凝集素(Ha-lectin)基因?yàn)镠a-Lect (基因全序列已經(jīng)由我們提交到GenBank， http:〃www. ncbi. nlm. nih，接受號(hào)DQ533877)。 在大腸桿菌中重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素(Ha-lectin)全長(zhǎng)基因、功能域、以及在上述基 因的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾或堿基突變產(chǎn)生的基因，獲得重組蛋白凝集素或凝集素功能域。碳水化 合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRDl (全長(zhǎng)Ha-Lect(接受號(hào)DQ533877)中的第30個(gè)氨基酸至第156個(gè) 氨基酸的序列)和Ha-CRD2 (全長(zhǎng)Ha-Lect(接受號(hào)DQ533877)中的第68個(gè)氨基酸至第307 個(gè)氨基酸的序列)
本發(fā)明還提供一種基因重組表達(dá)棉鈴蟲c-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)
構(gòu)域Ha-CRDl和Ha-CRD2的方法，包括如下步驟針對(duì)插入表達(dá)載體的Ha-Lect、 Ha-CRDl和Ha_CRD2的基因序列分別設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，用PCR方法分別擴(kuò)增Ha-Lect及Ha-CRD1和Ha-CRD2;在大腸桿菌中擴(kuò)增并提取表達(dá)載體-Ha-Lect、表達(dá)載體-Ha-CRD1和表達(dá)載體-Ha-CRD2質(zhì)粒；將表達(dá)載體-Ha-Lect、表達(dá)載體-Ha-CRD1和表達(dá)載體-Ha-CR&質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入宿主
體內(nèi)'用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)用Ni2'柱或其它填料純化重組rHa-Lect、 rHa-CRD1和rHa-CRD2。 所述誘導(dǎo)物為IPTG (異丙基硫代-p-D-半乳糖苷的縮寫)、甲醇或其它化合物。 其中，步驟[l]中所述表達(dá)載體選自大腸桿菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、或昆蟲桿狀病毒
載體。優(yōu)選的，大腸桿菌表達(dá)載體選自pET系列載體或pGEX系列載體,酵母表達(dá)載體選自
pPIC系列載體。
其中，步驟[l]中所述Ha-Lect、 Ha-CRDl和Ha-CRD2為Ha-Lect基因(GenBank， http:〃ww.ncbi.nlm.nih，接受號(hào)DQ533877)及其基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾或堿基突變產(chǎn)生的基 因。
其中，步驟[2]中所述大腸桿菌表達(dá)菌株為任何大腸桿菌表達(dá)菌株，優(yōu)選DH5oc。
其中，步驟[3]中所述宿主為大腸桿菌、酵母菌或其它表達(dá)生物。所述大腸桿菌，優(yōu)選
BL21 (DE3);所述酵母菌，優(yōu)選畢赤酵母(A'c/w'a pastor/s);所述其它表達(dá)生物，優(yōu)選
昆蟲細(xì)胞。
本發(fā)明還提供所述基因重組表達(dá)Ha-Lect及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域 Ha-CRDl和Ha-CRD2的生物藥物的應(yīng)用，其特征是，用于防治家養(yǎng)昆蟲感染性病害。所述家 養(yǎng)昆蟲選自家蠶、棉鈴蟲、甜菜夜蛾。 '
利用本發(fā)明的方法創(chuàng)制的基因重組rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2凝集素，可以用
于家蠶等家養(yǎng)經(jīng)濟(jì)昆蟲的感染性病害防治。
將rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2與病源生物共同注射到昆蟲幼蟲體內(nèi)，可以減少 由病源生物引起的幼蟲死亡率，減少幅度為50~70%。
將rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2與病源生物共同注射到昆蟲幼蟲體內(nèi)，可以增加 幼蟲血細(xì)胞對(duì)病源生物的吞噬能力，增加幅度為40~60%。
將rHa-lectin、 rHa-CRDl和rHa-CRD2與病源生物共同注射到昆蟲幼蟲體內(nèi)，可以減少 病源生物在體內(nèi)的存活數(shù)量，減少幅度為50~70%。
所述昆蟲選自棉鈴蟲、家蠶、甜菜夜蛾。所述病源生物選自蘇云金桿菌蘇云金桿菌 (Sac///us ^2w〃'"g/ew^), 克雷伯氏菌(X7e^n'e〃a pwewwo"/ae), 白色念球菌(Q "c /(iara化z'03M5)，纟錄〈畺菌ifetar力jf么ii//77. 3/7J'sop7ise, 白僵菌^esi/Fer/s力assj'a/ 3。
將rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2添加到滅菌冷卻至37°C的人工養(yǎng)殖的昆蟲的飼
料中，lmg/L,防治微生物對(duì)家蠶等人工養(yǎng)殖昆蟲的感染。所述人工養(yǎng)殖的昆蟲選自棉鈴蟲、
家蠶、甜菜夜蛾。所述微生物選自蘇云金桿菌(Sflc///^ Z/mn'"gz'ew^),綠僵菌(i/efr力i^/湖
朋is。A/i3e)， 白僵菌(5e3t/mris Z as57-朋a)。
該發(fā)明所創(chuàng)制的基因重組rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2凝集素的思路、基因和方
法都是由我們首次報(bào)道。 '
本發(fā)明所述的基因重組rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2凝集素，可以減少病源生物
對(duì)昆蟲的致死率，增加血細(xì)胞對(duì)病源生物的吞噬效率，減少病源生物在蟲體中的生存數(shù)量。
防治昆蟲細(xì)菌性疾病的傳統(tǒng)方法主要是使用抗生素，如添食氯霉素、紅霉素、土霉素，這
樣的方法會(huì)導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生，抗生素對(duì)昆蟲的正常生命活動(dòng)也會(huì)產(chǎn)生不利影響。我們發(fā)明的
昆蟲凝集素屬于生物藥物，昆蟲凝集素是昆蟲本身存在的抵御微生物浸染的天然物質(zhì)，通過
生物技術(shù)方法重組表達(dá)生產(chǎn)的昆蟲凝集素可以補(bǔ)充昆蟲體內(nèi)的凝集素的不足。重組表達(dá)的
凝集素通過取食或呼吸進(jìn)入蟲體后通過凝集入侵的細(xì)菌從而增加血細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬，不會(huì)
導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生，對(duì)昆蟲本身的正常生命活動(dòng)沒有不良影響，使用該藥物可以減少抗生素
的使用，減少環(huán)境中耐藥菌的產(chǎn)生。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對(duì)利用本發(fā)明的方法得到的基因重組昆蟲凝集素的作用作進(jìn)一步的說明。
方法(1):設(shè)計(jì)l對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增C-型凝集素基因成熟肽(84-1013 bp)，' 即去掉信號(hào)肽部分。引物如下LectEco: 5， -TACTCAGAATTCGCGTTTACATGCGACTAC-3， (￡boR I) ; LectXho: 5' -TACTCACTCGAGTTATTCAACTTTGTTATT-3， (J/ o I) ， PCR反應(yīng)，條件 為94。C 30 sec， 60°C 45 sec, 72°C 1 min， 72°C 10 min。將PCR片段和pET-30a(+)載體 分別用^coRI和"wl酶切，由L DNA連接酶將純化的cDNA片段與純化的pET-30a(+)載體 連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coW DH5 a ，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，取l pL構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì) 粒，稀釋10倍，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. co7i BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在LB/Kan培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 加入終濃度為0. 5 mM的IPTG誘導(dǎo)插入基因的表達(dá)，取誘導(dǎo)后的菌液，6000 rpm離心5 min， 收集菌體，用3ml PBS(140 mM NaCl, 2. 7 mM KC1, 10 raM N&HP04， 1.8 mM KH2P04, pH7. 4) 和30 pi 20% Triton X-100，充分混勻，冰浴超聲破碎10 min，破碎好的菌體4°C， 12， 000 rpm離心20 min，分別收集上清和沉淀，用鎳親和柱純化重組蛋白。方法(2):設(shè)計(jì)1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增rHa-CRD1，引物如下CRDlEco: 5， -TACTCAGAATTCTGCGACTACAMTACAGTCTA-3， WcoRI ， CDRlXho
5， -TACTCACTCGAGAAAGCAGATGTAAGGTCTGGG-3， JZ oI，后面的步驟同方法(1)。
方法(3):設(shè)計(jì)1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增rHa-CRD2， 引物如下CRD2Eco 5， -TACTCAGAATTCTGTGGTACTCCTGATGATGGA-3， ￡c。RI , CDR2Xho
5， -TACTCACTCGAGCTCACAAATGAATGGAGCTGG-3， 7力o1,后面的步驟同方法(1)。
方法(4):將rHa-lectin、 rHa-CRDl和rHa-CRD2 (每只幼蟲0. 5 ng' 3 fjg or 15 jag) 與Bt (30個(gè)/幼蟲)混合，注射到昆蟲幼蟲(如棉鈴蟲)體內(nèi)，24和48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)死亡 率，與a射生理鹽水的對(duì)照組比較。
方法(5):將rHa-lectin、 rHa-CRDl和rHa-CRD2 〔每只幼蟲3嗎)與Bt (30個(gè)/ 幼蟲)混合，注射到昆蟲幼蟲(如棉鈴蟲)體內(nèi)，24小時(shí)后取出血淋巴，用生理鹽水稀釋 后涂布在LB平板(W蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl, 1.5%瓊脂，pH 7.0),計(jì)數(shù)統(tǒng) 計(jì)菌數(shù)。
方法(6):將Bt用70%乙醇處理10分鐘，收集細(xì)胞，加入丫啶橙(1 pg/ml)染色5 分鐘，收集細(xì)胞在生理鹽水中洗3次，將rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2 (每只幼蟲5 叫)與Bt (lxl07幼蟲)混合，注射到昆蟲幼蟲(如棉鈴蟲)體內(nèi)，24小時(shí)后取出血淋巴 和血細(xì)胞，在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)與細(xì)胞吞噬細(xì)菌的數(shù)量。
方法(7):將rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2添加到人工養(yǎng)殖的昆蟲的詞料中，.防 治微生物對(duì)家蠶等人工養(yǎng)殖昆蟲的感染。
方法(8):將rHa-lectin、 rHa-CRDl和rHa-CRD2噴霧到人工養(yǎng)殖的昆蟲的飼料ji,防' 治微生物對(duì)家蠶等人工養(yǎng)殖昆蟲的感染。 實(shí)施例l '
設(shè)計(jì)1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增C-型凝集素基因成熟肽(84 - 1013 bp)，即去掉信號(hào) 肽部分。引物如下LectEco: 5， -TACTCAGAATTCGCGTTTACATGCGACTAC-3， (iboR I); LectXho: 5' -TACTCACTCGAGTTATTCMCTTTGTTATT-3' (J力o I) ， PCR反應(yīng)，條件為94°C 30 sec, 60'C45sec， 72X 1 min， 72。C10min。將PCR片段和pET-30a(十)載體分別用fcoRI 和J力ol酶切，由L DNA連接酶將純化的cDNA片段與純化的pET-30a(+)載體連接，將連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coW DH5a ，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，取1 pL構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒，稀釋10 倍，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. co"'BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在LB/Kan培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入終濃度為 0. 5 mM的IPTG誘導(dǎo)插入基因的表達(dá)，取誘導(dǎo)后的菌液，6000 rpm離心5 min,收集菌體，用3ml PBS (140 mM NaCl， 2. 7 raM KC1， 10 mM Na2HP04， 1. 8 mM KH2P04， pH7. 4)和30 |al 20% Triton X-IOO，充分混勻，冰浴超聲破碎10 min,破碎好的菌體4°C, 12， 000 rpm離心20 min，分別收集上清和沉淀，用鎳親和柱純化重組蛋白。
實(shí)施例2
設(shè)計(jì)1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增rHa-CRD1 ， 引物如下CRDlEco : 5' -TACTCAGAATTCTGCGACTACAAATACAGTCTA-3' ￡coRI ， CDRlXho
5' -TACTCACTCGAGAAAGCAGATGTAAGGTCTGGG-3 ， ，后面的步驟同實(shí)施例1 。
實(shí)施例3
設(shè)計(jì)1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增rHa-CRD2 ， 引物如下CRD2Eco 5' -TACTCAGAATTCTGTGGTACTCCTGATGATGGA-3， ￡coRI ， CDR2Xho
5， -TACTCACTCGAGCTCACAAATGAATGGAGCTGG-3' J/wI，后面的步驟同實(shí)施例1。 實(shí)施例4
將rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2添加到人工養(yǎng)殖的昆蟲(如家蠶)的飼料中，1 mg/L，防治微生物對(duì)家蠶等人工養(yǎng)殖昆蟲的感染。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法可以減少環(huán)境中病源微 生物引起的家蠶感染性疾病的發(fā)生，如綠霉菌感染和蘇云金桿菌感染，發(fā)病率減少60%。 實(shí)施例5
在實(shí)施例l、 2、 3的基礎(chǔ)上，突變基因，獲得表達(dá)產(chǎn)物，具有相同的防治微生物感染的 功效。如1)將基因中任一編碼氨基酸的密碼子的第3位堿基突變而不改變氨基酸，獲得 具有相同氨基酸序列的rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2，如將tac， aca， gtt， ttt， tgc (分 別編碼Y 、 T、 V、 F、 C氨基酸)，突變成tat， act、 c、 g， gtc、 a、 g， ttc， tgt(仍然分別編' 碼Y 、 T、 V、 F、 C氨基酸)，基因中其它序列也如此；2)將基因中的部分序列缺失，獲 得具有相同功效的rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2， 如將基因編碼框中的第1-78堿基 缺失、或?qū)⒌?73-503堿基缺失、或?qū)⒌?26-1010堿基缺失，獲得具有相同功效的 rHa-lectin; 3)將基因編碼蛋白質(zhì)中的氨基酸突變而獲得具有相同功效的rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2，如將S L L T K突變成S L L A K，基因編碼蛋白質(zhì)中的其它氨基酸 突變也如此。 實(shí)施例5
在實(shí)施例l、 2、 3的基礎(chǔ)上，換用其它表達(dá)載體，如pGEX系列載體、酵母表達(dá)載體如 pPIC系列載體、以及昆蟲桿狀病毒載體，獲得相同功能的凝集素產(chǎn)物。 實(shí)施例6在實(shí)施例1、 2、 3的基礎(chǔ)上，換用其它表達(dá)系統(tǒng)，如酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)， 獲得相同功能的凝集素產(chǎn)物。 實(shí)施例7給藥方式
將rHa-lectin (每只幼蟲15嗎)與Bt (30個(gè)/幼蟲)混合，注射到昆蟲幼蟲(如棉 鈴蟲)體內(nèi)，減少感染死亡率。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與注射生理鹽水的對(duì)照組比較，48小時(shí)后統(tǒng)計(jì) 死亡率從97%降低到23%。注射rHa-CRD2 (每只幼蟲15嗎)與Bt (30個(gè)/幼蟲)混合， 與注射生理鹽水的對(duì)照組比較，48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)死亡率從97%降低為38. 2%。
方法(5):將rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2 (每只幼蟲3 jig)與Bt (30個(gè)/ 幼蟲)混合，注射到昆蟲幼蟲(如棉鈴蟲)體內(nèi)，24小時(shí)后取出血淋巴，用生理鹽水稀釋 后涂布在LB平板(W蛋白胨，0. 5%酵母提取物，1% NaCl， 1. 5%瓊脂，pH 7. 0)，計(jì)數(shù)統(tǒng) 計(jì)菌數(shù)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與注射生理鹽水的對(duì)照組比較，血淋巴中細(xì)菌數(shù)從3.87xl()S個(gè)/pl降低 為2.77 0.93xl()5個(gè)爾l。 '
將Bt用70%乙醇處理10分鐘，收集細(xì)胞，加入丫啶橙(1叫/ml)染色5分鐘，收集 細(xì)胞在生理鹽水中洗3次，將rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2 (每只幼蟲5 pg)與Bt (lxl07幼蟲)混合，注射到昆蟲幼蟲(如棉鈴蟲)體內(nèi)，24小時(shí)后取出血淋巴和血細(xì)胞， 在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)血細(xì)胞吞噬細(xì)菌的數(shù)量。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與注射生理鹽水的對(duì)照組比較，吞 噬細(xì)菌的血細(xì)胞的數(shù)量從19.02 %增加到54.41%。
將rHa-lectin、 rHa-CRD1和rHa-CRD2添加到人工養(yǎng)殖的昆蟲的飼料上，防治微生物對(duì) 家蠶等人工養(yǎng)殖昆蟲的感染。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法使昆蟲感染性疾病的發(fā)生從90%降低到30%。
權(quán)利要求
1. 一種基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRD1和Ha-CRD2的生物藥物，其特征是，將棉鈴蟲C-型凝集素基因及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRD1和Ha-CRD2，重組表達(dá)到大腸桿菌中。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合 物識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRD1和Ha-CRD2的生物藥物，其特征是，所述棉鈴蟲C-型凝集素基因?yàn)?Ha-Lect、在大腸桿菌中重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素全長(zhǎng)基因、功能域、以及在上述基因的 基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾或堿基突變產(chǎn)生的基因，獲得重組蛋白凝集素或凝集素功能域。
3. —種基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域 Ha-CRD1和Ha-CRD2的方法，包括如下步驟[1]針對(duì)插入表達(dá)載體的Ha-Lect、 Ha-CRD1和Ha-CRD2的基因序列分別設(shè)計(jì)帶酶切位 點(diǎn)的引物，用PCR方法分別擴(kuò)增Ha-Lect及Ha-CRD1和Ha-CRD2;[2]在大腸桿菌中擴(kuò)增并提取表達(dá)載體-Ha-Lect、表達(dá)載體-Ha-CRDl和表達(dá)載體-Ha-CRD2質(zhì)粒；[3]將表達(dá)載體-Ha-Lect、表達(dá)載體-Ha-CRD1和表達(dá)載體-Ha-CRD2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入宿主 體內(nèi)，用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)；[4]用附2+柱或其它填料純化重組rHa-Lect、 rHa-CRD1和rHa-CRD2。
4. 如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí) 別結(jié)構(gòu)^Ha-CRDl和Ha-CRD2的方法，其特征是，步驟[3]中所述誘導(dǎo)物為IPTG、甲醇或其 它化合物。
5. 如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí) 別結(jié)構(gòu)域Ha-CRDl和Ha-CRD2的方法，其特征是，步驟[l]中所述表達(dá)載體選自大腸桿菌表 達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、或昆蟲桿狀病毒載體。優(yōu)選的，大腸桿菌表達(dá)載體選自pET系列載 體或pGEX系列載體，酵母表達(dá)載體選自pPIC系列載體。
6. 如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí) 別結(jié)構(gòu)域Ha-CRDl和Ha-CRD2的方法，其特征是，步驟[l]中所述Ha-Lect、Ha-CRDl和Ha-CRD2 為Ha-Lect基因及其基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾或堿基突變產(chǎn)生的基因。
7. 如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí) 別結(jié)構(gòu)域Ha-CRD1和Ha-CRD2的方法，其特征是，步驟[2]中所述大腸桿菌表達(dá)菌株為DH5a。
8.如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRDl和Ha-CRD2的方法，其特征是，步驟[3]中所述宿主為大腸桿菌、酵母菌 或其它表達(dá)生物；所述大腸桿菌，優(yōu)選BL21 (DE3);所述酵母菌，優(yōu)選畢赤酵母(Wc/n'a / a"on's);所述其它表達(dá)生物,優(yōu)選昆蟲細(xì)胞。
9. 如權(quán)利要求1所述的基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基H的兩個(gè)碳水化合物識(shí) 別結(jié)構(gòu)域Ha-CRD1和Ha-CRD2的生物藥物的應(yīng)用，其特征是，用于防治家養(yǎng)昆蟲感染性病害。 所述家養(yǎng)昆蟲選自家蠶、棉鈴蟲、甜菜夜蛾。
10. -如權(quán)利要求9所述的基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物 識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRD1和Ha-CRD2的生物藥物的應(yīng)用，其特征是，將rHa-lectin、 rHa-CRD1 和rHa-CRD2與病源生物共同注射到昆蟲幼蟲體內(nèi)，所述昆蟲選自棉鈴蟲、家蠶、甜菜夜蛾； 所述病源生物選自蘇云金桿菌蘇云金桿菌、克雷伯氏菌、白色念球菌、綠僵菌、或白僵菌；或?qū)Ha-lectin、 rHa-CRDl和rHa-CRD2添加到滅菌冷卻至37°C的人工養(yǎng)殖的昆蟲的 飼料中，lmg/L;所述人工養(yǎng)殖的昆蟲選自棉鈴蟲、家泰、甜菜夜蛾；所述微生物選自蘇云 金桿菌、綠僵菌或白僵菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供一陣基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRD1和Ha-CRD2的生物藥物，將棉鈴蟲C-型凝集素基因及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRD1和Ha-CRD2重組表達(dá)到大腸桿菌中。還提供基因重組表達(dá)棉鈴蟲C-型凝集素及該基因的兩個(gè)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域Ha-CRD1和Ha-CRD2的方法。本發(fā)明的凝集素，可以減少病源生物對(duì)昆蟲的致死率，增加血細(xì)胞對(duì)病源生物的吞噬效率，減少病源生物在蟲體中的生存數(shù)量。不會(huì)導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生，對(duì)昆蟲本身的正常生命活動(dòng)沒有不良影響，使用該藥物可以減少抗生素的使用，減少環(huán)境中耐藥菌的產(chǎn)生。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101434955SQ200810238560
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者王金星, 趙小凡 申請(qǐng)人:山東大學(xué)